毕业设计(论文)
学生姓名：刘雨翔
学号： 1311090230 所在学院：生物与制药工程学院
专业：制药工程
设计(论文)题目：酶催化合成氯乙酸邻硝基苄酯的研究
指导教师：韩萍芳
2013 年5月29日
酶催化合成氯乙酸邻硝基苄酯的研究
摘要
氯乙酸硝基苄酯及其衍生物是一类重要的生物医药中间体，也可以用来作为确定蛋白酶中含有酯类催化结构的抑制剂。目前已报道的该类化合物均为化学法合成，以酰基化法居多，其反应条件苛刻，后处理较难，污染环境。与化学法相比，以脂肪酶作为催化剂催化氯乙酸与硝基苄醇的酯化反应，具有工艺简单、反应条件温和、副反应少等优点，符合当今“绿色化学”发展要求。
本文以Novozym435脂肪酶为催化剂，在摇床传质作用下，合成氯乙酸邻硝基苄酯。对影响该酶催化反应的诸因素, 如溶剂、温度、反应时间和摇床转速等，分别进行了考察, 并对反应条件进行优化; 结果确定：用20mL甲苯为溶剂，反应10h，摇床转速为180rpm，反应温度50℃，Novozym435脂肪酶、邻硝基苄醇和氯乙酸的浓度分别为3.4g·L-1、5g·L-1和6.2g·L-1，其酯化率约为30%。
关键词：氯乙酸邻硝基苄酯脂肪酶动力学合成
ABSTRACT
Nitrobenzyl chloroacetate and its derivatives is an important sort of bio-pharmaceutical intermediates. They also can be used as inhibitors detecting the structure of ester catalysis in the protease. These compounds were synthesized by chemical methods. Especially acylation was the most important one, which have been reported so far. But this method has many disadvantages, such as hard reaction conditions, difficult to post-processing, and environmental pollution. Compared with the traditional chemical method, the synthesis of nitrobenzyl chloroacetate by the reaction of nitrobenzyl alcohol and monochloroacetic acid with using immobilized lipase as catalyst has many advantages, and is more in line with the present requirements of “green chemistry”, because of its sim ple processes, mild reaction conditions and less side reactions.
In this paper, nitrobenzyl chloroacetate was synthesized by the reaction of relative isomer of nitrobenzyl alcohol and monochloroacetic acid with using Novozym435 lipase as catalyst, and operated by swing bed. The influence factors were studied, such as the solvent used, the reaction temperature, the reaction time and speed of swing bed. The reaction conditions were optimized, for 4-nitrobenzyl chloroacetate they were：20mL toluene as solvent, 5g·L-1of 4-nitrobenzyl alcohol, 6.2g·L-1 of monochloroacetic acid, 3.4g·L-1 of Novozym435 lipase concentrations, 180 rpm of speed of swing bed, 50℃of reaction temperature and 10h of reaction time, 2-nitrobenzyl chloroacetate yield of 30 %.
KEYWORDS：nitrobenzyl chloroacetate；lipase；kinetics；synthesize.
目录
摘要............................................................. I 目录............................................................ I I 第一章综述 (1)
1.1脂肪酶 (1)
1.1.1脂肪酶的性质 (1)
1.1.2 脂肪酶的主要用途 (2)
1.2非水相体系中酶催化反应 (2)
1.2.1 非水相酶学的发展概况与现状 (2)
1.2.2 有机相体系中的酶催化反应 (2)
第二章实验 (4)
2.1实验试剂与仪器 (4)
2.1.1 实验试剂 (4)
2.1.2 实验仪器 (5)
2.2实验方法 (5)
2.2.1 溶剂脱水 (5)
2.2.2 分子筛干燥 (5)
2.2.3 氯乙酸硝基苄酯的合成 (5)
2.2.4 最适反应条件的选择 (6)
2.3分析方法 (6)
2.3.1 薄层层析色谱(TLC) (6)
2.3.2 高效液相色谱(HPLC) (7)
第三章试验结果与讨论 (9)
3.1底物摩尔比对反应的影响 (9)
3.2硝基苄醇浓度对反应的影响 (10)
3.3反应时间对反应的影响 (11)
3.4温度对反应的影响 (11)
3.5酶浓度对反应的影响 (13)
3.6摇床转速对反应的影响 (14)
第四章结论与展望 (14)
4.1结论 (14)
4.1.1 氯乙酸硝基苄酯的反应条件的优化 (15)
4.2展望 (15)
参考文献 (15)
第一章综述
1.1 脂肪酶
脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。
1.1.1脂肪酶的性质
脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。
脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。
脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。
脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。
脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。
1.1.2 脂肪酶的主要用途
用于食品行业，造纸行业，皮革行业，饲料行业，医药催化合成，油脂奶酪加工等。
1.2非水相体系中酶催化反应
与传统化学催化剂相比，脂肪酶所催化的反应具有更加优越的特点。酶反应具有高催化活性和较强的专一性与选择性，反应的副产物少，在较温和的条件下进行反应，耗能少，设备投资小，对环境无污染，产品质量好。
1.2.1 非水相酶学的发展概况与现状
在1913年就有酶在非水相进行催化反应的报道，但在1984年，Zaks and Klibanovt 研究报道表示，酶在非水相进行催化反应后，非水相酶学才真的引起大家广泛的兴趣并且成为研究的一个热点领域而得到快速发展，吸引了大量的研究人员的广泛兴趣。非水相酶学的研究在最近20多年里取得了长足的发展，脂肪酶所应用的反应体系也有了较大的改善。这主要集中在有机相中的酶催化反应，还有微水条件下的无溶剂体系、微乳液体系和超临界流体介质。
1.2.2 有机相体系中的酶催化反应
有机溶剂的种类很多，理化性质选择的余地大，容易操作。近年来手性药物在有机溶剂中的酶促拆分与合成的研究热点集中在酶的催化活性和选择性。有机相中酶催化反应主要受有机相含水量和溶剂极性的影响。此外还受温度和pH值的影响。有机溶剂中酶的催化作用，水仍然是必需的基本条件。酶蛋白分子周围紧密结合着的一层水，称为必需水。在绝对无水的体系中，酶不表现催化活性。一般认为，蛋白质分子折叠的结果使暴露在溶剂(水溶液)中的疏水基团减少到最低限度，这样蛋白质分子表面就有较多的亲水基团和带电基团，水就通过和这些亲水基团形成氢键相互作用吸附在蛋白质的表面。对保持酶的自然(活性)构象起着平衡和稳定的作用，同时屏蔽了蛋白质表面极性基团之间的相互作用，使酶分子在水中具有一定的柔性。柔性的增加意味着底物靠近酶分子和产物离开酶分子的
第一章综述
过程中受到的阻力减小，酶的催化活性增加。但酶分子保持一定的刚性结构非常重要。由于结构的刚性，酶在有机溶剂中能保持(记忆)进入有机相前的构象，这种构象使酶分子保持高度的催化专一性和活力。必需水的含量与溶剂的极性也有直接的关系。疏水的非极性溶剂不容易夺取酶分子周围的必需水、含有必需水的酶在这类介质中比较稳定。极性溶剂易与酶争夺必需水，但当增加水的含量，酶也可以在极性较大的溶剂中保持一定的活力。
反应体系的含水量也会对酶的含水量产生影响。在许多情况下，为了促使酯合成反应的进行，有必要除去反应所生成的水，可以采用全蒸发、冷阱、分子筛或通入氮气来实现。目前，含水量主要采用直接加水于反应体系或酶，或者采用水合盐与固定化酶在密闭体系中达到平衡。有时，体系的含水也采用水合盐对的水活度法来控制。另有研究表明，在反应体系中除加入水外，加入其它添加剂，如甘油、多羟基化合物，也可以提高酯交换反应的速度。
脂肪酶的活性稳定性的研究对酶的工业活性应用有非常重要的意义。Shimada等在研究油脂酯交换制备功能性油脂的过程中发现：酶活性的降低并不是由于结合于固定化酶上水的失去所致。这样，在酶使用过程中，酶上过量的水为“干"底物所除去，并逐渐降至临界含水量，而后酶的含水量很难受底物的变化，同样地，酶的水含量也很难使体系的含水量发生变化。关于每一种脂肪酶的临界含水量的详细说明还没有文献报道。溶剂的极性对酶的催化活力也有较大的影响。一般认为酶在非极性溶剂中的活力较高。采用疏水性参数LogP可以定量的描述溶剂的极性。一般地，LogP越大，溶剂的疏水性越强，酶的活力越大。
酶的选择性是多方面的，包括底物专一性、对映体选择性、前手性选择性和位置选择性等，对药物的拆分与合成起决定作用的是能识别对映体的对映体选择性。酶在两个底物之间的选择性通常定义为专一性常数之比，这样对映体选择性就可以表示为
(Kcat/Km)R/(Kcat/Km)S, Kcat和Km分别表示酶的转换数和米氏常数。显然对映体选择性越高，产物的光学纯度越高，对手性药物的拆分越有利。酶的对映体选择性受溶剂性质的显著影响，可以通过改变溶剂种类的方式来改变酶的对映体选择性。关于溶剂是怎样影响酶选择性的，这个问题目前内没有充分、准确、清楚的解释。有的影响可以用溶剂的某些性质(如疏水性参数LogP)并通过底物、酶和溶剂的相互作用来解释。
在溶剂体系下的酶催化反应，由于有机溶剂的使用又造成环境污染，使产品后处理过程更加复杂，对产品的安全性也不利。尝试采用其他的反应介质来取代有机溶剂是绿色合成的追求目标。采用不加任何溶剂和表面活性剂的无溶剂体系可避免溶剂体系和微乳液体
系的不足，产品的后处理简单，环境污染小，满足产品和生产的安全性，对酶的活性和选择性影响不大，同时，由于没有溶剂等的稀释作用，底物浓度较高，反应速度快。但在该体系下，反应混合物粘度大，往往需要较高的温度，这是其不利的一面。尽管如此，无溶剂体系在油脂酯交换制备结构脂方面仍具有非常广泛的应用。
第二章实验
2.1实验试剂与仪器
2.1.1 实验试剂
表2-1 实验试剂
Table2-1 Experimental reagents
实验试剂规格生产厂家
Novozym435脂肪酶Novo Nordisk
氯乙酸AR先进技术工业有限公司
对硝基苄醇99.5% 河南化工
续表2-1
间硝基苄醇99.5% 河南化工
间硝基苄醇98% Alfa Aesar
甲醇HPLC 国药集团化学试剂有限公司
磷酸85% 国药集团化学试剂有限公司
二氯甲烷AR 上海凌峰化学试剂有限公司
氯仿AR 上海凌峰化学试剂有限公司
丁酮AR 上海凌峰化学试剂有限公司
叔戊醇AR 上海凌峰化学试剂有限公司
甲苯AR 上海凌峰化学试剂有限公司
正己烷AR 上海凌峰化学试剂有限公司
正庚烷AR 上海凌峰化学试剂有限公司
2.1.2 实验仪器
表2-2 实验仪器与设备
Table 2-2 Experimental instruments
实验仪器型号生产厂家
恒温水浴振荡器DSHZ-30 太仓市实验设备厂
旋转蒸发器R201BL 亚荣生化仪器厂
分析天平TG328B 上海天平仪器厂
硅胶板GF254 青岛海洋化工厂
高效液相色谱仪戴安summit
工作站Chromeleon工作站
色谱柱Prevail Alltech
溶剂过滤装置FB-10T 天津仪器厂
真空干燥箱100A-1 上海实验仪器总厂
2.2实验方法
2.2.1 溶剂脱水
向有机溶剂中分别添加20%(质量比)已干燥的4A型分子筛，放置平衡2-3周，以除去有机溶剂中残留水分，备用。
2.2.2 分子筛干燥
将4A型分子筛置于坩埚中，用马福炉加热到350-400℃，并活化3-5h，将活化后的4A 型分子筛置于干燥器中冷却到80-90℃，倒入广口瓶，放入干燥皿中备用。
2.2.3 氯乙酸硝基苄酯的合成
在50mL具塞锥形瓶中进行，分别加入一定量氯乙酸、硝基苄醇和Novozym435脂肪酶，20mL甲苯，温度50℃，摇床转速为180rpm下反应10h。转化率以反应体系内消耗硝基苄醇的量计算。
第二章 实验 100%(%)= 生成一氯乙酸硝基苄酯消耗的硝基苄醇的量
参加反应的硝基苄醇的量硝基苄醇转化率
2.2.4 最适反应条件的选择
底物摩尔比：硝基苄醇与氯乙酸的摩尔比为：3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:3时，在50mL 具塞锥形瓶中进行，分别加入一定量氯乙酸、硝基苄醇和Novozyme435脂肪酶，20mL 甲苯，在摇床转速为180rpm 下反应24h 后，进行分析。
硝基苄醇浓度：硝基苄醇浓度分别为2g/L 、3g/L 、4g/L 、5g/L 、6g/L 时，在50mL 具塞锥形瓶中进行，分别加入一定量氯乙酸、硝基苄醇和Novozyme435脂肪酶，20mL 甲苯，在摇床转速为180rpm 下反应24h 后，进行分析。
反应时间：在50mL 具塞锥形瓶中进行，分别加入一定量氯乙酸、硝基苄醇和Novozyme435脂肪酶，20mL 甲苯，在摇床转速为180rpm 下，分别反应2h 、5h 、10h 、15h 、20h 、25h 、30h 、35h 、40h 、45h 、50h 后，进行分析。
温度：在50mL 具塞锥形瓶中进行，分别加入一定量氯乙酸、硝基苄醇和Novozyme435脂肪酶，20mL 甲苯，在摇床转速为180 rpm 下反应10h ，温度为：30℃、40℃、50℃、60℃、70℃.
酶量：在50mL 具塞锥形瓶中进行，分别加入一定量氯乙酸、硝基苄醇和，20mL 甲苯，在温度摇床转速为180 rpm 下反应10h ，Novozyme435脂肪酶浓度为硝基苄醇的量10%、20%、30%、40%、50%、60%。
摇床转速：摇床转速设为60 rpm 、90 rpm 、120 rpm 、150 rpm 、180 rpm 、210 rpm 、240 rpm 。在50mL 具塞锥形瓶中进行，分别加入一定量氯乙酸、硝基苄醇和Novozyme435脂肪酶，20mL 甲苯，反应10h ，进行分析。
2.3 分析方法
2.3.1 薄层层析色谱(TLC)
展开剂：二氯甲烷(加入无水硫酸镁除水)
薄层层析色谱的Rf 值：f=
R 斑点中心与原始样点之间距离溶剂前沿与原始样点之家距离
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2.3.1.1 氯乙酸邻硝基苄酯薄层层析色谱图：
图2-1 氯乙酸邻硝基苄酯薄层色谱图
Fig. 2-1 the TLC of 2-nitrobenzyl chloroacetate
在图2-1中，1号位点为邻硝基苄醇原料点，2号位点为反应中的点板，因而断定2号位中的前面的点为产物点，即氯乙酸邻硝基苄酯的点。
邻硝基苄酯的Rf=0.25；氯乙酸邻硝基苄酯的Rf=0.88。
2.3.2 高效液相色谱(HPLC)
色谱柱Alltech C18(250 mm×4.6 mm , 5μm )，流动相：甲醇:磷酸缓冲溶液(0.02mol/L)=70%:30% (体积比)，流动相的流速0.6mL?mi n-1，色谱柱的柱温度40℃，紫外检测器波长254nm。
分别取氯乙酸硝基苄酯溶于乙腈中，配制成浓度为40mg/L, 80mg/L, 120mg/L, 160mg/L 和200mg/L溶液，吸取20μL的样品进样，样品浓度为横坐标，锋面积为纵坐标，绘制标准曲线。计算方法为外标法。
第二章 实验
2.3.2.1 氯乙酸邻硝基苄酯高效液相色谱图
图2-2氯乙酸邻硝基苄酯高效液相色谱图
Fig.2-2the HPLC of 2-nitrobenzyl chloroacetate
在图2-2中：邻硝基苄醇保留时间是6.49min ；氯乙酸邻硝基苄酯保留时间是9.6min 。
P e a k a r e a (m A U *m i n )2-nitrobenzyl chloroacetate concentration (μg ?L -1)
图2-3 氯乙酸邻硝基苄酯标准曲线
Fig.2-3Calibration curve of 2-nitrobenzyl chloroacetate
由图2-3可知氯乙酸邻硝基苄酯的锋面积与浓度呈线性关系。
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
12.0 15.0 -10
200
400
600
800
1,000
1,200
1,400 101214 #8 [modified by chromcenter] UV_VIS_1 mAU
min
Absorbance [mAU] Retention Time [min] 1 - 6.392 2 - 7.715 3 - 9.643
WVL:254 nm
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氯乙酸邻硝基苄酯的标准线性回归方程：y=1.0743x-0.765，其中x为进样的样品浓度，y 为锋面积。
第三章试验结果与讨论
3.1 底物摩尔比对反应的影响
图3-1 底物醇酸摩尔比对转化率的影响
Fig.3-1 Effect of substrates molar ratio on conversion rate
反应底物硝基苄醇与氯乙酸摩尔比是影响酶催化合成的重要因素。考察醇酸摩尔比对反应影响，首先固定反应体系中硝基苄醇的质量，通过改变氯乙酸的质量，达到改变反应体系酸醇的摩尔比。图3-1表明，邻硝基苄醇与氯乙酸摩尔比为1:1.5时，邻硝基苄醇转化率均达到最大，为29.1%。增大氯乙酸摩尔量，有利于反应向酯化反应方向进行，提高硝基苄醇转化率。由于氯乙酸具有酸性，提高反应体系中氯乙酸的摩尔量会导致反应体系中pH变小，酸性增强，如果反应体系中酸性超出脂肪酶耐受范围，会导致脂肪酶活性降低甚至失活。如图6-1所示：当底物硝基苄醇与氯乙酸摩尔比超过最适的摩尔比，硝基苄醇转化率均有明显下降。邻硝基苄醇的空间位阻最大，不利于邻硝基苄醇与酶的活性位点结合，提高氯乙酸摩尔量不能改变邻硝基苄醇与酶活性位点结合机率，反而降低反应体系中pH，可能会导致酶失活，所以邻硝基苄醇转化率最低。因次，邻硝基苄醇与氯乙酸最适合摩尔比为1:1.5。
第三章实验结果与讨论
3.2 硝基苄醇浓度对反应的影响
图3-2 底物浓度对转化率的影响
Fig.3-2 Effect of substrates concentration on conversion rate
底物浓度对酶催化反应有很大影响。当底物浓度达不到酶的饱和浓度时，酶催化反应速度随底物浓度的升高而加快，当底物浓度达到酶饱和浓度时，反应速度达到最大值，即便增加底物浓度，该反应速度保持不变，这是因为酶催化反应是一一对应关系，当能起到催化作用的酶都被饱和，反应体系中的催化剂量就不足，所以再加大底物浓度也不能提高反应初速度，相反，当反应体系中底物浓度过高，酶也会受到高浓度底物抑制作用。因此，对于不同的酶催化反应而言，都要有适宜的底物浓度。
该实验主要考查硝基苄醇的浓度分别2g·L-1、3g·L-1、4g·L-1、5g·L-1和6g·L-1时，硝基苄醇的转化率。图3-2显示，当硝基苄醇小于5g·L-1，邻硝基苄醇转化率随浓度增加而有明显的提高。当硝基苄醇浓度为5g·L-1时，邻硝基苄醇转化率达均到最大值，为30.6%，这说明反应体系中硝基苄醇的量和脂肪酶处于饱和状态。但当硝基苄醇浓度大于5g·L-1时，硝基苄醇转化率均出现下降，由于随着底物浓度增大，氯乙酸浓度也会相应增大，导致反应体系中氯乙酸浓度过高，会降低反应体系的pH，破坏脂肪酶的水化层，导致酶的活性降低，同时过高浓度的氯乙酸也可能会产生底物抑制作用，因而出现产率下降趋势。所以该实验中邻硝基苄醇适宜的浓度为5g·L-1。
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3.3 反应时间对反应的影响
图3-3 反应时间对转化率的影响
Fig. 3-3 Effect of time on conversion rate
在酶催化反应中，反应时间长短是酶催化反应效率的表现，同时也会间接影响酶活性。反应时间过长容易造成酶失活和增加能源消耗，造成不当的浪费。本实验考察时间分别为2h、5h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h和50h时对酯化反应影响。
反应时间对底物转化率影响如图3-3显示，在整个反应过程中，底物转化率随着反应时间增加而先变大后减小趋势，主要因为在反应开始时，反应条件有利于酶催化合成方向进行，所以出现硝基苄醇转化率急剧升高；随着反应时间增加，Novozym435脂肪酶可能在较高温度下部分失活，同时Novozym435脂肪酶在长时间酸性条件会改变酶表面水化层的pH值，从而钝化或者破坏Novozym435脂肪酶活性。
邻硝基苄醇转化率在反应15h后转化率也达到最大值，为28.9%。从图6-3可以看出，邻硝基苄醇转化率在10h时比15h时低4%。但如果考虑生产中应用，邻硝基苄醇反应时间可选在10h，这样可以缩短酶催化反应时间，加大酶催化反应次数，减小能源消耗和酶活性损失。
所以，适宜的催化反应时间：邻硝基苄醇反应时间为15h。
第三章实验结果与讨论
3.4 温度对反应的影响
图3-4 温度对反应的影响
Fig.3-4 Effect of temperature on conversion rate
通常情况下，升高温度能增加底物分子的热能，降低反应所需的活化能，加快反应速度。温度是影响脂肪酶催化反应的重要因素，而且效果非常明显。一般地说，温度每升高10℃，反应速度大约增加1-2倍，升高温度会增加酶蛋白结构的分子热能，增大氢键和范德华力等非共价键相互作用破裂的机会，因此当反应温度超过酶的最适温度时，酶蛋白因产生变性作用而减弱甚至丧失其催化活性，其直接表现为硝基苄醇转化率降低。在非水相介质反应催化体系中，由于微量的脂肪酶催化反应的必需水存在，脂肪酶的稳定性增强，因此脂肪酶的最适温度要高于其在水相反应体系中催化的最适温度。但过高温度的同样会使酶的催化活性降低，甚至失活。因此考察反应温度对反应影响，选择脂肪酶在特定反应体系中的最适温度。本实验主要考察温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃时，温度对硝基苄醇转化率影响。
温度对硝基苄醇转化率如图6-4显示：温度对脂肪酶活性影响很大。当温度低于50℃时，硝基苄醇转化率随温度升高而增加，即酶的活性变强；当超过50℃，硝基苄醇转化率降低，酶活性降低。提高温度可以降低反应体系粘度，减小传质阻力，提高反应速度，同时增大底物溶解度，促使反应向酯化方向移动，因此转化率变大；但高温使酶分子的失活速度提高，表现为酶催化反应中底物转化率降低。所以说，在该酶催化反应实验中，最适合的酶催化反应温度为50℃，此时酶活性最高，稳定性好。邻硝基苄醇转化率达到最大，
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为28.1%。
3.5 酶浓度对反应的影响
图3-5 酶浓度对反应的影响
Fig.3-5 Effect of enzyme concentration on conversion rate
在酶催化反应中，当底物浓度远高于酶浓度时，酶易被底物饱和，与底物的结合机率伴随酶浓度的增加而增大，酶催化反应速度与酶的浓度成正比，酶催化反应速度越大，底物转化率就越高；但是酶浓度过大时，由于底物量不足，会导致底物转化率降低。因此在酶催化反应中要选择适合的酶浓度，可以减少催化剂的浪费和提高底物转化率。本实验主要考察酶浓度分别为1.1 g·L-1、2.2 g·L-1、3.4 g·L-1、4.5 g·L-1、5.6 g·L-1和6.7 g·L-1时对该反应影响。
酶浓度的定义：酶的质量与反应体系的体积之比，单位为g·L-1。图3-5显示：硝基苄醇转化率随Novozym435脂肪酶浓度增加而变大。因为酶浓度的增大，增大底物与酶的活性位点接触的机率，因此硝基苄醇转化率变大[81]。邻硝基苄醇转化率一直随Novozym435脂肪酶浓度增加而增大，这主要与邻硝基苄醇结构有关，邻硝基苄醇的硝基基团和羟基基团相邻，导致邻硝基苄醇的空间位阻大，不易与Novozym435脂肪酶活性位点相结合，导致邻硝基苄醇转化率偏低。在保持邻硝基苄醇浓度不变条件，加大Novozym435脂肪酶浓度就是增加邻硝基苄醇和Novozym435脂肪酶活性位点结合机率，邻硝基苄醇转化率增大。
由于Novozym435脂肪酶的价格昂贵，综合考虑底物转化率和经济因素，在该反应体系中最适合的酶浓度为3.4g·L-1，邻硝基苄醇转化率为28.9%
第四章结论与展望
3.6 摇床转速对反应的影响
摇床转速直接影响到反应底物之间的传质，反应底物在溶剂中随摇床震荡，转速越高，底物间传质越快，增加底物与酶活性位点结合机率，提高底物转化率。本实验主要考察摇床转速为60rpm、90rpm、120rpm、150rpm、180rpm、210rpm和240rpm时对反应的影响。
摇床转速对转化率的影响如图3-6 所示：邻硝基苄醇转化率却在摇床转速为210rpm时达到最大，这因为邻硝基苄醇的空间位阻大，加大摇床转速可以加快邻硝基苄醇与底物间传质，也加大邻硝基苄醇与酶活性位点结合机率。但当摇床转速大于210rpm时，邻硝基苄醇转化率不再随摇床转速增加而变大，说明此时邻硝基苄醇的酯化反应不受外扩散的影响。因此在邻硝基苄醇酯化反应中，最合适的摇床转速为210rpm。
图3-6摇床转速对反应的影响
Fig3-6 Effect of speed of swing bed on conversion rate
综上所述，在制备氯乙酸邻硝基苄酯的反应体系中，摇床转速设为210rpm。
第四章结论与展望
4.1 结论
本文是对在摇床作用下酶催化合成氯乙酸硝基苄酯的反应进行研究，考察了影响酶催化反应的主要几种因素，如有机溶剂、反应时间、酶量、温度和摇床转速等对酶催化酯化
反应的影响。确定最优化反应条件，了解合成氯乙酸邻硝基苄酯的酯化反应特点。此外，对Novozym435脂肪酶在甲苯溶剂中催化合成氯乙酸硝基苄酯的酯化反应动力学进行研究，在消除外扩散因素影响，确定酶催化合成氯乙酸硝基苄酯的反应机制，并求解出该酶催化反应动力学方程。
4.1.1 氯乙酸硝基苄酯的反应条件的优化
本文是对Novozyme435脂肪酶催化合成氯乙酸硝基苄酯的酯化反应条件进行摸索及优化。在实验中发现，甲苯是最适合的反应介质。邻硝基苄醇的空间位阻作用较大，不易与酶的活性位点结合，导致产率降低。同时加大摇床转速，可以增加地区间传质作用，提高硝基苄醇转化率，所以，在氯乙酸邻硝基苄酯的反应体系中，摇床转速为210rpm。通过对反应条件的优化，确定最优的反应条件。
氯乙酸邻硝基苄酯的最佳反应条件为：20mL甲苯溶剂，反应15h，摇床转速为210rpm，反应温度50℃，Novozym435脂肪酶、邻硝基苄醇和氯乙酸的浓度分别为3.4g·L-1、5g·L-1和4.6g·L-1，其酯化率仅为30%左右。
4.2 展望
目前困扰脂肪酶催化研究的主要问题是，Novozym435脂肪酶成本较高，不允许太多失误，运行的稳定性比较差。这三个因素也是影响脂肪酶催化和化学催化竞争的主要因素。我们要努力寻找提高效率和降低运行成本的方法，以提高脂肪酶催化的竞争力。随着能源价格的上升，也会增加能量密集型化学催化的成本。脂肪酶催化本身的优势以及这个领域不断取得的成就将为这项研究提供一个光辉的未来。
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