磁珠法提取DNA试剂盒
磁珠法提取DNA试剂盒，它是生物科学和纳米材料科学二者合一的高新技术产品，是我国DNA提取技术和纯化技术的一次大的突破，它彻底的解决了我国DNA的提取与纯化长期依赖进口的局面，其价格只有进口产品的1/3。
中文名
磁珠法提取DNA试剂盒
属性
高新技术产品
学科
生物科学和纳米材料科学二者合一
贡献
一次大的突破
价格
进口产品的1/3
技术现状
两个问题
目录
1背景
2DNA提取技术现状
3发展历程
4适用范围
5优势
1背景
众所周知,DNA提取技术是分子生物学研究的基础技术。提取DNA的纯度及结构的实验，是进行基因工程各项研究所必须的条件，DNA提取技术是DNA检验的第一步骤，也是最关键的步骤。能否成功地进行DNA检验，完全取决于能否从生物检材中获得纯量的DNA。DNA提取技术的优劣，将直接关系下游实验的安全与成败。
2DNA提取技术现状
就我国的DNA提取技术现状来讲，主要存在以下两个问题：
1，技术发展滞后。现在采用的DNA提取技术仍然停留chelex—100法。有机提取法等常规方法上，存在着提取DNA不纯、耗时、效率低，不能定量提取和DNA提取后扩增成功率低等诸多缺陷。
2，缺少自主的知识产权。美国、德国、挪威、芬兰等国家的生物公司，这些年来相继开发的新的DNA提取试剂盒，成功的解决了DNA提取纯化和定量提取等很多的难题，尤其是
磁珠法可以实现自动化提取的技术更加的诱人。但由于这些试剂盒基于专利技术，价格昂贵，不可能在国内推广使用。应用于建立DNA数据库所需大量的生物样本的提取，更是可望不可及的事情。
3发展历程
2005年7月25日，磁珠法提取DNA试剂盒在公安部第三期法医物证检验技术推广班上受到参会百余名专家学者的一致认可。
2005年11月30日，磁珠法提取DNA试剂盒通过公安部刑事技术产品质量监督检验中心检验。
2005年8月12日，磁珠法提取DNA试剂盒在教育部、初高中生物实验课经验交流会议上受到来自生物实验课知道老师的一致认可和好评。
2006年3月，中国动植物检验检疫所、国家质检总局食品安全局，农业部食品局达成意向，由动植物检验检疫研究所牵头，用磁珠法提取DNA试剂盒进行食品和实用油脂中转基因植物成分定性检测、试验。
4适用范围
磁珠法提取DNA试剂盒是纳米技术、分子生物学技术、生物医学技术和法医学技术的综合高科技产品。可广泛应用于分子生物学中的基因组研究、分子进化研究、医学中遗传病的研究、突变基因的检测、肿瘤的筛查、HPV等的检测、HLA分型、移植配型等、法医学生物样本血斑、精斑、头发、烟蒂等现场证物的检测、和司法上的亲子鉴定、血缘关系的鉴定等提供证据、考古学、大中小学的生物试验等许多领域。磁珠法提取DNA试剂盒要比传统的方法，例如：Chelex100 法、有机法、二氧化硅法、盐析法等更为简单、方便，转移离心管的次数较少，不易污染等。磁珠法在DNA纯化、微量检裁及PCR扩增等方面是其它方法不可代替的。
5优势
独特的裂解液/蛋白酶K迅速裂解细胞并灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA选择性吸附于磁珠，再通过一系列快速的漂洗-分离的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后用双蒸水即可将纯净基因组DNA从磁珠上洗脱。
产品特点：
·不使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤，而且省去了离心步骤。
·快速简捷，一般可在36分钟内完成。
·不用多次漂洗磁珠也可确保高纯度，提取出的基因组DNA OD260/OD280典型的比值达1.7-1.9，
长度可达2 0 k b - 5 0 k b，可直接用于P C R、Southern-blot和各种酶切反应。
·洗脱液可以用双蒸水代替，不影响下游酶切、连接等反应。
·适用范围：
新鲜植物、动物组织，高温干燥过 DNA破坏比较严重的植物、动物组织，海洋生物，法医鉴定，新鲜哺乳动物血液或干血点，转基因食品
·产品储存：
·所有试剂均可室温保存
·有效期达180天以上
磁珠法核酸提取
背景编辑
自沃森、克里克的DNA双螺旋模型诞生，生物学进入到了一个全新的时代，在生物学界言必DNA，论必中心法则，对DNA的提取成为生物医药领域甚至农林牧渔等领域内所有学科科学研究的基础，随着基因诊断、转基因食品检测、个性化医疗等的快速发展，现在的核酸提取技术已经不能够满足当今生物技术的需要，急需能够高通量、自动化的核酸提取方法。
在这种背景下，磁珠法核酸提取应运而生(资料来源：惠尔纳米)。
2磁珠法核酸提取简介编辑
磁珠法核酸提取试剂盒，是生物科学和纳米材料科学二者合一的高新技术产品，是我国核酸提取纯化技术的一次大的突破，它彻底的解决了我国核酸提取纯化长期依赖进口的局面。
磁珠法核酸提取，具有传统DNA提取方法无法比拟的优势，主要体现在[1-2]：①能够实现自动化、大批量操作，目前已有96孔的核酸自动提取仪，用一个样品的提取时间即可实现对96个样品的处理，符合生物学高通量的操作要求，使得传染性疾病爆发时能够进行快速及时的应对，这一特点使得传统方法望尘莫及；②操作简单、用时短，整个提取流程只有四步，大多可以在36-40分钟内完成；③安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害减少到最少，完全符合现代环保理念；④磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。
3磁珠法核酸提取原理编辑
依据与硅胶膜离心柱相同的原理[3]，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的DNA 和RNA分离出来，可应用在临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。
4磁珠法核酸提取过程编辑
磁珠法核酸提取一般可以分为四步：裂解——结合——洗涤——洗脱。
磁珠法核酸提取过程示意图
惠彤磁珠法提取玉米种子电泳图
磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤
?磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。
?磁珠法纯化DNA原理
?磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE，COOH)等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。
?核酸分离与纯化的原则
?核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性：排除其他分子污染。
?核酸分离与纯化的步骤
?大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
? 1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。
?(1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从<
500bp ～ > 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。
?(2) 化学作用:在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween
20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸
胍、肌酸胍) 而获得。而p H 环境则由加入的强碱(NaOH) 或缓冲液 ( TE、STE 等) 提供。在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
?(3) 酶作用:主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。
其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。
? 2. 酶处理:在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。
? 3. 核酸的分离与纯化:核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性,根据它们理化性质的差异,用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化。(1) 酚提取/ 沉淀法:核酸分离的一个经典方法是酚∶氯仿抽提法。细胞裂解后离心分离含核酸的水相,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25 ∶24 ∶1 体积) 混合液。依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂,预先要用STE 缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联：故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入p H5. 0～5. 5 ,终浓度为0. 3M 的NaOAc 或KOAc 后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2～2. 5 倍体积的乙醇,经一定时间的孵育,可使核酸有效地沉淀。其他的一些有机溶剂[ 异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等]和盐类(10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等) 也用于核酸的沉淀。不同的离子对一些酶有抑制作用或可影响核酸的沉淀和溶解, 在实际使用时应予以选择。经离心收集,核酸沉淀用70 %的乙醇漂洗以除去多余的盐分,即可获得纯化的核酸。(2) 层析法:层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析方法。
包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法在内的层析法。因分离和纯化同步进行,并且有商品试剂盒供应,而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下,核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。另外一些选择性吸附方法以经修饰或包被的磁珠作为固相载体,磁珠可通过磁场分离而无需离心,结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。该法分离纯化核酸,具有质量好、产量高、成本低、快速、简便、节省人力以及易于实现自动化等优点。
?玻璃粉或玻璃珠被证实为一种有效的核酸吸附剂。在高盐溶液中,核酸可被吸附至玻璃基质上,离液盐碘化钠或高氯酸钠可促进DNA 与玻璃基质的结合。Dederich 等用酸洗玻璃珠分离纯化核酸,获得高产量的质粒DNA。在该方法中,细胞在碱性环境下裂解,裂解液用醋酸钾缓冲液中和后,直接加至含异丙醇的玻璃珠滤板,被异丙醇沉淀的质粒DNA 结合至玻璃珠,用80 %乙醇真空抽洗除去细胞残片和蛋白质沉淀。最后用含RNase A 的TE 缓冲液洗脱与玻璃珠结合的DNA ,获得的DNA 可直接用于测序。
?Elkin 等使用羧化磁珠分离纯化质粒DNA。该法在细胞裂解后,离心分离含质粒的水相,再加入羧化的磁粒,然后用 PEG/ NaCl 沉淀,使目的DNA 吸附至磁珠,最后磁场
分离被吸附的DNA ,经乙醇洗涤,用水洗脱,可获得高产量的适用于毛细管测序的模板DNA。
?也有用铁粒为固相支持物,经磁场分离而纯化质粒DNA 的报道。细菌用溶菌酶2煮沸法裂解,质粒被释放至悬浮液中, 加铁珠捕获,用磁场使铁珠分离,经漂洗后用水洗脱质粒,可获得高产量、测序级的质粒DNA。
?亲和层析是利用待分离物质与它们的特异性配体间所具有的特异性亲和力来分离物质的一类层析方法。Chandler 等报道了一种用肽核酸(PNA) 分离核酸的方法。PNA 是一类以 N-(2-氨乙基)2甘氨酸结构单元为骨架的DNA 类似物,可作为纯化皮克(pg) 级核糖体DNA ( rDNA) 和核糖体RNA ( rRNA) 的试剂。在该方法中,以生物素标记的肽核酸(peptide nucleic acids ,PNAs) 为探针,以包被了抗生蛋白链菌素的磁珠作为固相载体。PNA 探针在高盐环境下, 与目的核酸(DNA 或 RNA) 混合,经煮沸、冰浴、温育杂交步骤后,直接加入包被了抗生蛋白链菌素的顺磁性颗粒,经静置捕获PNA-核酸杂交体,水洗而获得纯化的核酸。
?Schluep 等亦基于亲和层析原理,采用一种三螺旋体DNA 的方式进行质粒DNA 的分离。三螺旋体DNA 由同质嘌呤
? 2 同质嘧啶双螺旋链与同质嘧啶单链组成,单链上的T 识别A ·T 碱基,对形成T ·A ·T 三联体,质子化的单链胞嘧啶 (C+ ) 识别G·C 碱基对形成C ·G·C 三联体。
在适当的条件下,三螺旋体的结合具有高特异性和高稳定性。将配体聚嘧啶寡核苷酸链通过化学方法连接至Sephacryl S21000 SF 颗粒上形成亲和载体。当含目的序列的质粒DNA 溶液与其混合时,在酸性环境(p H 4. 5～5. 5) 下,质粒结合至亲和载体颗粒上,溶液中高浓度的NaCl 可稳定三联体形式并减少与蛋白质、细胞DNA 的非特异性结合。经一段时间反应后,颗粒悬浮液被加至一层析柱,用适当的洗脱液改变p H 值至碱性环境,可使三联体解聚,质粒被洗脱。经该法分离质粒DNA ,质粒产量可达到加入量的62 %。
?也有用Schizophyllan ( SPG) 制备亲和层析柱分离纯化 RNA 的报道。SPG是一种β21 ,32葡聚糖,在低温下,含RNA 的流动相通过层析柱,Poly (C) 和poly (A) 与SPG通过氢键和疏水作用形成复合物而被吸附于柱上,然后通过改变缓冲液成分,将被吸附的RNA 洗脱。亲和层析应用于核酸分离与纯化的另一个例子是用oligo
( dT)2纤维素层析法从真核细胞总 RNA 中分离带poly (A) 尾的mRNA。在该方法中,短链oligo (dT) 通过其52磷酸与纤维素的羟基共价结合而连接至纤维素介质上。当样本经过oligo (dT) 柱时,mRNA 因其poly (A) 可与短链oligo (dT) 形成稳定的RNA2DNA 杂合链,而被连接到纤维素介质上,从而与其他RNA 分离。在适当的条件下(低盐、加热) ,poly (A) RNA 可被水洗脱而得以纯化。
?离子交换层析以具有离子交换性能的物质为固定相,其与流动相中的离子能进行可逆交换,从而能分离离子型化合物。用离子交换层析纯化核酸是因为核酸为高负电荷的线性多聚阴离子,在低离子强度缓冲液中,利用目的核酸与阴离子交换柱上功能基质间的静电反应,使带负电荷的核酸结合到带正电的基质上,杂质分子被洗脱。然后提高缓冲液的离子强度,将核酸从基质上洗脱,经异丙醇或乙醇沉淀即可获得纯化的核酸。该法适用于大规模核酸的纯化。Ferreira 等用含0. 5 M NaCl 的TE 缓冲液平衡层析柱,加样后用含1 M NaCl 的TE 缓冲液洗脱核酸,获得了很好的分离效果。
?(3) 密度梯度离心法:密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质具有不同的密度,因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带, 该法适用于大量核酸样本的制备,其中氯化铯2溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是纯化大量质粒DNA 的首选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质,梯度液中的溴化乙锭与核酸结合,离心后形成的核酸区带经紫外灯照射,产生荧光而被检测,用注射针头穿刺回收后,通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。
?提取DNA有许多方法：酚-氯仿提取DNA，磁珠法纯化提取DNA可以采用天根的试剂盒、全自动核酸与蛋白提取仪、自动核酸纯化系统等等。生物帮推荐磁珠法纯化提取DNA产品大全：极微量病毒核酸提取试剂盒（低于10^1/mL）、StreptAvidin磁珠（biotin分离免疫磁珠）
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