基于EET机理比率型荧光探针的研究进展

有机化学

Chinese Journal of Organic Chemistry

ARTICLE

* E-mail: yuhaibo@https://www.doczj.com/doc/2714526936.html,

Received September 23, 2014; revised November 18, 2014; published online December 2, 2014.

Project supported by the National Natural Science Foundation of China (21302080). Program Funded by Liaoning Province Education Administration (L2014010).

国家自然科学基金(No.21302080)，辽宁省教育厅科研项目(No.L2014010)资助项目.

DOI: 10.6023/cjo201409036 研究论文

基于EET 机理比率型荧光探针的研究进展

陈忠林a 李红玲a 韦驾a 肖义b 于海波a ,*

(a 辽宁大学 环境学院 沈阳 110036)

（b 大连理工大学 精细化工国家重点实验室 大连 116024)

摘要 激发态能量转移（Excitation Energy Transfer, EET ）作为一类重要的光物理现象，被广泛用于比

率型荧光探针和分子灯标的设计以及DNA 检测等多个领域。影响EET 效率的两个重要因素是供受体间的空间距离和光谱交盖，通过调节供受体间的空间距离或光谱重叠程度来调控能量转移过程，实现对目标客体的双波长比率检测。本文综述了基于不同供受体荧光团的EET 体系、供受体间的连接方式对能量转移效率的影响，以及通过调控供受体间光谱重叠程度或空间距离，获得识别不同客体的比率型荧光探针，并对EET 机理的比率型荧光探针的设计以及未来在生物成像和医学检测等领域的应用进行了展望。

关键词 荧光探针; 激发态能量转移; F?rster 能量转移; 比率型荧光探针; 荧光发色团

Recent Progress in Ratiometric Fluorescent Probes Based on EET Mechanism

Chen Zhonglin a Li Hongling a Wei Jia a Xiao Yi b Yu Haibo a *

(a College of Environmental Sciences, Liaoning University, Shenyang)

(b State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian)

Abstract Excitation Energy Transfer (EET) is one of the vital photophysical phenomenons, which is wide-ly used in many applications, such as the design of ratiometric fluroesent probes, molecular beacon and DNA analysis, and so on. The process of energy transfer from donor to acceptor can be regulated by two factors: the spatial distance between donor and acceptor, and the spectral overlaps between donor’s emission and acceptor’s absorption, which results that there is a wide variety in the ratio at two different wavelengths of ratiometric fluo-rescent probes. In this review, noticeable EET systems with different donor fluorophore, connection form and energy transfer efficiency between donor and acceptor, and the modulation of spatial distance or spectral overlap are summarized. Finally, as a promising tool, the future developing prospects of EET fluorescent probes in bioi-maging and medical diagnostics are discussed and highlighted.

Keywords Fluorescent probe, Excitation energy transfer, F?rster resonance energy transfer, Ratiometric probe, Fluorophore

随着荧光显微成像技术和时间分辨技术的迅速发展，基于超分子化学和有机染料的荧光探针现已成为研究生物学和医学领域相关问题的重要工具。荧光探针在与目标客体相互作用过程中荧光信号会发生改变，借助于荧光信号的变化，荧光探针能够对目标客体进行实时在线的检测或监测，并被广泛用于分析化学，生物化学，医学和环境监测等多个领域[1]。荧光探针主要有三种类型：淬灭型、增强型和比率型。由于增强型荧光探针在与目标客体作用后，荧光输出信号增强，在荧光显微成像中比淬灭型荧光探针更为灵敏，故增强型荧光探针是目前荧光探针领域设计的主流[2]。

与增强型荧光探针相比，比率型荧光探针在定量检测方面具有明显的优势，近些年来，比率型荧光探针的设计

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是目前荧光探针领域研究的热点之一[3-7]。比率型荧光探针具有双波长发射（或激发）的特征，该波长比率值的变化独立于探针浓度和光源强度，其中最突出的特征在于其光谱形状及比率的变化值与检测客体的浓度一一对应，从而为定量检测客体分子提供依据。自钱永健（Tsien R. Y.）[8,9]于1985年首次设计了钙离子比率型荧光探针Fura-Ca以来，分子内电荷转移（Intermolecular Charge Transfer，ICT）机制便成为设计比率型荧光探针的主要机理之一[10]。除了ICT机制外，近些年来出现了多种比率型荧光探针设计机理和设计模式，其中较为出色的是利用激发态能量转移(Excitation Energy Transfer，EET)[11-14]机制来设计新型的比率型荧光探针。关于EET机制和比率型荧光探针，前人已做了详细的介绍，其中Speiser[15]和Peng[16]等人分别对EET机理和比率型荧光探针的设计进行了总结。与ICT机制的比率型探针相比，EET型比率荧光探针具有明显的优势：（1）激发波长单一，双发射峰重叠少，比率值变化更加明显。受自身机制的限制，ICT型比率探针的双发射光谱存在较大重叠，比率值变化不明显并且在很大程度上会受到仪器灵敏度的限制，尤其是在荧光显微成像中，这一问题尤为突出；（2）比率值的变化不受溶剂极性等因素的干扰，EET体系中的荧光光谱取决于各自的荧光团，合理选择荧光团可以使其光谱不受“溶剂化效应”的影响，即比率值的变化不受微环境极性的影响，而仅仅与检测客体浓度相关。众所周知，ICT型比率荧光探针的荧光团均为分子内电荷转移体系，溶剂化效应是其自身难以克服的固有缺陷。EET机理能够克服上述ICT机理在设计比率型荧光探针方面的不足，具有广阔的前景。为了使科研工作者更好的了解EET比率型荧光探针的设计和构建模式，本文主要对近年来EET比率型荧光探针的研究进展进行总结，以期望研发出更多新颖的比率型荧光探针。

1 激发态能量转移（EET）

随着能量转移理论研究的不断深入，人们对能量转移过程有了更深的了解，设计合成了多种类型的EET体系[17,18]。能量转移体系的分类方法不尽相同，依据能量传递的方式可以分为跨空间能量转移（Through-Space Energy Transfer,TSET）和跨键能量转移（Through-Bond Energy Transfer, TBET）[15,19]。

图1跨空间和跨键型能量转移体系示意图，a. 跨空间型能量转移体系；b. 跨键型能量转移体系

Figure 1EET model of systems Through-Space (a) or Through-Bond (b)

1.1 Through-Space Energy Transfer（TSET）

跨空间(Through-Space，TS)能量转移机理由Prof. F?rster（1910-1974）于1946年首次提出。TSET体系是指两个不同的荧光团分别作为供体donor和受体acceptor，其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定程度的重叠，当两个荧光团相互靠近时（一般小于100?），可观察到能量由供体向受体转移的现象，即当激发供体时，能量由供体转移至受体，从而最终观测到受体以辐射（荧光）或非辐射的形式将能量释放出去[20,21]，如图1a所示。TSET 体系中供受体通过柔性链相互连接，该类型也称为F?rster Resonance Energy Transfer，FRET,即F?rster能量转移体系。

由于TSET体系中供受体间的连接方式采用柔性链连接，供体与受体间的空间取向（取向因子k2）会发生变化，取向因子k2的大小取决于供受体偶极跃迁的空间取向，通常其数值介于0-4之间，该数值的变化会直接影响对F?rster

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半径的R 0的估算，如公式1所示[22]，最终会影响能量转移效率的计算。取向因子k 2的影响在均一的溶液中并不显著，这是因为在均一的溶液中供受体间保持了较为稳定的空间距离和空间取向。当采用TSET 体系作为分子标尺测量生物大分子的空间距离时，方向因子的影响就较为凸显，这是由于供受体的空间取向会受到微环境中其他生物大分子的干扰。

6/140

420])()([211.0λλλελd I n k R A D D ∫

∞

?Φ= (1)

式中k 2 表示偶极取向因子，能量供体与受体间的相互取向无规则时，因子k 2 = 2/3；ФD 是供体的量子效率；n 是溶剂因子；I D （λ）是供体的归一化荧光光谱；εA （λ）是受体的摩尔消光系数。

该理论指出能量既可以在分子内的不同荧光团间转移，也可以在不同分子间发生转移，通过改变供受体间的空间距离可以有效地调控供受体间的能量转移过程。常见的TSET 体系多为两个发色团结构，近些年来也出现了多发色团的能量转移体系，例如Zissel [17]和Xiao [18]分别报道了基于氟硼吡咯（BODIPY ）为母体的三荧光团EET 体系，多发色团的能量转移体系将会在光捕集系统、光电材料等领域发挥重要作用。

1.2 Through-Bond Energy Transfer （TBET ）

除了TSET 之外，还有一类重要的能量转移体系，即通过刚性链连接的EET 体系，也称为跨键（Through-Bond ，TB ）能量转移（TBET ），如图1b 所示。TBET 体系中供体和受体均处于同一分子内，二者之间的空间距离相比TSET 体系要小，并且空间取向较为固定，不易发生改变，可以通过电子云的重叠区域实现电子交换，从而使能量由供体转移至受体。由于电子交换的速率相比于偶极耦合更为快速，因此，与TSET 体系相比，TBET 型能量转移体系表现出较快的能量转移速率，并且在一定的空间距离内，TBET 体系的能量转移效率基本不受空间距离与光谱交盖的影响。

图 2 供受体具有不同空间取向的TBET 能量转移体系

Figure 2 TBET cassettes with different orientations between donor and acceptor

与TSET 体系的连接方式不同，TBET 体系中供体和受体之间通过刚性的、部分共轭的π电子体系进行连接，最为常见的π电子体系是苯乙炔、二苯乙炔等结构单元[23,24,25]。Topp 和Burgess 设计并合成了三个系列的基于苯乙炔、二苯乙炔连接单元的TBET 体系I [23]，如图2所示,由于供受体S 0-S 1能级间跃迁矩的取向不同，使得三类能量转移体系在能量转移速率上呈现出明显不同。当供受体间跃迁矩取向处于同一轴线上时，如I-1所示，能量转移速率最快，能量转移所用的时间最短（<0.2ps ），此时供受体间空间距离的适当增大或减小不会对能量转移速率产生影响；其次是供受体间跃迁矩取向相互垂直，如I-2所示，此时能量转移所用的时间处于～0.4ps ，而该能量转移过程也不受供受体间光谱交盖程度的影响；当供受体间跃迁矩取向保持平行时，如I-3所示，能量转移的速率最慢，约为6ps ，但依然比TSET 体系要快得多，TSET 体系的能量转移时间一般处于20—50ps 。TSET 和TBET 体系的不同点不仅仅在于其连接方式的不同，更重要是体现在供/受体间的能量转移速率不同，通常TBET 体系的能量转移速率比TSET 体系要高1-2个数量级[21]。 1.3 影响EET 效率的因素

无论是TSET 还是TBET 体系，其能量转移过程都受到多种因素的干扰，有时可能是多种因素共同作用的结果。EET 体系中供体与受体间的能量转移过程会受到三方面因素的影响：

（1）供体的发射光谱和受体的吸收光谱存在一定程度的重叠或交盖。光谱重叠的程度取决于荧光团自身的光谱

S 0--S 1transition moment

I-1

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性质，改变供受体间的光谱交盖程度，可以有效调控能量转移效率，从而使供受体荧光峰呈现双波长比率的变化。选择合理的供/受体荧光团，对于成功设计EET比率型荧光探针至关重要。

（2）供体和受体之间具有合适的空间距离，一般介于1-100 ?。该空间距离是调控能量转移过程的另一个重要因素。通过改变供体荧光团与受体荧光团的距离，可以调控能量转移的效率。当激发供体时可以观测到供/受体各自荧光强度发生改变，在荧光光谱上直观表现为波长比率值的变化，这为设计基于EET机理的比率型荧光探针提供了理论依据。因此，利用调控供受体的空间距离来设计EET比率型荧光探针是也是设计EET型荧光探针的主要另一重要方式。

（3）除了上述两个基本条件之外，供体和受体之间的连接方式也是影响供受体间能否发生能量转移的重要因素。EET体系中的供受体通常要通过一个非共轭的连接臂相连，该连接臂可以是柔性的烷烃链，也可以是刚性的芳环。无论采用何种连接方式，在设计EET体系时荧光团之间的电子转移不容忽视，因为分子内的电子转移效率往往比荧光团间的能量转移效率高得多[26-29]。

2 EET比率型荧光探针的研究进展

2.1 基于丹磺酰胺为供体的EET比率型荧光探针

图3基于丹磺酰胺的EET比率型荧光探针

Figure 3EET Ratiometric fluorescent probes with dansylamide fluorophore as energy donor

丹磺酰胺的吸收光谱处于330-400 nm，荧光发射光谱位于460-600 nm，其作为能量转移供体通常要与长发射的荧光团构建EET体系，其中能量受体通常选用罗丹明系列荧光团。2008年Park 和Kim报道了基于丹磺酰胺为能量供体、罗丹明B荧光团作为能量受体，通过三氨乙基胺柔性链作为连接臂和识别位点，设计Cu2+了比率型荧光探针1[30]（图3）。该探针能够于水溶液中快速的检测铜离子，其与Cu2+的络合常数为7.0×103 M-1。在没有Cu2+存在下，探针1由于罗丹明螺内酰胺呈闭环形式，其吸收峰位于紫外区，在可见区无吸收、无荧光，当用420 nm的激发光激发丹磺酰胺荧光团时，由于供受体间光谱无交盖，能量转移不能发生，此时只能观测到受体丹磺酰胺在507 nm 处发射的绿色荧光；结合Cu2+后，罗丹明螺环被打开，罗丹明荧光团在可见区的吸收和荧光得以恢复，当用420 nm 的激发光激发丹磺酰胺荧光团时，能量由丹磺酰胺转移至罗丹明荧光团，能量转移效率达到93%，此时可以观测到探针1在580 nm处发射的红色荧光。随着铜离子的不断加入，探针1在507 nm和580 nm处呈现双波长比率的变化。探针1是通过调控供受体间的光谱交盖程度实现对能量转移过程的调控，最终实现了对溶液中Cu2+的比率检测。然而由于丹磺酰胺荧光团是典型的ICT型荧光团，吸收和荧光光谱谱带较宽，其与罗丹明的荧光峰存在较大的重叠，加之丹磺酰胺的激发波长处于紫外区，最终限制了其用于生物体内Cu2+的共聚焦显微成像。

2010年Das等人也报道了基于丹磺酰胺和罗丹明6G分别为能量供体和受体的汞离子比率型荧光探针2[31]（图

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3）。该探针表现出较好的汞离子选择性，除了铜离子存在一定的竞争之外，其他金属离子对其无干扰。在乙腈与水的混合溶剂中（体积比1:1），随着汞离子的加入，探针2在530 nm 处的吸收峰不断增强，500 nm 处的荧光峰不断减弱，而550 nm 处的荧光峰不断增强，探针与汞离子的络合常数达3.9×104 M -1。探针2与探针1识别机理类似，同样是利用通过调控供受体间的光谱交盖程度实现对能量转移过程的调控。不同之处在于探针2中供受体间的连接方式发生了变化，连接臂与识别位点实现了分离，这一改变理论上有利于设计多种比率型荧光探针。然而，值得注意的是，在无金属离子存在下，当激发供体时观测到探针2在400-650nm 的范围内呈现较宽的谱带，这是由于在溶液中即使无汞离子存在下，罗丹明螺内酰胺依然存在少量的开环形式，这表明该连接模式会影响罗丹明螺内酰胺的稳定性[32]。

2.2 基于香豆素为供体的EET 比率型荧光探针

香豆素及其衍生物是一类重要的香料，也是重要的荧光染料。其吸收光谱通常处于350-450 nm 之间，荧光光谱处于400-550 nm 。香豆素也被广泛用作能量供体设计多种EET 比率型荧光探针，Chang 以香豆素为供体，荧光素为受体设计了比率型过氧化氢探针3[33]（图4），供受体间通过稳定构象的环己二胺作为连接臂，探针分子在未遇到过氧化氢前，由于荧光素经硼酸酯的“屏蔽（mask ）”作用，其结构为类荧光素螺内酯的环状结构，其吸收光谱处于紫外区，与香豆素的发射光谱没有交盖，所以激发香豆素荧光团时观察不到能量受体的荧光，只能观测到香豆素的蓝色荧光。当与过氧化氢作用后，由于过氧化氢可以解除类荧光素中硼酸酯的“mask ”作用，而使其生成荧光素。能量受体荧光素的吸收光谱与香豆素的发射光谱存在较大的重叠，此时能量转移顺利发生。激发香豆素时可以观察到荧光素的发射光谱，这一过程实现了EET 由“关”到“开”的转化，探针的荧光光谱红移并呈现比率型变化。该探针被已成功用于细胞内过氧化氢的检测。

图 4 基于香豆素为供体的EET 比率型荧光探针

Figure 4 EET ratiometric fluorescent probes with Coumarin as energy donor

Hamachi [34]等人报道了类荧光素ATP 荧光探针4-2Zn(II)（图4），该探针在与锌离子结合后，其占吨环能与水分子结合，生成在可见区无吸收、无荧光的中间体。当遇到ATP 后，失去水分子荧光得以恢复，与ATP 作用后荧光明显增强，增强倍数达到33倍。在水溶液中，4-2Zn(II)与ATP 的结合力较强，其结合常数达到1.3×106 M -1。4-2Zn(II)的这一性质非常适合设计“开-关”型的EET 比率型荧光探针。于是Hamachi 等人以香豆素为能量供体，以4-2Zn(II)为受体，通过乙酰基哌嗪作为连接臂，设计了识别ATP 的EET 比率型荧光探针5和6。5与6的区别在于香豆素的结构不同，其对ATP 的识别机理与4-2Zn(II)类似，均是通过与锌离子络合形成5-2Zn(II)和6-2Zn(II)，再与水分子结合形成隐色体，当与ATP 作用后，失去水分子荧光得以恢复。在这一过程中，由于香豆素作为能量供体，用340 nm 激发光激发香豆素，由于5-2Zn(II)的类荧光素荧光团是隐色体，在可见区无吸收，能量转移过程处于关闭状态，只能观测到能量供体香豆素在454 nm 处的荧光发射；当遇到ATP 后，类荧光素荧光团失去水分子，其在可见区的吸收恢复，能量转移过程处于开放状态，激发供体香豆素可以观测到受体荧光素在525 nm 处的绿色

3

4-2Zn(II)

6R=NEt 2

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荧光。因此识别ATP 的过程中可以观测到双波长比率的变化，比率值R 从0.14增加至1.95，增幅△R 达1.81。该探针已被成功用于细胞内核苷中多磷酸含量的可视化监测，同时也可以监测ATP 相关酶的活性。

香豆素作为能量供体，能量受体可以选用荧光素，也可以选用罗丹明荧光团。然而由于香豆素的荧光发射多处于400-500 nm ，与罗丹明的吸收光谱交盖较少，Lin [35]等人首次报道了一系列以香豆素为供体，罗丹明为受体并且具有较大Stokes 位移的EET 体系。其中报道的探针7（图4）可以作为EET 比率型pH 荧光探针，Lin 等人借助于Through-Bond 型能量转移的连接方式，将光谱交盖较少的香豆素和罗丹明通过刚性的苯环连接在一起，由于刚性非共轭的连接方式，使得香豆素至罗丹明的能量转移效率基本不受光谱交盖的影响。探针7体系中能量由香豆素转移至罗丹明荧光团的效率高达99%。

2.3 基于萘酰亚胺为供体的EET 比率型荧光探针

萘酰亚胺荧光染料在荧光探针领域中扮演着重要的角色，在阳离子、阴离子及有机小分子的识别上做出了突出的贡献，而近些年来发现其具有较好的非线性光学特性[36,37]，使得萘酰亚胺被广泛用于多个领域。由于萘酰亚胺在4-位上的衍生方法灵活，因此其吸收和荧光光谱分布较宽，吸收光谱通常处于350-500 nm ，荧光光谱处于450-550 nm 。Ramaiah 等人报道了基于萘酰亚胺和丹磺酰胺的EET 比率型铜离子荧光探针8[38]（图5）。萘酰亚胺与丹磺酰胺的吸收光谱极为相近，在没有铜离子存在下，激发萘酰亚胺发色团，由于萘酰亚胺的4位没有衍生，其发射光谱与丹磺酰胺的吸收光谱重叠，从而发生能量转移，可以观测到丹磺酰胺在525 nm 处的荧光发射；当加入铜离子后，铜离子与丹磺酰胺结合，使得丹磺酰胺的吸收光谱出现蓝移，其与萘酰亚胺的发射光谱重叠较小，不能发生能量转移，所以当激发萘酰亚胺时，只能观测到萘酰亚胺在375 nm 处的荧光峰，从而实现了比率识别铜离子。由于该探针的激发波长为337 nm 处于紫外区，在用于生物样品的检测时，较短的激发波长会对生物样品造成损伤，但是该工作具有重要的理论意义，为设计通过调节光谱移动调控EET 过程的比率型荧光探针提供了新思路。

图 5 基于萘酰亚胺为供体的EET 比率型荧光探针

Figure 5 EET ratiometric fluorescent probes with Naphthalimide as energy donor

N N

O O

118

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Bojinov 等人报道了基于萘酰亚胺为供体、罗丹明6G 为受体的EET 比率型pH 荧光探针9[39]（图5）。该探针与以往的EET 比率型荧光探针不同，在探针9体系中除了能量转移过程之外，还存在光诱导电子转移过程（Photoinduced Electron Transfer ，PET ），即萘酰亚胺的4位上引入了N-甲基哌嗪，由于哌嗪结构中的N 原子能够淬灭萘酰亚胺荧光团。当溶液的pH>8.0时，受体罗丹明6G 处于螺内酰胺结构，在可见区无吸收无荧光；此时激发供体萘酰亚胺（Ex ：390 nm ），由于哌嗪N 原子的淬灭作用，所以只能观测到萘酰亚胺在514 nm 处微弱的荧光。随着溶液pH 的降低，当溶液的7.0

Li 等人还报道了基于萘酰亚胺和罗丹明的EET 比率型铬离子荧光探针10[40]（图5），能量供体和受体之间通过柔性链进行连接。通过铬离子的络合诱导罗丹明螺内酰胺发生开环反应，开环后的罗丹明在568 nm 处有强吸收，其与萘酰亚胺的荧光光谱交盖增大，从而实现了能量由萘酰亚胺转移至罗丹明荧光团，可以观测到592 nm 处的荧光不断增强，544 nm 处的荧光不断减弱，比率值由0.73增至5.63；探针与铬离子按1:1络合，络合常数为9.4×103 M -1。利用该探针成功实现对细胞内铬离子的比率型荧光成像。萘酰亚胺除了与罗丹明荧光团搭档之外，还可以与长波长染料方酸构建EET 比率型荧光探针。Xiao 课题组选用长波长、窄峰型的荧光团方酸作为能量受体、萘酰亚胺为能量供体设计了EET 比率型氰根离子荧光探针11[41]（图5）。对于探针11，在未加入氰根离子的时候，激发供体萘酰亚胺，能量由供体转移到受体方酸，观测到方酸在636 nm 处的荧光峰；当加入氰根离子后，氰根离子对方酸亲核加成，改变了方酸的吸收光谱，使得EET 不能发生，最终实现了EET 由开到关的调控，并获得荧光的比率变化。试验中发现，供体发色团与受体发色团靠得太近会发生明显的电子转移，通过改变供受体间的空间距离，可以有效抑制供受体间的电子转移。

2.4 基于荧光素为供体的EET 比率型荧光探针

图 6 基于荧光素为供体的EET 比率型荧光探针

Figure 6 EET ratiometric fluorescent probes with Fluorescein as energy donor

荧光素的荧光发射峰处于500-530 nm ，是常用的供体发色团。荧光素和罗丹明是最为常见的EET 能量供体和受体。荧光素作为能量供体其5(6)位上的羧基发挥了重要作用。由于羧基的衍生方式有多种类型，例如酰胺的方式

P O -O

5-TAMRA

11

12

12-Zn 2+

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衍生，Nagano报道一个基于荧光素为供体，罗丹明为受体的EET比率型羟基自由基荧光探针11[42]（图6）。该体系由柔性的过脱氧胸苷二聚体进行连接，柔性链既是连接臂又是羟基自由基的反应位点，在没有羟基自由基存在下，当激发供体6-FAM（496 nm）时，能量转移发生，观测到受体5-TAMRA在576 nm处发射荧光。当遇到羟基自由基后，羟基自由基会使两个荧光团的连接键断裂，供体与受体间的空间距离增大。此时激发供体6-FAM，由于荧光素与四甲基罗丹明发色团间断开了连接，空间距离增大不能满足能量转移的必要条件，因此只能观测到荧光素自身在518 nm处的荧光发射。该探针表现出了较好的选择性和抗干扰性，其他活性氧与活性氮对其无干扰。

供体荧光素除了借助于羧基通过酰胺键连接受体，还可以借助于荧光素醛与受体进行连接，构建EET比率型荧光探针。Rusin[43]和Lippard[44]等人报道在50% NaOH的溶液中荧光素与氯仿发生Reimer-Tiemann反应生成荧光素醛，荧光素醛被广泛用来设计PET型荧光探针。2010年Zhang[45]等人利用荧光素醛与罗丹明B螺内酰肼反应，通过Schiff 碱将荧光素和罗丹明荧光团构建在同一EET体系中，设计了EET比率型锌离子荧光探针12（图6）。当锌离子与探针12结合后，由于锌离子的络合会诱导罗丹明螺内酰胺发生开环反应，当激发供体荧光素荧光团时能量转移得以发生，从而观测到双波长比率的变化。该探针表现出较好的选择性和灵敏度，其对锌离子的检测极限达到40 nM。这要归功于供受体的选择以及供受体间的连接方式。由于荧光素和罗丹明的发射峰型窄、荧光峰重叠少（半峰宽只有20-40 nm），所以双波长比率值的变化较为明显。细胞成像实验表明探针12能够定量检测细胞内的锌离子，是有潜在应用前景的比率型锌离子荧光探针。

图7基于荧光素为供体的TBET比率型荧光探针

Figure 7TBET ratiometric fluorescent probes with Fluorescein as energy donor

荧光素作为能量供体，其与能量受体的连接方式还可以采用非共轭的刚性连接模式，其中最具代表的是Burgess 研究组在TBET体系方面的研究工作[46,47,48]。Burgess利用荧光素为能量供体，类罗丹明作为能量受体，通过非共轭的、刚性的二苯乙炔基将荧光素与罗丹明连接在一起，设计合成了TB型的能量转移体系13[46](图7)。在pH 8.0 的磷酸盐缓冲溶液中，化合物13只在556 nm处呈现出一个强吸收峰；当用556 nm激发化合物13时，观测到受体罗丹明在579 nm处发射的强荧光，同时供体荧光素在560 nm处的荧光峰并未完全消失，这意味着化合物13在该条件下能量并未由供体荧光素完全转移至受体罗丹明荧光团，能量转移效率仅仅为80%，然而这并不影响化合物13用于对小鼠酰基辅酶A蛋白（ACBP）的标记以及示踪成像。值得注意的是，化合物13体系中由于供受体的吸收和发射光谱交盖过大，化合物13在556 nm处的吸收峰是由供受体荧光团各自吸收峰叠加而成。随后Burgess研究组采用长波长的罗丹明为受体设计合成了能量体转移体系14[47]（图7）。化合物14与化合物13相比，不同点在于化

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合物14将标记位点设计在荧光素2羧基上，使该荧光素与罗丹明的体系设计成具有通用性的EET标记试剂，这为设计其他新型的EET标记试剂具有重要的启示意义。在使用化合物14对ACBP标记示踪成像中，发现化合物14在细胞中的光谱性质与其在体外磷酸盐缓冲溶液中（pH 8.0）不同，其原因可能是受到细胞微环境的干扰，这种干扰主要来自于细胞内酸碱性的不均一以及供体荧光素的pH敏感性。于是Burgess等人设计了以荧光素为能量供体、氟硼吡咯为能量受体的EET体系15（FB）[48]（图7），该体系中能量供体和能量受体依然通过苯乙炔基进行连接，并将FB体系成功应用于细胞内pH的比率监测。荧光素对中性pH较为敏感，其荧光在pH 6.5-7.0范围内变化明显，因此FB体系中的供体荧光素也具有pH敏感性。当溶液的pH<6.0时，荧光素在溶液中以未解离的酚羟基（FB-phenolic form）的形式存在，488 nm激发供体荧光素发色团后，能量由荧光素转移至氟硼吡咯荧光团，故可以观测到受体氟硼吡咯在600 nm处的荧光峰；当溶液的pH>6.5时，荧光素在溶液中的主要存在形式是解离的酚羟基（FB-phenolatic form）形式，激发供体荧光素发色团，此时仅有少量能量由供体转移至受体，故可以观测到能量供体荧光素在525 nm 处的荧光峰。该探针在pH 5.0-8.0的溶液中能够比率的监测pH的变化。经过体外的校正试验后，探针FB已被成功用于细胞内pH的比率成像，并且可以定量的检测和监测细胞内pH的变化。

2.5 基于氟硼吡咯(BODIPY)为供体的EET比率型荧光探针

氟硼吡咯即氟化硼络合二吡咯甲川（Boron Dipyrromethene，BODIPY）是一类重要的荧光发色团，其于1968年被首次报道后，直到最近一二十年间才被人们广泛关注和利用。氟硼吡咯荧光染料具有非常优异的光化学物理性能，例如：①其摩尔消光系数高，在可见区400-520 nm范围内摩尔消光系数高达~(5-7)×104 L/mol?cm；②其荧光量子产率高，荧光量子产率高达0.8~1，即使在水溶液中也具有较高的荧光量子产率；③其光谱性质非常稳定，不易受到溶剂极性和pH值的影响。与ICT型荧光染料相比不存在“溶剂化效应”。④其荧光光谱峰宽较窄，半峰宽通常不超过50 nm，与同为绿光区的荧光素相比具有更加稳定的pH不敏感性；⑤光稳定性高，其光稳定性要明显优于同波段的荧光素和罗丹明110。因此，氟硼吡咯优异的性能使其被广泛用于有机功能材料和生物荧光检测等领域。

BODIPY的结构修饰有多种方式[49-52]，通过修饰人们可以获得不同发射波长的BODIPY荧光染料，因此基于BODIPY的EET荧光探针也是较为常见。Akkaya研究组设计了以短波长的BODIPY为供体、长波长的BODIPY为受体的银离子和汞离子荧光探针16和17[53,54]（图8）。在与银离子或汞离子结合前后，能量转移过程一直保持着“开”的状态。在未结合目标客体时，当激发供体，能量转移至长波长BODIPY。由于受体的荧光较弱，故只能观测到微弱的受体荧光。当探针与目标客体结合后，由于能量转移过程并未发生改变，故激发供体能够观测到受体的荧光增强。尽管受体部分在识别银离子时有波长的蓝移，但由于识别前荧光很弱，所以识别后可以看作荧光增强型识别，而观测不到双波长比率的变化。通过氟硼吡咯自身构建比率型荧光探针的目的并未实现，除此之外该体系还存在的不足之处在于，BODIPY染料具有很强的疏水性，这些探针在使用过程中必须加入大量的有机溶剂，因此限制了此类探针的应用。然而，该探针的优势在于短波长氟硼吡咯的引入，使得探针分子的斯托克位移可增加至100 nm以上；同时该体系中BODIPY采用刚性非共轭的连接方式，使得能量转移效率高达99%，这些均为设计大斯托克位移、高能量转移效率的荧光探针提供了新的设计思路。

近年来，罗丹明隐色体的开关环反应被广泛用于设计增强型荧光探针。众所周知，罗丹明的2-羧基与伯胺反应后由于氨基的亲核性，会最终形成闭环并且结构稳定的罗丹明螺内酰胺结构，该结构在可见区无荧光无吸收，但在目标客体的诱导下又会发生开环反应，生成强荧光的罗丹明衍生物，在550-650 nm呈现出强荧光、在540-600 nm 范围内呈现强吸收 [55]。罗丹明的长波长发射以及螺内酰胺开关环特征反应，使其非常适合作为能量转移的受体来设计EET比率型荧光探针，这一点已被丹磺酰胺供体的EET比率型荧光探针所验证[30,31]。BODIPY优异的光谱特性使其成为罗丹明EET比率型荧光探针设计中能量供体的首选发色团。2008年Xiao课题组利用罗丹明螺内酰胺的开关环反应，首次以BODIPY为能量供体、罗丹明螺内酰胺为受体设计了EET比率型汞离子荧光探针18[56]（图8），该探针实现了对汞离子的高灵敏、高选择性的定量检测。随着汞离子的不断加入，探针在560 nm处的吸收峰不断增强，这是由于汞离子的诱导脱硫使得罗丹明的螺内酰胺开环并生成稳定的恶唑结构，开环后的罗丹明衍生物其最大吸收峰处于560 nm处；随着汞离子的不断加入，探针的荧光光谱在514 nm处的发射峰逐渐减弱，589 nm处的发射峰逐渐增强，荧光光谱最大发射波长红移可达75 nm，呈现出明显的双波长比率变化，比率值介于0-5.5之间。细胞比率成像实验表明，探针18能够借助于比率值的大小对细胞内的汞离子进行定量检测。该结果进一步证明氟硼吡咯和罗丹明的组合在设计高灵敏的EET比率型荧光探针方面具有明显优势。

有机化学 研究论文

图 8 基于氟硼吡咯为供体的EET 比率型荧光探针

Figure 8 EET ratiometric fluorescent probes with BODIPY as energy donor

探针18与探针1、探针9以及探针12等EET 比率型荧光探针相比具有一个共同的特点：能量供体发色团与罗丹明单元的链接位点处于螺内酰胺一侧，并且与探针的识别位点融合在一起。这一共性使得在利用EET 机理设计比率型荧光探针的时候缺乏通用性，尤其是在设计探针时需要充分考虑识别位点与能量供体之间的合理连接方式。与众多的增强型罗丹明荧光探针相比，这些探针的设计模式不具有通用性。为了构建比率型荧光探针的通用型能量转移平台，Xiao 课题组首次报道了基于BODIPY 为能量供体、罗丹明为能量受体的平台分子19（BRP ）[57]（图8）。为了实现平台的通用性，Xiao 等人将罗丹明的2位羧基应予以保留外，同时为了获得带有其他的活性基团的罗丹明，该课题组首次成功合成分离得到单一取代的5/6溴代四甲基罗丹明（TMR ）[58]，通过高效的Pd 催化偶联反应将BODIPY 与TMR 荧光团构建成EET 平台分子BRP ，BRP 分子在质子和非质子型溶剂中分别呈现出橙色和绿色荧光（图8）。为了进一步验证平台具有设计EET 比率型荧光探针的通用性，该课题组还报道了两个基于BRP 的汞离子

N B N

F F

O

S 20

21

I n t e n s i t y

Wavelength(nm)I n t e n s i t y

Wavelength(nm)

Fluorescent response of 20upon addition of mercury ion Fluorescent response of 21upon addition of mercury ion

Chinese Journal of Organic Chemistry ARTICLE

比率型荧光探针20、21[57]（图8）。随着汞离子浓度的增加（0-0.35 μM），探针20在562 nm处出现新的吸收峰，随着汞离子的不断加入，该吸收峰不断增强，同时BODIPY发色团的吸收峰（λabs 500 nm）也有所增强；荧光光谱呈现双波长比率变化，510 nm处荧光峰不断降低，584 nm处的荧光峰不断增强，如图8所示。当汞离子浓度处于0.03-0.3 μM（6-60 ppb）范围内，I584/I510比率值与汞离子的浓度成非线性关系，其数值介于0-7之间，荧光比率变化范围较宽并且变化明显，探针20具有较高的灵敏度。与探针20相似，探针21在遇到汞离子后也呈现出双波长比率的变化；不同之处在于，当汞离子的浓度处于6.5-62.5 μM（1.3-12.5 ppm）范围内，I585/I510比率值与汞离子的浓度成良好的线性关系，如图8所示；共聚焦成像表明BRP平台具有普遍适用性，并且基于BRP能量转移体系的平台，可以成功的设计多种比率型荧光探针，这必将为设计针对不同客体的比率型荧光探针提供更多可视化的工具。

3 展望

随着对荧光染料性能和能量转移机理研究的不断深入，人们对能量转移的过程以及能量转移过程的调控越来越熟悉，设计的能量转移体系多种多样、纷繁复杂。在EET体系的设计中，较为常见的荧光团有香豆素、荧光素、罗丹明、氟硼吡咯BODIPY、萘酰亚胺等，通过选用不同的荧光团分别作为能量供体或受体，可以构建多种EET体系；加之近年来，许多新型的荧光团被不断的设计合成出来[59-61]，这为构建多功能化的EET体系提供了更多的选择。

随着新兴的荧光显微技术的出现与技术革新，基于EET的比率型荧光探针目前面临着极佳的发展机遇，但同样也面临着挑战。首先EET机理与其他机理相比，尽管在一定程度上能够克服溶剂化效应、具有比率值变化更为明显等优势，但是在设计合成上EET体系合成困难，体系较为复杂，并且不具备设计不同客体的通用性。因此，EET 比率型荧光探针在设计上急需构建更多的平台分子，以便简化EET比率型荧光探针的合成；其次，香豆素、萘酰亚胺、丹磺酰胺等ICT型荧光团在极性溶剂中存在明显的溶剂化效应，目前EET比率型荧光探针中多选用这些荧光团作为供体，导致EET比率型荧光探针的光谱和比率值会受到溶剂极性的干扰。而且这些荧光团的激发波长通常处于紫外区，激发光会对生物样品产生极大的损伤，限制了其在生物成像领域的应用。可供选择的供体荧光团相对较少，因此急需研发不受溶剂极性、pH影响以及光稳定性和溶解性均较好的荧光团。此外，目前在EET比率型荧光探针的设计中绝大多数采用光谱交盖原理的设计模式，而利用调控空间距离的方式来设计比率型荧光探针还具有极大的发展空间。

有机荧光团中可做为EET供体和受体还远不止上述这些，其它如菁染料也是应用较广泛的一类。基于EET机理的比率型荧光探针，以其激发波长单一、双发射峰重叠少、比率值变化灵敏且不易受到干扰等优势，必将成为比率型荧光探针的设计主流。

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有机化学

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ARTICLE

* E-mail: yuhaibo@https://www.doczj.com/doc/2714526936.html,

Received September 23, 2014; revised November 18, 2014; published online December 2, 2014.

Project supported by the National Natural Science Foundation of China (21302080). Program Funded by Liaoning Province Education Administration (L2014010).

国家自然科学基金(No.21302080)，辽宁省教育厅科研项目(No.L2014010)资助项目.

DOI: 10.6023/cjo201409036 研究论文

Recent Progress in Ratiometric Fluo-rescent Probes Based on EET Mecha-nism

Chen, Zhonglin; Li, Hongling; Wei, Jia; Xiao, Yi; Yu Haibo *

Chin. J. Org. Chem. XXXX , XX (XX), XX

The recent progress in noticeable EET systems and ratiometric fluorescent probes based on EET mechanism is reviewed. The selection of donor and acceptor fluorophores, connection form, and the modulation of spatial distance or spectral overlap between donor and acceptor are mainly discussed. Finally, as a promising tool, the future devel-oping prospects of EET fluorescent probes in bioimaging and medical diagnostics are discussed and highlighted.

荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +

Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光

荧光比率探针及其应用研究进展

７ 前　言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用，　此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。 荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据，　通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。 另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳＊　，郭成海，张国胜 （防化研究院第四研究所，北京　１０２２０５） 摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量 ＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。 １应用比率测量的阳离子探针： 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用，　如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 １．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针： 探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－　Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、　ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２

荧光探针汇总

1.Fluo-3 AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离 的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2.Mag-fura-2 AM（钙离子荧光探针） 原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2，从而被滞留在细胞内。Fura-2可以和钙离子结合，结合 钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的荧光，而在380nm激发光下则会 导致荧光减弱。这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内 的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗 漏，细胞厚度差异等一些误差因素。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长为340nm和380nm 发射波长510nm （蓝色） 备注仪器滤光片不适用 3Fluo-4-AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo 4 是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。所以用氩 激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。由于Fluo 4与钙离子的亲和力 和Fluo 3近似，所以使用上和Fluo 3也基本相同 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长494nm 发射波长516nm （绿色） 备注用激光器激发时荧光强度强，因此不推荐 4.DCFH-DA （活性氧荧光探针） 原理DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长485nm 发射波长520nm （绿色） 备注推荐使用 5.DHR 123 （活性氧荧光探针） 原理本身无荧光, 在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化, 转变成发射绿色荧光的罗丹明123 (Rhodamine 123), 因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS), 如过氧化物, 次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6.RhodamineI23 （线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料, 能够迅速被活线粒体摄取, 而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515 ~ 575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位

荧光探针研究新进展

《生物工程进展》2000,Vol.20,No.2 荧光探针研究新进展 章晓波　徐　洵 (国家海洋局第三海洋研究所,厦门　361005) 摘要　自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(hetero2 geneous assay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneous assay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。 关键词　荧光探针　分子信标探针　荧光PCR 1　常规荧光探针 固相杂交中,探针非特异结合于支持物表面,降低了灵敏度。Heller等(1982)以及Heller和Morri2 son(1985)[3]最早进行了同相杂交试验,同相杂交不需支持物,减少了固定目的DNA及除去未杂交探针等操作。他们的试验中使用了两个探针,这两个探针分别与目标DNA的两个相邻区域互补,第1探针在3′末端标记,第2探针在5′末端标记,根据标记物的光谱特性,使第1标记物为第2标记物的能量供体。当探针与目标DNA杂交时,二探针彼此靠近,光吸收或化学反应激发供体标记物,通过能量转移引起受体标记物的激发,这样,第1标记物发射光的减少以及(或)第2标记物发射光的增加标志着目标DNA的存在。 后来Morris on等[3]扩展了这一方法,他们使用的两个探针互补且相应于目标DNA上同一碱基序列,一个探针在5′末端标记荧光素,另一互补探针在3′末端标记荧光素发射的淬灭剂芘丁酸(pyrenebutyrate)或磺基若丹明101(sulforhodamine101)。无目标DNA 时,两探针结合,荧光素的能量转移至淬灭剂,不产生荧光。存在目标DNA时,探针与目标DNA之间竞争杂交,由于探针与目标DNA的结合,在494-496nm 光照下,产生荧光,目标DNA浓度越高,荧光信号越强,最低可检测到4pM的目标DNA,此方法得到一些应用[2,4,5]。Cardullo等[4]在应用Morris on方法的同时,提出在两个互补探针的5′末端分别标记荧光素和四甲若丹明(T etramethylrhodamine),因为荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy trans ferr FRET)的效率随供体和受体之间距离的-6次方而减少,当两者相距20个核苷酸(70!)即产生不明显的能量转移,因此此方法中所使用的探针长度较短,特异性降低。 2　分子信标探针 同相杂交一般同时采用两个标记探针,Tyagi 和Kramer(1996)[6]首次建立了分子信标探针(molecular beacon probe),在同一寡核苷酸探针的5′末端标记荧光素、3′末端标记淬灭剂(DABCY L)。分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环与目的DNA碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA无关的碱基互补的臂。无目的DNA时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂,DABCY L吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。当探针遇到目的DNA 分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,便两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。 影响分子信标探针构型变化的参数主要有[6]:臂长、臂序列GC含量、噜扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在Mg2+存在条件下,4～12个核 41

荧光探针汇总

精心整理 1. Fluo-3AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3AM 的荧光非常弱，进入细胞后可以 被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2. Mag-fura-2AM （钙离子荧光探针） 原理Fura-2AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM 进入细胞后可以被细胞内的酯 3 4. 成5. 原理本身无荧光,在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化,转变成发射绿色荧光的罗丹明 123(Rhodamine123),因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS),如过氧化物,次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6. RhodamineI23（线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料,能够迅速被活线粒体摄取,而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515~575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位

备注正在使用 7.Hoechst33342（DNA荧光探针） 原理Hoechst33342是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。Hoechst 染料可透过细胞膜在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合并对DNA染色而发出强 烈的蓝色荧光。 生理意义标记双链DNA 激发波长355nm发射波长465nm（蓝色） 备注正在使用 8.FDA 原理FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。 生理意义反映细胞膜完整性和细胞活力 9.PI（ 倍。 10.EB 11.DAPI 20 12.CalceinAM 原理Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色 荧光，且细胞毒性很低，适合用于活细胞染色。 生理意义检测细胞膜完整性 激发波长494nm发射波长517nm（绿色） 备注跟FDA功能类似，细胞毒性很低，可以长时间标记细胞，但价格比较贵 13.BCECF-AM(pH荧光探针) 原理BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发 形成绿色荧光。 生理意义检测细胞内pH

基于EET机理比率型荧光探针的研究进展

有机化学 Chinese Journal of Organic Chemistry ARTICLE * E-mail: yuhaibo@https://www.doczj.com/doc/2714526936.html, Received September 23, 2014; revised November 18, 2014; published online December 2, 2014. Project supported by the National Natural Science Foundation of China (21302080). Program Funded by Liaoning Province Education Administration (L2014010). 国家自然科学基金(No.21302080)，辽宁省教育厅科研项目(No.L2014010)资助项目. DOI: 10.6023/cjo201409036 研究论文 基于EET 机理比率型荧光探针的研究进展 陈忠林a 李红玲a 韦驾a 肖义b 于海波a ,* (a 辽宁大学 环境学院 沈阳 110036) （b 大连理工大学 精细化工国家重点实验室 大连 116024) 摘要 激发态能量转移（Excitation Energy Transfer, EET ）作为一类重要的光物理现象，被广泛用于比 率型荧光探针和分子灯标的设计以及DNA 检测等多个领域。影响EET 效率的两个重要因素是供受体间的空间距离和光谱交盖，通过调节供受体间的空间距离或光谱重叠程度来调控能量转移过程，实现对目标客体的双波长比率检测。本文综述了基于不同供受体荧光团的EET 体系、供受体间的连接方式对能量转移效率的影响，以及通过调控供受体间光谱重叠程度或空间距离，获得识别不同客体的比率型荧光探针，并对EET 机理的比率型荧光探针的设计以及未来在生物成像和医学检测等领域的应用进行了展望。 关键词 荧光探针; 激发态能量转移; F?rster 能量转移; 比率型荧光探针; 荧光发色团 Recent Progress in Ratiometric Fluorescent Probes Based on EET Mechanism Chen Zhonglin a Li Hongling a Wei Jia a Xiao Yi b Yu Haibo a * (a College of Environmental Sciences, Liaoning University, Shenyang) (b State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian) Abstract Excitation Energy Transfer (EET) is one of the vital photophysical phenomenons, which is wide-ly used in many applications, such as the design of ratiometric fluroesent probes, molecular beacon and DNA analysis, and so on. The process of energy transfer from donor to acceptor can be regulated by two factors: the spatial distance between donor and acceptor, and the spectral overlaps between donor’s emission and acceptor’s absorption, which results that there is a wide variety in the ratio at two different wavelengths of ratiometric fluo-rescent probes. In this review, noticeable EET systems with different donor fluorophore, connection form and energy transfer efficiency between donor and acceptor, and the modulation of spatial distance or spectral overlap are summarized. Finally, as a promising tool, the future developing prospects of EET fluorescent probes in bioi-maging and medical diagnostics are discussed and highlighted. Keywords Fluorescent probe, Excitation energy transfer, F?rster resonance energy transfer, Ratiometric probe, Fluorophore 随着荧光显微成像技术和时间分辨技术的迅速发展，基于超分子化学和有机染料的荧光探针现已成为研究生物学和医学领域相关问题的重要工具。荧光探针在与目标客体相互作用过程中荧光信号会发生改变，借助于荧光信号的变化，荧光探针能够对目标客体进行实时在线的检测或监测，并被广泛用于分析化学，生物化学，医学和环境监测等多个领域[1]。荧光探针主要有三种类型：淬灭型、增强型和比率型。由于增强型荧光探针在与目标客体作用后，荧光输出信号增强，在荧光显微成像中比淬灭型荧光探针更为灵敏，故增强型荧光探针是目前荧光探针领域设计的主流[2]。 与增强型荧光探针相比，比率型荧光探针在定量检测方面具有明显的优势，近些年来，比率型荧光探针的设计

生物化学与分子生物学进展(基础)期末考试总结

生物化学与分子生物学进展（基础） 概论、目的基因 分子克隆的载体 核酸序列分析 聚合酶链反应（自学） 分子克隆技术常用的工具酶（自学） 肿瘤转移的分子机制 新生血管研究与转化医学 细胞周期与细胞增殖 基因打靶的设计与实现 细胞分化的分子机制 医学系统生物学和蛋白质组学 细胞信号转导 一、1.操纵子那张图 以乳糖操纵子为例，其组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I 存在诱导物（乳糖）时，mRNA得到转录；不存在诱导物时，mRNA无法转录。 （1）阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。（2）CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。 2.概念 （1）基因诊断：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽。（2）基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。包括直接导入外源正常基因、采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因、将特定的基因导入非病变细胞等。（3）pBR322：大小为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚，是最早应用于基因工程的大肠杆菌质粒载体之一，有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个。 （4）pUC质粒系列：是在pBR322基础上改建成的。大小约2.69kb，去除了pBR322的抗四环素区段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。含有易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用α互补原理进行蓝白筛选。 3.分子医学的主要研究内容 分子医学是指从基因的角度重新认识疾病，运用基因技术预防、诊断和治疗疾病。研究内容主要包括疾病的分子机理、基因诊断、基因治疗和基因预防这四个方面。 （1）疾病的分子机理：探索疾病的原因，是有效治疗疾病的前提。基因科学的发展，为人类从细胞内部的微观生理学和分子生物学水平上寻找病因提供了新的思路。以尿黑酸症为例，

双光子荧光探针的研究进展

有机双光子材料的研究进展 随着以光电子学为中心的信息时代的到来，具有特殊信息处理功能和超快响应的光电材料将成为未来信息材料发展的主体，而非线性光学材料就是其中发展较为迅猛的一种。非线性光学是强光光学，研究的是物质在强光作用下产生的输出光强度与原入射光的非线性关系。非线性光学材料在强光作用下，反映介质性质的物理量（如极化强度P等）不仅与场强E的一次方有关，而且还决定于E的更高幂次项，从而导致许多在线性光学中不能解释的新现象，表现出独特的非线性光学性质。双光子吸收属于三阶非线性光学效应的一种，有着独特的光学和电学效益，使得双光子技术在未来光电子集成、生物分子探测、医学诊断等领域具有巨大的应用潜力和广阔前景[1]。 一、双光子吸收的基本概念 双光子吸收属于三阶非线性光学效应，该理论最早是由Goeppert- Mayer于1931年首次提出的。它是指在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发该样品，使其通过一个虚中间态(virtue state)直接吸收两个光子跃迁至高能态的过程，所吸收的两个光子的能量可以相同(ω1=ω2，简并吸收)，也可以不同(ω1≠ω2，非简并吸收)，其机理如图1所示。 图1 单、双光子吸收和发射机理示意图 和单光子吸收和发射相比，双光子吸收和发射有以下本征特点： （1）在材料中高的穿透深度。单光子荧光过程是短波激发长波发射，吸收和发射所涉及的基元光物理过程服从Stark-Einstein定律。而双光子荧光是长波激发短波发射，所用激发光的波长红移近一倍，一般位于600-900nm，远远低于单光子过程紫外辐照光(波长为250-400nm)的光子能量。这一波段的光具有很好的穿透性，Rayleigh散射小，背景光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。

分子荧光的机理和荧光探针原理

1.3荧光分子探针识别机理 1.3.1光诱导电子转移[4,12](Photoinduced Electron Transfer,PET) 典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团部分R(reseptor)，通过一间隔基S(space)和荧光团F(fluorophore)相连而构建。其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所，识别基团部分则用于结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。PET荧光探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱，一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射出强烈荧光（图1-1）。PET荧光探针作用机制可由前线轨道理论来说明（图1-2）。由于与客体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”、“开”状态，因此这类探针又被称做荧光分子开关。 图1-1 PET荧光探针的一般原理图LUMO 图1-2 PET荧光探针的前线轨道原理图 已报道的PET荧光分子探针中，多数都是以脂肪氨基或氮杂冠醚作为识别基团。de Silva 研究小组利用多种荧光团设计了大量该类PET探针用于氢质子、碱金属阳离子识别。化合物1是一个简单的PET荧光分子探针，在甲醇中和K+络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.14。钱旭红等设计的PET荧光探针（化合物2），对氢质子有很好的识别作用，已被Molecular Probe公司推广为细胞内酸性内酯质探针。de Silva研究小组利用类似于EDTA

谷胱甘肽荧光探针的研究进展

第46卷第7期2018年4月广　州　化　工 Guangzhou Chemical Industry Vol.46No.7Apr.2018 谷胱甘肽荧光探针的研究进展 * 石　磊1,2,黄　玲3,龚盛昭1,2 (1广东轻工职业技术学院轻化工技术学院,广东　广州　510300;2广东省绿色日用化工工程技术研究中心,广东　广州　510300;3佛山市安安美容保健品有限公司,广东　佛山　528099) 摘　要:谷胱甘肽在生物体的许多生理过程中发挥着重要作用,所以细胞内谷胱甘肽含量的检测对细胞功能研究和病理分 析都具有重要的意义三以荧光探针为基础的荧光分析法因其操作简便二灵敏度高和专一性强等优点而备受大家关注,并且有机小分子荧光探针还可以应用于活体细胞和生物体的成像技术三本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的研究现状,并按照谷胱甘肽与探针识别基团的识别机理分类阐述,同时对谷胱甘肽荧光探针的未来发展趋势进行了展望三 关键词:谷胱甘肽二荧光探针二识别机理二检测　 中图分类号:O657.3 　文献标志码:A 文章编号:1001-9677(2018)07-0023-06 * 基金项目:广东轻工职业技术学院人才类项目(项目编号:KYRC2017-0031)三第一作者:石磊(1985-),男,博士,讲师,主要从事荧光探针的合成与应用三通讯作者:龚盛昭三 Research Progress on Fluorescent Probes for Glutathione * SHI Lei 1,2,HUANG Ling 3,GONG Sheng -zhao 1,2 (1School of Chemical Engineering and Technology,Guangdong Industry Polytechnic,Guangdong Guangzhou 510300;2Guangdong Engineering Technical Research Center for Green Household Chemicals,Guangdong Guangzhou 510300; 3Foshan Anan beauty &Health products Co,Ltd,Guangdong Foshan 528099,China)Abstract :Glutathione plays an important role in many physiological processes of life system,and the detection of glutathione in cell is significant for the research of cell function and pathological analysis.Fluorometric analysis based on fluorescent probes has attracted much attention due to its advantages,such as simple operation,high sensitivity and specificity.Moreover,the organic fluorescent probes could also be applied to bioimaging technology for living cells and organisms.The research progress on glutathione fluorescent probes was introduced and classified according to the recognition mechanism between glutathione and recognition groups of probes,and the developing trends of fluorescent probes for glutathione were prospected. Key words :glutathione;fluorescence probe;recognition mechanism;detection 谷胱甘肽(Glutathione,缩写GSH)是一种含有巯基二氨基和γ-酰胺键的三肽,主要由谷氨酸二半胱氨酸和甘氨酸组成三谷胱甘肽是细胞内一种重要的调节代谢物质;它不仅能够清除体内的过氧化物及其他自由基,促进肝脏酶活性二解毒和维持红细胞膜完整性等作用,同时还具有维持DNA 的生物合成和细胞免疫等多种生理功能[1-2]因此,检测生物体中的GSH 含量对于一些疾病的预防二研究和治疗都具有十分重要的作用,故而引起了诸多科研工作者的高度关注[3-4]三 相比于分光光度法二色谱法二毛细管电泳法二电化学法等传统检测方法,以荧光探针为基础的荧光分析法具有测试简单二选择性高二响应时间短等优点三更重要的是,荧光探针还能应用于生物体内的实时监测和生物成像研究,故而被广泛应用于生物医学二分析化学和化学生物学等诸多领域[5-6]三 近年来,基于谷胱甘肽的荧光探针得到了迅猛发展;若按照谷胱甘肽与荧光探针识别基团的识别机理进行分类,可以将 其分为加成反应取代反应和还原反应三本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的设计合成与应用进展,并分类阐述如下三 1　加成反应 加成反应是利用GSH 中具有亲核性的巯基与不饱和双键(主要是碳碳双键)发生加成反应,使得探针的荧光发射光谱发生变化,从而实现对检测对象的识别与检测三 1.1　马来酰亚胺类 自Kanaoka [7]首次报道了以马来酰亚胺作为生物硫醇识别基团的荧光探针以来,基于马来酰亚胺的香豆素二BODIPY二喹啉二萘酐等[8-10]荧光探针陆续涌现出来,并成功应用于生物体内GSH 的选择性识别(图1)三然而,按此原理构建的大部分荧光探针对半胱氨酸(Cys)二同型半胱氨酸(Hcy)和GSH 均有响应,很难对这三者进行区分;仅少许报道是例外三其中,

香豆素类荧光探针研究进展

医药化工化 工 设 计 通 讯 Pharmaceutical and Chemical Chemical Engineering Design Communications ·204· 第44卷第6期2018年6月香豆素又名苯并-α-吡喃酮，广泛存在于自然界中，并且 在许多植物中也存在大量的香豆素类衍生物[1]。香豆素类化合 物不仅在抗肿瘤药物的开发方面进行研究，并且以香豆素为骨架的基团也常作为荧光探针中最优的荧光团之一，其具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与修饰、良 好的荧光量子产率和好的光稳定性等特点。本文通过以香豆素为骨架的荧光探针对待测物的选择性不同进行分类，对近几年报道的香豆素类荧光探针进行了概述。 1 二氧化硫衍生物荧光探针 二氧化硫溶于水中，形成亚硫酸盐和亚硫酸氢盐之间的 平衡[2]。高浓度的亚硫酸盐会导致过敏反应、哮喘、胃肠疾病及皮肤过敏等疾病[3]。因此，用荧光探针技术来检测细胞中HSO 3-/SO 32-具有重要意义。Zhao 等将香豆素和苯并咪唑通过C —C 双键连接得到荧光探针1[2]，亚硫酸盐与该探针的α，β-不饱和酮之间的发生迈克尔加成反应，导致π共轭被阻断，荧光发生改变。该探针利用单光子荧光成像技术成功的实现了对活细胞中亚硫酸盐的检测。Feng 课题组以氮杂香豆素-半花菁偶联物为母核，设计合成比率型近红外荧光探针2[4]。该探针在条件温和的水溶液中对HSO 3-有好的选择性和高的灵敏度，成功应用于活 细胞中内源性和外源性亚硫酸氢盐的荧光成像研究。Li 课题组设计合成了以香豆素-丙二腈衍生物为骨架，以缺电子的C —C 双键为HSO 3-的反应位点的比率型荧光探针3[5]。该探针对 HSO 3-有高的选择性和敏感性，并且成功应用于对MCF-7细胞中HSO 3-荧光成像的研究。2 活性氧荧光探针活性氧（Reactive Oxygen Species ，ROS ）包括了超氧阴离子（O 2-）、过氧化氢（H 2O 2）、羟基自由基（·OH ）、次氯酸（HOCl ）以及一氧化氮等，这些物质的活性较高，在人类健康和疾病中有着重要的作用[6]。Liu 等以双光子可激发的香 豆素基团为荧光团，苯偶酰为荧光淬灭和H 2O 2的特异性识别基团设计了荧光探针[7]。该探针在H 2O 2的存在下，苯偶酰基团可以通过Baeyer-Villiger 反应转化为苯甲酸酐，然后苯甲酸酐水解得到苯甲酸，并释放荧光团。该探针成功运用单光子和双光子进行了实验，表现出对H 2O 2的选择性要高于其他活性氧分子，具有高灵敏度。运用单光子显微镜和双光子显微镜实现了其在MKN-45细胞中对H 2O 2的成像研究。Yoon 等以香豆素-半花菁染料为骨架，通过C —C 双键连接设计合成了荧光探针[8]。荧光探针中的双键被ONOO -氧化，大的共轭被阻断，从而导致ICT 过程被破坏，并成功应用于细胞中内源性和外源性ONOO -的检测。Zhao 课题组基于FRET 机理以香豆素-苯乙烯基-苯并噻吩为母核设计合成了靶向于线粒体基团的荧光探针[9]。并且该探针可靶向于细胞的 线粒体，成功应用于RAW264.7细胞中内源性和外源性ClO -的检测。Lin 等以苯并吡喃-香豆素为骨架设计合成了选择性检测ClO -的荧光探针[10]。次氯酸盐与该探针的α，β-不饱 和羰基发生反应导致π共轭体系中断从而产生香豆素基团的荧光性质，该探针具有低的细胞毒性及成功应用于Hela 细胞中次氯酸盐的荧光成像研究。3 硫醇化合物荧光探针硫醇类化合物与人类的生活、健康和疾病有着密切的联系。例如，半胱氨酸（Cys ）、高半胱氨酸（Hcy ）和谷胱甘肽（GSH ）等生物小分子硫醇在维持氧化还原稳定、生物催化、结合金属和翻译后的修饰中起着重要的作用[11]；硫化氢（H 2S ）是一氧化氮（NO ）和一氧化碳（CO ）之后的第三种气体信号分子[12]。在血管舒张、血管生成、细胞凋亡、炎症、神经调节和保护缺血再灌注的损伤等生理过程中起重要作用[13]。因此，在生理条件下硫醇化合物进行检测具有重要的意义。 Feng 等以香豆素-TCF 骨架为荧光团，丙烯酸酯为反应基团得到荧光探针[14]，在GSH/Hcy 存在下该探针也可特异性的检测Cys ，该探针的细胞毒性较低且成功用于对HeLa 细胞中 Cys 的检测和荧光成像研究。Guo 等设计了含有氯基团的香豆素-半花青素荧光探针[15]，该探针基于不同的发射波长来检测Cys 和GSH 。Zhang 等以N ，N-二乙基香豆素为荧光团，2，4-二硝基苯磺酰胺为苯硫酚的识别基团和荧光淬灭基团设计 合成了荧光探针10[16]。该结构可以阻断N ，N-二乙氨基的扭曲来增加荧光团的荧光。 4 其他类型荧光探针以香豆素衍生物为骨架的荧光探针在N 2H 4、H +、溶剂极性及金属离子等检测方面也被广泛应用。Y u 等设计了第一个用于 实时监测线粒体pH 的比率型型荧光探针[17]。该探针的酚羟基 是一个pH 敏感的基团，在酸性或中性条件下，羟基是弱的供 电子基团；在碱性条件下羟基去质子化得到O -，是强的供电子基团。因此，酚羟基的质子化和去质子化可导致发射波长的变化。5 结语 以香豆素为骨架的基团作为荧光探针中最优的荧光团之 一，具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与 修饰、好的荧光量子产率和好的光稳定性。荧光探针对基础 生物学研究以及对疾病的诊断和治疗都具有重要的作用，为 “可视化”提供了可能，因此，对荧光探针的研究受到了越来越多的关注。然而，在荧光探针的研究中也面临着更多的挑战。首先，开发真正高选择性和敏感性的探针仍具有挑战性，例如，摘　要：香豆素类化合物不仅具有广发的生物活性，同时香豆素类化合物具有荧光强度高、溶解性和细胞渗透性好及易于合成的优点。因此，香豆素类化合物也是优良的荧光团之一。综述了近几年利用香豆素片段为荧光团，对待测物进行荧光成像研究的荧光探针，同时对这些荧光探针的设计、机理及特点进行了概述。 关键词：香豆素；荧光探针；荧光成像 中图分类号：O631.3 文献标志码：A 文章编号：1003–6490（2018）06–0204–02 Research Progress of Coumarin Fluorescent Probes Qiu Yang ，Wen Kai ，Wang Zheng-long ，Zhou Xiang Abstract ：Coumarin compounds not only have broad biological activity ，but also have the advantages of high fluorescence intensity ，good solubility and cell permeability ，and easy synthesis.Therefore ，coumarin compounds are also one of the excellent fluorophores.In this paper ，fluorescence probes for fluorescence imaging of analytes using coumarin fragments as fluorophores are reviewed.The design ，mechanism and characteristics of these fluorescent probes are summarized. Key words ：coumarin ；fluorescent probe ；fluorescence imaging 香豆素类荧光探针研究进展 邱?洋，温?锴，王郑龙，周?湘 （中国药科大学有机化学教研室，江苏南京?210009） 收稿日期：2018–04–10 作者简介： 邱洋（1992—），男，山东淄博人，硕士研究生，主要研 究方向为靶向抗肿瘤小分子药物的设计及合成。

有机荧光探针最新研究进展

有机荧光探针最新研究进展 徐绍彬 （化学化工学院，1081109001） 摘要荧光探针是是一种极好的生物分子传感器,具备灵敏度高反应时间迅速等特点。近年来,随着生命科学的不断发展,荧光探针已经在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面发挥了重要作用。随着荧光探针的合成及应用技术的不断改进,人们对有机荧光化合物的认识和研究也不断深入,有机荧光探针的发展前景将越来越广阔。本文对最近几年国内外有机荧光探针的研究情况做一综述。 关键词BODIPY 荧光探针染料 探针是一种能和某特异靶分子相互作用,实现对靶分子进行检测的分子,并要求相互作用后对被探测对象不产生或仅产生可忽略的干扰。荧光探针就是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光,通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。荧光分析方法灵敏度高,选择性好,试样量小,在分析化学,特别是在分子生物学、生物化学、医学等领域中有较广泛的应用。由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱,检测灵敏度较差,人们用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或衍生,生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质,使检出限大大降低,这就是荧光探针技术。 荧光探针可有多种分类方法:按荧光波长可分为发射在紫外可见区的荧光探针和近红外区的荧光探针。按荧光探针用途不同可分为荧光标记试剂(fluorescent) 和荧光生成试剂(nuorlgenic)。按荧光探针物质本身的性质又可分为有机(包括稀土金属有机配合物) 荧光探针、量子点荧光探针、高分子荧光探针等。近年来随着生命科学的日益发展，大量的各式各样荧光探针被合成出来，人们对荧光探针技术的认识和研究也不断的深入。目前常用于合成荧光探针的染料有BODIPY、菁染料、噻嗪与噁嗪类染料、呫吨类染料等。本文将讨论最近三、四年的有机荧光探针的发展情况，并重点对基于BODIPY的有机荧光探针的合成及应用进行概述。 1 BODIPY类 二氟化硼－2－二吡咯甲烷(BODIPY) 是一类重要的有机荧光染料，由于其分子结构易于改性，近十年来研究人员合成了一系列的BODIPY衍生物，并在荧光探针技术上得到应用。这类荧光染料具有荧光量子产率高、摩尔吸光系数大、稳定性好、对pH、溶液极性不敏感等优点，因而在金属离子检测、PH值测定、DNA的标记及测序等方面得到重要应用。 1.1基于BODIPY的金属离子荧光分子探针研究进展 设计一种检测生理过程重要金属离子的荧光探针是非常活跃的领域，对金属离子探针的研究早在20世纪七八十年代就已开始，己经报道的探针分子成百上千。BODIPY类金属离子荧光探针的研究也陆续见诸报道，不少研究人员利用BODIPY荧光染料合成形形色色的金属离子荧光分子探针，使它代替了许多早期的荧光染料而应用在生物和化学分析方面。 2008年，Serdar Atilgan 等人通过逐步法合成了一种高灵敏的锌离子荧光探针。这种新颖的双苯乙烯基取代的BODIPY衍生物结合锌离子以后，发射峰从730nm蓝移至680nm，因而可做为发射峰在近红外区域的水溶性荧光探针。