Southern 印迹杂交实验报告
姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生
实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤
【实验目的】
学习核酸杂交的基本过程和操作
【实验原理】
将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。【实验步骤】
1、基因组DNA的限制性内切酶酶切
取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。总体积20μL。37℃保温1.5小时。
2、1％琼脂糖电泳
先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。浇板，水平放置，待凝。胶凝后按照以下顺序加样。两组共用一块凝胶，共7个样。
①基因组DNA10 20μl （自己的）
②基因组DNA10 μg（老师的）
③酶切样品
④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl)
⑤酶切样品
⑥基因组DNA10 μg （老师的）
⑦基因组DNA10 20μl （自己的）
插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。
3、变性
切胶，2—6孔，宽4.5cm,长7cm(从顶部开始，可用尼龙膜保护纸作为标尺）
①将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇动20分钟。
②ddH2O洗2次。
③在胶中和液中慢慢摇动15分钟。
4、转移
①在搪瓷盘中加入300 ml 10×SSC，放上培养皿和小玻璃板。
②将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡。
③切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上（加样孔面向下），赶走滤纸与胶之间的气泡。
④再将与胶大小相同的尼龙膜（浸湿）放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的
滤纸，赶走气泡。
⑤紧贴凝胶四周各放一张X光片。
⑥小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动。
⑦用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保鲜膜，但不能割破滤纸。取走滤纸上的
保鲜膜。
⑧整齐地放上草纸，数张草纸一折为二，草纸堆要高出搪瓷盘边约10 cm。
⑨在草纸上放上玻璃板, 压上约500 g重的重物, 转移过夜。
5、固定
①将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样槽在尼龙膜上画上槽的位置。
②正面朝上放在紫外交联仪中，交联固定。
6、杂交和洗膜
①将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 68℃封闭6小时。②倒出预杂交液, 加杂交液，68℃杂交过夜。③回收杂交液（可重复使用），将膜放在洗膜溶液I（2xSSC,0.1%SDS）中, 室温洗2次, 每次摇动5分钟。④再在洗膜溶液II（0.5xSSC, 0.1%SDS）中, 68℃洗2次, 每次摇动15分钟。
7、检测
①将膜在缓冲液1(马来酸缓冲液)中漂洗3分钟。
②在缓冲液2（封闭液）中室温摇动封闭30分钟。
③在含anti-DIG-AP的抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。
④用洗膜溶液III（马来酸缓冲液，0.3%吐温）洗2次, 每次15分钟。
⑤在缓冲液3（检测缓冲液）中平衡3分钟。
⑥将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育0.5-16小时。
⑦当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深前, 用TE或ddH2O洗去底物液，拍照并干
燥保存。
【实验结果】
上面两张图分别为琼脂糖凝胶电泳结果和Southern blot结果，琼脂糖凝胶电泳结果显示1-3条带（基因组DNA自己的；基因组DNA老师的；酶切样品）均有DNA片段显示，4阳性对照对应条带无DNA片段显示，1、2条带因为基因组很大，在电场作用下基本不会动，故在靠近加样孔的地方；而酶切后的基因组由于断裂成一系列的片段，电泳时会形成均匀的涂抹状，见条带3；尾巴高亮怀疑是RNA量过多；Southern blot 只显示了阳性对照结果。【注意事项】
1、DNA限制性酶的用量1-5U/ugDNA，时间为1-20小时。中途可取少量（小于十分之一）电泳检测是否酶切完全。
2、EDTA会抑制酶活性，在酶解反应液中的浓度小于0.25mmol/l为佳。
3、内切酶一般保存在甘油中，甘油会抑制酶活性，因此，所加入酶的体积应小于反应总体积的十分之一，否则应将反应体积加大。
4、若基因组DNA浓度低，可在酶切后用一冲成点浓缩DNA后跑胶。
5、标记探针在加入杂交液之前，一定要加热变性处理，并且要先在杂交液中混匀后加入，不要直接加在膜上。
6、杂交也可以在杂交袋中进行。
7、含有DIG标记探针的杂交液可以放在-20°C保存，反复多次使用，每次用前在68°C热变性。
8、为了获得最佳效果，第一次使用的探针，可做系列模拟杂交，即将小块尼龙膜在不同探针浓度的杂交液中杂交过夜，然后经显色检测，采用背景可以接受的最高的探针浓度进行真实杂交。
9、第一次杂交的DNA可用碱去除探针（限于尼龙膜），用第二个探针做预杂交和杂交。
10、杂交的灵敏度取决于杂交液中探针的弄得和显色时间。
11、对于尼龙膜可采用碱溶液转移，更有利于DNA的结合。
12、若目的片段大于10kb可用0.25mol/lHCl先部分脱嘌呤，使片段变短，便于有效转移。【讨论】
●结果分析
本实验凝胶电泳后，紫外灯下观察1-3条带均有DNA片段显示，4阳性对照对应条带无DNA片段显示。
转膜结果中只有阳性对照组有杂交后显色，可能原因有：①本实验采用毛细管法向上转移，可能是由于转膜速度慢、效率低导致的转膜不完全，使DNA含量非常少，以至于无法抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色；②DNA含量过少，非放射性标记探针法灵敏度不高，可以试用放射性探针标记法提高灵敏度；③预杂交液封闭非特异性结合位点时也结合了含量很低的待测DNA位点，可以尝试用不同浓度的预杂交液来封闭非特异性位点；④洗膜条件有：低严格度（低温、高盐）、高严格度（高温、低盐），随着盐浓度增加，杂交率增加（Na+的作用），高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以洗膜时一定要按照低严格度→高严格度，可以减少DNA的流失。
●影响杂交的因素：
1、待检核酸分子的浓度和长度，浓度越大，复性速度越快，敏感性越高；分子越大，转膜越困难，敏感性下降。
2、探针的性质（标记效率、浓度，核酸性质）：对于单链探针，浓度越高，杂交率增加；探针标记方法和检测方法的选择。
进行探针标记的标记物分两大类：放射性和非放射性。放射性标记物的灵敏度极高，可检测到10-14—10-18g的物质，在最适条件下，可检测出样品中少于1000个分子的核酸含量，但是存在着放射性污染及放射核素发生衰变所产生的不稳定性两大缺点。非放射性标记物（生物素、地高辛、荧光物质、酶类、金属Hg等）优点是无放射性污染，稳定性好，可以较长时间存放等。
本实验采用地高辛连接于dUTP上进行标记，地高辛标记的探针与靶核酸杂交后，用带有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行免疫结合反应，通过酶底物的化学显色来显示。与放射性标记相比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可以长期保存。与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。
3、杂交液体积、温度和杂交时间：体积越小，杂交动力学越高；DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃；温度↓非特异性↑；温度↑敏感性↓。
4、杂交液的离子强度：低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（Na+的作用），高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的杂交时，必须维持
杂交液与洗膜液中较高的盐浓度。
5、非特异性杂交反应：预杂交的作用，杂交前封闭膜上非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异吸附。常用的封闭物：①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA，小牛胸腺DNA，②高分子化合物：脱脂奶粉等。
6、杂交后的漂洗：盐浓度、温度、次数，体积；漂洗从低严谨度（低温高盐）→高严谨度（高温低盐）。
7、固相膜的选择：阳离子尼龙膜。
8、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm，含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到30—42°C。使用甲酰胺的优点：低温下探针更稳定，能更好地保留非共价结合的核酸。
Southern杂交 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量 基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 Northern 印记杂交 Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 Western杂交 原理：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
Southern印迹杂交
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量
实验原理 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是 将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定 的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针 在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。 该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后， 经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。近年来 印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方 法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化 学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern 印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中 某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性 片断长度多态性分析（RFLP）等。
northern印迹杂交 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern 印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。 RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法。 <1>试剂： 10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/L EDTA pH8.0。 5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝。 甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。 20×SSC； 去离子甲酰胺； 50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)； 0.1mol/L Tris，pH7.5。 <2>步骤： [1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml10×MSE缓冲液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。 [2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。 [3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。 [4]55℃加热15min，冰浴冷却。 [5]加2ml5×载样缓冲液。 [6]上样、同时加RNA标记物。
仪器设备 1、医用微波炉； 2、水浴锅； 3、OLYMPUS BX51荧光显微镜； 4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。 FISH试剂 （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃； （2）20×SSC（）； （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成； （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。 （5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。 （6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH 前升至室温。 实验步骤 1、脱蜡： 1）二甲苯脱蜡3次，每次5min； 2）100％酒精两次，每次2min； 3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。 2、蛋白酶处理: 1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。 2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。 3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。 4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。 3、变性： 1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液； 2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； 3）78℃孵育8min； 4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min； 5）空气干燥。 4、杂交： 1）准备探针； 2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片； 3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片； 4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。 杂交后的水洗： 5）镊子小心去除盖玻片； 6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min； 7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min； 8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。 检测：
果蝇杂交实验报告 实验日期：2012年9月28日 -2012年10月20日 小组编号：周五5组 小组成员：白坦蹊陈朱媛呼波王启明 【摘要】 实验利用果蝇，这一常用的遗传学模式生物，进行杂交实验，验证了基因的分离定律、自由组合定律、伴性遗传、基因连锁交换等遗传学规律。报告对实验数据进行了卡方检验，对三隐性状中的基因遗传距离进行了计算，证明实验数据基本符合假设的。 【实验原理】 一、遗传定律 1.基因分离定律 一对等位基因在杂合状态中保持相对的独立性，在配子形成时，按原样分离到不同的配子中去，理论上配子分离比是1∶1，F2代基因型分离比是1∶2∶1，若显性完全，F2代表型分离比是3∶1 。 控制体色性状的突变基因位于2号常染色体，正常体色对黑体完全显性，用正常体色果蝇与黑体果蝇交配，得到F1代都是正常体色，F1代雌雄个体之间相互交配，F2代产生性状分离，出现两种表现型。 2.基因自由组合定律 不同相对性状的等位基因在配子形成过程中，等位基因间的分离和组合是互不干扰，各自独立分配到配子中去，它们所决定的两对相对性状在F2代是自由组合的，在杂种第二代表型分离比就呈9∶3∶3∶1。 控制体色性状的突变基因位于2号常染色体，正常体色对黑体完全显性，控制眼色性状的突变基因位于性染色体。红眼对白眼完全显性，用黑体红眼果蝇(♀)与正常体色白眼果蝇(♂)交配，得到F1代都是正常体色，F1代雌雄个体之间相互交配，F2代产生性状分离，出现四种表现型。 3.伴性遗传 位于性染色体上的基因，其传递方式与位于常染色体上的基因不同，它的传递方式与雌雄性别有关，因此称为伴性遗传。 果蝇的性染色体有X和Y两种，雌蝇为XX，雄蝇为XY。红眼与白眼是一对相对性状，控制该对性状的基因(W)位于X染色体上，且红眼(W)对白眼(w)为完全显性。 当红眼雌蝇与白眼雄蝇杂交时，F1代雌性果蝇、雄性果蝇都为红眼，F2代雌性果蝇都是红眼，雄性果蝇红眼和白眼的比例为1∶1；当白眼雌蝇与红眼雄蝇杂交时，F1代雌性果蝇为红眼，而雄性果蝇为白眼，此现象又称为绞花式遗传，F2代雌性果蝇的红眼与白眼比例为1∶1，雄性果蝇的红眼与白眼比例也是1∶1 。 4.连锁与交换定律 连锁是指在同一同源染色体上的非等位基因连在一起而遗传的现象；互换是指同源染色体的非姊妹染色单体之间的对应片段的交换，从而引起相应基因间的交换与重组。同一条染色体上的基因是连锁的，而同源染色体基因之间可以发生一定频度的交换，因此在子代中将发现一定频度的重组型，但一般比亲组型少得多。 5.基因定位 基因定位就是确定基因在染色体上的位置，确定基因的位置主要是确定基因之间的距离和顺序，而它们之间的距离是用交换值来表示的。只要准确地估算出交换值，并确定基因在染色体上的相对位置就可以把它们标志在染色体上，绘制成图。
Southern 印迹杂交实验报告 姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生 实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤 【实验目的】 学习核酸杂交的基本过程和操作 【实验原理】 将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。【实验步骤】 1、基因组DNA的限制性内切酶酶切 取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。总体积20μL。37℃保温1.5小时。 2、1％琼脂糖电泳 先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。浇板，水平放置，待凝。胶凝后按照以下顺序加样。两组共用一块凝胶，共7个样。 ①基因组DNA10 20μl （自己的） ②基因组DNA10 μg（老师的） ③酶切样品 ④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl) ⑤酶切样品 ⑥基因组DNA10 μg （老师的） ⑦基因组DNA10 20μl （自己的） 插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。 3、变性 切胶，2—6孔，宽4.5cm,长7cm(从顶部开始，可用尼龙膜保护纸作为标尺） ①将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇动20分钟。 ②ddH2O洗2次。 ③在胶中和液中慢慢摇动15分钟。 4、转移 ①在搪瓷盘中加入300 ml 10×SSC，放上培养皿和小玻璃板。 ②将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡。 ③切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上（加样孔面向下），赶走滤纸与胶之间的气泡。 ④再将与胶大小相同的尼龙膜（浸湿）放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的 滤纸，赶走气泡。 ⑤紧贴凝胶四周各放一张X光片。 ⑥小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动。
荧光原位杂交仪实验报告 实验者：魏兰兰 实验时间：2016/10/18—2016/10/19 一、实验目的 1．探针试剂吸液量定量—10ul； 2．观察探针试剂滴液时是否有残留； 3．观察探针试剂滴液后盖板是否能压紧，是否均匀摊开，石蜡是否能完全浸裹； 4．观察上一步试剂对探针试剂有无影响； 5．观察探针试剂对下一步试剂有无影响； 6．观察37℃恒温16小时后，探针试剂是否挥发； 二、实验器材 1．荧光原位杂交仪 2．10ul取样器 3．一次性枪头 4．探针试剂（墨水稀释液） 三、实验步骤 1．10ul定量：利用10ul取样器确定一次性枪头吸液10ul液面所在的刻度位置，经过多次调整杂交仪柱塞泵电机的吸液步数，最终确定电机的吸液步数为1920时，吸液量恰好是10ul。 2．对反应池1运行以下程序步骤以确定实验目的的2.3.4.6项： 3．对反应池2、5运行以下程序步骤以确定实验目的的2.3.5.6项： 四、实验结果 1．本实验3次吸探针试剂量均在10ul刻度线处； 2．本实验3次滴探针试剂时基本没有残留； 3．本实验3次滴探针试剂后盖板均能压紧，目测无缝隙，石蜡完全
浸裹； 4．反应池1、5的上一步试剂均排液排尽，对探针没有其他影响； 5．反应池2因上一步（二甲苯试剂）排液时恰在中间位置残留大约50ul试剂，导致探针试剂压紧后溢出到盖板外1/4-1/3的液量； 6．由于探针试剂用到石蜡覆盖，排液时石蜡不能完成排尽，故而下一步试剂上还会有部分石蜡覆盖，除此之外无其他影响； 7．反应池1、5经过37℃恒温16小时后，探针试剂基本无挥发且成均匀摊开状；反应池2经过37℃恒温16小时后，探针试剂挥发1/2左右（因有溢出）基本成均匀摊开状。 8．盖板掀开后探针试剂表面有石蜡油，一种可能是实验中扩散到盖板内覆盖探针试剂，另一种可能是盖板掀开后扩散探针试剂表面。
Southern 杂交实验 Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 一、溶液配制 (1)20 X SSC(1000 mL) : 组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠 NaCl 175.32g 柠檬酸钠88.26g NaOH调PH值到7.0，高温高压灭 (2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml 组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20. Maleic acid：2.32g Nacl： 1.75g Tween20 0.6ml NaOH固体约1.7g调Ph值7.5 (3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml 组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20oC) Maleic acid：2.32g Nacl： 1.75g Tween20 0.6ml NaOH固体约1.7g调Ph值7.5 (4)检测缓冲液Detection buffer 100ml 组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20oC) Tris 1.21g, NaCl 0.584g
果蝇杂交实验正式报告 姓名： 学号： 班级： 日期：年月日
果蝇的杂交实验 一、实验目的 1、了解伴性遗传和常染色体遗传的区别； 2、进一步理解和验证伴性遗传和分离、连锁交换定律； 3、学习并掌握基因定位的方法。 二、实验原理 红眼和白眼是一对相对性状，控制该对性状的基因位于X染色体上，且红眼对白眼是完全显性。当正交红眼雌蝇与白眼雄蝇杂交时，无论雌雄均为红眼；反交时雌蝇都是红眼，雄蝇都是白眼。 三、实验材料和器具 野生型雌蝇雄蝇，突变型雌蝇雄蝇、放大镜、麻醉瓶、毛笔、超净台、乙醚、酒精棉球、酵母、玉米粉、丙酸、蔗糖、琼脂 四、实验流程 配培养基→选处女蝇→杂交（正交，反交）→观察F1 五、实验步骤 1、配培养基 2、选处女蝇在超净台上选取野生型和突变型的雄蝇雌蝇 3、杂交 （1）正交取红眼雌蝇5个和白眼雄蝇4个，放入培养瓶中（♀）红眼（+ +x x w） x）×（♂）白眼（y （2）反交取红眼雌蝇3个和白眼雄蝇4个，（♀）白眼（w w x x）×（♂）红眼（y x+） 贴上标签，放于恒温箱饲养 4、观察并记录 分别将正反交的F1代用乙醚麻醉，倒在白纸上，分别数红白眼的雌蝇和雄蝇，记录数据。 六、实验结果与分析
在正交实验中，F1代雌雄硬都是红眼；在反交实验中，雌性都是红眼，雄性都是白眼，但也出现了个不该出现的雌性白眼分析：在伴性遗传中，也有个别例外产生，这是由于2条X不分离造成的，F1中出现的不该出现的雌性白眼，但是这种情况极为罕见。 七、注意事项 要经常观察，如果培养瓶内有生霉的，必须将果蝇转移到干净的培养瓶中 F1代幼虫出现即可将亲本放出或处死 要严格控制温度，偏高的温度或者偏低的温度都可能引起果蝇的死亡 亲本必须是处女蝇，其原因是雌蝇生殖器官有受精囊，可以保存交配所得的大量精子，能使交配后卵巢产生的卵受精。在杂交时若不是处女蝇，其体内已储有另一类型雄蝇的精子，会严重影响实验结果，导致整个实验失败。 在F1代羽化前，一定要将亲本全部清除干净并处死，以免出现回交现象，影响结果 果蝇的麻醉要适当，掌握好麻醉时间，麻醉过度会使果蝇直接死亡 取果蝇的时候用毛笔，避免用其他锋利的器具，避免戳伤果蝇，影响生长繁育 八、个人总结 第一次饲养果蝇，开始时感觉这么复杂和漫长的实验是一个很大
荧光原位杂交实验（FISH） 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。 1实验方法原理： 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。 杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III 类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-
地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH，冰冻切片操作过程： 1、多甲固定：应尽量在半个小时内完成。（固定时间以24-36小时为宜，避免RNA 降解或固定过度。） 2、切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。（选用16um）（切好的片 子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。（重新固定10-15min） 3、用0.1MPB洗切片3*5min 4、切片放入100%乙醇5min，空气中干燥。 杂交液：（20ml）藏于-20度 20*SSC 4ml 硫酸葡聚糖 4g 去离子甲酰胺 10ml 将他们溶解后，加入以下物质： Poly A（10mg/ml） 0.5 ml SsDNA（10mg/ml） 0.5 ml tRNA （10mg/ml） 0.5 ml DTT (1M) 2ml 50*Denhardts 0.2ml 上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到37度。 杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml，一般是以200ng/ml为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定，对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可能30-40ul足够。 加好杂交液以后，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何的气泡），为防止杂交液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的话杂交会有一个很高的背景） 在湿盒中37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交的信号，但是前提是不能让切片干燥。 杂交后处理; 制备0.5*SSC和1*SSC（从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用的时候的温度是55度。 注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10mM的DTT（将1.2g的DTT加入到800ml的SSC中） 杂交后，用小镊子将盖玻片轻轻移走，然后倒掉杂交液，将切片放入洗液中，在振摇水浴中按照下面的要求来洗片： 快洗： 1*SSC（10mMDTT）室温 2*15min：1*SSC（10mMDTT）55度 2*15min 0.5*SSC(10mMDTT) 55度 1*10min 0.5*SSC（10mMDTT）室温 将切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。 检测： 将切片转移到TBS缓冲液中（100mM tris-HCl，150mM NaCl，PH=7.5），将切片在TBS缓冲液中洗3*5min，
科目遗传学实验题目果蝇杂交实验 果蝇杂交实验 摘要果蝇（Drosophila）是遗传学实验中最常用的动物之一。因为果蝇染色体数目少、生活史短、繁殖率高、饲养简便，在基因分离、连锁、交换等方面有着深入的研究。本次实验通过设计杂交实验，观察记录实验过程中的性状和数据，运用统计学相关知识分析实验数据，并验证分离定律、自由组合定律、连锁交换定律和伴性遗传。 1.引言 普通果蝇的生活史历经卵，幼虫，蛹和成虫四个阶段，是一个完全变态过程。果蝇具有生活史短，突变型多，染色体数目少（2n=8）,繁殖率高，饲养简便等特点，是进行遗传学研究的好材料。普通果蝇突变型中，有常染色体的残翅及伴性遗传的白眼等容易观察到的性状，便于实验分析。 实验中选用的果蝇突变性状一般都可用肉眼鉴定，例如红眼与白眼，正常翅与残翅等。而另一些性状可在解剖镜下鉴定，如焦刚毛与直刚毛等。列表如下： 表一：本次杂交实验中使用的果蝇突变品系 影响部分突变名称基因符号染色体上的座位 翅残翅vg IIR 67.0 眼色白眼w X 1.5 体色黑檀体 b IIR 48.5 刚毛卷刚毛sn X 21.0 翅型小翅m X 36.1 （卷刚毛的基因符号为sn3，报告中简写为sn。） 分离定律： 在生物的体细胞中，控制同一性状的遗传因子成对存在，不相融合；在形成配子时，成对的遗传因子发生分离，分离后的遗传因子分别进入不同的配子中，随配子遗传给后代的现象叫做孟德尔分离定律。理论上配子分离比是1∶1，F2代基因型分离比是1∶2∶1，若显性完全，F2代表型分离比是3∶1 。 野生型果蝇为红眼、灰身、长翅、直刚毛，与这些性状对应的突变性状很多，其中灰身（+）与黑身（b）是一对相对性状，且灰身对黑身为完全显性，控制这对相对性状的基因位于第二号染色体上。用具有这对相对性状的两纯合亲本杂交，性状的遗传行为应符合分离定律。 自由组合定律： 当具有两对（或更多对）相对性状的亲本进行杂交，在子一代产生配子时，在等位基因分离的同时，非同源染色体上的基因表现为自由组合。实质上就是不同相对性状的等位基因在配子形成过程中，等位基因间的分离和组合是互不干扰，各自独立分配到配子中去，它们所决定的两对相对性状在F2代是自由组合的，在杂种第二代表型分离比就呈9∶3∶3∶1。 黑体果蝇的体色为黑色（b），与之相对应的野生型果蝇的体色为灰色（+），灰色对黑色为完全显性，控制这对相对性状的基因位于第二号染色体上；果蝇另一突变性状为焦刚毛（sn），与之对应的野生型性状为直刚毛（+），控制这对相对性状的基因位于第一号染色体上，直刚毛对焦刚毛为完全显性。用具有这两对相对性状的纯合亲本杂交，其性状的遗传行为应符合自由组合定律。 伴性遗传： 位于性染色体上的基因，其传递方式与位于常染色体上的基因不同，它的传递方式与雌雄性别有关，因此称为伴性遗传。 生物某些性状的遗传常与性别联系在一起，这种现象称为伴性遗传（sex-linked inheritance），这是由于
地高辛标记探针的Southern杂交 1.探针标记(20μL体系)： 1)将10ng-1μg模板DNA用无菌去离子水补足至16μl。 2)沸水浴或干浴锅98o C10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。 3)充分混匀DIG-high Primer（1#管），并取4μl至变性DNA管，混匀并离 心； 4)37o C温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）； 5)停止反应，加2μL0.2M EDTA（pH8.0）或65o C加热10分钟。若不用 将于-20o C冰箱保存。 2.探针标记效率检测： 将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下： 1)根据表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记 产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl(原始浓度是5ng/μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA稀释 表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量 Template DNA1h20h 10ng45ng600ng 30ng130ng1050ng 100ng270ng1500ng 300ng450ng2000ng 1000ng850ng2300ng 3000ng1350ng2650ng
表2探针DNA及Control DNA系列表 Tube DNA(μl)From Tube#DNA dilution buffer(μl) Dilution Final concentration 1Diluted orginal 1ng/μl 2211981:10010pg/μl 3152351:3.33pg/μl 452451:101pg/μl 553451:100.3pg/μl 654451:100.1pg/μl 755451:100.03pg/μl 856451:100.01pg/μl 90-50-0 1)将上述稀释的2-9号管的control DNA及探针DNA各取1μL点膜； 2)120o C固定30min或紫外交链3-5min； 3)将膜放入装有20mL Maleic acid buffer的塑料器皿中，室温振荡2min； 4)将膜放入10mL Blocking solution中室温温育30min； 5)将膜放入10mL Antibody solution中室温温育30min； 6)用10mL Washing buffer洗2次，每次15min； 7)在10mL Detection buffer平衡2-5min； 8)将膜放入2mL新配制的Color substrate solution(从试剂5#中取100ul到 5mL)中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡! 9)当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相 染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较标记的探针与Control DNA染色情况计算出地高辛标记的DNA的量：如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果0.1pg的对照显色，0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg 显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng 探针/ml杂交液）；如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。
Southern Blot印记杂交常见问题解析 1、针对不同的实验材料，southern杂交实验难度有差异么？答：不同的实验材料，在进行试验过程中难度差异很大，例如玉米、 小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。 (1)、物种本身的基因组较大（例如小麦），检测操作难度大 (2)、材料本身含有高糖多酚（例如葡萄）严重影响酶切操作 (3)、物种品系复杂（例如玉米），在基因组信息研究层面还不透彻。 2、核酸质量对southern杂交实验的影响 答：核酸质量对实验的影响是直接的，既要求客户提供的总量足够——实验消耗（上样量），又要求保证质量——按要求准备材料。 上样量指的是基因组DNA酶切消化后，回收后的DNA片段的量。根据 不同物种的基因组大小不同，上样量也有所区别。基因组越大，上样 量越多。例如，拟南芥大概需要3ug ，酵母3ug，人8ug，小麦15ug。酶切消化之后不能直接上样，需要回收纯化。回收会有损失，最多能 损失一半，所以需要客户提供足够量的样品，一般要求至少20 ug的 基因组DNA。（以上上样量均为一个泳道） DNA 样品一般对 OD 值和浓度有如下要求：OD260/280=1.8～2.0， OD260/230＞2.0，浓度≥100 ng/ul 。同时，需要对 DNA 样品进行琼 脂糖凝胶电泳，电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染，无降解弥散，条带清晰。（如图所示）
3、探针设计是怎么回事，有哪些原则？ 答：探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列，可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。探针设计有如下几个原则: (1)、长度适中。探针的片段长度一般控制在300-1000bp，探针太长时会导致非特异性结合的概率增加，探针太短时，探针结合的地高辛标 记物太少，会导致发光信号减弱。 (2)、特异性强。最佳的探针序列是仅与目的基因同源，与整个基因组 序列的同源片段低于30%。 (3)、ATGC含量均匀，无发卡结构和高度重复序列。
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤 FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。试验方法如下： 1）玻片处理 （a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。 （b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。 （c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。 （d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温 过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。称 量试剂勺也要干烤。塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进 行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC 水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。若为进口已处理的无RNase 和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。 （e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。 2）样品制备及其所涉及的试剂包括： （a）缓冲溶液 1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g， 溶入1000mL超纯水； 3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，
果蝇杂交实验 【实验目的】 通过实验验证分离规律、自由组合规律、伴性遗传和连锁互换规律，掌握果蝇杂交的实验技术和基因定位的三点测验方法，在实验中熟练运用生物统计的方法对实验数据进行分析。 【实验原理】 1. 果蝇（fruit fly）是双翅目（Diptera）昆虫，属果蝇属（genus Drosophila），约有3000多种，我国已发现800多种。大部分的物种以腐烂的水果或植物体为食，少部分则只取用真菌，树液或花粉为其食物。以果蝇作为遗传学研究的材料，利用突变株研究基因和性状之间的关系已近一百年，至今，各种研究遗传学的工具已达完善的地步，果蝇对今日的遗传学的发展有其不可磨灭的贡献；从1980年初，Drs. C. Nesslein-Volhard和E. Weichaus以果蝇作为发育生物学的模式动物，利用其完备的遗传研究工具来探讨基因是如何调控动物体胚胎的发育，也带动了其它模式生物（线虫、斑马鱼、小鼠和拟南芥等）的研究，且有非常具体的成果。 通常用作遗传学实验材料的是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）。用果蝇作为实验材料有许多优点： ⑴饲养容易。在常温下，以玉米粉等作饲料就可以生长，繁殖。 ⑵生长迅速。十天左右就可完成一个世代，每个受精的雌蝇可产
卵400～500个，因此在短时间内就可获得大量的子代，便于遗传学分析。 ⑶染色体数少。只有4对。 ⑷唾腺染色体制作容易。横纹清晰，是细胞学观察的好材料。 ⑸突变性状多，而且多数是形态突变，便于观察。 果蝇的生活史： 果蝇的生活周期长短与温度有密切关系。一般来说，30℃以上温度能使果蝇不育或死亡，低温能使生活周期延长，生活力下降，饲养果蝇的最适温度为20～25℃。 生活周期长短与饲养温度的关系 果蝇在25℃时，从卵到成蝇需10天左右，成虫可活26～33天。果蝇的生活史如下： 雌蝇→减数分裂→卵 受精 雄蝇→减数分裂→精子 第一批成虫 羽化（第八天） （可活26～33天）产第一批卵
Sourthern 杂交 （1）DIG-DNA标记：a）取1 μg的模板DNA加入灭菌双蒸水至16 μL体积；b）将16 μL的模板DNA置于100℃水浴变性10 min，之后迅速置于冰上冷却；c）加入4 μL混匀后的DIG-High Primer，混合均匀后离心，置于37℃水浴20 h以上；d）65℃水浴10 min终止反应。 （2）基因组DNA的酶切消化、电泳以及变性：a）用限制性内切酶酶切基因组DNA（30~60 μg），点样跑胶以较低的电压3 v/cm电泳酶切样品；c）将凝胶转移至含1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaOH的变性液中，室温轻轻振荡30 min，使凝胶中的基因组DNA变性（注意中间可以换液1次）；d）倒去变性液，用去离子水清洗3次，然后加入0.5 mol/L Tris-HCl，1mol/L NaCl（pH8.0）的中和液室温轻轻摇动洗涤30 min。 （3）DNA转膜：a）将带电荷的尼龙膜漂浮于含去离子水的平皿中，直至尼龙膜完全浸湿，然后转移至碱性转膜缓冲液（0.4M NaOH, 1M NaCl）中浸没5 min；b）在水平玻璃板放一张厚的滤纸（20 cm × 20 cm）作为滤纸条，待完全湿润后，用玻璃棒轻轻滑动以赶走气泡；c）从转膜缓冲液中取出浸泡过的凝胶，置于滤纸条的中央，用玻璃棒轻轻滑动，使得凝胶与滤纸条之间没有气泡；d）用塑料薄膜封闭凝胶的边缘，确保尼龙膜的边缘不能与滤纸条接触，然后吸取转膜缓冲液将凝胶表明湿润，再将尼龙膜置于凝胶上面，确保尼龙膜与凝胶之间无气泡；e）再取两张与尼龙膜同等大小的厚的滤纸置于尼龙膜的上面，用玻璃棒轻轻滑动赶走气泡；f）剪取一叠同等大小的纸巾置于两张滤纸上，再在上面平放一玻璃板，用400 g砝码压平稳，静置转移约12~24 h，期间需要频繁更换纸巾数次；h）弃纸巾、凝胶以及滤纸，在尼龙膜上用铅笔标记加样孔的位置以及方向，然后浸没于中和缓冲液（0.5M Tris-HCl, 1M NaCl）中，达30min，注意中间换洗1次，然后在10× SSC溶液中浸泡5min；i）将尼龙膜置于1张干净的滤纸上，自然风干；j）将尼龙膜置于紫外交联仪（70000 μJ/cm2）照射，正面朝上，使得DNA固定交联到尼龙膜上。 （4）探针杂交过程：a）将含有靶DNA的尼龙膜浸于盛有6×SSC的平皿中，直至尼龙膜自上而下完全浸湿，浸泡2 min；b）用镊子将尼龙膜放入杂交管中，
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册 蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A 蛋白样本提取制备 1 细胞或组织裂解 2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量 4 电泳上样样品的准备 B 电泳 1 PAGE胶的制备 2 蛋白分子量Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳 C 转膜与显色（Western Blot） 1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜 3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色 D 常见问题分析与解决方案 附录1 WB实验试剂配制方法 附录2 SDS-PAGE胶的配制
WB概述: 检测原理:
A 蛋白样本提取制备 蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤， 总体原则和注意事项： 1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 （通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品） 2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择） 3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂） 4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略） 5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。 A-1 细胞或组织裂解 A-1-1 细胞裂解 裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择* 目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒 全细胞NP-40 or RIPA（附录1）全蛋白抽提试剂盒 细胞质（可溶蛋白）Tris-HCl（附录1）胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒 线粒体蛋白提取试剂盒 细胞质（细胞骨架等不溶蛋白）Tris-Triton（附录1）蛋白分级抽提试剂盒 细胞质（磷酸化蛋白）磷酸化蛋白抽提试剂盒 细胞膜NP-40 or RIPA（附录1）膜蛋白抽提试剂盒 蛋白分级抽提试剂盒 细胞核RIPA（附录1）核蛋白抽提试剂盒 线粒体RIPA（附录1）线粒体蛋白抽提试剂盒 亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法： 1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2） 2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask). 3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中， 44℃摇动30 min 54℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力） 6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀. A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解， 2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于 -80°C， 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组 织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml). 4 4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本， 弃沉淀,