网络出版时间：2014-10-10 10:04
网络出版地址：https://www.doczj.com/doc/229194843.html,/kcms/doi/10.13287/j.1001-9332.20141010.003.html
叶绿酸铁对亚适温条件下黄瓜幼苗渗透调节物质及抗氧化酶活
性的影响*
张蒙1王秀峰1,2张帆洋1魏珉1,2,3史庆华1,2杨凤娟1,2李岩1
(1山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安271018；2作物生物学国家重点实验室，山东泰安271018；
3农业部黄淮海设施农业工程科学观测实验站，山东泰安271018)
摘要以黄瓜品种“津研四号”为试材,利用光照培养箱进行亚适温处理(昼/夜18/12 ℃),研究亚适温条件下喷
施5 mg·L-1叶绿酸铁溶液对黄瓜幼苗生长、脯氨酸、可溶性糖、丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响.结果表
明: 亚适温条件下叶面喷施叶绿酸铁可以缓解亚适温对黄瓜生长的抑制,增加叶片中脯氨酸和可溶性糖含量,
减少丙二醛含量,提高超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶及抗坏血酸过氧化物酶活性.喷施叶绿酸铁
在一定程度上可通过促进渗透调节物质的积累和提高抗氧化酶活性,来降低膜脂质过氧化水平,从而增强黄
瓜幼苗对亚适温的适应性.
关键词叶绿酸铁亚适温渗透调节物质抗氧化酶
中图分类号S642.2
Effects of chlorophyllin-iron on osmotic adjustment and activities of antioxidantive enzymes in cucumber
seedlings under suboptimal temperature.ZHANG Meng1, WANG Xiu-feng1,2, ZHANG Fan-yang1, WEI
Min1,2,3, SHI Qing-hua1,2,YANG Feng-juan1,2, LI Yan1 (1College of Horticulture Science and Engineering,
Shandong Agricultural University, Tai’an271018, Shandong, China; 2State Key Laboratory of Crop Biology,
Tai’an271018, Shandong, China; 3Scientific Observing and Experimental Station of Environment Controlled
Agricultural Engineering in Huang-Huai-Hai Region, Ministry of Agriculture, Tai’an 271018, Shandong, China)
Abstract: Cucumber cultivar ‘Jinyan 4’ was subjected to suboptimal temperature treatment of 18/12℃ ( day /
night ) in the growth chambers. A solution culture experiment was conducted to study the effect of exogenously
spraying 5 mg·L-1 chlorophyllin-iron solution on plant growth, the content of proline, soluble sugar, MDA and
activity of peroxidase in the leaves of cucumber seedling under suboptimal temperature. Application of
chlorophyllin-iron showed prominent effects on mitigating the stress of suboptimal temperature on growth of the
cucumber seedlings, significantly increasing the plant height, leaf area, shoot dry mass, the contents of soluble
sugar and proline and the activities of SOD, POD, CAT and APX.Exogenously spraying chlorophyllin-iron could
promote the accumulation of proline and soluble sugar, raise the activities of antioxidant enzymes, decrease the
membrane lipid peroxidation and improve the adaptability of cucumber seedlings under suboptimal temperature.
Key words: chlorophyllin-iron; suboptimal temperature; osmoregulation substance; antioxidant enzyme.
*国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-25)资助.
**通讯作者. E-mail: xfwang@https://www.doczj.com/doc/229194843.html,
2014-02-28收稿，2014-09-21接受.
黄瓜(Cucumis sativus)属于冷敏感植物，是冬春设施栽培的主要蔬菜之一。我国设施多以非加温的日光温室和塑料大棚为主，冬春季节常因低温弱光对黄瓜的生长、光合、碳氮代
谢、酶活性和干物质积累产生影响[1]，并影响黄瓜的产量和品质[2]。
叶绿酸(chlorophyllin)是叶绿素水解脱除疏水性植醇侧链而生成的一种绿色衍生物。叶绿素衍生物除具有光合作用外还具有促进造血功能、抗肿瘤、抗氧化、抗诱变和杀菌等作用
[3]。Kamat等[4]在大鼠肝细胞线粒体体外试验中发现，叶绿酸能有效抑制活性氧(reactive
oxygen species,ROS)导致的膜脂质过氧化，从而保护线粒体免受氧化损伤。叶绿酸铁对绿豆
和小麦有很好的抗盐胁迫作用，用叶绿酸铁浸种可以提高小麦、玉米、水稻和油菜等多种作
物的种子萌发率，促进生长[5-6]。近年来，叶绿素衍生物在化工、医药、食品、保健等方面
有着极其广泛的应用[7]，但关于农业生产方面的应用研究较少。
本试验以“津研四号”黄瓜品种为试材，研究叶面喷施叶绿酸铁对亚适温条件下黄瓜幼苗生长、渗透调节物质含量及抗氧化酶活性的影响，探讨施用叶绿酸铁后黄瓜幼苗对亚适温环境的适应性。
1 材料与方法
1.1试验材料
试验于2013年3—9月在山东农业大学园艺科学与工程学院进行，供试黄瓜品种为“津研四号”。选取饱满、整齐一致的种子，按常规方法浸种催芽，挑选发芽整齐的种子，播于装有基质的育苗盘中。子叶展平后，浇灌营养液，待幼苗长至2叶1心时，选取生长一致的健壮幼苗移栽到直径8cm的营养钵中，常规方法管理。
1.2试验处理
待幼苗长至3叶1心时将其移至GXZ型光照培养箱(宁波产)中，正常温度(昼/夜25/18℃)预处理3 d后开始亚适温处理。试验共设3个处理，每处理50株，各处理光照条件一致，其光量子通量密度（PFD）均为600 μmol·m-2·s-1。3个处理分别为：对照(CK)：昼/夜25/18℃；亚适温处理(T1)：昼/夜18/12℃；缓解亚适温处理(T2)：昼/夜18/12℃，外源喷施5 mg·L-1叶绿酸铁溶液。亚适温处理期间，每天16:00对T2幼苗叶面喷施5mg·L-1叶绿酸铁溶液，其他处理喷施等量蒸馏水，各处理均匀喷洒叶面，以叶片均匀附着一层小水珠为准，每处理3次重复。本试验中所采用的叶绿酸铁溶液浓度由预备试验筛选得出。处理5、10 d后取样进行各项相关指标的测定，每处理3次重复。
1.3 测定项目与方法
1.3.1植株生长势用直尺分别测定黄瓜幼苗株高(茎基部到生长点的高度)、叶片长和宽(叶片的最长和最宽处)。根据公式计算叶面积：14.16-5.0×叶长+0.94×叶长2+0.47×叶宽+0.63×叶宽2-0.62×(叶长×叶宽)。
取不同处理的地上部分，用去离子水洗净，拭干，称其鲜质量，后将植株置于烘箱内105℃杀青15min，然后70℃烘干至恒量，称其干质量。
1.3.2电解质渗漏率及丙二醛(MDA)含量取各处理黄瓜鲜叶用蒸馏水洗净，用打孔器打取圆片，取0.5g，装入大试管中，加入20mL蒸馏水，室温保持3～4h，多次摇动，测初电导值，封口沸水浴10min，冷却(可用冷水冲泡)，平衡10min后测终电导值，同时测定蒸馏水电导值，计算电解质渗漏率。称取0.5g鲜叶，加1 mL磷酸缓冲液(0.05 mol·L-1，pH=7.8)，冰浴研磨成匀浆至5mL，移至离心管中，平衡，低温(0~4℃)10500 r·min-1离心20min，取上清液1 mL(对照加1mL蒸馏水)，加2 mL 0.67%TBA(硫代巴比妥酸)，封口沸水浴15min，迅速冷却(用冷水冲泡)，倒入指形管中，4000 r·min-1下离心20min，取上清液于600nm、532、450nm下比色测定OD值，计算丙二醛含量[8]。
1.3.3 可溶性糖含量可溶性糖含量根据向曙光等[9]的方法测定。
1.3.4 脯氨酸含量脯氨酸含量根据Barroso等[10]的方法测定。
1.3.5 酶活性测定酶液提取方法同上，SOD活性根据Stewart等[11]的方法采用氮蓝四唑(NBT)法测定；CAT和POD活性采用Cakmak等[12]的方法测定，其中POD活性测定采用愈创木酚法；APX活性采用Nakano等[13]的方法测定。
1.4 数据处理
采用Excel 2003和DPS 7.55软件对试验数据进行处理和差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1外源叶绿酸铁对亚适温下黄瓜幼苗生长的影响
由表1可以看出，处理5 d后，亚适温处理(T1)的黄瓜株高、叶面积及地上部干鲜质量均显著低于对照，比对照减少了22.3%、37%、35.6%和10.1%。而喷施叶绿酸铁处理(T2)的各
生长指标较T1明显增加，但仍低于对照。处理到10 d时，各处理的黄瓜株高、叶面积及地上部干鲜质量均比处理5 d时增加，各处理间的差异趋势与处理5 d时基本一致，亚适温胁迫处理(T1)的黄瓜株高、叶面积及地上部干鲜质量仍显著低于对照，喷施叶绿酸铁处理(T2)的各生长指标明显高于T1，分别比T1增加了5.2%、19.8%、17.9%和16.4%，表明叶面喷施叶绿酸铁缓解了亚适温对黄瓜幼苗生长的抑制。
表 1 外源叶绿酸铁对亚适温条件下黄瓜幼苗生长的影响
Table 1 Effects of iron chlorophyllin on the growth of cucumber seedlings under suboptimal temperature (mean±SD)
5 d10 d 处理天数 Treatment days CK
T1
T2
5 d10 d
处理天数 Treatment days
CK
T1
T2
图1外源叶绿酸铁对亚适温下黄瓜幼苗电解质渗漏率和丙二醛含量的影响
Fig.1 Effects of iron chlorophyllin on electrolytic leakage and MDA content in cucumber seedling leaves under suboptimal temperature.
不同字母表示处理间差异达显著水平(P<0.05) Different small letters meant significant difference among treatments at 0.05 level.下同The same below.
2.3外源叶绿酸铁对亚适温下黄瓜幼苗叶片可溶性糖和脯氨酸含量的影响
由图2可以看出，处理5d后，亚适温处理(T1)的可溶性糖含量明显高于对照，比对照增加了43.8%，而喷施叶绿酸铁处理(T2)的可溶性糖含量则显著高于对照和T1。处理10 d后，各处理的可溶性糖含量与处理5d时无明显变化，但各处理间的差异趋势与处理5 d时一致，
亚适温处理(T1)的可溶性糖含量仍显著高于对照，喷施叶绿酸铁处理(T2)的可溶性糖含量比T1显著增加了22.6%，表明其缓解亚适温胁迫的效果明显。
处理5 d后，亚适温处理(T1)和喷施叶绿酸铁处理(T2)的脯氨酸含量均显著高于对照，而T2的脯氨酸含量比T1显著增加了21.1%，表现出明显缓解亚适温胁迫的效果。处理到10 d 时，各处理的脯氨酸含量比处理5d时有所降低，但差异与处理5 d时表现出一致的趋势,与T1相比，T2的脯氨酸含量增加了37.6%。处理10 d时，由T1和T2脯氨酸含量的差异，仍能看出喷施叶绿酸铁的缓解效果（图2）。
5 d10 d CK T1 T2
5 d10 d CK T1 T2
图2
Fig.2 leaves
2.4
由图3可以看出，各处理SOD、POD和APX活性均呈现出一致的差异趋势。处理5 d 后，亚适温胁迫处理(T1)的黄瓜叶片中SOD和APX活性显著高于于对照，POD和CAT活性与对照无显著差异，而喷施叶绿酸铁处理(T2)后POD、CAT和APX活性均显著高于T1，其酶活性分别增加了9.3%、31.0%和9.4%。处理到10 d时，T1和T2处理的黄瓜叶片中各抗氧化酶活性均显著高于对照，T2处理的各抗氧化酶活性均显著高于T1，分别提高了3.6%、39.8%、27.0%和52.6%。亚适温胁迫下，喷施叶绿酸铁使黄瓜叶片中的抗氧化酶活性保持在较高水平，以有效缓解亚适温条件诱导产生的氧化胁迫。
220
230
240250260270
280 5 d 10 d 处理天数 Treatment days
超氧化物歧化酶活力S O D a c t i v i t y (u n i t s g -1F W )
CK
T1
T2
246
81012
5 d 10 d
处理天数 Treatment days
过氧化物酶活力P O D a c t i v i t y (u n i t s .g -1F W )
CK
T1T2
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
5 d
10 d
过氧化氢酶活性
C A T a c t i v i t y （u m o l H 2O 2.g -1F W m i n -1）
CK
T1T2
10 d
CK T1T2
图3Fig.3 under 3 产物MDA 定性，从而使MDA 含量和电解质渗漏率显著降低，但叶绿酸铁对细胞膜的作用机理还需进一步研究。
当植物遭受胁迫时，为调节细胞内渗透势、维持水分平衡，细胞内会积累一些物质，如脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、甜菜碱、多胺等[18]，以提高细胞液浓度、维持细胞膨压、
降低冰点、防止原生质过度脱水[19]。
亚适温条件下，黄瓜和番茄叶片内脯氨酸含量升高[14-15]，亚低温诱导番茄幼苗的可溶性糖和脯氨酸含量升高，提高植物的低温耐受性[16]，15℃/15(℃昼夜)处理使茄子幼苗叶片中脯氨酸含量高于25℃/25℃(昼夜)处理时的含量[20]。蒋慧等[5]研究表明，盐胁迫下叶绿酸铁可以促进脯氨酸含量的积累。本试验在亚适温条件下，黄瓜幼苗叶片中脯氨酸和可溶性糖含量升高，与他人研究一致。外源喷施5mg·L -1叶绿酸铁溶液使叶片中积累更多的脯氨酸和可溶性糖，维持细胞内渗透平衡，从而提高黄瓜幼苗对亚适温的适应性，维持体内正常的物质代谢。
在正常情况下，植物依靠自身的自由基清除系统保持细胞内的活性氧平衡，但在逆境胁迫下，活性氧平衡受到破坏，活性氧大量积累，此时，SOD、POD、CAT和APX等通过酶促作用清除体内产生的过量活性氧自由基。亚适温条件下，辣椒幼苗叶片中SOD、APX活性升高，CAT活性下降[21]，POD活性下降[15]。周艳虹等[1]研究得出，黄瓜幼苗经低温弱光处理后
℃昼夜)处理使茄子幼苗叶片中SOD、POD和CAT活性高其SOD和POD活性上升，15℃/15(
于25℃/25℃(昼夜)处理[20]。胁迫程度、试验材料种类、处理时期、取样时期和部位等都可能影响各抗氧化酶活性，使其变化趋势产生一定差异。蒋慧等[5]研究表明，盐胁迫下叶绿酸铁可以提高各活性氧清除酶活性。Kumar等[22-23]证实叶绿酸具有较强清除ROS的能力，发现叶绿酸能有效清除辐射产生的羟自由基和过氧化物，从而减少DNA损伤。本试验中，亚适温处理使黄瓜幼苗叶片中各抗氧化酶活性升高，这可能是因为在亚适温环境下黄瓜幼苗依靠自身的抗氧化酶保护系统抵御过量自由基造成的伤害。外源喷施5mg·L-1叶绿酸铁溶液可以使黄瓜幼苗在亚适温下保持较高的抗氧化酶活性，这可能是因为叶绿酸铁能够清除植物体内多余的活性氧，使抗氧化酶结构免受损伤并维持较高活性，提高黄瓜幼苗对亚适温的适应性。
综上所述，亚适温下，叶绿酸铁通过减轻植物膜脂过氧化程度，增加渗透调节物质含量，清除过多的活性氧，维持较高的抗氧化酶活性来提高黄瓜幼苗对亚适温的适应性，但其作用机理有待进一步研究。
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作者简介张蒙，女，1988年生，硕士研究生。主要从事设施蔬菜与无土栽培研究。E-mail: zhangmeng19881208@https://www.doczj.com/doc/229194843.html,
责任编辑张凤丽
一.超氧化物歧化酶(SOD): 超氧化物歧化酶，是一种新型酶制剂，是生物体重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体清除自由基的首要物质。SOD在生物体的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！ 超氧化物歧化酶(SOD)按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基的称（Cu.Zn—SOD），最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。 SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶。超氧化物岐化酶（SOD）能催化如下的反应：O2-+H+→H2O2+O2，O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。SOD是机体天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶（POD）会立即将其分解为完全无害的水。
这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。 目前，人们认为自由基（也称游离基）与绝大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓的自由基就是当机体进行代时，能夺去氧的一个电子，这样这个氧原子就变成自由基。自由基很不稳定，它要在身体组织细胞的分子中再夺取电子来使自己配对，当细胞分子推出新一个电子后，它也变成自由基，又要去抢夺细胞膜或细胞核分子中的电子，这样又称会产生新的自由基。如，超氧化物阴离子自由基、羟自由基、氢自由基和甲基自由基，等等。在细胞由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。它能引起蛋白质变性和交联，使体的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代失常等，最终使机体发生病变。因此，自由基作为人体垃圾，能够促使某些疾病的发生和机体的衰老。虽然自由基会对机体产生诸多危害，但是在一般的条件下人体细胞也存在着清除自由基、抑制自由基反应的体系，它们有的属于抗氧化酶类，有的属于抗氧化剂。像SOD就是一种主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及预防衰老等方面起着重要作用。 SOD能专一地清除体有害的自由基，以解除自由基氧化体的某些组成成分而造成的机体损害。如氧中毒、急性炎症、水肿、自身免疫性疾病、辐射病等疾病都与活性氧的毒性有关。实验证明，SOD能够清除自由基，因此可消除上述疾病的病因。此解毒反应过程是两步：
SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）
叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用
抗氧化酶 S O D P O D C A T活性测 定方法 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液 （pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na 2HPO 4 ·12H 2 O（分子量 358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH 2PO 4 ·2H 2 O（分子量 156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na 2HPO 4 ) 228.75ml，B母液(NaH 2PO 4 ) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。 参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 （3）100μM EDTA-Na 2溶液：取0.03721gEDTA-Na 2 用磷酸缓冲液定 容至1000ml。 （4）20μM核黄素溶液：取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml，避光保存。 （5）750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.06133g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 2、酶活性测定 （1）取10ml试管（要求透明度好）
货号：MS1110 规格：100管/96样 硫氧还蛋白氧化还原酶 （thioredoxin reductase,TrxR）试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似，催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。 测定原理： TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412nm有特征吸收峰，通过测定412nm波长处TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。 自备仪器和用品： 低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 2mL 蒸馏水溶解。 试剂三：粉剂×1 管，4℃保存。临用前加入 2mL 蒸馏水溶解。 粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）； 然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 TrxR 测定操作： 1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412nm，用蒸馏水调零。 2. 试剂一在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）预热30min。 3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL试剂二，20μL试剂三，160μL试剂一， 迅速混匀后于412nm 测定10s和310s吸光度，记为A1和A2。△A空白管=A2-A1。 4. 测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL试剂二，20μL试剂三，140μL试剂一， 20μL上清液，迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度，记为A3和A4。△A 测定管=A4-A3。注意：空白管只需测定一次。 TrxR 活性计算公式： (1). 按蛋白浓度计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。 TrxR（nmol/min/mg prot）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T = 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷Cpr 第1页，共2页
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）L磷酸缓冲液(PBS，： A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g； B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。 （3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。 （4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 （5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 2、酶活性测定 （1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀； （2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中 （3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min； 同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 （4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。 （5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在
货号：QS1111 规格：50管/48样 谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, GR）活性测定试剂盒说明书 紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。 测定原理： GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340 nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水 试剂组成和配置： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5.0 mL蒸馏水，混匀。 试剂三：液体×1支，4℃保存。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 操作步骤： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一置于25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）中预热30min。 3. 空白管：取1mL石英比色皿，加入850μL试剂一，100μL试剂二，50μL试剂三，充分混匀，于340nm 处测定10 s和190 s吸光度，记为A空1和A空2，△A空白管= A空1﹣A空2。 4. 测定管：取1mL石英比色皿，加入750μL试剂一，100μL试剂二，100μL上清液，50μL 试剂三，充分混匀，于340nm测定10 s和190 s吸光度，记为A测1和A测2，△A测定管= A 测1﹣A测2。 注意：空白管只需要测定一次。 计算公式： 第1页，共2页
土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。
重要的抗氧化酶和抗氧化剂的作用 超氧化物歧化酶（SOD）是美国的McCord和Fridovich在1969年发现的一种清除超氧阴离子自由基的酶。SOD是一种广泛存在于生物体内的金属酶，按金属辅基的成分不同主要分成三类,第一类含铜和锌，称为CuZn-SOD，是最常见的一种，呈蓝绿色，主要存在于真核细胞的细胞浆内。第二类含锰，称为Mn-SOD，呈粉红色，主要存在于原核细胞体、真核细胞的细胞浆和线粒体内。第三类含铁，称为Fe-SOD，呈黄褐色，主要存在于原核细胞中。另外，在牛肝中还发现一种CoZn-SOD[8]。 正常生理状态下，机体产生的自由基和清除自由基的速率处于动态平衡状态。但当机体内自由基产生增多，就会对机体的蛋白质、脂质和DNA造成损伤，导致机体疾病的发生。SOD是生物体内对抗氧自由基的一种最重要的抗氧化酶，是专门清除超氧阴离子自由基的。它的作用是将氧自由基歧化，发生2O2- +2H+ SOD H2O2 + O2的反应。由于H2O2 在SOD活性部位生成，会对SOD本身产生杀伤。催化产生的H2O2 如果不被及时清除，它会与O2-反应生成毒性更大的羟基自由基。衰老自由基学说认为，代谢产生的自由基对机体造成的损害可引起衰老，SOD可有效的清除自由基，在一定程度上延缓衰老。此外，SOD还具有增强机体免疫力，提高机体对自由基引发的疾病的抵抗力，消除运动性疲劳等生理功能[3]。 过氧化氢酶（CAT）是一种末端氧化酶，广泛存在于动植物和微生物体内，酶分子结构中含有铁卟啉环，1个分子酶蛋白中含有四个铁原子[9]。CAT的生物学功能是催化过氧化氢分解为水和氧，2 H2O2 CAT 2H2O + O2 。过氧化氢酶（CAT），广泛存在于动植物和微生物体内的一种末端氧化酶。它的生物功能是催化细胞内的过氧化氢分解，起抗氧化作用，即2H2O2 2H2O+O2，它可防止过氧化氢含量过高对机体组织造成损伤，对细胞起到保护作用。 本研究结果显示，力竭运动后，大鼠的心组织、肝组织和肺组织中CAT活性均表现出升高，这可能是由于运动应激造成大鼠组织过氧化物质增多，使得组织CAT活性对应升高。同时，结果显示，联合补充谷氨酰胺和番茄红素对力竭运动大鼠肝组织和肺组织的抗氧化能力提高的效果最为明显，而单纯补充番茄红素对心脏
测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn
酶活性测定 1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu) 2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu) 3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase) 试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷） 0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6) 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化
抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase ，APX）活性测定试剂盒使用说明 微量法100T/96S 产品简介： APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化H 2O 2氧化AsA，是植物AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到AsA 的含量，在胁迫和解胁迫条件下，APX 与AsA 具有一定的负相关性。 APX 催化H 2O 2氧化AsA，通过测定AsA 的氧化速率，可计算得APX 活性。 试验中所需的仪器和试剂： 低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 试剂一：液体×2瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加3mL 蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体×1支，4℃保存。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 称取约0.1g 样品，加1mL 试剂一，冰上充分研磨，13000g 4℃离心20min，取上清液。 二、测定操作表： 1.分光光度计预热30min 以上，调节波长到265nm，用蒸馏水调零。 2.试剂一在25℃中预热30min 以上。 3.空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL 蒸馏水、140μL 预热的试
剂一、20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。 4.测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL预热的试剂 一、20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。 APX活力计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：每克样品每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/g鲜重)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Wε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间（min），2min。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.1848×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：每克样品每分钟氧化1μmol AsA为1U。
货号：MS1111 规格：100管/96样谷胱甘肽还原酶（GR）活性测定试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。 测定原理： GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。 自备仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、和蒸馏水 试剂组成和配置： 试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 2mL 蒸馏水，混匀。 试剂三：液体×1 支，4℃保存。 粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）； 然后8000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 操作步骤： 1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一置于25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）中预热30min。 3. 空白管：取微量石英比色皿或96孔板，加入170μL试剂一，20μL试剂二，10μL试剂三， 于340nm 测定10s和190s吸光度，记为A空1和A空2，△A空白管= A空1﹣A空2。 4. 测定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入150μL试剂一，20μL试剂二，20μL上清液， 10μL试剂三，于340nm测定10s和190s吸光度，记为A测1和A测2，△A测定管=A测1﹣A测2。注意：空白管只需要测定一次。 计算公式： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1). 按蛋白浓度计算 第1页，共3页
一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g） 二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。 酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；
植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法 【实验目的】 1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。 2. 熟悉植物叶片中ROS 去除机制。 【实验原理】 超氧化物歧化酶（SOD ）普遍存在于动植物与微生物体内。SOD 是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD ：Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。SOD 能够清除超氧阴离子自由基 （O 2—），它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。 超氧阴离子自由基（O 2—）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H 2O 2和O 2。生成的H 2O 2可被过氧化氢酶分解为O 2和H 2O ： 2 O 2—+ 2H + H 2O 2+O 2 2 H 2O 2 O 2+H 2O 超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD 活性。本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2—。当加入NBT 后，在光照条件下O 2—又可将NBT 还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大光吸收。 当加入SOD 时，SOD 可通过清除O 2—，而抑制NBT 的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。抑制NBT 光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U ）。 【器材与试剂】 1. 实验仪器与用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、微量移液枪、刻度移液管、离心管、光照箱（光照度为4000lx ）、容量瓶（10ml ）、试管 2. 实验试剂 50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 130mmol/L 甲硫氨酸（MET ）溶液； 750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液； 100μmol/L EDTA- Na 2溶液； CAT SOD
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。 酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。 为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。 紫外-可见分光光度法测定酶活： 1. β一半乳糖苷酶 β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。 【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。 【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。 2. 超氧化物歧化酶 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。 【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。同时测定Sigma公司的SOD标准品，对所测样品SOD 活性进行校正。 【酶活定义】在lml反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个酶活单位，即325nm 0.035OD/min为一个酶活单位。 3. 多酚氧化酶 多酚氧化酶(PPO)是一类由核基因编码在细胞质中合成的含铜质体的金属酶，其作用机理在于铜的氧化-还原作用。大麦中的多酚物质经过PPO的催化氧化后，具有单宁性质，易和蛋白质起交联作用而沉淀出来，进而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。大
一?超氧化物歧化酶(SOD): 超氧化物歧化酶，是一种新型酶制剂，是生物体重要的抗氧化酶, 广泛分布于各种生物体，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体清除自由基的首要物质。SOD在生物体的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损塞，并及时修复受损细胞。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD 的地位越来越重要！ 超氧化物歧化酶(SOD)按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜(Cu)锌(Zn)金属辅基的称(Cu.Zn—SOD),最为常见的一种酶，呈绿色， 主要存在于机体细胞浆中；第二种是含猛(Mn) 金属辅基的称(Mn—SOD),呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞；第三种是含铁(Fe)金属辅基的称(Fe-SOD),呈黄褐色, 存在于原核细胞中。 SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶。超氧化物岐化酶(SOD)能催化如下的反应：O2-+H+fH26+6,。2淋为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种,具有极强的氧化能力，是生物氧毒塞的重要因素之一°SOD 是机体天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有蚩的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有蚩的活性氧，但体的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会 立即将其分解???专 为完全无蚩的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。 目前，人们认为自由基（也称游离基）与绝大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓的自由基就是当机体进行代时，能夺去氧的一个电子，这样这
植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定 一、原理 植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。 丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。 二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在 450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为： Y532＝-0．00198十0．088D450 (44—1) D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。三、材料、仪器设备及试剂1、[仪器设备]紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：10ml1支，2ml1支；剪刀1把。