肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)使用说明
货号：G3670
规格：100mL
保存：室温避光保存，有效期12个月。
产品说明：
甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)中的阳离子有染色作用,组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色。临床上，经常用甲苯胺蓝对软骨细胞和肥大细胞进行染色。
操作步骤(仅供参考)：
1、石蜡切片入二甲苯2次，每次15min。
2、系列乙醇各1min。自来水洗2min。
3、入Toluidine Blue O Stain，浸染10～15min。
4、自来水洗2min，滤纸吸干水分。
5、95%乙醇分色至肥大细胞呈紫蓝色，背景呈淡蓝色。
6、95%乙醇1min。无水乙醇2次，每次2min。二甲苯透明，中性树胶封固。
染色结果：
肥大细胞颗粒紫蓝色
背景淡蓝色
注意事项：
1、针对于胃粘膜组织、软骨组织等较难着色组织的染色，浸染于甲苯胺蓝染色液的时间应相应延长。
2、固定液最好采用Carnoy固定液。
3、甲苯胺蓝染色后不宜采用低浓度乙醇脱水，否则容易导致褪色。
4、分色后应快速入95%乙醇、无水乙醇、二甲苯的时间不宜过久，否则容易导致褪色。
PH1237|标准革兰氏染色液 Standard Gramˊs Stain Catalog No：PH1237Size：?4×100mL|?4×250mL Store at RT 简介 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。 细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。 红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Standard Gramˊs Stain采用最经典的革兰染色配方,临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组份 名称4×100ml4×250ml Storage 试剂(A):结晶紫染色液100ml250ml RT避光 试剂(B):Gram碘液100ml250ml RT避光 试剂(C):脱色液100ml250ml RT 试剂(D):沙黄染色液100ml250ml RT避光 自备材料 1、接种环或挑取细菌的其他工具 2、酒精灯 3、载玻片 4、光学显微镜 操作步骤 (仅供参考)： 1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，混合均匀，涂成一薄层。 2、干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。 3、固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3~5次，每次1s，温度不宜过高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。 4、初染：滴加结晶紫染色液染色1~2min，清水冲洗去染色液。 5、媒染：滴加Gram碘液，并覆盖载玻片，室温放置1~2min，水洗。 6、脱色：滴加脱色液，摇动10～30s，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液，终止反应。
软骨染色液(甲苯胺蓝法)染色步骤及注意事项 货号：G2543 规格：100ml 保存：室温，避光，12个月。 产品说明： 甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料,属于醌亚胺染料类。这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用,组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团，还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色；肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色。甲苯胺蓝染色液(甲苯胺蓝法)呈强碱性，更利于组织细胞的着色。操作说明：（仅供参考） 1、常规脱钙，包埋，固定。 2、石蜡切片入二甲苯2次。 3、系列乙醇各1min。自来水洗2min。 4、入Toluidine Blue O Stain浸染30min。根据不同组织，染色时间不完全相同。 5、自来水洗2min，滤纸吸干水分。 6、丙酮分化至软骨细胞呈紫蓝色清楚可见。 7、逐级乙醇脱水。 8、二甲苯透明，中性树胶封固。 染色结果： 软骨、成骨细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。
注意事项： 1、第一次使用本试剂时建议先取1-2个样品做预实验。 2、针对于胃粘膜组织、软骨组织等较难着色组织的染色，浸染于甲苯胺蓝染色液的时间应相应延长。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 相关试剂： G3661甲苯胺蓝染色液(1%,磷酸盐法) G3662甲苯胺蓝染色液(0.5%,磷酸盐法) G3665甲苯胺蓝染色液(0.5%,硼酸盐法)
革兰氏染色液 保质期：2-8度一年. 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。 操作步骤： 1、标本处理： （1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。（2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm 离心10min.，取沉渣涂片染色。 2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行染色。 3、染色方法： 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。 （1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 （2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。 （3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。
（4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 （5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。 4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。 注意事项： 1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。 2．玻片通过火焰温度不能太高。 3．若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。 4．碘液变透明，则不能使用。 5.水洗时动作要轻柔,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。 革兰氏染色液如果用量少，买现成的比较话算，如果用量大，自己配起来也溶液，就是试剂种类多了点。其配制方法如下： (1)结晶紫(crystal violet)液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵水溶液80mL 将两液混匀置24h后过滤即成。 (2)卢戈(Lugol)氏碘液：碘0.33g，碘化钾0.66g，蒸馏水100mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至100mL即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为黄色即不能使用。 (3)95%乙醇：用于脱色，脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。 (4)番红溶液：番红O(safranine，又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。
标准革兰氏染色液 简介： 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram 于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G +)和革兰阴性菌(G -)两大类。细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Leagene Standard Gram ˊs Stain 采用最经典的革兰染色配方, 临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组成： 自备材料： 1、 接种环或挑取细菌的其他工具 2、 酒精灯 3、 载玻片 4、 光学显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、 涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与 的水混合均匀，涂成一薄层。 编号 名称 DM0015 4×10ml DM0015 4×100ml DM0015 4×250ml DM0015 4×500ml Storage 试剂(A): 结晶紫染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(B): Gram 碘液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(C): 脱色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 试剂(D): 沙黄染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 使用说明书 1份
甲苯胺蓝染色液(0.5%,磷酸盐法)使用说明 货号：G3662 规格：100ml 保存：室温，避光，12个月。 产品说明： 甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料,属于醌亚胺染料类。这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用,组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团，还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色。肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色。 操作说明：（仅供参考） (一)肥大细胞染色 1、脱蜡至蒸馏水。 2、浸染于甲苯胺蓝染色液10-15min，具体的染色时间根据切片厚度和组织的不同而定。 3、蒸馏水或去离子水轻轻冲洗。 4、(可选)0.5%冰乙酸分化，直到细胞核和颗粒清晰可见。 5、快速95%和无水乙醇脱水。 6、二甲苯透明，封固。 染色结果：肥大细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (二)软骨染色 1、石蜡切片入二甲苯2次每次15min。
2、系列乙醇各1min。 3、自来水洗2min。 4、入Toluidine Blue O Stain浸染30min。 5、自来水洗2min，滤纸吸干水分。 6、丙酮分化至软骨细胞呈紫蓝色清楚可见。 7、逐级乙醇脱水。 8、二甲苯透明，中性树胶封固。 染色结果：软骨、成骨细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (三)细胞涂片染色 1、用20%的乙醇溶液稀释甲苯胺蓝染色液,一般要求稀释到0.1%即可。 2、细胞涂片后，立即放入95%的乙醇中固定，取出放在纸巾上。 3、滴加稀释后的甲苯胺蓝染色液进行滴染，加盖玻片让染料渗透到细胞中。 4、将玻片竖起，稍加压力，使多余染料被纸巾吸去。 5、无需干燥，直接镜检。 染色结果：细胞核、淋巴细胞呈深蓝色；核仁呈紫红色；红细胞呈橘红；细胞质、单核细胞呈淡蓝色。 (四)原位杂交染色 1、用蒸馏水或去离子水稀释到相应的浓度，凭经验一般稀释比例大于1:100。 2、玻片在稀释好的染色液中短暂浸泡。 3、在蒸馏水或去离子水浸泡数次。 4、按需求进行压片固定。 注意事项：
微生物实验报告 细菌的革兰氏染色及形态观察 一、目的要求： 1、熟悉光学显微镜的使用方法。 2、掌握革兰氏染色法。 3、掌握大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的染色结果和形态特征 二、器材和器皿： 1、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 2、革兰氏染色液、香柏油、二甲苯 3、显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环等 三、实验原理： 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram 创立。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别很小，在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。 四、实验步骤： 1、取载玻片用纱布擦干，涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、涂片： 液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。 4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 5、染色：在菌膜上滴加草酸铵结晶紫液，染1min。 6、水洗：用蒸馏水轻轻冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。 7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。 9、复染：滴加蕃红复染约2min，水洗。至此，革兰氏染色结束。
增强革兰氏染色液 简介： 在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Leagene Enhanced Gram ˊs stain 采用最经典的革兰染色配方进一步改进，使用复红复染液替代沙黄染色液，增强了染色效率，用于极难染色的细菌。临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与 的水混合均匀，涂成一薄层。 2、 干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。 3、 固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3~5次，每 次1s ，温度不宜过高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。 4、 初染：滴加结晶紫染色液染色，清水冲洗去染色液。 5、 媒染：滴加Gram 碘液，并覆盖载玻片，室温放置，水洗。 6、 脱色：滴加脱色液，摇动，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液， 终止反应。 7、 复染：滴加复红复染液染色，水洗。 8、 干燥。镜检：置油镜观察。 编号 名称 DM0016 4×10ml DM0016 4×100ml DM0016 4×250ml Storage 试剂(A): 结晶紫染色液 10ml 100ml 250ml RT 避光 试剂(B): Gram 碘液 10ml 100ml 250ml RT 避光 试剂(C): 脱色液 10ml 100ml 250ml RT 试剂(D): 复红复染液 10ml 100ml 250ml RT 避光 使用说明书 1份
甲苯胺蓝染色液(1%,磷酸盐法) 简介： 甲苯胺蓝(T oluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料, 属于醌亚胺染料类, 这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用, 组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类, 帮助发色团对组织产生染色力, 使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色。 组成： 操作步骤(仅供参考)： (一)肥大细胞染色 1、脱蜡至蒸馏水。 2、根据切片厚度和组织的不同，浸染于甲苯胺蓝染色液。 3、蒸馏水或去离子水轻轻冲洗。 4、(可选)0.5%冰乙酸分化，直到细胞核和颗粒清晰可见。 5、快速95%和无水乙醇脱水。 6、 二甲苯透明，封固。 染色结果：肥大细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (二)软骨染色 1、 石蜡切片入二甲苯2次每次。 2、 系列乙醇各1min 。 3、 自来水洗2min 。 4、 入Toluidine Blue O Stain 浸染。 5、 自来水洗2min ，滤纸吸干水分。 6、 丙酮分化至软骨细胞呈紫蓝色清楚可见。 7、 逐级乙醇脱水。 8、 二甲苯透明，中性树胶封固。 染色结果：软骨、成骨细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (三)细胞涂片染色 编号 名称 DA0055 Storage Toluidine Blue O Stain(1%,磷酸盐法) 100ml RT 避光 使用说明书 1份
1、用20%的乙醇溶液稀释甲苯胺蓝染色液, 一般要求稀释到0.1%即可。 2、细胞涂片后，立即放入95%的乙醇中固定，取出放在纸巾上。 3、滴加稀释后的甲苯胺蓝染色液进行滴染，加盖玻片让染料渗透到细胞中。 4、将玻片竖起，稍加压力，使多余染料被纸巾吸去。 5、无需干燥，直接镜检。 染色结果：细胞核、淋巴细胞呈深蓝色；核仁呈紫红色；红细胞呈橘红；细胞质、单核细胞呈淡蓝色。 (四)原位杂交染色 1、用蒸馏水或去离子水稀释到相应的浓度，凭经验一般稀释比例大于1:100。 2、玻片在稀释好的染色液中短暂浸泡。 3、在蒸馏水或去离子水浸泡数次。 4、按需求进行压片固定。 注意事项： 1、针对于胃粘膜组织、软骨组织等较难着色组织的染色，浸染于甲苯胺蓝染色液的时间应 相应延长。 2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
普通光学显微镜的使用及微生物形态观察与革兰氏染色法 胡雪芳 201300261033 【实验目的】 1.学习显微镜的结构、各部分功能和使用方法 2.学习细菌制片方法 3.学习细菌染色原理和方法 4.巩固无菌操作技术 5.学习图像结果的规范表示 【实验原理】 1.显微镜的结构和各部分功能 现代普通光学显微镜 利用目镜和物镜两组透 镜系统来放大成像，故又 常被称为复式显微镜。它 们由机械装置和光学系 统两大部分组成。在显微 镜的光学系统中，物镜的 性能最为关键，它直接影 响着显微镜的分辨率。而 在普通光学显微镜常配 置的几种物镜中，油镜的图1. 显微镜的构造放大倍数最大，对微生
物的研究最为重要，与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间加滴镜油，这主要有如下两方面的原因：1.1增加照明亮度 油镜的放大倍数可达100x，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照度却很大。而从显微镜的结构看，从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头）有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时，会因为射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率为1.52）。 1.2增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率和分辨力是指显微镜能辨别两点之间最小距离的能力。最小可分辨距离越小，分辨率越高。从物理学角度来看，光学显微镜的最小可分辨距离受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为： 最小可分辨距离= λ2NA 式中：λ为光源光波长，NA为物镜的数值孔径值。 光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4~0.7μm），而数值孔径值取决于物镜的镜口角和玻片与物镜间介质的折射率，可表示为： NA=n*sin? 式中：?为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距
甲苯胺蓝染色液(0.5%,硼酸盐法) 简介： 甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料, 属于醌亚胺染料类, 这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用, 组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类, 帮助发色团对组织产生染色力, 使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色。另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质，遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，临床上经常用于肥大细胞染色。 Leagene 甲苯胺蓝染色液(Toluidine Blue,1%,硼酸盐法)由于硼酸盐缓冲液呈强碱性，更利于组织细胞的着色。 组成： 操作步骤(仅供参考)： (一)肥大细胞染色 1、脱蜡至蒸馏水。 2、根据切片厚度和组织的不同，浸染于甲苯胺蓝染色液。 3、蒸馏水或去离子水轻轻冲洗。 4、冰乙酸分化，直到细胞核和颗粒清晰可见。 5、快速和无水乙醇脱水。 6、 二甲苯透明，封固。 染色结果：肥大细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (二)软骨染色 1、 石蜡切片入二甲苯。 2、 系列乙醇各。 3、 自来水洗。 4、 入Toluidine Blue O Stain ，浸染。 5、 自来水洗，滤纸吸干水分。 6、 丙酮分化至软骨细胞呈紫蓝色清楚可见。 7、 逐级乙醇脱水。 编号 名称 DA0059 Storage Toluidine Blue O stain (0.5%,硼酸盐法) 100ml RT 避光 使用说明书 1份
8、二甲苯透明，中性树胶封固。 染色结果：软骨、成骨细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (三)细胞涂片染色 1、用乙醇溶液稀释甲苯胺蓝染色液, 一般要求稀释即可。 2、细胞涂片后，立即放入乙醇中固定，取出放在纸巾上。 3、滴加稀释后的甲苯胺蓝染色液进行滴染，加盖玻片让染料渗透到细胞中。 4、将玻片竖起，稍加压力，使多余染料被纸巾吸去。 5、无需干燥，直接镜检。 染色结果：细胞核、淋巴细胞呈深蓝色；核仁呈紫红色；红细胞呈橘红；细胞质、单核细胞呈淡蓝色。 (四)原位杂交染色 1、用蒸馏水或去离子水稀释到相应的浓度，凭经验一般稀释比例大于1:100。 2、玻片在稀释好的染色液中短暂浸泡。 3、在蒸馏水或去离子水浸泡数次。 4、按需求进行压片固定。 注意事项： 1、针对于胃粘膜组织、软骨组织等较难着色组织的染色，浸染于甲苯胺蓝染色液的时间应 相应延长。 2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效。 相关： 编号名称 DA0056甲苯胺蓝染色液(0.5%,磷酸盐法) DC0032Masson三色染色液 DG0005糖原PAS染色液 DH0006苏木素伊红(HE)染色液 TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)
革兰氏染色液配制 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
革兰氏染色液 保质期：2-8度一年. 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。 操作步骤： 1、标本处理： （1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。 （2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm?离心10min.，取沉渣涂片染色。
2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行染色。 3、染色方法： 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。 （1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 （2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。 （3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。 （4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 （5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。 4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。 注意事项：
甲苯胺蓝染色液(软骨专用)使用说明书 货号：G2493 规格：100ml 保存：室温，避光，12个月。 产品说明： 甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料,属于醌亚胺染料类。这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用,组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团，还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色；肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色。甲苯胺蓝染色液(Toluidine Blue，1%，硼酸盐法)由于硼酸盐缓冲液呈强碱性，更利于组织细胞的着色。 操作说明：（仅供参考） 1、常规脱钙，包埋，固定。 2、石蜡切片入二甲苯2次，每次15min。 3、系列乙醇各1min。自来水洗2min。 4、入Toluidine Blue O Stain浸染15-20min。根据不同组织，染色时间不完全相同。 5、自来水洗2min，滤纸吸干水分。 6、丙酮分化至软骨细胞呈紫蓝色清楚可见。 7、逐级乙醇脱水。 8、二甲苯透明，中性树胶封固。 染色结果： 软骨、成骨细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 注意事项： 1、第一次使用本试剂时建议先取1-2个样品做预实验。
2、针对于胃粘膜组织、软骨组织等较难着色组织的染色，浸染于甲苯胺蓝染色液的时间应相应延长。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 相关产品： G3661甲苯胺蓝染色液(1%,磷酸盐法) G3662甲苯胺蓝染色液(0.5%,磷酸盐法) G3665甲苯胺蓝染色液(0.5%,硼酸盐法)
革兰氏染色液使用说明 货号：G1060 规格：10ml/100ml 保存：阴凉处保存，保质期1年。 产品内容: 结晶紫；碘液；95%酒精；蕃红。 产品简介： 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌细胞壁较厚，肽聚糖网层次较多且交联致密，乙醇脱色时，肽聚糖脱水使孔径缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。革兰氏阴性菌细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，脱色后类脂外膜迅速溶解，缝隙加大，结晶紫与碘复合物溶出，因此乙醇脱色后再经番红复染，呈红色。 操作步骤： 1.涂片固定 菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2.染色 一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 （2）加上碘液后染色1分钟，水洗。 （3）加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约20-60秒，水洗，吸去水分。 （4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 （5）吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌 可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄 也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌体自行溶解， 都常呈阴性反应。 3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以均匀分散 开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈现假阳性。 注意事项： 1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。若涂片较厚，应延长脱色 时间，直至不再出现紫色为止。 2．玻片通过火焰温度不能太高。 3．碘液变透明，则不能使用。 4．水洗时动作要轻柔,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。
实验细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的要求 1、学习制染色片技术，学习简单染色的原理和方法。 2、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。 二、实验原理 细菌的菌体很小，活细胞的含水量在80％～90％，因此对光的吸收和反射与水溶液相差不大，所有观察其细胞结构必须染色。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。本实验只学习前两种。 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的，是细菌学上最常用的 鉴别染色法。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 三、实验器材 菌种：培养24小时的大肠杆菌 染色剂和试剂：石炭酸复红染色液，革兰氏染色液(草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)，香柏油、二甲苯 器材和器皿：显微镜，酒精灯，载玻片，盖玻片，接种环，擦镜纸，吸水纸，火柴，小烧杯，玻片架、试管、小滴管等 四、操作方法 1、简单染色： （1）涂片：取干净的载玻片一块，滴一小滴生理盐水于载玻片中央，严格按无菌操作程序，挑取大肠杆菌于载玻片的水滴中，调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多；涂片必须均匀；涂布面积直径约1.5cm为宜；挑取菌种时切勿将培养基挑破。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在搁架上，加复红染色1-2min。 （5）水洗：染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。 （6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 2、革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。
革兰染色液说明书 【产品名称】 革兰染色液 【包装规格】 货号：DM0016 单瓶包装规格分别为：20ml、100ml、250ml、500ml、5000ml； 每套/盒包装规格分别为：4×20ml/盒、4×100ml/盒、4×250ml/盒、4×500ml/盒。 【预期用途】 用于细菌或真菌的涂片染色。 【检验原理】 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是由肽聚糖层厚度和结构决定的，经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时显现红色，红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来；在革兰阳性细胞染色中乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁不易脱色，所以保持着紫色。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法(属复染法)，可用于标本涂片或菌落涂片，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以临床分类鉴定，染色结果将细菌分为革兰氏阳性菌(紫色)和革兰氏阴性菌(红色)两大类。 【主要组成成分】 试剂组成主要成分 1、结晶紫染色液结晶紫、乙醇 2、碘溶液碘、碘化钾 3、脱色液乙醇、水 4、沙黄染色液或复红染色液沙黄染色液：沙黄、乙醇 复红染色液：品红、乙醇 【储存条件及有效期】 5℃～35℃保存，原包装未开封染色液的有效期为24个月，在有效期内的已开封染色液应在开封后6个月内使用完，每次用后应及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。 【样本要求】 涂片时必须注意细心操作，涂片薄而均匀；制备的涂片应自然干燥，采用加热固定时，固定温度不宜过高，以背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变影响观察结果。 【检验方法】 1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与水混合均匀，涂成一薄层； 2、干燥、固定：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，也可以用甲醇或乙醇固定； 3、染色。 4、滤纸吸干或在空气晾干，镜检。 【检验方法的局限性】 采用陈旧标本涂片时有产生假阴性的可能。 【注意事项】 1、涂片之前，应事先在背面做好圆圈标记，以便判断后续试验的位置。 2、取细菌时，应注意自我防护，拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在
革兰氏染色标准操作规程 1 目的 确保革兰氏染色的正确操作，使革兰氏染色的操作得到有效控制，以提供稳定的实验结果。 2 适用范围 适用于本公司微生物实验室革兰氏染色实验。 3 职责 实验室技术人员应遵循此程序，确保按标准操作规程进行革兰氏染色。 4 程序 4.1革兰氏染色原理 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层较多且交联致密，故遇丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故丙酮处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过丙酮脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 4.2实验物品 灭菌玻片、接种环、移液器、酒精灯、计时器、显微镜、香柏油、革兰氏染色液等。 4.3实验步骤 4.3.1涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液器吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用移液器分别吸取10ul金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌位于待检品的两侧（中间要有足够的空间），分别作为阴阳性对照。用无菌接种环将液滴涂布成均匀的薄层，涂布面不宜过大。
4.3.2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯火焰高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 4.3.3固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉得烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。 4.3.4初染：在涂片薄膜上滴加革兰氏结晶紫试剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4.3.5水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 4.3.6媒染：取1-2滴革兰氏碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4.3.7水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 4.3.8脱色：斜置载玻片，滴加革兰氏脱色剂脱色，至流出的脱色剂不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。 4.3.9复染：在涂片薄膜上滴加革兰氏番红精复染剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4.3.10水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 4.3.11干燥：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下观察。 4.3.12观察：待标本片干后置显微镜下观察，用低倍镜观察，发现目标物后滴一滴香柏油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色。 4.4结果判定 显微镜观察由金黄色葡萄球菌制成的标本显示葡萄球状蓝紫色，大肠埃希菌制成的标本显示杆状红色，则实验过程有效。一方不成立则实验结果无效。 此时，如果样品在显微镜下呈蓝紫色，则判定样品菌株为革兰氏阳性菌；如果样品在显微镜下呈红色，则判定样品菌株为革兰氏阴性菌。 4.5实验结束 4.5.1实验结束后，按显微镜使用、维护和保养规程的要求，关闭和清洁显微镜。 4.5.2实验过程中用到的带菌工具，根据工具的不同选择不同的灭菌方式，确保物品丢弃前均已灭菌。
实验6 细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 目的：初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。 内容：1．制作细菌染色装片。 2．进行革兰氏染色法操作。 二、实验材料和用具 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌菌液，待测菌菌液1～2种。 革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。 三、操作步骤 (一)制片 1．涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。 2．干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。 3．固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 (二)染色 l．初染于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。 2．媒染滴加卢戈氏碘液，lmin后水洗。 3．脱色滴加95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至lmin)，水洗。 4．复染滴加石炭酸复红液复染lmin，水洗。 5．滤纸吸干，油镜镜检。 (三)结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。 (四)检测未知菌 用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。 四、注意事项 1. 涂片务求均匀，切忌过厚。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。 3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌。 4．老龄菌因体内核酸减少，会便阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。 五、实验报告 (一)绘图 1．大肠杆菌革兰氏染色视野图。 2．金黄色葡萄球菌或苏云金杆菌革兰氏染色视野图。 (二)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。 (三)未知菌的检测结果。 六、问题和思考 1．涂片后为什么要进行固定?固定时应注意什么? 2．什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么? 3．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。
革兰氏染色的一般步骤 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌 与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。 革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用结晶紫染色1分钟后水洗，然后加革兰碘 液媒染一分钟后用酒精脱色，再用稀释石炭酸复红复染。染色后除可以看到细菌形态外，还 可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋）。被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（Gˉ）。 革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因 素有关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等 属革兰氏染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌（大肠埃希菌）、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、 痢疾杆菌、霍乱弧菌、沙门菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性菌。所 以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出 诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）纯化水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。 7）番红染色液（稀）染10秒钟后，纯化水冲洗。干燥，镜检。 染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。
SD大鼠甲苯胺蓝染色步骤 1、甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞表型 Ⅱ代软骨细胞以2x105／ml的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的24孔细胞培养板中，与原代培养条件相同，制作细胞爬片，常规培养48h后行甲苯胺蓝染色。 具体操作步骤如下： (1)倾去培养液，PBS充分漂洗3次，加入10％的中性甲醛常温下固定30min。 (2)倾去10％的中性甲醛，PBS充分漂洗3次，加入70％的乙醇固定30min除去四价铵离子，以免影响染色。 (3)倾去70％的乙醇溶液，PBS充分漂洗3次，晾干，加入甲苯胺蓝乙醇液(甲苯胺蓝0.2g 溶于30％乙醇100m1)染色_20min。 (4)PBS充分漂洗3次，迅速用无水乙醇再漂洗1次。 (5)取出爬片，干燥后中性树脂封片，电子显微镜下观察、摄片。 2、型胶原免疫细胞化染色法鉴定软骨细胞表型 Ⅱ代软骨细胞以2×105／ml的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的24孔细胞培养板中，与原代培养条件相同，制作细胞爬片，常规培养48h后行免疫细胞化学法染色。实验过程严格遵照免疫细胞化学染色试剂盒说明书进行操作，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照组。 具体操作步骤如下： (1)倾去培养液，冰冷的PBS漂洗3x3min，加入4%多聚甲醛1ml室温固定15min。 (2)PBS清洗标本3x3min，每张标本滴加1滴新鲜配制的3％H202，室温下孵育10min。 (3)PBS清洗标本3x3min，每张标本滴加穿膜液0.5m](0.1％timton+o.1M Glycine)冰上孵育 30min。 (4)PBS清洗标本3x3min，每张标本滴加5mg／ml的动物非免疫封闭血清(BSA)0.5ml，室温 下封闭1h。 (5)滴加1：150稀释的兔抗大鼠II型胶原多克隆抗体50ul于封口膜上，使标本与一抗充分 接触，置于湿盒中4℃过夜。PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照组。 (6)PBS清洗标本3x3min，加入二抗工作液，37℃孵育20min。 (7)PBS清洗标本3x3min，每张标本滴加1滴SABC试剂，37℃孵育20min后PBS(pH7．2~7．6) 清洗标本4x5min。 (8)DAB显色：取蒸馏水1ml，加入试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后滴加至标本。 室温下显色，显微镜下观察并控制反应时间(约5-30min)。 (9)蒸馏水漂洗，苏木素轻度复染，脱水。 (10)干燥后中性树脂封片，电子显微镜下观察、拍照。 豚鼠关节软骨细胞甲苯胺蓝染色鉴定 将F1代豚鼠关节软骨细胞以1×104／ml的浓度传代至孔底铺有圆形盖玻片的24孔板 中；正常培养，制作细胞爬片，镜下观察细胞状态，取细胞状态及数量适宜(2天左右) 的爬片染色。染色步骤如下： 1取出细胞爬片，用PBS缓冲液漂洗3次，每次3min，吸弃PBS，每张爬片滴加4％多聚甲醛100 ul，铺满爬片，室温固定3h。 2 PBS漂洗3次，每次3min后吸弃PBS，每张爬片滴加70％的乙醇100 ul室温固定20min。 3 PBS漂洗3次，每次3min后吸弃PBS，晾干后每张爬片滴加0．04％的甲苯胺蓝溶液50 ul，室温下处理20min，无水乙醇迅速漂洗1次，晾干封片，观察拍照记录。