Western blot 试验操作步骤
一、蛋白样品制备
1 用细胞刮刀将细胞刮下（不要将培养基倒掉），用吸管将其吸至离心管中
2 用4℃预冷的PBS 1ml冲洗培养瓶2次收集入上述离心管中
3 1000rpm，离心10min
4 倒掉上清，沉淀用1ml PBS 重悬，转入EP管中，再加1ml PBS冲洗离心管壁上残留的细
胞转入EP管中
5 4℃，4000rpm，离心5min
6 倒掉上清液（用抢把残余上清吸干净）
7 配制裂解液，计算所需用量，每个EP管中加入100ul裂解液(10mg组织/100ul)
若有4管（4组），配制400ul裂解液：PMSF储备液浓度100mM，用RIPA稀释至1Mm. 【单去污剂裂解液（PMSF）：1mol/L Tris·HCl（pH8.0）2.5ml; NaCl 0.438gTritonX-100 0.5ml ;
蒸馏水至50ml; 混匀后4℃保存】
8 4℃裂解30-45min，每5min振荡一次
9 4℃ 14000g 离心5min，取上清（移入1.5ml的EP管中）。
10 蛋白定量（常用BCA法，参见蛋白定量试剂盒使用说明）
每管蛋白一致，分装约20ul/管左右（加入5×buffer并用RIPA稀释成1×）
11 将蛋白样100℃，变性5min，，-80℃（or -20℃）保存。
二、SDS-PAGE的配制：
1 试剂及配制：
（1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N,N-亚甲基双丙烯酰胺1g，去离子水至100ml，过滤，避光，4℃贮存。
（2）1. 5mmol/L Tris溶液（PH8.8）：称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。
（3）1.0mmol/LTris溶液（pH6.8）：称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。
（4）10%SDS：1g SDS加入10ml去离子水，室温贮存。
（5）10%过硫酸铵溶液：0.1g过硫酸铵加入1ml水，4℃保存，现用现配。
（6）TEMED（可购买成品）
（7）5×电泳缓冲液(Tank buffer)：称取15.14g Tris碱(分析纯)，72.1g甘氨酸(分析纯)，5g SDS(分析纯)，加适量的超纯水溶解，pH值应该在8.3左右，加超纯水定容1000ml，室温储存。（8）分离胶、浓缩胶液配方：（两个用小烧杯，用完立即刷）
总体积5ml 2ml 5ml
浓度12%分离胶5%浓缩胶10%分离胶
水(ml) 1.6 1.4 1.9
30%丙烯酰胺(ml) 2.0 0.33 1.7
1.5mmol/L Tris溶液(pH8.8)(ml) 1.3 — 1.3
1.0mmol/L Tris溶液(pH6.8)(ml) —0.25 —
10%SDS(ml)（透明）0.05 0.02 0.05
10%过硫酸铵溶液(ml) 0.05 0.02 0.05
TEMED(ml)（铺胶前加）0.002 0.002 0.002
2. 制胶程序：（小分子量）
（1）装板（小玻璃朝外）
（2）配制分离胶，加TEMED后，充分混匀，立即注入玻璃板间隙，从一边开始，并为浓缩胶留足够空间（梳齿长约1cm）。立即覆盖蒸馏水至顶部，天冷可放入烤箱15-20分钟，待分离胶聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶（配方见上表），插入样品梳，避免气泡出现。
（3）待聚合后（约20分钟），拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽的前后槽，在加样孔中加入10-20ul样品（蛋白量20ug左右）。左侧第一孔加maker，样品不够可用laoding buffer。
电泳：接通电源，浓缩胶80伏约半小时，此后分离胶120/160伏继续1小时左右。
三、转膜：
1、转移缓冲液的配制：（先用先配）
试剂用量
甘氨酸14.413g
Tris碱 3.0285g
无水甲醇40-200ml（蛋白量150以上加40）
水至1000
2、转膜程序：
（1）剪4张滤纸，和一张PVDF膜，大小与凝胶相同（滤纸要比胶小，膜稍大以防转膜时发生短路）。在膜的一角做一记号（或剪角）。
（2）将剪好的膜依次序浸入100%甲醇（10秒）→去离子水（5min）→转移缓冲液（大于10min）。（3）滤纸和海绵（纤维）垫浸入转移缓冲液中（大于10min）
（4）剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号。
（5）安装转膜装置：从正极（红色）→负极（黑色）依次为：白色边盒→多孔垫片→（1~2张）滤纸→PVDF膜→凝胶→（1~2张）滤纸→多孔垫片→黑色边盒。扣上吊扣后插进转膜槽中。转膜槽内加冰盒，防止电泳时过热。
（6）接通电源：恒流电转移两个小时，电流一般是100mA（视蛋白大小而定）。
（7）电泳结束后，关闭电源，将膜取出。
四、封闭及免疫反应
（一）试剂的配制：
1．5x TBS：（PH 7.5）用时稀释5倍
试剂1000ml用量
Tris-base 6.05g
NaCl 43.83g
去离子水至1000ml
2．1x TBST：1x TBS+0.05%Tween-20
试剂1000ml用量
Tween-20 0.5ml
1x TBS 1000ml
3．Blocking buffer：1x TBST+5% Dry Milk
试剂100ml用量
Dry Milk 5 g
1x TBST 100ml
（二）、免疫反应程序：
1.取膜（平头镊子，玻璃平皿），放入10ml Blocking buffer（封闭缓冲液），室温轻摇2h，或
4℃过夜。
2.一抗孵育，用TBST配制，1:1000（比例须看说明书，装入塑封袋中赶净气泡后用封口机
封口），室温摇床上孵育1h后4℃过夜。用TBST室温洗膜10min×3次
3.二抗孵育。用Tbst稀释，1:2000（比例须看说明书，方法同上），室温轻摇45min-2h。
4.用TBST洗膜10min×3次。
五、显影：
1 试剂
（1）超敏发光液（ECL）（A、B液等比混合）
（2）显影液：显影粉（按说明书配制）
（3）定影液：定影粉（按说明书配制）
2 显影程序
（1）发光液工作液的配制：等体积混合适量A液（200ul）和B液(200ul)，视膜大小而定，直接在保鲜膜上混合。
（2）显色反应：将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体（切勿接触膜的蛋白面），然后置于保鲜膜上，浸入并与发光液均匀充分地接触。
（3）压片检测：将膜固定于暗盒内（蛋白面朝胶片）。暗盒内放入胶片，压片曝光。（压片时间要摸索，15s-过夜）
（4）显影：胶片放入显影液，观察显影情况。（时间视显影情况而定）
（5）定影：胶片放入定影液，2-10min。流水冲洗，干燥保存
六、ECL膜再生
1 试剂
膜再生液：（500ml）SDS：10g ；Tris：3.62g （Tris 碱）；H2O：400ml 调PH值6.7；定容至500ml；加250μlβ-巯基乙醇。
2 膜再生程序：
（1）TBST洗膜10min×3次
（2）用时将膜浸在膜再生液中，60℃水浴30 min（摇床）
（3）TBST洗膜10min×3次
（4）封闭液封闭
BBB法脊髓损伤的行为学评分
评估大鼠后肢运动功能的恢复情况。将动物放置于平台上,观察记录其后肢的行走及肢体活动。评分分三部分第一部分为0一7分,评判动物后肢各关节活动第二部分为8一13分,评判后肢的步态及协调功能第三部分为14一21分,评判运动中爪的精细动作,三项满分为21分.
定义：将动物放入一开口盆中，轻敲盆壁，使其爬行，观察动物的臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况。
0 无可观察到的后肢运动
1 1或2个后肢关节轻度活动，一般为髋关节/膝关节。
2 1个后肢关节大幅运动和另一关节轻度活动
3 2个后肢关节大幅运动
4 所有3个后肢关节轻度活动
5 2个后肢关节轻度运动和第3个关节大幅运动
6 2个后肢关节大幅运动，第3个关节轻度活动
7 所有3个后肢关节大幅运动
8 不负重摆动，或足底着地，但不负重
9 仅站立的时候足底负重或偶尔/频繁/持续以足背负重步行，无足底负重步行
10 偶见负重步行，但前、后肢不协调
11 由频繁到持续负重步行，但无前、后肢协调
12 由频繁到持续负重步行，偶见前、后肢协调
13 由频繁到持续负重步行，频繁前、后肢协调
14 持续协调足底步行，优势爪在刚触地和抬起时旋转
15频繁足底步行，持续前、后肢协调，偶尔足背侧步行
16 持续协调足底步态，当前肢向前时无或偶有伸趾，优势爪刚触地时平行
17 持续协调足底步态，频繁伸趾，优势爪触地时平行，抬起时旋转
18 持续协调足底步态，频繁伸趾，优势爪在触地及抬起时均平行
19 持续协调足底步态，持续伸趾，优势爪在触地及抬起时均平行
20 基本内容同18，尾在部分或全部观察期中下垂
21 基本内容同18，尾持续上翘，但躯体不稳
丙戊酸对大鼠急性脊髓损伤后BDNF及NT [摘要] 目的探讨丙戊酸（VPA）对脊髓损伤后脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养素3（NT-3）表达的影响。方法将60只雄性SD大鼠随机分为三组：对照组（C组）、损伤组（SCI组）和丙戊酸保护组（VPA组）。采用改良Allen法制作脊髓损伤动物模型。VPA组术后即刻及其后每12 h皮下注射VPA 300 mg/kg；C组和SCI组在相应时间点注射等体积的生理盐水。于伤后24、48、72 h和1周取材。利用BBB评分标准进行不同时段的行为学评分。通过免疫组化法观察各组大鼠脊髓损伤后BDNF及NT-3表达的变化。结果BBB评分显示，C 组运动功能未受影响，VPA组的BBB评分均高于SCI组，在伤后48、72 h和1周两者比较，差异有统计学意义（P [关键词] 脊髓损伤；丙戊酸；脑源性神经营养因子；神经营养素3 [中图分类号] R651.2 [文献标识码] A [":.gerenzongjie.co" ="" class="">文章编号] 1673-7210（2012）07（c）-0023-03 Effects of valproic acid on the expression of BDNF and NT-3 in rats after acute spinal cord injury LI Xinzhi Department of Anatomy and Histo-Embryology, Chengdu Medical College, Sichuang Province, Chengdu 610083, China [Abstract] Objective To investigate the effects of valproic acid (VPA) on the expression of BDNF and NT-3 in rats after acute spinal cord injury. Methods 60 adult rats were randomly divided into three groups: control group (C group), spinal cord injury group (SCI group) and VPA treatment group (VPA group). Spinal cord injury model was made by modified Allen technique. VPA (300 mg/kg) was administrated in rats through subcutaneous injection immediately after injury and repeated per 12h after injury, while C group and SCI group were received
BBB(大鼠脊髓损伤)评分标准： 0分：无可见后肢运动 1分：一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节 2分：一个关节广泛活动或一个关节广泛活动且有另一关节轻微活动3分：两个关节广泛活动 4分：后肢全部三个关节可轻微活动 5分：两个关节轻微活动，第三个关节可广泛活动 6分：两个关节广泛活动，第三个关节可轻微活动 7分：后肢全部三个关节可广泛活动 8分：非承重情况下可以爪掌面着地 9分：间或爪掌面承重支撑或爪背面承重移动，无爪掌面支撑移动10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作 11分：可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作 12分：可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作 13分：常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作 14分：有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动 15分：持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓地；初接触时主动爪位置与身体平行 16分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移
后旋转。 17分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。 18分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。 19分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂。 20分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起。 21分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。 关于BBB评分，的确有很大的主观性，我目前把BBB评分分三大块，0-7 主要看关节动否？有几个关节动？ 8-14 看脚掌能否着地？着地后能否运动？运动协调不？ 15-18 看脚尖能否抓地？脚尖与前进方向是否一致？前后肢运动是否协调 19-21 看运动时躯干稳不稳定？尾巴翘不翘？
B2B与B2B2B的区别 一、定义 1、B2B的定义 B2B（Business To Business）是企业对企业之间的营销关系。电子商务是现代B2B marketing的一种具体主要的表现形式。它将企业内部网，通过B2B网站与客户紧密结合起来，通过网络的快速反应，为客户提供更好的服务，从而促进企业的业务发展。 2、B2B2B的定义 B2B2B：生厂商——渠道商——消费者企业，供职的客户主体都是企业。与B2B的模式相比，B2B2B在世界范围内应用的比较少，他把广大散户排除在外。但是由于充分整合B2B、B2C、C2C叁种模式的优点，产业链条间的各企业结合更加紧密，便于各方在生产计划、安排、运输等各流程的衔接，实现经济活动的优化，最终实现对整个产业的优化升级，从而超越叁种模式并弥补了各自的不足。生产商可以专注自己的量产，降低成本，同时利用专业的渠道商广泛的批发、零售关系，做量，一来可以降低资金的周转期，再者可以剪断自营链的长度，规避风险。 二、B2B与B2B2B的区别（从5个纬度来分析） 1、信息流 1.1信息流概念 信息流（Information flow;the flow of information）是指信息的传播与流动，信息流是物流过程的流动影象，信息流分三个过程：采集、传递和加工处理。 广义的信息流是指人们采用各种方式来实现信息交流，从面对面的直接交谈直到采用各种现代化的传递媒介，包括信息的收集、传递、处理、储存、检索、分析等渠道和过程。 狭义的信息流是从产品到客户的信息过程，即产品的信息是如何让客户知道、产品的具体功能与性能是如何让客户了解的、产品的交易流程是如何让客户掌握等几部分。 1.2 B2B与B2B2B的信息流区别 因为B2B平台与B2B2B方式的基本功能就是让信息对称，所以在信息流上两种交易形态没有本质的区别。所有B2B2B交易过程中产品的传达展示、交易场所与方式的引导信息都可以在B2B平台上实现。 2、库存 2.1库存概念 库存是指仓库中实际储存的货物。库存包括现有库存和在途库存或者还有合同库存，也就是账面上的和实际的。 2.2 B2B与B2B2B的库存区别 选择B2B商业模式的企业没有产品库存，而选择B2B2B商业模式的企业会把生产商的产品先引进，放入自己的仓库，形成库存之后，再进行销售。在现代电子商务运营模式下的渠道商有可能不会形成库存，而在零库存的状态下让供应商成为自己的库存形态，但前提是渠道商必然会让供应商采用自己的信息化系统来管控物流过程，让没有库存的状态下客户得到产品的速度与有库存的情况下基本一致。同时也有许多电子商务模式的渠道商采用集约式的库存系统来管理覆盖地区的整体物流效率。B2B平台式的渠道商几乎不需要考虑这些因素，它们的服务着重于对称信息流部分 3、现金流 3.1现金流概念 现金流量是现代理财学中的一个重要概念，是指企业在一定会计期间按照现金收付实现制，通过一定经济活动（包括经营活动、投资活动、筹资活动和非经常性项目)而产生的现金流入、现金流出及其总量情况的总称。即：企业一定时期的现金和现金等价物的流入和流出的数量。 3.2 B2B与B2B2B的现金流区别
褪黑素对大鼠急性脊髓损伤内质网应激蛋白GADD153／CHOP表 达的影响 目的探讨褪黑素（MT）对急性脊髓损伤（ASCI）大鼠模型脊髓组织GADD153/CHOP表达的影响。方法选取健康SD大鼠96只，随机分为生理盐水处理组（NS组）、乙醇处理组（ET组）及褪黑素治疗组（MT组）各32只。所有大鼠均以改良Allen法制备脊髓损伤模型；MT组在模型制备的基础上给予褪黑素治疗；ET组在模型制备的基础上给予5%乙醇处理；NS组在模型制备的基础上给予0.9%氯化钠溶液处理。分别于伤后3 h、1 d 、3 d、7 d时各取8只应用改良Tarlov评分法评价其神经功能；Tarlov评分后处死，取受损节段脊髓行HE染色及免疫组化染色，观察形态学改变和CHOP表达的特点；并应用TUNEL方法检测神经细胞凋亡情况。其量的评定借助于麦克奥迪数码医学图像分析系统A（Motic.med 6.0）软件，结果分别用累积光密度（IOD）及细胞凋亡指数（AI）来表示。结果所有实验大鼠脊髓组织均有不同程度出血、水肿、细胞凋亡及坏死。MT组Tarlov评分除3 h时间点外，其他各时间点Tarlov评分明显高于ET组及NS组，且差异有统计学意义（P 0.05）。结论MT可抑制CHOP 表达，降低脊髓细胞凋亡指数，可能为其发挥急性脊髓损伤保护作用的重要机制之一。 标签：褪黑素；急性脊髓损伤；GADD153/CHOP；细胞凋亡；药物治疗 现代研究结果显示[1]，急性脊髓损伤（actue spinal cord injury，ASCI）后存在广泛细胞凋亡现象。细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，目前大量研究认为其对损伤后神经功能产生重要的影响[2]，是导致继发性脊髓损伤的主要原因[3]。以往认为细胞凋亡信号传导通路包括线粒体和死亡受体途径[4]。最新研究表明，内质网应激也参与了细胞凋亡，其中CHOP/GADD153（C/EBP homologous protein/growth arrest-and DNA damage inducible gene 153）是内质网应激特异的转录因子[5-6]，可由DNA生长停滞性损害诱导产生。黄怀等[7]发现内质网应激可以诱导大鼠ASCI神经细胞的凋亡，加重脊髓的损伤及神经功能障碍，该研究还发现ASCI组织CHOP表达含量的高低与ASCI的严重程度一致。CHOP又称内质网应激促凋亡蛋白，是继发性脊髓损伤发生机制的重要因素之一。褪黑素（melatonin，MT）是人体重要神经内分泌活性物之一，主要由松果体分泌，因此也称为松果体素。目前，MT对脊髓损伤的保护作用是国外研究的热点。据相关文献报道，MT对脊髓的保护作用主要通过线粒体通路或者死亡受体通路而实现，关于MT通过内质网通路发挥脊髓保护作用的文献鲜有报道。本实验旨在观察褪黑素对大鼠ASCI后脊髓组织内质网应激相关蛋白GADD153/CHOP表达的影响，探讨其对脊髓损伤的保护作用。 1 材料与方法 1.1 动物与分组
BBB(大鼠脊髓损伤)评分标准： 0分： 无可见后肢运动 1分： 一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节 2分： 一个关节广泛活动或一个关节广泛活动且有另一关节轻微活动3分：两个关节广泛活动 4分： 后肢全部三个关节可轻微活动 5分： 两个关节轻微活动，第三个关节可广泛活动 6分： 两个关节广泛活动，第三个关节可轻微活动 7分： 后肢全部三个关节可广泛活动 8分： 非承重情况下可以爪掌面着地 9分： 间或爪掌面承重支撑或爪背面承重移动，无爪掌面支撑移动10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作
11分： 可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作 12分： 可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作 13分： 常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作 14分： 有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动 15分： 持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓地；初接触时主动爪位置与身体平行 16分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转。 17分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。 18分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。 19分：
步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂。 20分： 持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起。 21分： 持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。 关于BBB评分，的确有很大的主观性，我目前把BBB评分分三大块，0-7主要看关节动否？有几个关节动？ 8-14看脚掌能否着地？着地后能否运动？运动协调不？ 15-18看脚尖能否抓地？脚尖与前进方向是否一致？前后肢运动是否协调19-21看运动时躯干稳不稳定？尾巴翘不翘？
大鼠行为学实验评价汇总 大鼠行为学评定方法比较 大鼠进行行为学评定(behavior test)的十分重要，对其评定的方法也颇多，但究竟那种方法更适用，目前未有人进行过比较。为了合理选择MCAO后的评定方法，如下对目前常用的几种行为学评定方法进行比较。 行为学检查方法:由3位参加试验的人员分别以单盲法对试验的大鼠进行打分和记录.然后将3组的记分结果进行平均后的得分进行统计计算。（国内） 由一个对试验实施过程不了解的观察者对大鼠进行行为学评测。评测续贯进行。如果大鼠在一次评测中出现恰当的行为，而以后却未出现，按前者记分。(国外) 1. 神经行为学检查Longa评分法 2．Berderson评分法姿势反射测验（postural reflex test） 3. 攀绳实验 4．网屏测验（screen test） 5．肢体放置测验（limb-placement test）Elicited Forelimb Placing 6．开野试验（Open－Field法）测定行为 7．MNSS 8.转动杆测验（rotating pole test） 9．Rotation 10．肢体对称试验评分法 11. rotarod test 12. adhesive-removal somatosensory test 13．Spontaneous Activity 14．Symmetry in the Movement of Four Limbs 15．Forepaw Outstretching 16．Climbing 17．Body Proprioception 18. Response to Vibrissae Touch 改善记忆作用 1.跳台试验 2.避暗试验 3.穿梭箱试验 4.水迷宫试验 Motor behavior (1) observation of spontaneous ipsilateral circling, (2) contralateral hindlimb retraction, (3) beam walking ability,平衡木测验（balance beam test） (4) bilateral forepaw grasp, Skilled forelimb function (1)staircase feeding apparatus nociception (1) plantar test
评分者内部一致性的研究和应用 徐晓锋Ξ1 刘 勇2 (1中央司法警官学院,保定,071000)(2华南师范大学心理应用研究中心,广州,510631) 摘 要 在行为科学的研究和实践中,研究者常常需要将个体层次的评价,整合到群体层次的评价,对于这种自下而上整合模式的一致性问题,国内一些学者常常错误地使用评分者内部信度作为评分者内部一致性的指标。评分者内部一致性和评分者内部信度不仅在理论基础上存在差异,而且在实践中也存在前者很高(或很低),而后者却很低(或很高)的不一致情况。文章阐述了学术界对评分一致性这一问题的提出、争论和取得一致观点的发展脉络,以期学者们对这一问题能够有深入的思索,避免在今后的研究中出现类似的错误。 关键词:评分者内部一致性 评分者内部一致性信度 区别 1 问题的提出 在行为科学的理论和实践中,许多情况下都需要一组成 员对某个特定对象进行评定,如面试、无领导小组讨论中考官依据BARS (Behaviorally Anchored Rating Scale )对候选人胜任情况的评定;某个学术期刊编辑委员会对一个所投稿件录用可能性的评定等等。当K 个评判者都对某一对象进行评定,而这一对象可能是一个单一的变量,或所测量的同一结构的一系列的J 个条目,这种情况下采用一种科学的、能够衡量评判者一致性的指标对测量结果的评价是非常重要的。 在国内心理学的研究和实践中,一些学者使用评分者内部信度来代替评分者内部一致性,甚至还存在将二者完全等同的情况,例如存在“对评分者一致性即评价中心的信度作 出研究”[1]、或“评分者信度(评分者一致性)”[2] 的错误说法,这种不加区别的使用,常常使结果的解释存在许多值得商榷的地方,同时也混淆了对评分一致性的认识。 在心理学的历史上,关于评分一致性和评分者信度的认识问题有很长时间的讨论,本文通过介绍学术界对评分一致性这一问题的认识、争论和发展的情况,试图澄清对评分者内部一致性和评分者信度概念认识的误区,以期在今后的研究中减少误用的情况。 2 评分一致性研究的历史发展 在行为科学的研究中,研究一组评定者评分的汇聚性问 题,在心理测量中有很长的研究历史。一些研究者使用百分比或比例的一致性作为指标,但把评定选项视为顺序变量还是等距变量,离散变量还是连续变量,会导致不同评定者分数能否进行数学加减运算的区别;另外,它也不能解释偶然存在的一致性(chance agreement )情况。还有一些研究者使用肯德尔和谐系数作为对一致性研究的指标,这种方法只有在将评定选项视为顺序变量时才能应用,而且计算方法较为粗略。 为了克服以往计算指标的缺陷,寻找更加科学的计算方法,James 等(1984)在《Journal of Applied Psychology 》上发表的文章中提出了r wg 的概念[3],认为组内一致性(within — group agreement )评定的是来自个体共同变异(interchangement )程度,并对其理论基础进行了阐述,深化了 对上述问题的认识。 但对的认识问题学术界也经历了长达十余年的讨论过程。James 等(1984)认为是一个组内评分者信度(within -group interrater reliability )的指数,从而将评分者信度(interrater reliability )和评分者内部一致性(interrater agreement )问题相混淆。K ozlowski 和Hattrup (1992)澄清了对上述问题的一些错误认识[4],他们认为James 等(1984)提出的概念一直是按照一致性指数加以推导和定义的,实际上计算的是评分者内部一致性问题,而却用评分者信度的名称来代表r wg ,这导致了在研究文献中对信度和评分一致性认识的混淆。James 、Demaree 和Wolf (1993)在重新讨论问题的时候,认为K ozlowski 和Hattrup (1992)提出的观点,即关于是评分一致性的测量指标,而非评分者信度指标的观点是正确的,同时也改正了自己过去认为是测量评分者信度(interrater reliability )计算方法的错误认识[5]。此后,学者们逐渐接纳将看作是计算评分者一致性(interrater agreement )指标的观点[6-8]。目前在组织行为文献中,最常使用的组内评分者一致性的指标是r wg 或r wg (j ),分别用于评价一个单一条目(single items )和多条目变量(multiple —item scales )的一致性。 3 评分一致性研究的理论基础 Finn (1970)[9]以及James (1982)[10]认为总体变异划分为真变异和随机测量误差变异,这种观点的理论基础是经典的心理测量模型。后来,James 等(1984,1993)修正了他们在 1982年的看法,提出了与经典心理测量模型不同的观点,从 而对一致性研究产生了较大的影响。他们认为,从数学角度而言,评定者内部一致性是一系列判断的系统变异与总体变异的比例。总体变异由两部分组成,第一部分是由随机测量误差产生的变异,如心境的波动和动机的偶然变化、暂时性的注意分散、不可控的条件(如噪音)、疾病、疲劳、情绪紧张或偶然变化等非系统性因素构成;第二部分是系统变异,由真变异和反映一组评定者的共同反应偏差的系统误差变异 Ξ通讯作者:徐晓锋:男。E 2mail :xuxiaofeng5087@https://www.doczj.com/doc/288939956.html, 心理科学 Psychological Science 2007,30(5):1175-11781175
SD大鼠脊髓损伤模型的制备及功能的评定作者：程方圆沈程肖贵虎杨明英杨金梅罗川南 指导老师：荣成 （四川省成都市成都医学院，610500） 摘要目的：通过对SD大鼠脊髓顿挫损伤（Spinal cord injury，SCI）模型进行功能评价，观察SD大鼠脊髓恢复情况。方法：将SD大鼠随机分成实验组、对照组两组，将实验组用 Allens法进行T9脊髓顿挫损伤，制成大鼠脊髓损伤模型。对所有大鼠的后肢运动功能进行BBB评分和脊髓组织学观察。结果：实验组大鼠BBB评分一周后最高达到14分，最低达到3分。BBB功能评分显示实验组大鼠运动功能明显低于对照组，并逐渐恢复或增强。结论：脊髓顿挫导致大鼠后肢功能障碍，通过BBB评分显示，大鼠后肢功能逐渐增强。 【关键词】脊髓顿挫损伤；后肢运动功能；BBB评分 Objective: observe the recovery situation of the SD rats through the abortive on spinal cord injury in SD rats (spinal cord injury, SCI) function evaluation model .methods: SD rats were divided into two groups randomly, including normal group and experimental group. SD rat model of acute spinal cord injury were established by using Allens method at 9th spinal cord, evaluate the hind limb motor of all rats and observe the histology of spinal. Result: the experimental rats’ BBB score up to 14 points after one week, the lowest reach 3 points. The BBB score of experimental rat s showed that the rats’ motor function was significantly lower than the normal rats, and gradually restored or enhanced. Conclusion: aborting spinal cord leads to hind limb dysfunction, the BBB score showed that the hind limb function of rats is enhancing gradually。Key words: spinal cord injury; hind limb motor function; BBB score 前言：脊髓损伤是由于各种原因引起的脊髓结构和功能的损害，是脊柱损伤最严重的并发 症，往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，是中枢神经系统严重的致残性疾病。随着世界各国经济水平的发展，脊髓损伤发生率呈现逐年增高的趋势。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。有研究表明脊髓损伤后有一定修复能力，为此我们设计了此实验。通过对照实验将SD大鼠随机分为脊髓损伤与否两组大鼠，对脊髓损伤的大鼠模型进行功能评价，从而找到更好的治疗脊髓损伤的办法。经过实验，我们发现SD大鼠在脊髓损伤后功能逐步恢复。 1 材料与方法 1.1主要仪器 鼠台、橡胶圈、玻璃分针、烧杯、10g金属棒、粗剪刀、手术器械、婴儿磅秤、缝合针、棉线、棉签、注射器、脊髓打击装置。 1.2 主要试剂 3.6%水合氯醛、青霉素、葡萄糖、1.5%戊巴比妥溶液。 1.3 实验动物 健康成年雌性大鼠10只，体重200±50g。饲养两周后进行实验。
1、测定血脑屏障完整性原理 伊文思蓝属于一种常用的偶氮染料制剂,因其分子量大小与血浆白蛋白相近，而且在血液中与血浆白蛋白有很高的亲和力，由于正常状态下血浆白蛋白无法透过血脑屏障，所以染色时，如神经系统是完整的，与血浆白蛋白结合的依文思蓝无法使其着色。相反如果神经系统血脑屏障被破坏，依文思蓝就可以进入神经系统并使其着色。在荧光波长470与540 nm 各有一强峰，680 nm处有一弱峰。其在组织中的含量常使用化学透析法和比色法进行检测。 脑组织中血脑屏障的破坏，可以引起毛细血管的通透性增加，结合EB的白蛋白可通过BBB进入脑组织，应用化学比色法甲酰胺测定脑组织EB渗出量，可以反映血脑屏障的开放程度，并在此基础上进一步探讨不同细胞移植干预与BBB通透性的效应关系。 伊文思蓝灌注染色法结合共聚焦激光扫描显微镜观察脑切片中EB荧光强度，可以检测血脑屏障中血管形态的改变，同时对脑组织中渗入的EB含量进行定量分析。 两者结合可以从形态学、组织定量上相互补充完善。 2、实验准备 试剂：2%EB、1%戊巴比妥钠、0.9%氯化钠、20U/ml肝素钠、二甲基甲酰胺 器材：冰冻切片机、共聚焦激光扫描显微镜、分光光度计、恒温箱、离心机、注射器、输液器、解剖器械等 3、测定方法 1、各组动物处死前0.5h（也有的为1h、2h）尾静脉（或股静脉）注入2%EB（2ml/kg，也有的用3、4ml/kg）（剂量与提前时间成反比？） 2、1%戊巴比妥钠30-40 mg/kg麻醉后打开胸腔，心内灌注肝素生理盐水（0.9%氯化钠+20U/ml肝素钠）200-300ml（有文献提出当右心房流出液体变清澈时即可停止灌注），断头取脑作矢状切取半脑分离海马，一半脑组织进行冰冻切片，应用冰冻切片机行10-20μm 切片，于共聚焦激光扫描显微镜下观察EB通透情况。 3、另一半脑组织称重，剪碎置于二甲基甲酰胺（1ml/100mg脑组织，也可用三氯乙酸、甲酰胺）60℃孵育24h，1000r/min离心5min（有的作者认为脑组织在甲酰胺中匀浆呈胶状，上清液不能通过离心取得，水浴后直接取上清液比色），用分光光度计检测波长为620 nm 的吸光度。 4、采用软件（Oringen7.0）进行数据分析，根据绘制的EB标准曲线计算EB含量。 4、试剂购买 EB
Western blot 试验操作步骤 一、蛋白样品制备 1 用细胞刮刀将细胞刮下（不要将培养基倒掉），用吸管将其吸至离心管中 2 用4℃预冷的PBS 1ml冲洗培养瓶2次收集入上述离心管中 3 1000rpm，离心10min 4 倒掉上清，沉淀用1ml PBS 重悬，转入EP管中，再加1ml PBS冲洗离心管壁上残留的细 胞转入EP管中 5 4℃，4000rpm，离心5min 6 倒掉上清液（用抢把残余上清吸干净） 7 配制裂解液，计算所需用量，每个EP管中加入100ul裂解液(10mg组织/100ul) 若有4管（4组），配制400ul裂解液：PMSF储备液浓度100mM，用RIPA稀释至1Mm. 【单去污剂裂解液（PMSF）：1mol/L Tris·HCl（pH8.0）2.5ml; NaCl 0.438gTritonX-100 0.5ml ; 蒸馏水至50ml; 混匀后4℃保存】 8 4℃裂解30-45min，每5min振荡一次 9 4℃ 14000g 离心5min，取上清（移入1.5ml的EP管中）。 10 蛋白定量（常用BCA法，参见蛋白定量试剂盒使用说明） 每管蛋白一致，分装约20ul/管左右（加入5×buffer并用RIPA稀释成1×） 11 将蛋白样100℃，变性5min，，-80℃（or -20℃）保存。 二、SDS-PAGE的配制： 1 试剂及配制： （1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N,N-亚甲基双丙烯酰胺1g，去离子水至100ml，过滤，避光，4℃贮存。 （2）1. 5mmol/L Tris溶液（PH8.8）：称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。 （3）1.0mmol/LTris溶液（pH6.8）：称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。 （4）10%SDS：1g SDS加入10ml去离子水，室温贮存。 （5）10%过硫酸铵溶液：0.1g过硫酸铵加入1ml水，4℃保存，现用现配。 （6）TEMED（可购买成品）
Allen,S脊髓损伤大鼠模型评价 发表时间：2012-08-01T15:54:02.470Z 来源：《中外健康文摘》2012年第15期供稿作者：郑文添1 黄汉兴1 王玮2 [导读] 脊髓不完全损伤后功能的恢复较早就引起人们的注意，其机制十分复杂。 郑文添1 黄汉兴1 王玮2 （1福建省莆田市第一医院 351100;2福建医科大学基础医学院 350004） 【中图分类号】R681.5【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）15-0088-03 【摘要】目的观察Allen，S法脊髓损伤（SCI）后大鼠后肢功能恢复情况，以及损伤后18d脊髓内部结构的变化及意义。方法：取雌性SD 大鼠16只随机分为2组（n=8）：空白对照组、伤后18d组。Allen，s法致伤脊髓。用大鼠综合行为评分法（CBS）对各级神经功能评分。用免疫荧光化学和图像分析的方法观察GFAP表达变化。结果 1：在行为观察中，发现大鼠脊髓损伤后有自行恢复倾向，损伤后18天后肢功能恢复68%。2：脊髓损伤后18d GFAP反应明显增强。结论 1、急性脊髓损伤后脊髓有自我修复的倾向。2、胶质细胞对脊髓损伤后的功能恢复起到重要作用。 【关键词】脊髓损伤 GFAP 行为学 The Evaluation of Allen,s Weight-dropping Model Experiment Spinal Cord Injury 【Abstract】 Objectives:To observe the recovery of hindlimb function and the changes of structures of the spinal cord 18d after spinal cord injury （SCI）and its significance.Methods:16 female SD rats were randomity divided into the two groups:the groups of spinal cord injury (n=8) and control group (n=8). Spinal cord was injuried with Allen,s weight-dropping model. Immunohistochemical technique and imagine analysis technique were used to detect the express of GFAP in spinal cord tissue, and the neurological function of spinal cord was graded according to Gale combined behavioral score(CBS) . Results:1. In behavior examination , there was about 68% self-recovery of hindlimb function of the injuried rats. 2. The expression of GFAP showed increased 18 day after spinal cord injury. Conclusion:1.There was a tendency of self-repairing after spinal cord injury.2.The data indicted that GFAP may play an important role in self-repairing and regeneration after spinal cord injury. 【Key words】Spinal cord injury GFAP Behavioral analysis 脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是一种严重影响人类生命质量和生活质量的疾病。研究脊髓损伤最基本的条件是建立标准，理想的脊髓损伤型。理想的模型应符合以下要求：1.临床相似性;2.可调控性;3.可重复性;4.可操作性。传统观念认为,哺乳动物的脊髓损伤后不能再生,导致其后期功能恢复的预后较差，近年来实验研究证实,中枢神经损伤后具有一定的再生能力。本实验用Allen，s法建立脊髓损伤模型，观察脊髓损伤后功能自行恢复情况，并行免疫荧光染色观察脊髓损伤后胶质细胞反应情况,试图对Allen，s模型进行客观的评价。 材料与方法 一、实验动物 成年雌性Sprague-Dawley大鼠16只，体重230-270g，由福建医科大学动物实验中心提供。将大鼠随机分为2组（n=8）：空白对照组、脊髓损伤组。 二、方法 1、模型制备[1]： 所有动物用2%的戊巴比妥纳（40mg/kg）腹腔麻醉后，后路显露T10脊髓。用Allen法制成脊髓背侧损伤动物模型，打击力度为（12.5g×10cm）125势能克厘米力（gram-cm force ,gcf），然后冲洗伤口，用1-0号线依次缝合椎旁肌肉和皮肤。对照组同法暴露，但不损伤脊髓。术后皮下注射青霉素（100U/d）。术后给予人工挤压膀胱帮助排尿，每天两次，直到能自行排尿为止。 2、动物行为评分[2]： 分别于术后每隔24小时进行行为观察。观察者为非本组实验人员。应用Gale联合行为评分（CBS）综合评定大鼠脊髓损伤后功能，包括运动、感觉、反射以及肢体动作协调等方面，最小值为0分，表示神经功能完全丧失，最大值为100分，表示功能完全正常。 3、取材 4、Cajal氏镀银染色。 5、GFAP免疫荧光染色。 7、各数据用SPSS10.0 for windows 分析软件进行统计学分析。数据用均数±标准差表示，各组间数据用方差齐性和两样本的t检验；相关分析用皮尔森相关分析。 结果 1、行为学评分结果 用CBS联合评分,对T10脊髓损伤后大鼠的后肢功能进行评分，发现后肢功能有进行性恢复的现象，损伤后18天功能恢复至68分（CBS 综合评分）。脊髓损伤组与对照组相比，差别均有显著性意义。（P<0.05）。（图1）
大鼠神经行为缺损评分与脑梗死率相关性研究分析 张俊清1，孟智宏2，樊小农 3 （1.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古包头014010；2.天津中医药大学第一附属医院，天津300193； 3.天津中医药大学第一附属医院针灸研究所，天津300193）摘 要：目的：研究经典线栓法制备局灶性脑梗死模型大鼠的神经功能评分与脑梗死率的相关性。方法：采用ZeaL-onga 法制作大鼠局灶性脑梗死模型，在不同时间段采用Zausinger 六分法对脑梗死大鼠进行神经功能缺损评分，并用 TTC （2、3、5－氯化三苯基四氮唑）溶液对脑组织染色，计算脑梗死率。结果：六次神经功能缺损评分与脑梗死率之间呈 显著相关性（r 1=－0.528；r 2=－0.535；r 3=－0.529；r 4=－0.512；r 5=－0.535；r 6=－0.5888）。结论：经典线栓法制备的局灶性脑梗死模型（大脑中动脉栓塞）中，大鼠的肢体运动功能与脑梗死率有相关性，第六次神经功能缺损评分与脑梗死率相关性最大，针刺能够改善神经功能缺损情况，提高评分，降低脑梗死率。 关键词：大脑中动脉缺血模型；神经功能缺损评分；脑梗死率；相关性 中图分类号：R364．17文献标识码：A 文章编号：1000－1719（2012）11－2140－03 Analysis on Correlation between Rats Neurobehavioral Scores and Cerebral Infarction Rate ZHANG Jun-qing 1，MENG Zhi-hong 2，FAN Xiao-nong 2 （1.The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College ，Inner Mongolia University of Science ＆Technology ，Baotou 014010，Inner Mongolia ，China ；2.First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine ，Tianjin 300193，China ；3.Institute of Acupuncture ＆Moxibustion ，First Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM ，Tianjin 300193，China ）Abstract ：Objective ：To study the relation between neurobehavioral scores and cerebral infarction rate in rats model which was made by method of classic suture method．Methods ：ZeaLonga method was used to make focal cerebral infarction model．In different periods ，Zausinger six points method was used for neural function defect scale ，and with TTC （2，3，5－chlorinated three four nitro-gen phenyl ）solution to make brain tissue dyeing ，the calculation of cerebral infarction rate was made．Results ：The neural function defect scales and cerebral infarction rate at six time points had a significant correlation （r 1=0.528；r 2=0.535；r 3=0.529；r 4=0.512；r 5=0.535；r 6=0.5888）．Conclusion ：In the focal cerebral infarction model （brain artery embolization ）made by classic su-ture method ，rat body movement function and cerebral infarction rate have correlation ，the sixth correlation of neural function de-fect scale and cerebral infarction rate is the largest．Acupuncture can improve neural function defects ，improve the grade ，reduce the rate of cerebral infarction． Key words ：MCAO ischemia model ；neural function defect scale ；cerebral infarction rate ；correlation 收稿日期：2012－05－17 基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）；针刺手法的量效关 系及生物学机制研究（2010CB530506） 作者简介：张俊清（1979－），男，内蒙古呼和浩特人，博士研究生，研究 方向：针刺治疗脑血管病机理及针刺手法疗效关系。 通讯作者：孟智宏（1963－），男，教授、主任医师，博士研究生导师，研究 方向：针刺治疗对心脑组织保护作用，针刺手法量效关系及生物学基础。 神经功能缺损评分是一种被广泛应用的脑缺血模 型评价方法。资料显示， 50% 70%的脑梗死存活者遗留瘫痪、失语等，神经功能缺损评分可直观的反映这些症状和体征，症状与体征的检测又可以反映脑损伤与恢复的程度。脑梗死灶体积的测定是评价局部脑缺血及缺血性脑损害程度最重要的客观指标之一，是公认的评价药物是否具神经保护效果的金指标。TTC （2，3，5－氯化三苯基四氮唑）染色法能够直观地显示 脑缺血发生的部位和程度，进而对脑梗死体积做出评 价。神经功能缺损评分是评价造模成功的标准，也是 神经功能缺损的反应， 梗死率是评价脑缺血损伤程度最准确的指标，二者之间是否存在相关性，相关程度如何罕见报道。本研究复制大鼠大脑中动脉缺血模型（MCAO ），以针刺频率的慢、中、快（1、 2、3次/s ）和针刺时间的短、中、长（5s 、 60s 、180s ）的两因素三水平针刺参数搭配组合9种针刺参数组， 以捻转手法刺激“内关穴”，以神经行为缺损评分、脑梗死率为效应指 标， 通过偏相关分析研究神经功能缺损评分与通过TTC 计算脑梗死率的相关性，以及相关的程度。分析TTC 计算脑梗死率与六次神经功能缺损评分的相关性。 1材料和方法 1.1试剂与仪器水合氯醛（分析纯）（天津市瑞科 有限公司）、多聚甲醛（分析纯）、 PBS 溶液、TTC 粉末、生理盐水（天津市联星生物技术有限公司）。