动物医学进展,2011,32(1):38-43
Prog ress in Veterinary M edicine
Flag标签抗原的偶联及其单克隆抗体的应用研究＊
王云龙1,2,李忠信1,李恒思2,李玉林2,王继美2,刘旺根3,李兆学1
(1.河南工业大学,河南郑州450001;2.河南省生物工程技术研究中心,
河南郑州450001;3.郑州大学,河南郑州450001)
摘 要:探讨不同免疫原制备抗Flag标签单克隆抗体的效果,以及Flag标签单克隆抗体在融合蛋白纯化中的应用。通过碳化二亚胺分别合成Flag-BSA、Flag-OVA、Flag-KLH3种完全抗原,采用SDS-PAGE 和免疫效价对比方法确定偶联效果,选最优者利用杂交瘤技术制备抗Flag标签单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水,并对其纯化、分析和鉴定。制备交联抗Flag-mA b的亲和层析柱,纯化带Flag标签的融合蛋白,经SDS-PAGE电泳后薄层扫描分析纯度,用Western blot检测mAb对融合蛋白的反应性。Flag-K LH 偶联效果最好,小鼠免疫效价在104以上,共制备3株抗Flag标签单克隆抗体杂交瘤细胞株2B-7、3C-5、5F-2,分泌抗体均为IgG1类型,与其他融合蛋白标签无交叉反应,经亲和层析纯化融合蛋白纯度达85%,且都可用于融合蛋白的Weste rn blo t检测,建立了带Flag标签的融合蛋白纯化和检测方法。成功偶联了Falg 完全抗原并制备单克隆抗体,为带Flag标签的融合蛋白纯化提供重要工具。
关键词:Flag标签;偶联;单克隆抗体;免疫亲和层析
中图分类号:S852.4文献标识码:A文章编号:1007-5038(2011)01-0038-06
融合标签技术始于20世纪末,做为一种基于报告基因的DNA技术,它的出现极大促进了基因组学和蛋白质组学的发展[1-2]。Flag融合标签是一种含有8个氨基酸的短肽(Asp-Ty r-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Ly s),在探索蛋白质的结构和功能[3],特别是融合蛋白质的免疫吸附纯化方面有着广泛用途[4-5]。Flag标签结构短小,且与融合蛋白质之间含有一个肠激酶切割位点,可以通过肠激酶切割被除去。现已发展出了M1、M2和M53种抗-Flag单克隆抗体,但价格昂贵,且多从国外进口,本研究利用杂交瘤技术研制出了抗Flag单克隆抗体并将其应用于融合蛋白的吸附纯化,取得了成功,现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为本实验室保存。
1.1.2 试剂 Flag8肽,H RP标记的羊抗鼠IgG,牛血清白蛋白(BSA),卵清白蛋白(OVA),小鼠钥孔血蓝蛋白(KLH)均由河南省生物工程技术研究中心提供;RPM I-1640培养基,H A T,H T,福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂,碳二亚胺(EDC),兔抗小鼠IgG,IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3和IgM抗体,均为Sigm a公司产品。胎牛血清为Gibco公司产品; PEG2000为Merck公司产品;其它化学试剂均为分析纯。
1.1.3 仪器 酶标仪(M ULTISKAN M K3,T her-mo);磁力加热搅拌器为Co rning公司产品(PC-420),CO2培养箱为Fo rm a公司产品(3326型); SDS-PAGE电泳仪为BIO-RAD公司产品;96孔细胞培养板和24孔细胞培养板均为NUNC产品。
1.1.4 实验动物 Balb/c纯系小鼠购自中国医学科学院动物研究所,采用6周龄～8周龄鼠进行免疫和制备饲养细胞,采用5月龄雌鼠制备腹水。
1.2 方法
1.2.1 完全抗原的合成 参照文献[6]用碳化二亚胺法合成Flag-BSA、Flag-OVA、Flag-K LH偶联抗原,共得到3种抗原,置-20℃保存备用。
1.2.2 偶联效果的鉴定 参照文献[7]采用100g/L分离胶、50g/L浓缩胶的SDS-PAGE鉴定蛋白偶联前后的分子量变化,对偶联效果初步评价。再用紫外可见分光光度计测定合成抗原在OD260n m 和OD280nm的吸光度值,计算蛋白含量,公式OD280n m ×1.45-OD260n m×0.74=蛋白浓度(mg/m L)。
＊收稿日期:2010-03-19
基金项目:“十一五”国家科技支撑计划重点项目子课题(2006BA F07B01)
作者简介:王云龙(1962-),男,河南洛阳人,教授,主要从事细胞工程、生物制药技术研究。
1.2.3 动物免疫 分别用上述Flag-BSA、Flag-OVA、Flag-K LH免疫8周龄小鼠各6只,采用腹腔注射、皮下注射、脾内注射3种方式,每种抗原、每种注射方式各免疫2只小鼠,初次免疫剂量为50μg/只。另设佐剂和生理盐水对照组。首次免疫以福氏完全佐剂乳化抗原(脾内免疫不加佐剂)。加强免疫以福氏不完全佐剂乳化,每次免疫间隔2周。共免疫3次,最后1次免疫14d后尾静脉采血并分离血清,用间接E LISA法检测血清抗体效价,对比各种方法免疫效果,选取效果最好者用于细胞融合。细胞融合前3d,腹腔注射50μg免疫原加强免疫。1.2.4 单克隆抗体的制备 选取各种抗原不同免疫方法的效价最高者,采用实验室常规方法制备[8-9]。
1.2.5 单克隆抗体特性鉴定
1.2.5.1 单克隆抗体的特异性鉴定 将不同的抗原(Flag合成抗原、H is合成抗原、GST合成抗原、my c合成抗原)分别以100ng/孔按行包被酶标板,按列分别加入特异性单克隆细胞培养液和阴、阳血清,用间接ELISA法测定。
1.2.5.2 杂交瘤细胞染色体分析 将筛选出的阳性细胞传代培养3d,用秋水仙素阻断法处理细胞,使细胞周期停滞于分裂中期,油镜下进行染色体计数。
1.2.5.3 效价测定 以包被抗原(100ng/孔)包被ELISA板,腹水从1∶1000开始作梯度稀释。标记抗体为H RP标记的羊抗鼠IgG。间接ELISA法检测上清液抗体水平,使用双波长(测定波长为450nm,参考波长为630nm)测定吸光值,OD值大于阴性对照组值2.1倍以上者为阳性。
1.2.5.4 单克隆抗体亚型的测定 单克隆抗体亚型的测定用间接ELISA试验。
1.2.5.5 抗体蛋白浓度和纯度的测定 抗体蛋白浓度测定采用公式OD280×1.45-OD260×0.74=蛋白(m g/m L)。抗体纯度测定采用SDS-PAGE凝胶电泳分析纯度。
1.2.6 单克隆抗体的应用
1.2.6.1制备酶标抗体 采用改良过碘酸钠法[10],将H RP标记到抗体上,得到酶-抗体(H RP-IgG)结合物。1.2.6.2 酶标抗体活性的测定 将抗原用抗原包被液稀释成100ng/孔包被96孔酶标板,4℃过夜,按行分别加入倍比稀释的酶标抗体,ELISA间接法测定OD值,最后以酶标抗体稀释倍数为横坐标,对应OD值为纵坐标作图,得到一条曲线,从坐标图中找出OD值为1.0时所对应的酶标抗体稀释倍数,即得酶标抗体活性。
1.2.6.3 Western blot检测融合蛋白 参照文献[6],融合蛋白经SDS-PAGE电泳分离蛋白后,用电转移仪低温160mA稳压转移2h,取下NC膜。PBST(pH7.4的PBS+0.5m L/L吐温-20)冲洗后,用封闭液(10m L PBS T+0.3g牛血清白蛋白)封闭1h～2h。用抗Flag的m Ab(1∶1500稀释的腹水)室温孵育30min,再次冲洗。加入H RP酶标的羊抗鼠Ig G(1∶1500稀释)温育30min。彻底冲洗后,加入显色剂显色。以未经诱导的细菌裂解液为对照。
1.2.6.4 亲和层析柱的制备及含Flag标签融合蛋白的纯化 常规制备交联抗Flag mAb的Sepha-ro se4B亲和层析柱,对带有Flag标签的酵母菌裂解上清进行亲和层析,层析产物经SDS-PAGE电泳,薄层扫描分析纯度。
2 结果
2.1 抗原偶联的分子质量
Flag与BSA、OVA和KLH偶联后的分子量,较BSA、OVA与KLH分子质量有一定增加,说明完全抗原偶联基本成功,具备了作为免疫原的条件(图1)。
2.2 抗原偶联含量
紫外分光光度计测定结果为,合成抗原Flag-BSA蛋白含量为5.87mg/m L,Flag-OV A蛋白含量为4.19m g/m L,Flag-KLH蛋白含量为7.25mg/mL。
2.3 小鼠免疫效价
最后一次免疫后14d,小鼠尾静脉采血并分离血清,间接E LISA法检测抗血清效价,各种抗原免疫小鼠后,均能产生抗体,以Flag-KLH经腹腔注射组效价最高(表1)。
39
王云龙等:F lag标签抗原的偶联及其单克隆抗体的应用研究
M.Protein molecular weight M arker;1.Flag-BS A;2.BS A;3.Flag-OVA;4.OVA;5.Flag-KLH;6.KLH
图1 合成抗原SDS-P AG E电泳图
Fig.1 S DS-PAG E results of synthetic antigen
表1 各种抗原不同免疫方法血清效价检测结果
Table1 Anti-serum test results in differen t immu nization schedu les and different an tigens
抗血清稀释度
An tis erum dilu tion 1∶801∶1601∶3201∶6401∶12801∶25601∶51201∶102401∶204801∶40960
阴性对照
Negative
control
空白对照
Blank
control
A12.6412.5452.3772.0161.5121.3130.8290.5100.2750.1120.0220.012 A22.5322.3782.1081.8291.4451.2230.6340.4140.2240.1030.0200.008 A32.6882.6102.4562.2732.0531.7171.4371.0480.5000.3600.0150.004 B12.7422.4632.3502.1341.8121.5130.9290.6100.4050.2220.0170.011 B22.6102.2212.3772.0161.7231.4851.2230.9530.5860.2750.0100.006 B32.7562.5402.4392.2351.9421.7321.5411.2260.7620.3120.0250.014 C12.5442.3292.0751.7181.4671.3780.8200.5140.3450.2180.0230.009 C22.5012.3622.1631.6701.3630.9470.7420.5250.2570.1420.0220.008 C32.6802.4822.2452.1441.9031.6421.3040.8360.4720.2670.0190.010佐剂
Ad juvan t0.0190.0170.0160.0160.0110.0130.0100.0070.0050.0030.0140.003生理盐水
NS0.0160.0140.0110.0090.0100.0070.0050.0050.0030.0020.0090.006
A.脾内注射组;
B.腹腔注射组;
C.皮下注射组
1.Flag-BSA;
2.Flag-OVA;
3.Flag-K LH
A.Intrasplenic injection g rou p;
B.Intraperitoneal in jection group;
C.Su bcutaneou s g rou p
1.Flag-BSA;
2.Flag-OVA;
3.Flag-K LH
2.4 阳性细胞株抗体稳定性检测
经过对融合细胞的筛选和克隆化共获得3株高亲和力、高特异性Flag-mAb,分别命名为2B-7、3C-5、5F-2。经过多次传代、3次冻存及复苏,杂交瘤细胞分泌抗体稳定。
2.5 染色体鉴定
制备对数期杂交瘤细胞株中期染色体,计算50个分裂相,2B-7、3C-5、5F-2的染色体平均数分别为98条、104条、98条。因小鼠脾脏淋巴细胞染色体为40条,而SP2/0在60～70之间,可见杂交瘤细胞染色体数基本上是小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞染色体数之和。说明这3株细胞确为杂交瘤细胞。2.6 单克隆抗体腹水效价、亚型的测定
结果见表2。
表2 腹水效价、亚型测定结果
Table2 The resu lts of as cites titration and m Ab s ubtype
mAb腹水效价
A scites titration
单克隆抗体亚型
m Ab subtype 2B-7108IgG1
3C-5108IgG1
5F-2108IgG1
2.7 单克隆抗体蛋白浓度测定
蛋白浓度2B-7为1.61m g/m L,3C-5为1.32mg/mL,5F-2为1.36mg/mL。
40动物医学进展 2011年 第32卷 第1期(总第211期)
2.8 单克隆抗体交叉反应测定
各种融合标签蛋白与抗Flag-mAb的交叉反应如表3所示,3株mAb与H is合成抗原、GS T合成抗原、m yc合成抗原均无交叉反应,特异性强。
表3 单克隆抗体交叉反应结果Tab le3 Cross-reactivity profiles of m Ab
mAb Flag合成抗原
Flag synthetic antigen
His合成抗原
His synthetic antigen
GS T合成抗原
GS T synthetic an tigen
myc合成抗原
myc sy nthetic antigen
2B-72.2760.0450.0450.074 3C-52.2970.0350.0550.058 5F-22.1920.0530.0430.043
2.9 酶标抗体活性测定
如表4所示,将H RP标记到抗体上后,经过ELISA检测,在酶标抗体稀释106倍后,OD值2B-7为1.871,3C-5为1.542,5F-2为1.634。
表4 酶标抗体活性测定结果
Table4 The detection results of activity of enzyme-lab elled an tibody
稀释梯度
Dilution gradient102103104105106107108
阴性对照
Negative con trol
空白对照
Blank control
2B-72.3912.5782.4022.6521.8710.3540.0860.0100.005 3C-52.2342.5242.4092.5971.6340.3730.0780.0140.007 5F-22.1432.4612.3862.5311.5420.2580.0680.0120.007
2.10 Weste rn blo t检测融合蛋白
Flag的mAb均能与带有Flag标签的3种融合蛋白在其Ms处形成清晰的条带(图2),阴性对照(未经诱导的细菌裂解液)未有条带出现。结果表明,mAb可用于融合蛋白的Western blot检测。2.11 亲和层析柱的制备及含Flag融合蛋白的纯化
以抗Flag标签的单克隆抗体与NH S-activ ated Sepharose4B交联制备亲和层析柱,纯化真核表达的3种融合蛋白上清,洗脱液经SDS-PAG E电泳(图3),薄层扫描蛋白纯度可达85%以上
。
1.pET30-Flag/TP47;
2.pE T30-Flag/T P15;4.p ET30-Flag/TP17;3～5.阴性对照
1.pET30-Flag/TP47;
2.pE T30-Flag/T P15;4.p ET30-Flag/TP17;3-5.Negative con trol
图2 抗Flag mA b的W este rn blot鉴定
Fig.2 Identification of anti-Flag m Abs byWestern b lot
41
王云龙等:F lag标签抗原的偶联及其单克隆抗体的应用研究
1、3、5.未经纯化前样品;
2、4、6.亲和层析后样品
1,3,5.Pre-purification samples;2,4,6.Post-purification samples 图3 抗Flag标签单克隆抗体纯化融合蛋白结果
Fig.3 Fu sion protein purified by Flag mAb affinity column
3 讨论
小分子物质本身不具有免疫原性,不能直接刺激动物机体产生特异性抗体,因此,对于制备半抗原单克隆抗体来说,人工抗原(包括免疫原和包被原)的合成是关键的一步,合成抗原的质量直接决定着抗体的效价和特异性。目前并没有精确方法测定半抗原是否偶联到载体蛋白分子上,本研究采用偶联后抗原免疫动物,通过酶联免疫技术检测动物对偶联抗原的免疫应答反应,以此判断偶联效果。在酶联免疫检测过程中还发现使用BSA做为载体蛋白有一定的局限性,因为BSA可能影响ELISA检测结果[12]。
含标签的融合蛋白已经成为后基因组时代的重要研究工具,而抗标签蛋白的mAb也将成为研究相应融合蛋白的主要方法之一。我们应用淋巴细胞杂交瘤技术,共获得3株抗Flag的m Ab,具有效价高、特异性强、亲和力高的特点,在含Flag标签融合蛋白的亲和层析纯化中取得预期效果,建立了可用于Flag融合蛋白纯化和检测的方法,更为后基因组时代大量涌现的新分子的结构和功能研究提供了重要的工具,具有很高的实用价值。
参考文献:
[1] H onda S,Selker E U.Tools for fungal proteomics:mu ltifu nc-
tional neu rospora vectors for gene replacem ent,p rotein expres-
sion and p rotein purification[J].Genetics,2009,182(1):11-23.
[2] Babu M,Bu tland G,Pogou tse O,et al.S equential pep tide affini-
ty pu rification sy stem for the sys tematic isolation and iden tifica-
tion of protein complexes from Escherichia coli[J].M ethods
M ol Biol,2009,564:373-400.
[3] 鲁凤民,李雅娟,庄辉.N-端加flag标签增加P21Cip1/WAF1蛋白
质稳定性[J].癌变·畸变·突变,2006,18(2):119-121.
[4] 詹万雷,崔 东,郑文岭,等.FLAG融合短肽在重组蛋白质纯
化中的应用[J].生命的化学,2004,24(2):155-156.
[5] Gloeckner C J,Bold t K,S chu macher A,et al.T andem affinity
pu rification of protein complexes from mam mal ian cells by th e
S trep/FLAG(SF)-T AP tag[J].M ethods M ol Biol,2009,564: 359-372.
[6] 朱彦彩,王选年,银 梅,等.H is6免疫原的制备及免疫小鼠抗
体效价检测[J].河南农业科学,2007(12):116-119.
[7] 吕会田,乐加昌,陈存社,等.克伦特罗小分子半抗原偶联率的
测定方法研究[J].饲料工业,2005,26(3):57-58.
[8] 徐竹蔚,刘 莹,户 义,等.抗3种标签蛋白单克隆抗体的制
备及特性鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志,2005,21(5):613-
618.
[9] 侯小强,夏咸柱,高玉伟,等.H5亚型虎源流感病毒血凝素单抗
制备及胶体金试纸条的研制[J].动物医学进展,2007,28(1): 22-25.
[10] 奥斯伯F.精编分子生物学实验指南[M].颜子颖,王海林,译.
北京:科学出版社,1998:413.
[11] 萨姆布鲁克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T,等.分子克隆实验指
南[M].2版.金冬雁,黎孟枫,侯云德,译.北京:科学出版社,
1992:119-122.
[12] 吴庆儒,郭定宗,张桂荣,等.BS A对牛结核抗体E LISA检测
的影响[J].动物医学进展,2007,28(5):5-9.
42动物医学进展 2011年 第32卷 第1期(总第211期)
动物医学进展,2011,32(1):43-46
Prog ress in Veterinary M edicine
苦马豆素抑制α-甘露糖苷酶的剂量效应关系
孔祥雅,荆新堂,张丽慧,李勤凡＊,郭 伟
(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100)
摘 要:根据苦马豆素(Sw)抑制α-甘露糖苷酶(AMA)的特点,建立了SW抑制AM A的剂量效应关系曲线和酶法测定SW溶液浓度的方法。SW溶液浓度范围在5×10-8mo l/L～5×10-6mol/L时,SW溶液浓度的负对数与其抑制A MA活性百分比呈线性关系,线性方程Y=0.026X+5.1674,R2=0.9947。建立了酶法测定SW溶液浓度的方法,为疯草的进一步研究提供技术支持。
关键词:苦马豆素;α-甘露糖苷酶;活性
中图分类号:S856.9文献标识码:A文章编号:1007-5038(2011)01-0043-04
疯草(Locow eed)是豆科棘豆属(Oxy tropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物的统称,其主要有毒成分是吲哚兹啶生物碱—苦马豆素(Sw ainsonine, SW)。SW抑制溶酶体α-甘露糖苷酶(α-manno si-dase,AM A)而使机体甘露糖的代谢发生异常,大量蓄积在细胞内而引致细胞的空泡变性,并最终导致细胞死亡[1]。
由于SW毒性大,在疯草或中毒动物体内的含
收稿日期:2010-07-12
作者简介:孔祥雅(1987-),女,河北衡水人,硕士研究生,主要从事临床兽医学研究。＊通讯作者
The Coupled Antigens FLAG Tag and Its Monoclonal Antibody Application
WANG Yun-long1,2,LI Zho ng-x in1,LI H eng-si2,LI Yu-lin2,
WANG Ji-mei2,LI U Wang-g en3,LI Zhao-x ue1
(1.Henan University o f Techno logy,Zhen gz hou,Henan,450001,China;
2.Henan B iotechnolog y Resear ch Center,Zhengz hou,Henan,450001,Ch ina;
3.Zhen gz hou Un iver sity,Zheng zhou,Henan,450001,Ch ina)
Abstract:To study the influence of different imm unog ens fo r preparing anti-Flag-tag mo no clonal antibo d-ies,and the application of Flag-tag m onoclo nal antibody in fusion protein purificatio n,th ree co mple te anti-gens,Flag-BSA,Flag-OVA and Flag-KLH w ere sy nthesized though the carbodiimide m ethod.SDS-PAGE and im mune potency com pariso n w ere used to determine the coupling effect.T he best one as im muno gen w as selected for producing anti-Flag tag m ono clo nal antibody hy bridom a cell lines with hy bridom a technol-ogy,the ascites fro m mouse w as obtained,and its purification,analysis and identificatio n w ere conducted. The anti-Flag mAb affinity chromatog raphy column w as prepared fo r purifying fusion proteins with Flag tags,SDS-PAGE electrophoresis and T LC w ere used to analy se its purity,Western blo t w as used to deter-mine the reactivity o f mAb against the fusion protein.The coupling of Flag-KLH w as the best,and the an-tibody titer w as mo re than104.Three anti-Flag tag m ono clo nal antibo dy hybrido ma cell lines2B-7,3C-5 and5F-2w ere o btained,and all of them secreted mo noclonal antibo dies of IgG1type.There w as no cross-reactivity w ith the other fusion pro tein tag s,and the purity w as85%after affinity chrom atog raphy.It can be used in We ste rn-blo tt detection fo r o ther fusion proteins,and it can be used to se t up the metho ds for purification and detection against the fusio n pro tein w ith Flag-tag.The study successfully go t the coupling of the FA LG complete antig en and produced mo noclonal antibody.It provides an important to ol fo r the purification of fusion protein tagg ed w ith Flag.
Key words:Flag-tag;coupling;monoclonal antibody;immunoaffinity chrom atog raphy
解偶联蛋白2的功能调控方式 解偶联蛋白（uncoupling protein，UCP）是线粒体内膜的一类线粒体载体蛋白。大量的研究结果显示，UCP功能的异常与多种疾病关系密切。UCP2是UCP的一种重要类型，现综述概括UCP2的主要功能调控方式以及这些调控的生理意义。 肥胖、动脉粥样硬化、糖尿病、免疫失调等慢性疾病是严重影响人民群众身心健康的重要公共卫生问题。深入探讨这些疾病发生的分子机制并在此基础上探索有效的防护措施具有重要的意义。解偶联蛋白（uncoupling protein，UCP）属于一类存在于线粒体内膜的线粒体离子转运体家族成员。近年的研究发现解偶联蛋白在前述多种慢性疾病的发生发展过程中发挥着重要作用。而其本身的功能又受到多种机制的调控，现对这方面的进展进行综述。 1 解偶联蛋白概述 线粒体是真核细胞内主要的供能细胞器，通过对底物的降解反应产生ATP。在这个过程中，通过质子电化学梯度将底物的氧化与A TP合成偶联起来。但这种偶联并不是绝对的，质子可以通过线粒体内膜漏出（质子漏）而不引起A TP的产生，这个过程中一部分氧化产生的能量最后以热量的形式被消耗掉。质子漏与解偶联蛋白相关联，通过允许质子进入线粒体基质的方式，解偶联蛋白使质子梯度下将，从而导致氧化呼吸链的解偶联以及热量的产生[1]。最具特征性的解偶联蛋白为UCP1，UCP1在1978年被鉴定并在1988年被首次克隆。UCP1表达于棕色组织，在寒冷和食物所导致的非寒战性产热过程中发挥重要作用[2]。1997年，2种与UCP1相似的基因被克隆并分别命名为UCP2和UCP3。随后又筛选出2种新的UCP1相似物，并被分别命名为UCP4和UCP5/BMCP[3]。在各种UCP中，UCP2的组织分布最为广泛。 2 UCP2功能概述 人类的UCP2基因定位于11号染色体，主要表达于脂肪组织、骨骼肌、脾、肺、胰腺的β细胞以及巨噬细胞。虽然结构与UCP1相似，但是干扰、抑制UCP2的表达不会导致肥胖以及对寒冷敏感性的升高[4]。关于UCP2是否参与对寒冷应答的研究结果不尽一致，一般认为它不是主要的产热调控因子。但当特定的效应因子激活时，UCP2同样可以发挥促进产热的作用。由于对偶联过程、活性氧产物（ROS）产生以及脂肪酸代谢等多方面都有着广泛的影响，UCP2已经被发现参与多种生理、病理过程，如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、感染、衰老、肿瘤发生等。例如UCP2能够抑制β细胞分泌胰岛素，从而与Ⅱ型糖尿病有关[5]。UCP2诱导质子漏的一个重要作用是减少线粒体ROS的产生。UCP2的高表达可预防氧化损伤，而抑制UCP2的表达则可在多种细胞类型中促进氧化损伤[6]。此外，UCP2还通过缓解氧化应激抑制结肠癌以及动脉粥样硬化的发生[7]。 3 UCP2功能调控 3.1 遗传多态性在加拿大魁北克开展的一项人群研究发现UCP2基因的3个微随体与能量消耗有关[8]。此外，UCP2启动子866有一个G/A单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。而该SNP被证实与血液三酰甘油、总胆固醇以及低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）胆固醇水平有关[9]。在Ⅱ型糖尿病患者，866-A等位基因携带者的胰岛素分泌能力比G等位基因携带者要低得多[10]。在德国的高加索人中，携带同样等位基因的糖尿病患者神经病变发生危险性显著降低[11]。而在中国人、马来人以及印度人，携带同样等位基因者拥有更高的腰/臀比，同时代谢性综合征的危险性也增高[12]。虽然在女性韩国人866-G等位基因携带者UCP2的表达和转录水平都显著降低，同时具有更高的体重指数（body mass index，BMI）以及脂肪量[13]，拥有866-G等位基因的澳大利亚高加索人却拥有较低的血清三酰甘油以及较高的胰岛素敏感性水平[14]。另外，UCP2基因4号
关于半抗原制备的小结 小分子抗原现在做的最多的是农药和兽药，这方面的文献也很多。以前查过一些材料，作者觉得小分子抗原能否制备出高性能的单克隆抗体主要以下几点决定。 1、对于半抗原结构的选择，如果待测物本身含有NH ，COOH，OH等活性基团， 2 可以利用待测物活性基团加入间隔臂，然后联入载体蛋白就可以成功合成人工抗原，制备特异性良好的抗体。但大部分待测物上并不含有活性基团或活性基团对药物的特异性和极性影响很大，所以大部分用于人工抗原合成的半抗原要经过改造或从头合成。例如在关于有机磷农药倍硫磷的免疫检测方法的研究中，半抗原物的获得采用的合成方法并不是从倍硫磷开始合成，而是采用另一途径，从起始物重新合成，这样反而能取得较好的效果，这一点对于制备具有多残留检测能力的抗体来说更为重要，只需合成出几种待测药物共有的结构就有可能制备出具有多残留检测能力的抗体。 2、待测物本身的结构有时对建立方法的性能有很重要的影响，在分子量在111－1202Da的化合物制备的单克隆抗体的亲和系数的试验中，半抗原的分子量在334–374Da之间时，制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。但当要检测的小分子化合物的分子量小于300Da时，产生具有良好灵敏度和特异性单克隆抗体的可能性下降。这说明药物的分子量是影响抗体性能的重要因素。同时待测物的结构对于制备人工抗原的难易程度有重要影响，有些半抗原经过理论分析能制备出高质量的抗体，但从化学合成的角度，这些化合物可能是合成不出来的或工艺过于复杂，所以半抗原结构能否合成出来，也是半抗原结构设计过程中要考虑的问题。 3、如果待测物结构过于简单，可能也是不能建立免疫检测方法的。待测物的结构最好含有特征性的环状结构或侧链结构，甚至含有杂原子，都能够增加制备出高质量抗体的可能性。在对脂肪酸类物质制备抗体的试验中，对于脂肪酸类物质来说，如果含有两个以上的羰基，及与蛋白偶联之后还有多余的羰基增强亲水性，同时酰基的不饱和双键和极性的头部结构都可以做为B细胞的抗原决定簇，可以将其他抗原性很弱的部分变成强抗原性。再者如果脂肪酸含有平面结构，也可以作为抗原决定表位，使产生特异性的抗体。这说明小分子的极性以及不饱和键，
如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到 【摘要】用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定偶联效果，计算偶联率。利用免疫抗原免疫小鼠，制备小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性，为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础。 【关键词】雷公藤内酯醇；14位羟基修饰；人工抗原；多克隆抗体 雷公藤内酯醇（triptolide，TP）分子式C20H24O6，分子结构如图1，相对分子质量360.41，为二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分，具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效。长期以来，TP作为临床上公认的免疫抑制剂，主要用于各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗。近年来研究发现，该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药，说明它具有抗肿瘤效果，因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注。除此以外，它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用。近年来，国内外对TP具有如此广泛作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣，从多个不同的角度进行了研究。但是，由于缺少方便快捷的TP检测手段，长期以来对TP直接作用位点的研究一直十分困难，对TP作用的靶蛋白和作用途径知之甚少。细胞免疫化学是追踪分子在细胞内作用过程的有力工具，如果能够得到TP的抗体，就为利用细胞免疫化学研究TP的作用靶点和在细胞内的定位等提供了分子探针，为最终研究TP作用机制和寻找其靶蛋白提供了可能。作为小分子半抗原，TP需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原。为了不影响小分子的生物活性，提高偶联效率，我们需要选择合适的反应基团。已有的TP结构 活性研究显示，TP的不同生物效应依赖于不同的功能基团。研究证实，对于12，13位环氧进行开环反应所获得的稳定的衍生物雷公藤内酯三醇（triptriolide）会丧失免疫抑制和抗炎的生物活性。14位羟基是TP最容易被改造修饰的基团，研究表明，14位羟基被改造为水溶性的基团作为前药能极大改善小分子的水溶性，促进体内代谢，降低毒性，甚至能改善TP在体内的免疫抑制活性和抗肿瘤活性［1 2］。 综合考虑，TP的14位羟基是最合适的偶联基团。TP的水溶性不理想，且14位羟基不容易在温和条件下和蛋白载体反应，我们首先对14位羟基进行结构修饰，改造为水溶性的羧基，利用缩合反应偶联阳离子化牛血清白蛋白（cationized BSA，cBSA）和鸡卵清蛋白（OVA），合成TP的免疫抗原TP cBSA和检测抗原TP OVA。用免疫抗原免疫小鼠，顺利得到了TP的多抗。 1 实验部分 1.1 试剂和仪器 TP（购自SIGMA公司），cBSA（购自PIERCE公司），OVA，1 乙基 （3 二甲基氨
硅烷偶联剂的使用（完整篇） 一、选用硅烷偶联剂的一般原则 已知，硅烷偶联剂的水解速度取于硅能团Si-X，而与有机聚合物的反应活性则取于碳官能团C-Y。因此，对于不同基材或处理对象，选择适用的硅烷偶联剂至关重要。选择的方法主要通过试验预选，并应在既有经验或规律的基础上进行。例如，在一般情况下，不饱和聚酯多选用含CH2=CMeCOO、Vi及 CH2-CHOCH2O－的硅烷偶联剂；环氧树脂多选用含CH2－CHCH2O及H2N－硅烷偶联剂；酚醛树脂多选用含H2N－及H2NCONH－硅烷偶联剂；聚烯烃选用乙烯基硅烷；使用硫黄硫化的橡胶则多选用烃基硅烷等。由于异种材料间的黏接可度受到一系列因素的影响，诸如润湿、表面能、界面层及极性吸附、酸碱的作用、互穿网络及共价键反应等。因而，光靠试验预选有时还不够精确，还需综合考虑材料的组成及其对硅烷偶联剂反应的敏感度等。为了提高水解稳定性及降低改性成本，硅烷偶联剂中可掺入三烃基硅烷使用；对于难黏材料，还可将硅烷偶联剂交联的聚合物共用。硅烷偶联剂用作增黏剂时，主要是通过与聚合物生成化学键、氢键；润湿及表面能效应；改善聚合物结晶性、酸碱反应以及互穿聚合物网络的生成等而实现的。增黏主要围绕3种体系：即（1）无机材料对有机材料；（2）无机材料对无机材料；（3）有机材料对有机材料。对于第一种黏接，通常要求将无机材料黏接到聚合物上，故需优先考虑硅烷偶联剂中Y与聚合物所含官能团的反应活性；后两种属于同类型材料间的黏接，故硅烷偶联剂自身的反亲水型聚合物以及无机材料要求增黏时所选用的硅烷偶联剂。 二、使用方法 如同前述，硅烷偶联剂的主要应用领域之一是处理有机聚合物使用的无机填料。后者经硅烷偶联剂处理，即可将其亲水性表面转变成亲有机表面，既可避免体系中粒子集结及聚合物急剧稠化，还可提高有机聚合物对补强填料的润湿性，通过碳官能硅烷还可使补强填料与聚合物实现牢固键合。但是，硅烷偶联剂的使用效果，还与硅烷偶联剂的种类及用量、基材的特征、树脂或聚合物的性质以及应用的场合、方法及条件等有关。本节侧重介绍硅烷偶联剂的两种使用方法，即表面处理法及整体掺混法。前法是用硅烷偶联剂稀溶液处理基体表面；后法是将硅烷偶联剂原液或溶液，直接加入由聚合物及填料配成的混合物中，因而特别适用于需要搅拌混合的物料体系。 1、硅烷偶联剂用量计算 被处理物（基体）单位比表面积所占的反应活性点数目以及硅烷偶联剂覆盖表面的厚度是决定基体表面硅基化所需偶联剂用量的关键因素。为获得单分子层覆盖，需先测定基体的Si－OH含量。已知，多数硅质基体的Si－OH含是来4-12个/μ㎡，因而均匀分布时，1mol硅烷偶联剂可覆盖约7500m2的基体。具有多个可水解基团的硅烷偶联剂，由于自身缩合反应，多少要影响计算的准确性。若使用Y3SiX处理基体，则可得到与计算值一致的单分子层覆盖。但因Y3SiX价昂，且覆盖耐水解性差，故无实用价值。此外，基体表面的Si-OH数，也随加热条件而变化。例如，常态下Si－OH数为5.3个/μ㎡硅质基体，经在400℃或800℃下加热处理后，则Si－OH值可相应降为2.6个/μ㎡或＜1个/μ㎡。反之，使用湿热盐酸处理基体，则可得到高Si－OH含量；使用碱性洗涤剂处理基体表面，则可形成硅醇阴离子。硅烷偶联剂的可润湿面积（WS），是指1g硅烷偶联剂的溶液所能覆盖基体的面积（㎡/g）。若将其与含硅基体的表面积值（㎡/g）关连，即可计算出单分子层覆盖所需的硅烷偶联剂用量。以处理填料为例，填料表面形成单分子
兽药人工抗原的合成方法 1 兽药人工抗原的合成方法 兽药人工抗原合成的基本方法为兽药半抗原与载体蛋白质的偶联。 1.1 半抗原的合成大多数的兽药小分子不具有直接与载体蛋白质交联的功能团（羧基和氨基），需要通过化学合成或衍生的方法首先制备出具有活性交联功能团的相应半抗原。理想的半抗原（合成或衍生后的半抗原）应具有待测物（待测的半抗原原型）的特征结构，且与载体连接后应保持该特征结构能在最大程度为免疫细胞识别和结合（能将该基团暴露）。兽药半抗原活性基团种类主要有-NH2、 -COOH、-OH、-SH，在与载体偶联制备人工抗原时，有些活性基团还需要先进行选择性保护和去保护，如阿维菌素半抗原的合成(李俊锁等，1999)。不同的兽药有不同的半抗原活化方法，目前获得半抗原常用的方法有：对药物分子进行改造使之产生活性基团；在药物分子内部引入活泼卤元素，达到所需反应的目的；利用原形药物的代谢产物作为活泼半抗原；利用化学合成的方法合成有活性功能团的半抗原；直接购买与半抗原结构相似的有活性基团的商品化学试剂。 1.2 兽药人工抗原合成常用的载体常用于兽药人工抗原合成的载体蛋白质包括牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HSA)及钥孔血蓝蛋白(KLH)，其中又以牛血清蛋白最为常用。因为BSA理化稳定，经济易得，分子内自由氨基多，与半抗原偶联率高，并且具有在不同pH值和离于强度下以及在含有某些有机溶剂状态下都能保持较大的溶解度。近年来，国内外都有文献介绍以人工合成的多聚肽做载体(常用多聚L赖较氨酸)，自身免疫原性很差但可以增加半抗原的免疫性，有利于机体产生特异性更高的抗体，且具有比BSA更多的自由氨基(与BSA相当分子量的多聚赖氨酸的自由氨基数约是BSA所含数目的10倍)，可以大大提高载体蛋白质与半抗原的偶联率。以多聚赖氨酸做载体来制备兽药人工抗原尚未见报道，这应该是一个值得探讨的方向。 1.3 兽药抗原的偶联方法活化的半抗原与载体偶联应根据半抗原功能团的不同，选用不同的偶联剂和不同的偶联方法。人工抗原合成的传统方法有：混合酸酐法、活泼酯法及碳二亚胺法，用于羧基半抗原与载体的偶联；戊二醛法或重氮化法用于氨基半抗原与载体的偶联；氨基氧乙酸化用于酮基半抗原与载体的偶联；丁二酸酐衍生化用于羟基半抗原与载体的偶联。人工抗原合成的基因工程方法：利用基因工程技术表达特定抗原蛋白或通过核苷酸序列推导合成相应编码的蛋白质抗原肽段，得到目的抗原。 2 影响兽药人工抗原质量的因素 人工抗原的质量好坏指其免疫原性的优劣，受多种因素的影响。不同药物的质量影响因素也不尽相同，一方面取决于人工抗原本身的性质，另一方面取决于接受该抗原刺激的机体的反应性。概括起来主要有以下几个方面。 2.1 抗原分子特性免疫学理论认为抗原物质除了要求具有一定的分子质量(10ku)外，其表面还必须有一定的化学组成和结构，分子结构和空间结构越复杂、支链越多，免疫原性越强，越易于诱导机体产生抗体。对于具有多个载体偶联位点的兽药半抗原，以不同位点相偶联制备的抗原，其相应的特异性、亲和性、效价也都不相同，即由于不同偶联位点制备的抗原的空间结构不同所致。所以，当一个兽药分子内部有多个不同的结合位点时，要尽可能多合成不同的人工抗原，然后通过比较筛选出最好的抗原用于抗
硅烷偶联剂使用说明 一、选用硅烷偶联剂的一般原则 已知，硅烷偶联剂的水解速度取于硅能团Si-X，而与有机聚合物的反应活性则取于碳官能团C-Y。因此，对于不同基材或处理对象，选择适用的硅烷偶联剂至关重要。选择的方法主要通过试验预选，并应在既有经验或规律的基础上进行。例如，在一般情况下，不饱和聚酯多选用含CH2=CMeCOO、Vi及CH2-CHOCH2O－的硅烷偶联剂；环氧树脂多选用含CH2－CHCH2O及H2N－硅烷偶联剂；酚醛树脂多选用含H2N－及H2NCONH－硅烷偶联剂；聚烯烃多选用乙烯基硅烷；使用硫黄硫化的橡胶则多选用烃基硅烷等。由于异种材料间的黏接可度受到一系列因素的影响，诸如润湿、表面能、界面层及极性吸附、酸碱的作用、互穿网络及共价键反应等。因而，光靠试验预选有时还不够精确，还需综合考虑材料的组成及其对硅烷偶联剂反应的敏感度等。为了提高水解稳定性及降低改性成本，硅烷偶联剂中可掺入三烃基硅烷使用；对于难黏材料，还可将硅烷偶联剂交联的聚合物共用。 硅烷偶联剂用作增黏剂时，主要是通过与聚合物生成化学键、氢键；润湿及表面能效应；改善聚合物结晶性、酸碱反应以及互穿聚合物网络的生成等而实现的。增黏主要围绕3种体系：即（1）无机材料对有机材料；（2）无机材料对无机材料；（3）有机材料对有机材料。对于第一种黏接，通常要求将无机材料黏接到聚合物上，故需优先考虑硅烷偶联剂中Y与聚合物所含官能团的反应活性；后两种属于同类型材料间的黏接，故硅烷偶联剂自身的反亲水型聚合物以及无机材料要求增黏时所选用的硅烷偶联剂。 二、使用方法 如同前述，硅烷偶联剂的主要应用领域之一是处理有机聚合物使用的无机填料。后者经硅烷偶联剂处理，即可将其亲水性表面转变成亲有机表面，既可避免体系中粒子集结及聚合物急剧稠化，还可提高有机聚合物对补强填料的润湿性，通过碳官能硅烷还可使补强填料与聚合物实现牢固键合。但是，硅烷偶联剂的使用效果，还与硅烷偶联剂的种类及用量、基材的特征、树脂或聚合物的性质以及应用的场合、方法及条件等有关。本节侧重介绍硅烷偶联剂的两种使用方法，即表面处理法及整体掺混法。前法是用硅烷偶联剂稀溶液处理基体表面；后法是将硅烷偶联剂原液或溶液，直接加入由聚合物及填料配成的混合物中，因而特别适用于需要搅拌混合的物料体系。 1、硅烷偶联剂用量计算 被处理物（基体）单位比表面积所占的反应活性点数目以及硅烷偶联剂覆盖表面的厚度是决定基体表面硅基化所需偶联剂用量的关键因素。为获得单分子层覆盖，需先测定基体的
抗原偶联选择方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
载体的选择： 1.载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联， 这是化学偶联制备抗原的前提； 2.其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足够的分子； 3.载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能； 4.而且载体应具有足够的稳定性,且应该是廉价易得的. 载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等 这些蛋白质分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基（等电点为7）、羧基（等电点2～4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等电点pH条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合.当然,这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境.牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同pH 和离子强度下能保持较大的溶解度.此外,这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质.近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加,被广泛应用。 人工抗原合成方法： 小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响.通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行.一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下： 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联 1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也称氯甲酸异丁酯法。偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixedacidanhydride)，然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 2）碳二亚胺法（CDI）：碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键,半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物,然后再与蛋白质上的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物（见图）.EDC被称作零长度交联剂之一,因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子. 此连接方法十分简便,只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中,然后加入水溶性碳化二亚胺,搅拌1～2h,置室温24h,再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基,可通过某些化学反应引入羧基.在引入羧基后,也可用上述方法进行偶联。 含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=C<，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和，可在4～40℃及～内进行，操作亦简便，因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联作用，因此最好使用新鲜的戊二醛。
一、选用硅烷偶联剂的一般原则 已知，硅烷偶联剂的水解速度取于硅能团Si-X ，而与有机聚合物的反应活性则取于碳官能团C-丫。因此，对于不同基材或处理对象，选择适用的硅烷偶联剂至关重要。选择的方法主要通过试验预选，并应在既有经验或规律的基础上进行。例如，在一般情况下，不饱和聚酯多选用含CH2=CMeC、OOVi 及CH2-CHOCH－2O 的硅烷偶联剂；环氧树脂多选用含CH2- CHCH2及H2N-硅烷偶联剂；酚醛树脂多选用含H2N-及H2NC0NH硅烷偶联剂；聚烯烃选用乙烯基硅烷；使用硫黄硫化的橡胶则多选用烃基硅烷等。由于异种材料间的黏接可度受到一系列因素的影响，诸如润湿、表面能、界面层及极性吸附、酸碱的作用、互穿网络及共价键反应等。因而， 光靠试验预选有时还不够精确，还需综合考虑材料的组成及其对硅烷偶联剂反应的敏感度等。为了提高水解稳定性及降低改性成本，硅烷偶联剂中可掺入三烃基硅烷使用；对于难黏材料，还可将硅烷偶联剂交联的聚合物共用。硅烷偶联剂用作增黏剂时，主要是通过与聚合物生成化学键、氢键；润湿及表面能效应；改善聚合物结晶性、酸碱反应以及互穿聚合物网络的生成等而实现的。增黏主要围绕 3 种体系：即（1）无机材料对有机材料；（2）无机材料对无机材料；（3）有机材料对有机材料。对于第一种黏接，通常要求将无机材料黏接到聚合物上，故需优先考虑硅烷偶联剂中丫与聚合物所含官能团的反应活性；后两种属于同类型材料间的黏接，故硅烷偶联剂自身的反亲水型聚合物以及无机材料要求增黏时所选用的硅烷偶联剂。 二、使用方法 如同前述，硅烷偶联剂的主要应用领域之一是处理有机聚合物使用的无机填料。后者经硅烷偶联剂处理，即可将其亲水性表面转变成亲有机表面，既可避免体系中粒子集结及聚合物急剧稠化，还可提高有机聚合物对补强填料的润湿性，通过碳官能硅烷还可使补强填料与聚合物实现牢固键合。但是，硅烷偶联剂的使用效果，还与硅烷偶联剂的种类及用量、基材的特征、树脂或聚合物的性质以及应用的场合、方法及条件等有关。本节侧重介绍硅烷偶联剂的两种使用方法，即表面处理法及整体掺混法。前法是用硅烷偶联剂稀溶液处理基体表面；后法是将硅烷偶联剂原液或溶液，直接加入由聚合物及填料配成的混合物中，因而特别适用于需要搅拌混合的物料体系。 1、硅烷偶联剂用量计算 被处理物（基体）单位比表面积所占的反应活性点数目以及硅烷偶联剂覆盖表面的厚度是决定基体表面硅基化所需偶联剂用量的关键因素。为获得单分子层覆盖，需先测定基体的Si—OH含量。已知，多数硅质基体的Si —OH含是来4-12 个/卩叭因而均匀分布时，1mol硅烷偶联剂可覆盖约7500m2的基体。具有多个可水解基团的硅烷偶联剂，由于自身缩合反应，多少要影响计算的准确性。若使用丫3SiX处理基体，则可得到与计算值一致的单分子层覆盖。但因丫3SiX价昂，且覆盖耐水解性差，故无实用价值。此外，基体表面的Si-OH数，也随加热条件而变化。例如，常态下Si —OH数为5.3个/卩川硅质基体，经在400C或800C 下加热处理后，则Si —OH值可相应降为2.6个/卩卅或V 1个/卩讥反之，使用湿热盐酸处理基体，则可得到高Si —OH含量；使用碱性洗涤剂处理基体表面，则可形成硅醇阴离子。硅烷偶联剂的可润湿面积（WS，是指ig硅烷偶联剂的溶液所能覆
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、 4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L 的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。 4、用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。 5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。
硅烷偶联剂的使用方法 硅烷偶联剂的使用方法主要有表面预处理法和直接加入法，前者是用稀释的偶联剂处理填料表面，后者是在树脂和填料预混时，加入偶联剂的原液。 (1)表面预处理法 将硅烷偶联剂配成0.5～1%浓度的稀溶液，使用时只需在清洁的被粘表面涂上薄薄的一层，干燥后即可上胶。所用溶剂多为水、醇（甲氧基硅烷选择甲醇，乙氧基硅烷选择乙醇）、或水醇混合物，并以不含氟离子的水及价廉无毒的乙醇、异丙醇为宜。除氨烃基硅烷外，由其它硅烷偶联剂配制的溶液均需加入醋酸作水解催化剂，并将pH值调至3.5～5.5。长链烷基及苯基硅烷由于稳定性较差，不宜配成水溶液使用。氯硅烷及乙氧基硅烷水解过程中伴随有严重的缩合反应，也不宜配成水溶液或水醇溶液使用，而多配成醇溶液使用。水溶性较差的硅烷偶联剂，可先加入0.1～0.2%(质量分数)的非离子型表面活性剂，然后再加水加工成水乳液使用。硅烷偶联剂配成溶液，有利于硅烷偶联剂在材料表面的分散，溶剂是水和醇配制成的溶液，溶液一般为硅烷（20%）、醇（72%）、水（8%），醇一般为乙醇（对乙氧基硅烷）甲醇（对甲氧基硅烷）及异丙醇（对不易溶于乙醇、甲醇的硅烷）因硅烷水解速度与PH值有关，中性最慢，偏酸、偏碱都较快，因此一般需调节溶液的PH值，除氨基硅烷外，其他硅烷可加入少量醋酸，调节PH值至4—5，氨基硅烷因具碱性，不必调节。因硅烷水解后，不能久存，最好现配现用，最好在一小时内用完。 (2)直接添加方法 将硅烷偶联剂直接加入到胶粘剂组分中，一般加入量为基体树脂量的1～5%。涂胶后依靠分子的扩散作用，偶联剂分子迁移到粘接界面处产生偶联作用。对于需要固化的胶粘剂，涂胶后需放置一段时间再进行固化，以使偶联剂完成迁移过程，方能获得较好的效果。实际使用时，偶联剂常常在表面形成一个沉积层，但真正起作用的只是单分子层，因此，偶联剂用量不必过多。 硅烷偶联剂具体使用方法 （1）预处理填料法 将填料放入固体搅拌机(高速固体搅拌机HENSHEL（亨舍尔）或V型固体搅拌机等)，并将上述硅烷溶液直接喷洒在填料上并搅拌，转速越高，分散效果越好。
常用的半抗原与蛋白偶联 方法简介 Last revision date: 13 December 2020.
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。
?综述与讲座?解偶联蛋白2与2型糖尿病 杨璐 2型糖尿病发病的中心环节之一是胰腺β细胞功能衰竭,其表现为胰岛素分泌功能进行性降低。最近,一种参与下调胰岛素分泌的线粒体上的蛋白质———解偶联蛋白(un2 coupling protein,Ucp)引起普遍关注。其中Ucp2在胰岛素分泌过程中究竟起什么作用,它与2型糖尿病的关系又如何呢?现就线粒体内膜上的Ucp2与2型糖尿病的发病及相关研究进展作一综述。 一、Ucp2的结构和功能 最先,Ucp1的发现是在棕色脂肪,其作用是产热,并能减少A TP的产生,与能量供给作用以及与哺乳动物的体重调节有关。但是成人棕色脂肪含量太少,Ucp1似乎不能起到调节体重的作用,因此相关的研究减少了许多。直到1997年,Ucp2和Ucp3的发现使解偶联蛋白再次成为焦点。研究[1]发现了Ucp2基因,其定位于人类染色体11q13,全长8.7kb,分子质量为33098u,编码308个氨基酸,由8个外显子和7个内含子组成。Ucp2和Ucp3定位的染色体11q13被认为是与人类肥胖相关的候选基因。在植物和啮齿类动物体内都发现Ucp,在啮齿类动物至少已有5种(Ucp1～Ucp5)并被克隆,亚细胞定位均在线粒体内膜,各成员间序列同源性较高,组织分布有一定特异性。Ucp2是该家族中分布最广的成员,在体内分布广泛,脂肪、胎盘、骨骼肌、心脏、脾脏、肾脏、淋巴结以及中枢神经系统都有存在,其中在胰腺中的分布是Ucp2特异表达。 二、Ucp2在β细胞的基本功能 1.Ucp2是胰岛素分泌的负性调节因子:线粒体氧化磷酸化是葡萄糖代谢胰岛β细胞分泌过程的一个重要环节。Ucp2通过使细胞线粒体的氧化磷酸化过程解偶联,降低A TP产生,A TP/ADP比值下降,来减少A TP敏感的钾离子通道的关闭,进而影响细胞除极。使电压依赖性的钙离子通道开放迟缓或幅度减低,钙离子内流抑制,含有胰岛素的颗粒细胞不能释放,胰岛素分泌减少[2]。机体为此所必须付出的代价是能量通过Ucp的作用以热能的形式被消耗,而不是以A TP形式被储存,Ucp2的这种质子传递作用能被细胞内的ADP抑制。 2.抑制活性氧簇(ROS),减少氧化损伤:在Ucp2含量丰富的巨噬细胞中发现,把Ucp2敲除则巨噬细胞内ROS含量增加,表明Ucp2能抑制ROS的生成[3]。活性氧是细胞氧化损伤的主要来源,损伤的后果是加重疾病和老化。ROS 在线粒体中的产生来源于呼吸链产物中一部分氧经单电子 作者单位:524000湛江,广东医学院附属医院内分泌科 还原为水的过程中经过呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ形成,包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等。当线粒体内的抗氧化防御系统如谷胱甘肽、MnSOD、CoQ及维生素E不能有效清除超氧化物时,ROS积聚会引发膜磷脂过氧化,蛋白质DNA的损伤激发级联反应最终导致线粒体破坏和细胞凋亡。 三、影响Ucp2mRNA表达的因素 1.脂肪酸的影响:脂肪酸对非胰岛组织Ucp2的诱导作用已经得到证实[4],用250μm油脂酸培养12～16h能使肝细胞内Ucp2的表达增加8倍以上。高脂饮食喂养2d就能明显上调A/J大鼠棕色脂肪组织中Ucp2mRNA的表达。Vettor等[5]发现用脂肪乳剂持续24h灌注能明显增加大鼠心脏和骨骼肌中Ucp2的表达,同时胰岛素调节的葡萄糖转运被抑制。同样游离脂肪酸对胰腺组织中Ucp2上调的影响也被许多实验证实。Tokuyuki等[6]通过将脂肪形成的关键转录因子即固醇调节元件结合蛋白(Sreb-1c)的腺病毒插入胰岛细胞,使细胞内脂肪酸合成大大增加,甘油三酯含量随之增加,Ucp2表达增加。另一项研究是应用高脂高糖和普通饲料喂养GK大鼠,观察其对β细胞胰岛素分泌功能的不同影响发现,高脂高糖能增加胰岛细胞内甘油三酯含量并且影响GK大鼠的胰岛素分泌,而且Ucp2蛋白表达水平增加,这些作用通过胰岛素治疗得到改善,表明Ucp2是β细胞胰岛素分泌的重要负性调节因子[7]。Joseph等[8]通过对Ucp2基因敲除小鼠和野生性小鼠胰岛细胞分别在体外用软脂酸培养48h后观察并比较细胞内甘油三酯含量和软脂酸代谢速率发现,Ucp2基因敲除鼠的β细胞游离脂肪酸的代谢速率提高,避免了甘油三酯细胞内堆积,从而避免脂毒性对β细胞损伤,这可能就是Ucp2表达过度损伤胰岛细胞功能的机制之一。 2.高血糖:高血糖对Ucp2mRNA表达的影响研究结果不尽相同,但多数研究[9-10]表明,高血糖能上调胰岛细胞线粒体的Ucp2表达,而且ROS的产生增加,进而抑制胰岛素的分泌,在协同高脂的环境下,ROS生成的增多有诱导Ucp2的表达增多,表明Ucp2活性增加对胰岛素分泌产生不利作用。同样在Ucp2基因敲除小鼠中发现其β细胞数量增加但在高脂高糖环境中仍能维持一定的胰岛素分泌功能。 3.其他因素:脂联素能减少A Y/a肥胖小鼠的内脏脂肪,可能与上调解偶联蛋白在棕色脂肪、白色脂肪以及骨骼肌中的表达有关[11]。瘦素通过提高白色脂肪中Ucp2的表达来加强或激活脂肪酸类代谢和利用[12]。甲状腺素能增加心脏、骨骼肌以及脂肪组织中Ucp2的mRNA表达。选择性β-3肾上腺素能激动剂能降低肥胖KK小鼠体重,可能是通
常用的半抗原与蛋白偶 联方法简介 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液） 2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III 液） 4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下） 5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、??4度搅拌12小时 7、??静置10小时（4度） 8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L 的溶液。 2、??加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、??用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、??按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。 5、?? （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、??用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。 2、??滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。
现代医药卫生2012年7月30日第28卷第14期J Mod Med Health ，July 30，2012，Vol.28，No.14解偶联蛋白-2及缺氧诱导因子-1在肿瘤细胞中表达的意义 戴纪刚1，汤兴平2，闵家新1，余祖滨1，张在永1（1.第三军医大学新桥医院胸外科，重庆400037；2.赤水市人民医院，贵州赤水564700） 【提 要】 解偶联蛋白-2（uncoupling protein -2，UCP -2）是线粒体内膜上的一种蛋白，能降低线粒体膜电位，限制三磷 酸腺苷（ATP ）合成，参与转运丙酮酸，与能量代谢关系密切；同时，UCP -2能控制线粒体内活性氧簇（ROS ）生成，与氧化应激、凋亡、肿瘤发生等过程也有密切联系。恶性肿瘤由于组织增生过快造成局部组织严重缺氧，但处于缺氧状态的肿瘤细胞仍能不断增殖和浸润，主要原因之一是缺氧引起肿瘤细胞一些基因和蛋白的表达发生改变，其中既有UCP -2的参与。有关研究结果证明，UCP -2在人结肠癌细胞中表达明显增加，且癌细胞的恶化程度与UCP -2的含量有正相关性。 【关键词】 肿瘤细胞； 缺氧； 转录因子； 膜转运蛋白质类； 线粒体蛋白质类； 解偶联蛋白-2； 缺氧诱导因子-1 文章编号：1009-5519（2012）14-2167-03 中图法分类号：R730.1 文献标识码：A 课题资助：国家自然科学基金面上项目（81172238）； 重庆市自然科学基金资助项目（2009C195）。 解偶联蛋白（uncoupling proteins ，UCPs ）是位于线粒体内膜上参与质子转运的一类蛋白家族，其可将呼吸链与三磷酸腺苷（adenosine triphosphate ，ATP ）产生过程解偶联，能降低线粒体膜电位，限制ATP 合成，参与转运丙酮酸，导致能量以热的形式消耗掉，从而调控机体能量代谢[1]，与能量代谢关系密切。早在1977年，在褐色脂肪细胞线粒体内膜上发现这种质子转运蛋白。当它被激活时，可产生质子的渗漏，使氧化磷酸化解偶联，ATP 合成降低，使产能转化为产热作用。此现象表明耗氧和二磷酸腺苷（ADP ）磷酸化之间并不是完全偶联的，该质子转运蛋白被称为UCPs [2] 。 目前，UCPs 家族主要分为5个亚型，各亚型在结构上有相互关联性，但组织分布不同。最初发现的UCP1只在棕色脂肪中表达，介导机体的产热反应，从而调控体温和机体能量代谢，在肥胖、糖尿病等代谢性疾病中发挥重要作用 [3] 。该蛋白家族的另一成员UCP2表达广泛，其主要生理功能与UCP1相差甚远，在产热和体 温调控中的作用有限，更主要的是通过介导“质子漏”，降低线粒体内膜的质子梯度，从而减少活性氧簇（reactive oxygen species ， ROS ）的产生和减轻氧化应激（oxidative stress ）反应[4]。UCP2分布 广泛，在多种组织如棕色脂肪组织、心、肺、肾和淋巴细胞等均有表达[5]。现已发现其与多种疾病密切相关，包括代谢综合征、糖尿病、高血压、心血管疾病以及肿瘤等[6]。而UCP2在肿瘤中的具体调控作用及其分子机制尚不清楚，本文就UCP2的基本生理功能及其在肿瘤中的病理生理调控作用进行综述[7]。 1UCP2的表达分布和活性调控 人UCP2基因位于第11号染色体，其基因在1997年被首次克隆，随后啮齿类动物的UCP2基因也被相继克隆[2]。各物种之间的UCP2基因序列一般是高度保守的，大鼠UCP2氨基酸序列与小鼠序列有99%一致，而与人UCP2氨基酸序列的一致性也高达 95%[8]，可见UCP2在机体生命活动中的重要性。UCP2蛋白氨基 酸序列与UCP1的一致性约为58%，而这也是两者生理功能有所偏重的结构基础。 UCP2是UCPs 蛋白家族中分布最广泛的蛋白，在心脏、肾脏、 肌肉、白色脂肪组织、肝脏、胰岛、脾、胃、肺及胸腺中都有相对高水平的表达[5，8-9]。 目前UCP2的基因表达和蛋白活性的调控机制尚不明确。现有的证据提示，机体代谢率、某些激素（如甲状腺激素），以及其他 一些生物活性分子（如脂多糖类、辅酶Q 和超氧阴离子等）都对 UCP2基因转录、翻译和蛋白表达功能有不同程度的调控作用，且 具有一定的组织特异性[10-11]。各种类型的激素及其代谢产物对 UCP2的调控作用提示其可能在机体物质和能量代谢中发挥着重 要的作用，而UCP2在出生后不同时期的表达差异提示其可能还参与调控机体的生长发育[12]。除此之外，多种生理和病理状态下 UCP2的表达上调，如禁食、高脂饮食、糖尿病等状态的共同生化 特征是超氧阴离子产生显著增加，这提示超氧阴离子有可能都是调控UCP2的表达和功能的重要分子[11，13-14]。 2UCP2基本生理功能和作用 UCP2同UCPs 蛋白家族的其他蛋白一样，基本生理功能都 是介导氧化磷酸化解偶联。线粒体内膜上的电子传递链在氧化底物的同时将质子泵到线粒体内外膜间隙，从而形成跨内膜质子梯度，由此产生质子势能导致质子在通过ATP 合成酶回流到线粒体基质的同时驱动ATP 合成酶将ADP 转化成ATP [15]。而UCP2可以提供一条质子回流基质的旁路途径而使其不产生ATP 。与UCP1不同的地方在于，UCP2发挥解偶联的主要作用并不是导致产热，而是调控ROS ，尤其是超氧阴离子的产生。 2.1线粒体ATP 的产生UCP2通过解偶联导致线粒体ATP 产 生减少，使能量以热能的形式消耗，而ATP 产量的减少可能会影响细胞的生理功能。UCP2基因敲除小鼠胰岛细胞中，ATP/ADP 比值的升高可支持上述观点，且这一现象与胰岛素分泌增加相关[1]。而与之不符的是大脑中UCP2的解偶联作用反而导致ATP/ADP 比值的升高，可能的解释是UCP2也有可能促进了脑细胞中线粒体密度的增加[12]。 2.2线粒体内钙离子摄取细胞内钙离子浓度的稳态是细胞生 理活动的必要条件。细胞内钙离子浓度受细胞膜上各种钙离子通道和细胞内钙库的精确调控。线粒体是重要的细胞内钙库，其对胞内钙离子浓度的调控依赖于线粒体内膜的电势[16]。UCP2可以通过解偶联降低线粒体内膜电势，从而影响线粒体对钙离子的摄取[5]。但UCP2的这种作用对肿瘤细胞调控中的作用机制尚不清楚。 2.3线粒体超氧阴离子的产生超氧阴离子及其他自由基都是 电子流经线粒体呼吸链时的副产物。正常细胞产生的超氧阴离子可被线粒体中的锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dis - mutase ，MnSOD ）和存在于胞浆中的铜锌超氧化物歧化酶（copper -zinc superoxide dismutase ，Cu/Zn -SOD ）转化为过氧化氢。过量产生 ·综述与讲座· ·2167·