DO I :10.3724/S P.J .1096.2010.01219
电化学发光免疫检测技术研究进展
张军瑞
1,2 陈健*1 刘仲明21(华南理工大学轻工与食品学院,广州510640) 2(广州军区广州总医院医学实验科,广州510010)
摘 要 本文介绍了电化学发光的发展状况和最新研究方向,综述了近年来电化学发光免疫检测技术的应
用和研究进展,并展望了电化学发光免疫检测技术的发展前景。
关键词 电化学发光免疫检测;抗原;抗体;综述
2009 12 17收稿;2010 03 12接受
本文系国家科技支撑计划(N o .2006BAD27B04)资助
*E m ai:l fejc h en @scu t .edu .cn 1 引 言
免疫检测法具有快速、灵敏、选择性好等特点,被广泛应用于临床诊断、法医学、药物学和环境科学等领域[1~6]。近年来,随着对免疫传感器的深入研究,发展了多种检测技术,包括电化学、光学、压电检测、放
射免疫分析法和电化学发光检测法等[7~12]。其中较常用的放射免疫分析法涉及环境污染问题,酶免疫分
析法受到酶保存和检测灵敏度的限制;时间分辨荧光免疫法有光的散射和杂光的干扰等问题,限制了其在免疫方面的应用。电化学发光是一种由于电化学反应引起的化学发光现象。1960年,研究者初次详细报道了红荧烯和类缘化合物电化学发光[13~15],近年来也发表了多篇关于电化学发光的综述[16~25]。电化学
发光因检测范围宽、灵敏度高、信号干扰低、操作简单等优点已在免疫检测领域得到广泛应用[26~30]
。2 电化学发光免疫检测的研究
2.1 鲁米诺及其衍生物做标记
2.1.1 鲁米诺及其衍生物电化学发光的研究 鲁米诺在一定条件下可被一些氧化剂氧化,发生化学发光反应,辐射出最大发射波长为425n m 的化学发光。鲁米诺的衍生物主要有异鲁米诺、4 氨基已基 N 乙基异鲁米诺、N (4 氨基已基) N 乙基异鲁米诺(AHE I)和N (4 氨基丁基) N 乙基异鲁米诺(ABE I)等。虽然目前对于鲁米诺电化学发光反应机理尚未形成统一的认识,但鲁米诺及其衍生物是电化学发光最常用的发光标记物质之一,已得到广泛研究[31]。Yang 等[32]研究了ABE I 在+1.0V (Ag /AgC l)氧
化电位的碱性溶液中可以发光,加入H 2O 2可以显著增强其化学发光的强度,溶液的p H 值、H 2O 2的浓度和工作电位都对电化学发光的响应度产生影响。在最佳条件下,ABE I 的检测范围为1.3 10
-6~6.5 10-12m o l/L ,在信噪比(S /N )为3时,ABE I 的检出限为2.2 10-12m o l/L 。最近,Chu 等[33]研究
了中性溶液中反应氧对鲁米诺电化学发光强度的影响,结果显示,反应氧无论是溶解于溶液中还是固定在常规的电极表面,都可以显著增强鲁米诺的化学发光信号。
近年来,人们通过各种方法提高电化学发光的检测灵敏度,包括使用新的或多种标记物[34,35]、探索
新的电极材料[36~39]。Dong 等[38]的研究结果表明,在中性溶液中,鲁米诺在纳米金修饰的电极上可以
产生强烈的化学发光。发光强度不仅和纳米金有关,还受电极的影响,金电极和玻璃碳电极是比较好的电极,而且纳米金修饰的金电极和玻璃碳电极还具有良好的稳定性和重复性,并且不需要对电极做预处理。电化学发光强度还受纳米金颗粒大小的影响,用直径为16nm 的纳米金修饰电极可以产生较强烈的电化学发光。W ang 等[39]用银纳米修饰金电极,将其作为工作电极,研究了鲁米诺在中性和碱性溶液中的电化学发光,结果表明,无论在中性还是碱性溶液中,鲁米诺在银纳米修饰的金电极上都可以产生很强烈的发光,并且重复性良好。
2.1.2 鲁米诺及其衍生物做标记的电化学发光免疫检测 早期,Tanaka 等
[40]依据结合的抗原可以抑
第38卷
2010年8月 分析化学(FENX IHUAXUE) 评述与进展Ch i nese Journa l o f Ana l y ti ca l Chem istry 第8期1219~1226
制鲁米诺电化学发光的原理建立了一种电化学发光免疫分析方法检测人免疫球蛋白(hIg G )。首先将鲁米诺标记在抗体上,当加入抗原时,抗原与抗体结合,抑制其化学发光,加入的抗原的浓度和电化学发光强度减弱的程度相一致,据此可以得知加入抗原的量。此方法的检测范围是10-12~10-8g /mL 。但该方法的免疫反应达到平衡的时间较长(数小时)。此后他们又改进了方法,即优化免疫反应的条件,利用同样的原理检测了血清中的肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)
[41],检出限为10-8g /L,抗原 抗体的结合时间缩短到5m in 。由于标记后的鲁米诺其发光效率明显降低,研究者对适用于作标记的鲁米诺衍生物进行了研究。庄惠生等[42]用自制的异硫氰酸异鲁米诺(I TC I)标记AFP 抗体,包被板上进行双抗夹心免疫反应,形成免疫复合物,在电化学发光反应介质KOH KC l H 2O 2中检测发光信号,测定AFP 的线性范围为5.0~100.0 g /L ,检出限为2.0 g /L ,相对标准偏差为6.2%。此方法与放射免疫法相比,相关性良好。ABE I 是异鲁米诺的一种衍生物,是比较好的电化学发光标记物。A rail 等[43]报道了检测h I gG 的灵敏方法,以ABE I 标记h I gG 抗体,h I gG 和ABE I hIg G 抗体进行免疫反应形成刚硬结构,可以显著增强电化学发光的强度。在此基础上可以检测加入的hI gG 的浓度,检出限为8 0ng /L(S /N =2),这种检测方法的灵敏度和准确性远超过了当时常规的检测方法。Q i 等[44]用ABE I 标记人免疫球蛋白,固定在
纳米金修饰的石墨电极上,然后加入抗原,因加入的抗原与其可以形成ABE I 的刚性结构,可以显著增强电化学发光的强度,加入的抗原的浓度与化学发光强度的增加一致,其检测线性范围为3.0 10
-11~1.0 10-9g /mL ,检出限为1 10-18g /L(S /N =3)。此研究结果表明,以纳米金修饰电极的均质免疫检
测是提高标记物和免疫检测灵敏度的有效方法。2009年,T i a n 等[45]也以纳米金修饰金电极,ABE I 标记
人免疫球蛋白的第二代抗体,将羊抗人免疫球蛋白固定在纳米金修饰的电极上,先加入人免疫球蛋白进行免疫反应,再加入用ABE I 标记的第二代抗体,在金电极上形成夹心式免疫复合物,电解池中加入含有H 2O 2的碳酸盐缓冲液进行检测,其检测线性范围为5.0~100 g /L ,检出限1 68 10
-6g /L(S /N =3),相对标准偏差在为3.79%(60 g /L ,n =9)。此方法简单并且灵敏度高,已成功应用于血清中h I gG 的检测。尽管此方法的检测灵敏度低于同样条件下均质的免疫检测方法[43,44],但目前均质的免疫检测方法在临床上的应用还易受到其它物质的干扰,而此方法可以通过简单的清洗电极将干扰物质除去,同时以纳米金修饰的电极作为固相载体,显著提高了检测灵敏度,因此它可以成功应用于实际血清样品中人免疫球蛋白的检测。
2.2 联吡啶钌及其衍生物做标记
2.2.1 联吡啶钌电化学发光的研究 1966年,H ercu les 等
[46]最早发现联吡啶钌(Ru(bpy )2+3)的化学发光现象,在Ru (bpy )2+3溶液中加入胺,观察到橘红色的发光。Tokel 等
[47]首次用电化学方法使Ru(bpy)2+3转为激发态,并观察到Ru (bpy )2+3
的电化学发光现象。这些开创性的工作为Ru(bpy)2+3电化学分析在分析科学中的应用奠定了基础。Ru(bpy)2+3及其衍生物是电化学发光应用最
为广泛的发光物质,由于它具有灵敏度高、稳定性好、发光效率高等特点,所以被广泛用于实际生物样品的分析检测[48,49]。目前,最常用的电化学发光体系为Ru(bpy)2+3/TPr A ,其反应机理如下:
Ru(bpy)2+3-e - Ru(bpy )3
3+TPr A-e - TPr A
+ TPr A
+ TPr A +H +TPr A +Ru(bpy)3
3+ [Ru(bpy)2+3]+Tpr A 氧化产物[Ru(bpy)2+3]* Ru(bpy)2+3+h v 近年来,人们对Ru(bpy)2+3/TPr A 体系进行了深入的研究,Chen 等
[50]研究了TPr A + 在经过电化学预处理的玻璃碳电极表面存在时间的长短对电化学发光强度的影响,当电极上的氧化物促使TPr A
+ 失去质子生成自由基TPr A 时,会极大地抑制电化学发光的强度。他们认为当Tpr A 在电极上较快的被氧化时,其氧化产物TPr A
+ 会更多的停留在电极表面,而TPr A + 失去质子的产物TPr A 易于被电极破坏掉,从而使其不能参与电化学发光的反应,导致电化学发光强度降低。最近,Jiang 等[51]在Ru(bpy)2+
3/Tpr A 体系的电解质溶液中加入嘧啶或其类似物(如喹啉)。研究表明,加入嘧啶或其类似
1220 分析化学第38卷
物可以增强发光强度,主要原因是嘧啶或其类似物可以吸附在金属电极表面,抑制电极表面被氧化。以铂电极为工作电极,电解质溶液中加入嘧啶时,其电化学发光强度至少提高了5倍;以金电极为工作电极时,可以在低电位下产生电化学发光,并且其发光强度也明显增加。尽管Ru(bpy )2+3/TPr A 共反应体系得到广泛应用,但使用TPr A 有一定的缺点[20,52~54],如有毒、易挥发、氧化速度慢,并且Ru(bpy )2+3/TPr A 的电化学发光强度在很大程度上依赖于电极的材料。因此,人们在研究能替代TPr A 的物质。L i u
等[55]研究了Ru(bpy)2+3/DBAE (2 (二正丁氨基)乙醇的电化学发光,结果表明,Ru(bpy )2+3/DB AE 体系具有明显的优越性,它可以弥补Ru(bpy)2+3/Tpr A 体系存在的不足,在免疫检测中DB AE 具有广泛的应用前景。Xue 等
[56]用Ru (bpy )2+3/DBAE 体系检测了多巴胺,其检测线性范围为5 10-10~7 10-7m o l/L ,检出限4.0 10-11m ol/L 。Y in 等
[57]将三级胺(如三乙烯四胺:TETA;N,N,N ,N 四甲基 1,4 丁二胺)作为Ru(bpy)2+3的共反应物,研究了影响其电化学发光的因素,并得到了与传统的电化学发光不同的结论,对于Ru(bpy)2+3/Tpr A 体系,由于Tpr A 溶解度较低,需在电解质溶液中加入离子液体
或表面活性剂,并用硫醇修饰电极,以提高其电化学发光的灵敏度,而对三级胺,其分子结构影响电化学发光的灵敏度,如六次甲基四胺(HMTA )的分子结构会抑制自由基的形成,使其发光效率较低,而含有羟基和羧基的共反应物可以通过改变N 的去质子化和自由基的稳定性影响电化学发光效率,这些结论可以很好地促进研究者寻找一种高效、稳定、安全、大众化的Ru(bpy )2+3共反应物。Y i n 等
[58]分别以3种氨基乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA )、氮三乙酸(NTA )和羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA )作为Ru(bpy)2+3的共反应物,研究其电化学发光,此3种共反应物对钌的检出限分别为1,60和680f m ol/L 。在最佳条件下NTA 激发钌的电化学发光效率显著高于TPA,并且与TPA 相比,NTA 毒性小、腐蚀性低、不易挥发,可以得到广泛地应用。Chen 等[59]研究电极表面的疏水性对Ru(bpy)2+3/三乙胺体系电化学
发光的影响,结果表明,电极表面的疏水基团越多,Ru(bpy)2+3的共反应物越易被氧化,并且在大多数情
况下,电化学发光强度越高,然而疏水环境会促使胺正离子失去质子,导致电化学发光效率降低。此研究对于建立高效的电化学发光免疫检测体系具有重要意义。
2.2.2 Ru(bpy)2+3衍生物作标记的电化学发光免疫检测 目前,钌衍生物中最常用的电化学发光标记物是Ru(bpy)2+3,因为它的电化学发光可在溶液中与适当的共反应物反应而产生,发射强度高且相当稳定,成为当前的研究热点。在早期,Xu 等[60]用Ru(bpy)2+
3标记前列腺特异性抗原(PSA)进行电化学发光。研究表明:发光强度和PSA 的浓度成正比,而与其质量和大小成反比。当加入PSA 抗体与其免疫反应后,由于形成的免疫复合物使其质量和大小增加,发光强度降低,据此可以得到不同类型的PSA 抗原与抗体的结合力,然后由结合力的大小可对抗原进行筛选。M iao 等[29]将金电极表面自组装成单分
子层作为载体,生物素化的抗体固定在其表面,加入C 反应蛋白抗原,再加入用Ru(bpy )2+3标记的
C 反应蛋白抗体,形成夹心式免疫复合物,组装好的金电极作为工作电极,可直接适用于未知C 反应蛋白样品的测定,其线性范围为1~24m g /L 。云雯等
[61]将兔抗人I gG 固定在金电极上,加入hIg G 和用Ru(bpy)2+
3标记的羊抗人免疫球蛋白抗体反应2h,在自制的石英皿检测池进行检测,其检测线性范围
是0.05~2m g /L ,检出限为20 g /L(3 )。此方法操作简单、耗时少、固定效率高、易于控制,不但能用于人Ig G 的检测,还能应用于其它抗原抗体的免疫检测。
纳米材料以其独特的性质为开发新型的电化学发光生物传感器提供了一种新思路。由于碳纳米管是与适当的生物分子、酶、氧化还原媒介物结合,可提高其选择性和灵敏度,在生物传感器的应用研究中得到人们的重视。W ohlstadter 等[62]用自制的含碳纳米管作为工作电极,他们将生物素化的甲胎蛋白抗体固定在自制的含碳纳米管片状物表面,加入甲胎蛋白和标记有发光物质的甲胎蛋白抗体,进行免疫反应,形成免疫复合物,此方法检测AFP 的线性范围为0.1~100nm o l/L 。该研究为定量检测系列生物相关分析物提供了一个完整的分析体系,可用于基本研究、药物分析、大样本的检测及医学诊断等。
磁微球因其独特的性质也在电化学发光免疫检测中得到了广泛的应用。如有较大的表面积,可以固定较高浓度的抗体、易于分离等。早期,N a mba 等[63]用磁微球作为固相载体检测了血清中的肿瘤标志物AFP ,首先将抗体固定在磁微球上面,加入AFP 和标记有发光物质的AFP 抗体,形成免疫复合体,1221第8期张军瑞等:电化学发光免疫检测技术研究进展
在电解池中由于磁力的作用使磁微球吸附到工作电极表面进行电化学发光,AFP 的浓度和电化学发光强度成比例。当免疫反应15m i n 后,检测AFP 的灵敏度可达到5ng /L 。此方法简单、快速、灵敏度高。
Yu 等[64]也使用磁微球作为固相载体进行电化学发光免疫检测生物标志物,进一步证明了使用磁微球进行检测不仅速度快,而且灵敏度高,可以在相关领域得到广泛地应用。这些研究采用带有磁性的聚苯乙烯微粒技术,构建了免疫反应在类似液相的均匀悬浮状态进行的方法和技术,不仅反应速度快,并且实现了游离和结合标记物的分离。
M iao 等[65]将Ru(bpy)2+3的衍生物包被在聚苯乙烯微球体内部,C 反应蛋白抗体分别固定在磁微球和聚苯乙烯微球体表面,加入C 反应蛋白,形成磁微球 抗体[抗原]抗体 聚苯乙烯微球体复合物。在检测池中由于磁力的作用使磁微球吸附在工作电极上,加入含有TPA 的缓冲液进行电化学发光,线性范围宽(10.0~10000 g /L)。此方法的检出限低于当时常规检测C 反应蛋白的自动化仪器,但由于将发光物质包被在聚苯乙烯微球体内部,在检测液中需加入有毒性的有机溶剂,使聚苯乙烯微球体溶解,将发光物质释放出来,使其在实际应用中受到限制。Yan 等[66]将磁铁固定在工作电极上,磁微球作为免疫复合物的载体吸附在工作电极表面,检测血清中P53抗体,检测的线性范围0.01~1000 g /L ,每次定量检测只需要50 L 的样品,免疫反应时间为30m in ,简单,快速,灵敏度高,并且可重复利用。但此方法在临床应用中还受到限制,因它不能对血清中的其它物质进行检测。H orn i n ger 等[67]也用磁微球作为固相载体,对血清中的TNF 抗体进行了检测,此方法准确,精密,可重复,可以作为物质药代动力学的研究,它也为检测复合基质中的生物大分子提供了一种新方法。
2007年,Zhan 等[30]提出一种新的电化学发光免疫分析方法,检测人血清中的C 反应蛋白。将发
光物质Ru(bpy)2+3注入脂质体内部,合成包被有发光物质的脂质体,C 反应蛋白抗体分别结合在磁微
球和包被有发光物质的脂质体表面,然后将C 反应蛋白、磁微球、脂质体混合,进行免疫反应,形成磁微球 抗体[抗原]抗体 脂质体免疫复合物,将复合物溶解于含有三丙胺、NaC l 和Triton X 100的缓冲溶液中,然后在电化学发光检测池进行检测,其检测线性范围0.1~10m g /L 。此方法与文献[65]相比不需要有毒的有机溶剂使发光物质释放出来,但其检测灵敏度还有待提高。2008年,Fang 等[68]提出一个新的免疫模
式对蛋白进行定量检测。他们将玻璃碳电极亲和素化,蛋白用Ru(bpy)2+3标记并生物素化,通过亲和素和
生物素的相互作用,将Ru(bpy)2+3标记的蛋白固定在玻璃碳电极上,组装好的玻璃碳电极作为工作电极,在电解池中加入含有三丙胺的缓冲溶液进行电化学发光,检测牛血清蛋白的线性范围是0.015~
7.5 m o l/L 。为了进一步验证此方法的有效性和其适合蛋白的定量检测,他们又对溶菌酶进行了检测,其线性范围为0.001~0.1g /L,检出限为0.1m g /L 。此方法将玻璃碳电极亲和素化,既有利于固定生物活性材料,又应用了生物素亲和素的放大技术,方法简单易行,可节约成本,有待进一步的发展。
2.3 其他金属鳌合物做标记
2.3.1 其他金属鳌合物电化学发光的研究 其它金属鳌合物,如Tb ,Eu ,C r ,Re 等,都可以产生电化学
发光,近年来已有很多人对它们的电化学发光进行研究。2005年,H akansson 等[69]通过阴极脉冲极化
研究了Tb( )鳌合物在M gO 电极和n ZnO A l/M g O 复合电极上的电化学发光。由于Tb( )鳌合物在电极上相对长的发光周期,可以用时间分辨电化学发光仪器对其进行检测,结果表明,M g O 电极和n ZnO A l/M g O 复合电极都可以作为Tb( )鳌合物发光的一次性工作电极。Eu( )与适当的配位基螯合,可以检测到长时间的发光信号[70]。早期,R ichter 等[71]已经对Eu( )作标记物的电化学发光进行了研究,其方法的主要缺点是不能用于纯水体系中,并且即使在无水溶液中也产生很少的光子。2006年,Ji a ng 等[72]又研究了Eu( )鳌合物在水溶液中由于热电子激发引起的时间分辨电化学发光,当Eu ( )和2,6 N ,N 二 (羧甲基)氨甲基 4 苯甲酰苯酚螯合,形成的螯合物可以产生电化学发光,但它在
A l 2O 3电极上的电化学发光强度比较弱。当加入S 2O 2-3时可以极大增强其电化学发光强度;加入
1mm o l/L S 2O 2-3时,电化学发光周期为0.94m s 。此螯合物可以作为电化学发光免疫检测的标记物,而与2,6 N ,N 二 (羧甲基)氨甲基 4 甲基苯酚螯合,形成的螯合物不会发光。L is 等[73]将Eu( )和其它物质结合,研究发现当Eu( )与四丁胺阳离子螯合,形成的螯合物可以产生最强烈的发光信号。在螯
合物溶液中加入邻二氮杂菲,发光强度和周期都明显增加。Stan i n sk i 等[74]以A l 2O 3为工作电极研究了1222 分析化学第38卷
Tb 3+,Dy 3+,Eu 3+鳌合物在水溶液中的电化学发光。研究表明,这些鳌合物产生的电子辐射主要是通过它们的配位基向金属电极的能量转移产生。
2.3.2 其它金属鳌合物作标记的电化学发光免疫检测 H eli n 等[75]利用合成的Tb( ) 2,6 b is[N,N b is(carboxy m ethy l)a m ino m ethyl] 4 benzoy l p heno l)螯合物标记人促甲状腺激素的第二代抗体,通过热氧化作用将硅片表面形成一层绝缘薄膜,其上依次加入抗体、抗原和标记有发光物质的第二代抗体进行免疫反应,用此硅片作为工作电极,在时间分辨电化学发光基础上检测其发光信号。电化学发光强度在很大范围内和促甲状腺激素成线性关系,但检出极限还有待降低。A la K le m e 等[76]等也利用热氧化作用形成的硅电极作为一次性的工作电极,用自合成的Tb( ) 1的异硫氢酸衍生物Tb( ) 1 NCS 标记C 反应蛋白抗体,在硅电极上进行的双抗夹心免疫反应,电解池中加入含有0.1%N a N 3的0.2m o l/L 硼酸(p H =7.8,H 2SO 4调节其pH 值)检测液进行电化学发光检测,得到的检出限(0.3 g /L)优于商业上的检测系统。Kul m a la [77]和Esko la [78]等都将铝电极经过特殊处理,表面被一层氧化薄膜包被,使其作为免疫复合物的固相载体,对人促甲状腺激素(TS H )进行了检测,但由于氧化薄膜包被的铝电极在水溶液中不稳定,其检测的准确性尚有待提高。
2.4 以量子点作发光物质
2.4.1 量子点电化学发光研究 量子点是由少量原子组成的准零级的纳米材料。1962年,Naka mura 等[79]针对金属超微颗粒费米面附件电子能级状态分布提出了著名的Kubo 理论。1983年,Ja i n 等[80]在市售半导体微晶掺杂的光学滤波玻璃上观察到了很高的3次非线性光学效应和快速的光响应。这一成果在光运算、全光开关和光通信等方面具有广阔的应用前景,使得量子点的研究工作引起了广泛关注。研究发现,半导体量子点具有独特的物理和化学性质,在磁学,电学,催化和化学传感等方面具有广阔的应用前景[81]。D i n g 等[82]研究发现半导体纳米晶体可以在一定的电位下被氧化和还原,并且通过一定的湮灭反应可导致相应的电化学发光过程。将电化学发光技术和新兴的纳米技术结合起来,为量子点在分析科学和生命科学中的应用开辟了一条新的途径。目前,人们找到一种高效的方法,即用适宜的配位体或受体化学修饰量子点表面,形成一种新型的纳米材料,使其作为一种光传感器检测特殊的敏感性物质。
H an 等[83]将三聚氰胺氰尿酸盐覆盖在碲化镉半导体纳米晶体的顶端,用它作为一种新型的量子点,
通过电化学发光检测水溶液中的H 2O 2,该传感器的电化学发光强度与过氧化氢的线性响应范围为0.2~10 mo l/L,检出限是0.06 m o l/L 。Jie 等
[84]已经证明了硫化镉纳米管的电化学发光;Shen 等[85]也报道了硫化锌半导体纳米晶体和共反应物S 2O 2-
8在碱性水溶液中的电化学发光。Lu 等[86]用聚酰胺 胺保护硫化镉半导体纳米晶体,与S 2O 2-8反应,可以产生强烈的电化学发光信号,并且通过改变电压脉冲的持续时
间和将扫描率提高,可以调整电化学发光的强度和稳定性。研究已经证明硫化镉量子点/碳纳米管(CNTs)混合物是电化学发光检测的一个重要前景,D i n g 等
[87]已对此混合物的电化学发光作了报道。2.4.2 量子点电化学发光免疫检测 Jie 等[88]将硒化镉量子点(CdSe QDs)/纳米管 壳聚糖/硫酸铵(APS)结合起来,研制了一种新型的电化学发光免疫传感器检测hIg G 。由于此体系有反应性胺基产生,所以它可以作为一种有效的交联剂连接生物大分子,如可以固定抗体。研究结果显示,当加入K 2S 2O 8作为共反应物时,它可以极大增强电化学发光信号,APS 催化CdSe 量子点和K 2S 2O 8反应机理如下:
CdSe NCs +n e -n CdSe - S 2O 2-8+RC 3H 7NH 2
SO 2-4+SO 4- +RC 3H 7NH 2+ CdSe - +SO 4-
CdSe *+SO 2-4CdSe *CdSe +h v
此方法检测结果和酶联免疫分析检测的结果有很大的相关性。随后他们将CdSe QDs/纳米金/前白蛋白抗体结合起来,提出一个无标记的电化学发光免疫传感器检测人前清蛋白
[89],此传感器通过免疫复合物定量抑制CdSe QD s 和S 2O 2-8反应,检出限达到 g /L 量级。Jie 等[90]又将巯代乙酸修饰的CdSe QD s/纳米金/脂蛋白抗体结合,对低浓度的脂蛋白进行检测,因脂蛋白和脂蛋白抗体特异性结合可以使发光强度降低,据此检测脂蛋白的浓度,检出限是0.006 g /L 。由于量子点的发光强度低于常规的化1223第8期
张军瑞等:电化学发光免疫检测技术研究进展
学试剂,如:鲁米诺、Ru (bpy )2+3。最近,Jie 等[91]将金电极/CdSe QDs 碳纳米管/PDDA /纳米金/h l g G 抗
体结合起来对h l g G 进行检测,线性范围0.002~500ng /L ,检出限达到0.6 g /L,显示了很高的灵敏度。综上所述,以量子点为基础的无标记的电化学发光免疫检测目前还处于初期阶段,但量子点独特的性质使其在免疫检测领域具有广泛的应用前景,有待深入研究。
3 展 望
电化学发光免疫分析具有灵敏度高、特异性强、适用面广等优点,广泛用于抗原、抗体和半抗原的免疫检测。又因其线性范围较宽,符合临床检验的需要,日益受到人们的青睐。电化学发光免疫分析技术为临床诊断和科学研究提供了一种超微量的非同位素免疫检测手段,在医学、食品、环境分析等方面具有广阔的应用前景。目前,电化学发光免疫分析已取得了一些成就,也存在一些问题,例如,将Ru 2+
配合物作为电化学发光探针标记在抗体(抗原)上;在某些体系中,这种模式不仅对探针的电化学发光性能有一定的影响,而且还影响抗原抗体的特异性结合。所以,研究者在如何提高免疫诊断的敏感性和特异性,发展新的分析技术等方面仍在不断探索。电化学发光免疫分析技术的发展趋势在于合成新的发光标记物以及建立新的免疫分析方法等,值得提及的是以纳米材料为基础的电化学发光免疫检测技术
特别引人关注,将Ru(bpy)2+3固定在碳纳米管、纳米粒、聚合薄膜上的化学和电化学发光特性,以量子
点为主体的无标记的电化学发光免疫检测技术,使其在生物医学上的具有广阔的应用前景。近年来,新的材料,如无机金属络合物薄膜、有机分子、纳米材料修饰的电极等,也将推动电化学发光进一步的发展。人们通过各种方法使电化学可视化,如扫描电化学显微镜。另一方面,人们通过酶促反应提高电化学发光检测的速度。化学发光免疫检测与微流技术的结合将会产生一种超高灵敏度的电化学发光检检方法,这些研究使电化学发光免疫检测技术在生物医学和环境科学的应用呈现美好的前景。
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Progresss of E lectroche m ilu m i nescence Immunoassay Technology
ZHANG Jun Ru i 1,2,C H E N Jian *1,L IU Zhong M i ng 2
1
(Co llege of L i ght Industry and Food Science of Sout h Ch i na Universit y of T ec hno logy,Guangzhou 510640)2(D e p ar t m ent of M edicine Laboratory,G enera lH o sp ital ,G uangzhou M ilit ary Comm and,Guangzhou 510010)
Abst ract The article introduced the deve l o p m ent status and research orien tations o f electroche m ilum i n es cence(ECL),su mm arized t h e applicati o n and research progress for e lectroche m ilu m i n escence i m m unoassay (ECLI A ).And fi n all y ,the future prospect and outlook of ECLI A w ere a lso d iscussed .
K eywords E lectroche m ilum i n escence i m munoassay ;Anti g en;An ti b ody ;Rev ie w
(Recei ved 17D ece m ber 2009;accep ted 12M arch 2010)1226 分析化学第38卷
o b e电化学发光免疫分 析仪 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
第一章系统概述 1、控制单元 A 显示器（连接cobas ） D 触摸式显示器（主机） B 键盘/鼠标（连接cobas） E 键盘/鼠标（主机） C 计算机（连接cobas） F 计算机（主机） G 人体学PC支架 2、核心单元 1）核心单元轨道 A 核心单元E 模块轨道 B 急诊标本位 F 常规标本上机位 C 条形码阅读器 G 标本退出位 D 标本架转盘 急诊标本位 A 标本架托盘 B 标本架 C 标本杯、微量杯2）标本架及标本容器 标本架类型标本架颜色标本架ID号软件中显示标本架上标签 常规标本架灰色5001-8999001-3999001-3999 STAT标本架红色4001-4999E001-E999S001-S999
标本试管直径为13mm或16mm，长度为75mm或100mm；标本杯可插入16 mm标本试管中用。 A 标本架上的标本杯 D 16mm×100mm试管 B 16mm×75mm试管 E 16mm×100mm试管上的标本杯 C 16mm×75mm试管上标本杯 3、cobas e 601免疫分析模块 e 601模块主要部件如下： A 预清洗区 C 测量区 E 系统试剂区（在前门后面） B 试剂区 D 耗品区 B 试剂区各部件 A 试剂盘 D 磁珠搅拌棒 F 试剂针 B 条件码阅读器 E 磁珠搅拌棒冲洗站 G 试剂针冲洗站 C 试剂盖开/关 H 探针清洗站 I 试剂注射器
C 测量区各部件 A 标本针 E 标本注射器 B 孵育盘 F sipper 注射器 C sipper 针 D sipper 冲洗站 D 耗品区 A 抓手 E TIP/CUP 盒升降器 B 涡流混合站 F TIP/CUP 丢弃袋 C TIP/CUP G TIP/CUP 盒丢弃区 D 指示灯 指示器灯“亮”时 抽屉可安全打开 指示器灯“灭”时 抽屉严禁打开 E 系统试剂区 第二章 软件系统简介 1、系统状态概览 2、日常工作菜单 仪器 各部件 温度 打印预览 Preclean Procell cleancel l 当更换三种系统试剂的任一种时，长按相对应的绿色按键 报警 试剂查看 取消保养 工作区 试剂 定标 质控 应用设定
罗氏电化学发光免疫分 析 标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
罗氏电化学发光免疫分析 技术是罗氏公司开发的，但全自动机械制造却由日本的日立公司承担，所以仪器上还有Hitachi的标志。这个仪器让大家吃惊的一大原因就在于一直在实验室研究的电致化学发光居然已经真正地产业化了，其中我们一直无法解决的诸多问题（尤其是重现性）均已得到解答，看来罗氏的确花了不少心血开发这款仪器。 罗氏电化学发光免疫分析技术的性能特点——创新的技术，与众不同 一、最先进的检测原理 电化学发光免疫测定，是目前最先进的标记免疫测定技术，是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，具有敏感、快速和稳定的特点，在固相标记免疫测定中技术上居领先地位。 电化学发光（ECL）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上是电化学和化学发光两个过程的完美结合。电化学发光与普通化学发光的主要差异在于前者是电启动发光反应，循环及多次发光，后者是通过化合物混合启动发光反应，是单次瞬间发光。因此ECL反应易精确控制，重复性极好。 电化学发光免疫测定是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物，直接以[Ru(bpy)3]2+标记抗体，反应时标记物直接发光。且[Ru(bpy)3]2+在电极表面的反应过程可以周而复始进行，产生许多光子，使光信号得以增强。 二、专利的包被技术 链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，特异性强且结合紧密。一分子SA可与四分子B 相结合，增大了抗体结合量，达到放大效果。在ECL的试剂中，SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体，另一试剂为活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时，抗原或抗体即包被在磁性微粒上。
荧光和化学发光免疫分析方法 免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应， 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。 一、免疫 免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。 特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义 抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。 抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类
完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。 半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质 决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义 抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。 人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合
第一章化学发光技术 一、免疫学检测发展阶段 免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。我国免疫学的检测基本历经了以下几个过程，如图1.1所示。 20世纪60年代70年代90年代时间 图1.1免疫学检测发展阶段 尽管免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位，但是从我国临床免疫诊断现状来看，无论是临床应用方面，还是产业化角度，都处于相对比较落后的状态，亟待改进。下表１.１就此做一比较： 表1.1 中国免疫诊断现状 由以上分析不难看出，化学发光免疫检测是大势所趋；而取代进口，发展我国的化学发光检测事业，
正是临床检验界着手发展的方向。由此，我公司自1998年立项至今，致利于化学发光检测方案设计，自行开发了具有国内领先水平的化学发光底物，与国外知名检测仪器生产商联合开发了化学发光全自动、半自动检测仪，并自行设计开发了化学发光管理软件，而今形成了仪器、试剂、软件全面配套，为我国的临床检验界提供了一套完善的解决方案。 二、化学发光免疫分析技术 【概述】 本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫（RIA）和酶免疫（EIA）相似，不同这处是以发光物质代替放射性核素或酶作为标记物，并藉助其自身的发光强度直接进行测定。 化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂，试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。 【原理】 在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术（ELISA），常采用双抗体夹心法、竞争法、间接法等反应模式，如图1.2，1.3，1.4所示。 如图1.2双抗体夹心法反应原理示意图
化学发光免疫分析技术原理简介 20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查。1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。1996 年推出的电化学发光免疫技术，在反应原理上又具有一些新的特点。这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。 一、化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。在CLIA中，主要有两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺(isolu-minol) 、金刚烷( AMPPD) 及吖啶酯( AE) 等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析) ，经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。亦可将氧化剂(如碱性磷酸酶等)或催化剂标记于抗原或 抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应，其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短，仅需30 - 60min 即可。试
化学发光免疫类体外诊断试剂（盒）产品技 术审评规范（2017版） 本规范旨在指导注册申请人对化学发光免疫类体外诊断试剂(盒)产品注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本规范是对化学发光免疫类体外诊断试剂(盒)产品的一般要求，申请人应依据具体产品的特性对注册申报资料的内容进行充实和细化，并依据产品特性确定其中的具体内容是否适用。 本规范是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本规范。 本规范是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本规范相关内容也将进行适时调整。 一、适用范围 本规范适用于利用化学发光免疫分析技术对被测物质进行定量检测的第二类体外诊断试剂（包括以微孔板、管、磁颗粒、微珠和塑料珠等为载体的酶促及非酶促化学发光免疫分析测定试剂）的注册技术审查。 依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称《办法》）、《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管〔2013〕
242号）化学发光免疫类体外诊断试剂(盒)产品分类代号为6840。 二、注册申报资料要求 （一）综述资料 综述资料主要包括产品预期用途、临床意义、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，应符合《办法》和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。 （二）主要原材料研究资料（如需提供） 主要原材料（例如各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等标记用酶、磁微粒及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验验证研究资料；校准品、质控品的原料选择、制备、赋值过程及试验资料；校准品的溯源性文件，包括具体溯源链、实验方法、数据及统计分析等详细资料。 （三）主要生产工艺及反应体系的研究资料（如需提供） 1.主要生产工艺介绍，包括工作液的配制、分装和冻干,固相载体的包被和组装，发光系统等的描述及确定依据等，可以图表方式表示； 2.反应原理介绍； 3.确定反应所需物质及其用量（校准品、样本、试剂等）的研究资料； 4.确定反应最适条件研究（反应条件、校准方法、质控方法）；
罗氏电化学发光免疫分析 技术是罗氏公司开发的,但全自动机械制造却由日本的日立公司承担,所以仪器上还有Hitachi的标志。这个仪器让大家吃惊的一大原因就在于一直在实验室研究的电致化学发光居然已经真正地产业化了,其中我们一直无法解决的诸多问题(尤其是重现性均已得到解答,看来罗氏的确花了不少心血开发这款仪器。 罗氏电化学发光免疫分析技术的性能特点——创新的技术,与众不同 一、最先进的检测原理 电化学发光免疫测定,是目前最先进的标记免疫测定技术,是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术,具有敏感、快速和稳定的特点,在固相标记免疫测定中技术上居领先地位。 电化学发光(ECL是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,实际上是电化学和化学发光两个过程的完美结合。电化学发光与普通化学发光的主要差异在于前者是电启动发光反应,循环及多次发光,后者是通过化合物混合启动发光反应,是单次瞬间发光。因此ECL反应易精确控制,重复性极好。 电化学发光免疫测定是电化学发光(ECL和免疫测定相结合的产物,直接以[Ru(bpy3]2+标记抗体,反应时标记物直接发光。且[Ru(bpy3]2+在电极表面的反应过程可以周而复始进行,产生许多光子,使光信号得以增强。 二、专利的包被技术 链霉亲和素(streptoavidin,SA和生物素(biotin,B是具有很强的非共价相互作用的一对化合物,特异性强且结合紧密。一分子SA可与四分子B 相结合,增大了抗体结合量,达到放大效果。在ECL的试剂中,SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上,形成通用的能与B结合的固相载体,另一试剂为活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时,抗原或抗体即包被在磁性微粒上。 三、独特的载体
化学发光免疫分析技术题库1-0-8
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]化学发光剂必须具备的条件错误的是（） A.其物理、化学特性要与被标记或测定的物质相匹配 B.能与抗原或抗体形成稳定的耦联结合物 C.其化学发光常是还原反应的结果 D.在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性 E.发光的量子产量高 能作为化学发光剂的有机化合物必须具备下列条件：发光的量子产量高；它的物理、化学特性要与被标记或测定的物质性匹配；能与抗原或抗体形成稳定的耦联结合物；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列不会影响标记的因素是（） A.被标记蛋白质的性质 B.原料比 C.温度 D.湿度 E.标记率 影响标记的因素包括：①发光剂的选择。②被标记蛋白质的性质。抗原作为被标志物时，应具有较高的纯度和免疫学稳定性；抗体作为被标志物时，则要求具有较高的效价，应用提纯的IgG来代替全血清。③标记方法的选择应正确选择与发光剂和被标志物结构相适应的耦联方式。④原料比。在制备发光剂-IgG抗体结合物时，IgG：发光剂：交联剂的克分子比mol：mol：mol会影响结合物的发光效率。⑤标记率。是指结合物中IgG与发光剂之间的克分子比。由于每一种发光剂对应于被标志物都有特定的最佳标记率，标志物选择不好，会出现不易保存等现象。⑥温度。控制标记时的反应温度极为重要，对于较稳定的小分子被标志物，温度可稍放宽些；而当被标志物是抗原或抗体蛋白质时，由于蛋白质对热的不稳定性，应在保证标记反应进行的前提下，尽量选择较低的温度，以避免蛋白质在标记过程中活性的丧失。⑦纯化与保存。多数经耦联反应制备的结合物，使用前都需进行纯化，除去未结合的发光剂和交联剂。结合物一般可分装保存在-70℃条件下，最好冷冻干燥保存。
总甲状腺素（TT4）测定试剂盒（电化学发光免疫分析法） 适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人体血清样本中总甲状腺素（TT4）的含量。 1.1产品型号/规格：100人份/盒、200人份/盒。 1.2主要组成 试剂盒由磁分离试剂（M）、试剂a（Ra）、试剂b（Rb）和定标品（TT4-Cal）（选配）组成。组成及含量如下： 2.1 外观 2.1.1 试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏； 2.1.2 磁分离试剂摇匀后应为棕色含固体微粒的均匀悬浊液，无明显凝集、无絮状物； 2.1.3 其它液体组分应澄清，无异物，沉淀物或絮状物； 2.1.4 包装标签应清晰、无磨损、易识别。 2.2 空白限 应不大于0.420μg/dL 。 2.3 准确度 用T4国家标准品（150551）进行检测，实测值与理论值之比应在0.850-1.150之间。 2.4 线性 在[1.0，24.86]μg/dL范围内，线性相关系数的绝对值（|r|）应不小于0.9900。 2.5 精密度 2.5.1 分析内精密度
在试剂盒的线性范围内，浓度为（5.0±1.0μg/dL）和（20.0±4.0μg/dL）的样品检测结果的变异系数（CV）应不大于8%。 2.5.2 批间精密度 在试剂盒的线性范围内，用3个批号试剂盒分别检测浓度为（5.0±1.0μg/dL）和（20.0±4.0μg/dL）的样品，检测结果的变异系数（CV）应不大于15%。 2.6 特异性 2.6.1与三碘甲状腺原氨酸（T3） 测定浓度不低于500ng/mL的T3样品，其测定结果应不高于1.5μg/dL； 2.6.2 与反三碘甲状腺原氨酸（rT3） 测定浓度不低于50ng/mL的rT3样品，其测定结果应不高于1.5μg/dL。 2.7 效期末稳定性 本产品效期为15个月，试剂盒在2～8℃下保存至有效期末进行检测，检测结果应符合2.1、2.2、2.3、2.4、2.5.1的要求。 2.8 溯源性 依据GB/T21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求，校准品溯源至国家标准品（编号150551）。
常见化学发光免疫分析技术比较 1、化学发光免疫分析 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，英音：[,kemi,lju:mi'nes?ns] [,imju:n?u?'sei] 是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 1.1、化学发光免疫分析原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hv) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。 1.2、化学发光免疫分析类型
化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种: (1)化学发光标记免疫分析法; (2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法 1.2.1化学发光标记免疫分析 化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) , 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester (AE) , 是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法, 大分子抗原则采用夹心法, 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。 1.2.2化学发光酶免疫分析 从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。 12.2.1HRP 标记的CLEIA
罗氏电化学发光免疫分析总结 罗氏电化学发光免疫分析总结 技术是罗氏公司开发的，但全自动机械制造却由日本的日立公司承担，所以仪器上还有Hitachi的标志。这个仪器让大家吃惊的一大原因就在于一直在实验室研究的电致化学发光居然已经真正地产业化了，其中我们一直无法解决的诸多问题（尤其是重现性）均已得到解答，看来罗氏的确花了不少心血开发这款仪器。 罗氏电化学发光免疫分析技术的性能特点——创新的技术，与众不同 一、最先进的检测原理 电化学发光免疫测定，是目前最先进的标记免疫测定技术，是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，具有敏感、快速和稳定的特点，在固相标记免疫测定中技术上居领先地位。电化学发光（ECL）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上是电化学和化学发光两个过程的完美结合。电化学发光与普通化学发光的主要差异在于前者是电启动发光反应，循环及多次发光，后者是通过化合物混合启动发光反应，是单次瞬间发光。因此ECL反应易精确控制，重复性极好。 电化学发光免疫测定是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物，直接以[Ru(bpy)3]2+标记抗体，反应时标记物直接发光。且[Ru(bpy)3]2+在电极表面的反应过程可以周而复始进行，产生许多光子，使光信号得以增强。 二、专利的包被技术 链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）是具有很强的非共价相互作用的'一对化合物，特异性强且结合紧密。一
分子SA可与四分子B相结合，增大了抗体结合量，达到放大效果。在ECL的试剂中，SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体，另一试剂为活化的B 衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时，抗原或抗体即包被在磁性微粒上。 三、独特的载体 ECL中采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8?m的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积极大，比板式扩大20－30倍，使反应在近乎液相中进行，反应速度大大加快，利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结合态和游离态，方便迅速，实现了精确的全自动化。 四、独到的磁分离技术 实现了结合相和游离相的完全自动化分离，且检测池在无电场时彻底清洗，避免了交叉污染。 五、超高的测定灵敏度和测定线性 发光信号检测的宽线性加上电化学发光独特的标记物本身（发光底物）循环发光和专利的链霉亲和素-生物素包被技术的信号放大作用，使电化学发光测定的检测下限可达10-12和10-18级，线性范围最大超越7个数量级，在待测抗原（抗体）极微量或达到病理期极限时，均能准确测定，避免了样本稀释重测定，既节约时间，又节省试剂。 六、稳定的试剂 电化学发光标记物三联吡啶钌在无电场和递电子体（三丙胺）存在的自然环境下非常稳定，保证了用它标记的抗体（抗原）试剂也非常稳定，2－8℃可稳定一年以上，批内和批间变异系数分别为<4%和<7%，在首日使用之后也可以稳定3个月。 七、简便创新的定标概念 每个测定项目的基本定标曲线已由罗氏公司完成，并已存入试剂的二维条形码，自动读入仪器，用户只需进行二点重定标即可。
全自动化学发光免疫分析仪 技术审查指导原则 （第一次征求意见稿） 一、前言 本指导原则旨在指导注册申请人对全自动化学发光免疫分析仪注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是对全自动化学发光免疫分析仪的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
二、适用范围 化学发光免疫分析根据化学发光物质的类型和发光特点，可分为电化学发光免疫分析和化学发光免疫分析，其中化学发光免疫分析根据发光剂的不同，可分为直接化学发光免疫分析、酶促化学发光免疫分析和鲁M诺氧途径免疫分析。目前，各类型化学发光免疫分析的常见发光剂包括：电化学发光剂为三联吡啶钌[（）]，直接化学发光剂为吖啶酯（），酶促化学发光剂为辣根过氧化物酶（）催化鲁M诺（氨基苯二甲酰肼，）及其衍生物或者碱性磷酸酶催化（′螺旋金刚烷）甲氧基（″磷酰氧基）苯二氧杂环丁烷（），鲁M诺氧途径发光剂为酞箐、二甲基噻吩衍生物及螯合物。 化学发光免疫技术根据反应过程中标记物是否需要分离可分为均相反应和非均相反应。均相反应主要应用于鲁M 诺氧途径免疫分析中，而非均相反应则应用于其他类型化学发光免疫分析中，通过采用固相分离、过滤分离、珠式分离、顺磁性颗粒分离等方式实现游离标记物和免疫复合物标记物的分离，其中顺磁性颗粒分离较其他分离方式更为常用。目前，基于鲁M诺氧途径免疫分析原理的产品还比较少，临床常用的全自动化学发光免疫分析仪更多地采用非均相反应模式。 本指导原则适用于采用上述化学发光免疫技术和反应
第一章系统概述 1、控制单元 A 显示器（连接cobas ） D 触摸式显示器（主机） B 键盘/鼠标（连接cobas） E 键盘/鼠标（主机） C 计算机（连接cobas） F 计算机（主机） G 人体学PC支架
2、核心单元 1）核心单元轨道 A 核心单元 E 模块轨道 B 急诊标本位 F 常规标本上机位 C 条形码阅读器G 标本退出位 D 标本架转盘
急诊标本位 A 标本架托盘 B 标本架 C 标本杯、微量杯
2）标本架及标本容器 标本架不同类型、颜色和相应编号如下： 标本架类型标本架颜色标本架ID号软件中显示标本架上标签 常规标本架灰色5001-8999 001-3999 001-3999 STA T标本架红色4001-4999 E001-E999 S001-S999 定标标本架黑色2001-2999 S001-S999 C001-C999 QC标本架白色3001-3999 C001-C999 Q001-Q999 保养标本架绿色B999 B999 W999 标本容器有三种类型：标本试管、标本杯、定标及质控小瓶 标本试管直径为13mm或16mm，长度为75mm或100mm；标本杯可插入16 mm标本试管中用。 A 标本架上的标本杯 D 16mm×100mm试管 B 16mm×75mm试管 E 16mm×100mm试管上的标本杯 C 16mm×75mm试管上标本杯 3、cobas e 601免疫分析模块
e 601模块主要部件如下： A 预清洗区 C 测量区 E 系统试剂区（在前门后面） B 试剂区 D 耗品区 B 试剂区各部件
本文由：华夏学术传媒网提供https://www.doczj.com/doc/2115574008.html, 摘要：本文根据各化学发光免疫分析方法所使用标记物质的不同，将化学发光免疫分析方法分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法，并对各方法经典标记物质及分析方法原理进行了分析。同时，介绍了化学发光免疫分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用进展情况。 关键词：化学发光免疫分析；分类；研究进展 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析［1］。 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的［2］。 一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。 1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。 2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。（二）化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强
皮质醇(Cortisol)测定试剂盒（电化学发光免疫分析法） 结构组成： 试剂盒由磁分离试剂（M）、试剂a（Ra）、试剂b（Rb）和定标品（Cortisol-Cal）（选配）组成。组成及含量见下表： 预期用途：本试剂盒用于体外定量测定人体血清样本中皮质醇（Cortisol）的含量。 2.1 外观 2.1.1 试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏； 2.1.2 磁分离试剂摇匀后应为棕色含固体微粒的均匀悬浊液，无明显凝集、无絮状物； 2.1.3 其它液体组分应澄清，无异物，沉淀物或絮状物； 2.1.4 包装标签应清晰、无磨损、易识别。 2.2 空白限 应不大于0.5nmol/L。 2.3 准确度 将已知浓度的Cortisol标准溶液加入到血清中，其回收率应在(85%～115%)范围内。 2.4 线性 在[2.0，1750.0]nmol/L范围内，线性相关系数（r）应不小于0.9900。 2.5 精密度 2.5.1 重复性
在试剂盒的线性范围内，检测高、低两个水平的样品,检测结果的变异系数（CV）应不大于8%。 2.5.2 批间差 在试剂盒的线性范围内，用3个批号试剂盒分别检测高、低两个水平的样品，检测结果的变异系数（CV）应不大于15%。 2.6 效期末稳定性 本产品效期为15个月，试剂盒在2～8℃下保存至有效期末进行检测，检测结果应符合2.1、2.2、2.3、2.4、2.5.1的要求。 2.7 溯源性 依据GB/T 21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求提供皮质醇（Cortisol）定标品的来源、赋值过程以及测量不确定度等内容，定标品溯源至企业工作校准品。
化学发光免疫分析技术题库1-2-10
问题： [单选]标本为组织切片的细胞表面粘附分子最常用的测定方法是（） A.酶免疫组织化学方法 B.免疫荧光方法 C.流式细胞仪 D.化学发光免疫测定方法 E.时间分辨荧光免疫测定方法
问题： [单选]细胞外可溶性粘附分子的最常用的测定方法是（） A.原位PCR B.原位RT－PCR C.化学发光免疫测定方法 D.RT－PCR E.ELISA
问题： [单选]下列有关化学发光错误的说法是（） A.化学发光是指伴随着化学反应过程所产生的光的发射现象 B.化学发光与荧光形成激发态分子的激发能相同 C.化学发光是吸收了化学能使分子激发而发射的光 D.大多数化学发光反应为氧化还原反应 E.化学发光必须提供足够的化学能 化学发光是吸收了化学能使分子激发而发射的光，而荧光是吸收了光能使分子激发而发射的光。https://www.doczj.com/doc/2115574008.html,/ 电竞之家
问题： [单选]化学发光免疫测定的发光剂不包括（） A.鲁米诺 B.吖啶酯 C.碱性磷酸酶 D.异鲁米诺 E.三联吡啶钉 除选项C外，其余均可作为化学发光免疫测定的发光剂。
问题： [单选]下列关于化学发光效率说法错误的是（） A.又称化学发光反应量子产率 B.发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率 C.发光效率决定于激发态分子发射效率 D.发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质决定 E.所有的发光反应都具有相同的化学发光效率 每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。
睾酮(Testosterone)测定试剂盒（电化学发光免疫分析法） 适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人体血清样本中睾酮（Testosterone）的含量。 1.1包装规格：50人份/盒、100人份/盒。 1.2主要组成成分 试剂盒由磁分离试剂（M）、试剂a（Ra）、试剂b（Rb）和定标品（Testosterone-Cal）（选配）组成。组成及含量见下表： 注：1、定标品靶值批特异，详见靶值单。 2、试剂盒条码卡内含主校准曲线。 2.1 外观 2.1.1 试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏； 2.1.2 磁分离试剂摇匀后应为棕色含固体微粒的均匀悬浊液，无明显凝集、无絮状物； 2.1.3 其它液体组分应澄清，无异物，沉淀物或絮状物； 2.1.4 包装标签应清晰、无磨损、易识别。 2.2 空白限
应不大于0.025ng/mL。 2.3 准确度 将已知浓度的Testosterone标准溶液加入到血清中，其回收率应在(85%～115%)范围内。 2.4 线性 在[0.10，15.0]ng/mL范围内，线性相关系数（r）应不小于0.9900。 2.5 精密度 2.5.1 分析内精密度 在试剂盒的线性范围内，浓度为（1.0±0.2ng/mL）和（5.0±1.0ng/mL）的样品检测结果的变异系数（CV）应不大于8%。 2.5.2 批间精密度 在试剂盒的线性范围内，用3个批号试剂盒分别检测浓度为（1.0±0.2ng/mL）和（5.0±1.0ng/mL）的样品，检测结果的变异系数（CV）应不大于15%。 2.6 效期末稳定性 本产品效期为15个月，试剂盒在2～8℃下保存至有效期末进行检测，检测结果应符合2.1、2.2、2.3、2.4、2.5.1的要求。 2.7 溯源性 依据GB/T21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求提供睾酮（Testosterone）定标品的来源、赋值过程以及测量不确定度等内容，定标品溯源至企业工作校准品。
引进全自动化学发光免疫分析仪可行性报告书 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
引进全自动化学发光免疫分析仪可行性报告书尊敬的各位领导： 随着检验技术快速的发展，在免疫检测项目方面也取得了很多优秀的成果。全球临床的实践验证，化学发光免疫分析技术由于其检测速度快、检测结果性能好、操作简单、等优点目前已成为全球最经典最先进的检测技术。 随着未来医院的不断发展壮大，考虑到医院的长期效益，我科需求一台全自动化学发光免疫分析系统，更好的满足临床诊疗工作的需要。 一、引进理由 1、引进先进医疗设备、提高医疗市场竞争力的需要，并且周边医院都有同类似的仪器（大英、河边镇中心卫生院、安居区人民医院）。 2、根据多数医院的了解，该设备都能取得良好的经济效益和社会效益。因此引进全自动化学发光仪是提高工作效率和检验质量的必需条件。 3、据统计，医院临床科室许多诊断依据来自，现在医学非常强调循证医学，作为窗口科室，先进的检验仪器有助于提高临床诊断率，提升医院在本地区的档次和地位，树立良好的社会形象。 4、提升经济效益、促进医院整体发展的需要
是个含金量极高的科室。据统计分析，收入普遍占医院总收入的8-12％，如引进全自动化学发光仪后，据了解，纯利可达45％左右。增大了临床要求和目前激烈的市场竞争需求 5、为临床快速提供检验结果的需要 全自动化学发光免疫分析仪测试速度高达100---180测试/小时，回报及时准确，并且对急诊项目设有急诊功能。 6、为临床提供全面检测项目的需要 全自动化学发光免疫分析仪可提供全面的检测项目，项目包涵：肿瘤、激素、甲状腺功能、心肌梗塞等多项。可灵活方便地分系统设置项目组合，大大方便临床诊断。 7、检验质量质控的需要 全自动化学发光免疫分析仪由仪器自动采样、加样并自动检测，采用独立试剂包，最大限度减少手工加样、试剂线性、交叉污染等因素对检验结果的影响，精密度、准确度都非常高。 二、经济效益分析 简单测算如下： 在收费价格方面，了解本地的情况是：我院每年住院病人是3000多人，每人只做两对半，年收入达30多万元，成本预计55%，年纯收入：150000元左右通过上述测算估计，引进全自动化学发光免疫分析仪效益可观。
胰岛素(Insulin)测定试剂盒（电化学发光免疫分析法） 适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人体血清样本中胰岛素（Insulin）的含量。 1.1包装规格：50人份/盒、100人份/盒。 1.2主要组成成分 试剂盒由磁分离试剂（M）、试剂a（Ra）、试剂b（Rb）和定标品（Insulin-Cal）（选配）组成。组成及含量见下表： 注：1、定标品靶值批特异，详见靶值单。 2、试剂盒条码卡内含主校准曲线。 2.1 外观 2.1.1 试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏； 2.1.2 磁分离试剂摇匀后应为棕色含固体微粒的均匀悬浊液，无明显凝集、无絮状物； 2.1.3 其它液体组分应澄清，无异物，沉淀物或絮状物； 2.1.4 包装标签应清晰、无磨损、易识别。 2.2 空白限
应不大于0.20μU/mL。 2.3 准确度 用Insulin国家标准品或国家标准品标化的企业参考品进行检测，其测量结果的相对偏差应在±10%范围内。 2.4 线性 在[1.0，1000.0]μU/mL范围内，线性相关系数（r）应不小于0.9900。 2.5 精密度 2.5.1 批内精密度 在试剂盒的线性范围内，浓度为（5.0±1.0μU/mL）和（100.0±20.0μU/mL）的样品检测结果的变异系数（CV）应不大于8%。 2.5.2 批间精密度 在试剂盒的线性范围内，用3个批号试剂盒分别检测浓度为（5.0±1.0μU/mL）和（100.0±20.0μU/mL）的样品，检测结果的变异系数（CV）应不大于15%。 2.6 特异性 2.6.1 与胰岛素原（Pro-insulin） 浓度不低于10ng/mL的胰岛素原（Pro-insulin）样本，在本试剂盒测定结果应不大于3.0μU/mL； 2.6.2 与C-肽（C-Peptide） 浓度不低于20ng/mL的C-肽（C-Peptide）样本，在本试剂盒测定结果应不大于3.0μU/mL； 2.7 效期末稳定性