５９８食品与生物技术学报第２９卷 的产物，经ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ双酶切得到长约２．２ｋｂ 的插入片断和长约９．３ｋｂ的载体片断，表明融合基 因已经成功插入到载体ｐＰＩＣｇｋ中。质粒测序结果 显示，全部序列没有发生突变，与预期一致。 １．ＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＩＬ２ｍｌ２．ＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐＢｌｕｅ／ ＨＳＡ，３．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＢＨＩｍｗｉｔｈＥｅｏＲＩ＃４．Ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓ— ｔｉｏｎｏｆｐＢＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏＲｌ／Ｎｏｔｌ；Ｍ．ＸＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ 圈１重组质粒ｐＢＨｌｍ的酶切分析 Ｆｉｇ．１Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ ｐＢＨｌｍ ３．３阳性转化子的筛选及诱导产物的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定 质粒ｐＰＨＩｍ经ＳａｌＩ酶切，回收线性化片断，电 击转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌｌ５感受态细胞。涂布ＭＤ 平板，３０℃培养４ｄ后共长出了约４００个转化子，挑 选其中２００个菌落进行初筛，选其中表达量较高的 １０株重组菌进行复筛验证，得到一株产量最高的重 组菌Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌｌ５／ｐＰＨＩｍ，诱导３ｄ后上清液 的ＳＤ§ＰＡＧＥ分析和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果如图３ 所示。 ３’ＡＩＬ２ｍ １．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＩＣ９ＫｗｉｔｈＥｃｏＲｌ；２．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＨＩｍｗｉｔｈ ＥｃｏＲＩ；３．ＤｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏ—Ｒｌ／ＮｏｔＩ；Ｍ．）．ＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ 图２重组质粒ｐＰＨＩｍ的物理图谱（Ａ）和酶切分析 （Ｂ） Ｆｉｇ．２ＰｈｙｓｉｃａｌｍａｐＩＡ）ａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂ）ｏｆ ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＰＨｌｍ 研究发现，表达的蛋白质的相对分子质量约为８２０００，与理论计算ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的相对分子质量相 符，且这一位置的蛋白与１１．－２、ＨＳＡ的抗体都能发 生免疫反应，进一步证实酵母经诱导表达ＨＳＡ— ＩＬ２ｍ。但７００００和４５０００这两处的降解条带又都 可以与ＨＳＡ的抗体发生免疫反应，认为是融合蛋 白降解所产生的条带。经白蛋白测定试剂盒测得 其中白蛋白融合蛋白的量约为６０．２ｍｇ／Ｌ（以 ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ计）。 ３．４诱导产物的活性测定 发酵液经脱盐处理后，冻干保存。取０．１ｍｇ冻干粉用２ｍＬＰＢＳ复溶后，离心取上清，测得其中 融合蛋白的量约为３００／－ｇ／ｍＬ。采用ＩＬ－２依赖细 胞株ＣＴＬＬ一２以标准品ＩＬ－２为对照，对上清液中的 融合蛋白的生物学活性进行了测定。标准品的活 性为２×１０５ＩＵ／ｍＬ，用ＲＰＭｌｌ６４０稀释到浓度为 ２００ＩＵ／ｍＬ。测定结果表明，上清液中的融合蛋白 可以有效的刺激ＣＴＬＬ－２细胞增殖。以标准品的 最高浓度ＯＤ啪值为１００ｏ／６，计算标准品、样品梯度 百分率。将百分率换算为概率单位，以概率单位为 纵坐标，以稀释度Ｘ的对数为横坐标，绘制直线回 归图（图４），通过计算得出融合蛋白粗蛋白的比活 性为１．５１×１０６ ＩＵ／ｍｇ。
人血白蛋白说明书 〔药品名称〕 通用名：人血白蛋白 英文名：Human Albumin 汉语拼音：RenXueBaiDanBai 本品组成成分： 活性成分：人血白蛋白 非活性成分： 辛酸钠16毫摩尔 乙酰色氨酸钠16毫摩尔 电解质浓度钠离子100—130毫摩尔 注射用水适量 〔性状〕浅黄色澄明溶液 〔药理毒理〕 人血白蛋白制剂是人体血清的正常组分，与生理状态的白蛋白作用相似。 人血白蛋白占人体血浆中蛋白含量的一半以上，并代表着肝脏中约10%合成蛋白活动。 理化数据：20%人蛋白血白有高膨胀压作用。其最重要的生理学功能是维持血液的渗透压和运载功能。白蛋白可稳定血容量，同时它是激素、酶、药品和毒素的载体。 〔药代动力学〕 在正常状态下，每公斤体重有4—5克白蛋白；其中40%至45%存在动脉血管内，55%至60%在外周血管内。在特定状态下可能会发生异常分布。例如，在严重烧伤之后的第一个24小时内和败血症性休克。 正常状态下，人血白蛋白的半衰期平均为19天，合成及分解之间的平衡通常是通过反馈机制来调节。在健康状态下，注射后的两个小时内，动脉血管内输注的白蛋白减少小于10%。血容量可见明显的个体差异。某些病人的血容量在数小时内可能较高。而在重症病人中大量的白蛋白以超出预计的速度从血管中释放出来。 〔适应症〕 当血容量不足，需要补充胶体时，输注白蛋白恢复并保持血容量。 〔用法用量〕 1、用量：在一般情况下，使用剂量及输液率根据患者个体情况而定。当人血白蛋白20%低盐溶液用于替代疗法时，使用剂量应参照正常血液循环参数，胶体渗透压的最低值为20毫米汞柱（2.7千帕斯卡）。 如人血白蛋白20%低盐溶液用于纠正血浆中的白蛋白水平，所需克量换算公式如下： 〔所需蛋白质总量（克/升）－实际蛋白（克/升）〕血浆量（升）×2 人体的正常生理血浆值为40毫升/公斤体重。 由于以上公式换算皆为估算值，建议进行实验室内蛋白质浓度的监测。 2、用法：本品为静脉用药。输注的速度应按个体情况和适应症作出调整。一般20%溶液应调节在每分钟1至5ml的速度。 当置血浆时，输注速度每分钟不应超过30ml，大量输注时，使用前应将本品加热至掌温或体温时方可使用。 通常本品是清澈或稍带乳白光的溶液。如溶液混浊或有沉淀时应勿作用。 本品一经开启应立即使用，任何未用完的溶液，即使冷藏亦应丢弃。 〔不良反应〕
人血白蛋白的合理临床应用 中国医学论坛报自1940 年开始应用白蛋白制剂以来,有关白蛋白应用的争论一直没有停止过。现在,世界各国已逐渐规范了白蛋白的使用指征。但我国在白蛋白应用上仍存在许多“误区”,临床滥用现象相当普遍。今年,我国更出现了严重的白蛋白短缺。因此,规范白蛋白的使用在我国有其紧迫性和重要性,值得大家思考和讨论。 临床误区:白蛋白作为营养制剂 误区一:纠正低白蛋白血症： 营养不良在手术和创伤病人中非常普遍,此类病人往往伴有不同程度的低蛋白血症。目前,临床上应用白蛋白的误区之一是将白蛋白作为营养补品用于手术后病人、营养不良患者、恶性肿瘤病人或危重病人中。 事实上,外科病人术后处于高代谢状态,表现为蛋白分解代谢加速,合成代谢下降,造成持续的负氮平衡。另一方面,外科手术创伤早期,机体存在全身性炎性反应,大量的炎性介质和细胞因子直接损伤毛细血管内皮细胞,毛细血管内皮细胞间隙增大,通透性增加,产生全身毛细血管渗漏综合征(SCLS),部分白蛋白渗漏到组织间隙中,导致术后早期的低蛋白血症。因此,外科手术病人术后早期的低蛋白血症并非全是营养不良或蛋白质分解的结果。 此时输注外源性白蛋白若不能改善患者本身的营养状况,其原因可能为:①外源性蛋白质进入人体后,首先水解为氨基酸,然后再被机体组织细胞所利用,合成所需的各种蛋白质。由于各种组织细胞内蛋白质有其特殊性,是由组织细胞自身来合成的,因此外源无法提供。白蛋白的分解产物内缺乏合成其他蛋白质的色氨酸,故营养价值低。②从代谢的角度看,以白蛋白作为营养补充并不恰当,白蛋白的半衰期约为21 天,人体仅能利用降解生成的氨基酸,而当日输入的白蛋白并不能发挥营养作用。③输注外源性白蛋白并不能从根本上改善由于氮供应不足所致的各个组织器官蛋白质合成不足的问题。 血浆白蛋白水平降低只是一个现象,从营养角度看,它的根本原因是由于热卡和氮的摄入不足所致。因此,要改善外科病人术后高分解代谢、负氮平衡和低蛋白血症,应该从根本上解决营养不良的问题,应该提供合适的能量和营养底物。营养底物中,氮的供给应选择平衡型的氨基酸制剂,而非白蛋白。 误区二:促进伤口愈合： 传统观点认为,即使对手术后病人进行肠外营养支持时,静脉输注白蛋白可提高或维持血浆胶体渗透压,减少术后组织水肿,促进伤口特别是吻合口的愈合。受上述观点影响,目前临床上许多外科医生仍喜欢应用白蛋白,这是造成术后白蛋白制剂应用普遍的另一原因。事实上,偱证医学研究表明,尽管输注白蛋白可提高血清白蛋白的水平,但并没有改善病人原发病的治疗效果,也不能减少并发症的发生率或改善临床预后。由于目前医用白蛋白的来源为献血者的血浆经血浆分离和灭菌处理后配置而成,当前我国血源紧张,所以白蛋白价格昂贵,术后输注白蛋白不仅加重了患者的经济负担,也增加了社会的负担。因此,常规应用白蛋白来改善病人的低白蛋白血症是不值得推荐的。 误区三:提高机体免疫力： 临床上应用白蛋白的另一误区是将白蛋白作为“强身剂”,用于提高机体免疫抵抗力,这就更错误了。因为白蛋白不但不能提高机体免疫力,而且其中的某些成分(如制剂中的微量α-1酸性糖蛋白)反而可使 机体免疫力下降。此外,给白蛋白含量正常患者输注外源性白蛋白还可抑制机体自身白蛋白的合成,加速白蛋白的分解,并可使循环负荷过重、血钠增高等副作用。 循证医学:白蛋白不适用于体液治疗 液体治疗是外科基本问题,特别是在手术后早期或外科危重病人,其目的是维持血流动力学稳定,维 持充足的体循环和微循环,保证良好的组织灌注和氧供,维持水、电解质和酸碱平衡。目前,临床上许多医生将白蛋白用作一线容量扩充剂用于体液治疗。但是,在一些病理情况下(如严重创伤、手术、感染或ARDS
血清前白蛋白测定标准操作规程 1 检验申请 单独检验项目申请：血清前白蛋白（缩写PAB)测定，组合项目申请：血生化中肝功能项目测定。临床医生根据需要提出检验申请。 2 标本采集与处理 2.1标本采集 2.1.1常规静脉采血约2 ml，不抗凝，置普通试管中。或采用含分离胶的真空采血管。检查体液乳酸脱氢酶的体液标本应用肝素抗凝。 2.1.2检验申请单和血标本试管标上统一且唯一的标识符。 2.1.3急诊标本采集后，在检验申请单上填写标本采集时间。 2.1.4标本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。专人负责标本的接收并记录标本的状态，对不合格标本予以拒收。 2.1.5下列标本为不合格标本 2.1.5.1标本量不足：少于0.3ml的全血标本，或少于0.1ml的血清或血浆。 2.1.5.2对反应吸光度有干扰的标本，包括严重溶血、严重浑浊的标本。 2.1.5.3无法确认标本与申请单对应关系的。 2.1.5.4其他如标识涂改、标本试管破裂等。 2.2标本保存 2.2.1接收标本后在30min内将标本离心分离出血清。 2.2.2标本保存时间：室温（15～25℃）下可稳定8h，普通冰箱中（2～8℃）稳定24h。-20℃保存稳定30天。为避免标本中水分挥发使血清浓缩，对保存时间超过1天的标本均加塞密闭或覆盖湿巾。2.2.3已完成测试的标本保持完整的识别号，置4～8℃冰箱内保存7天。
2.3标本采集的注意事项 2.3.1采血前使受检者保持平静、松弛、避免剧烈活动，24h不饮酒和12h以上禁食空腹状态。 2.3.2注意有无应用影响测试项目的药物。 2.3.3可以使用肝素抗凝的血液标本。 3 方法原理 人血清PA与其相应抗体在液相中相遇，立即形成抗原-抗体复合物，并形成一定浊度。该浊度的高低在一定量抗体存在时与抗原的含量成正比。通过与同样处理的校准比较，计算未知样品的PA含量 4 试剂及其他用品 4.1试剂：前白蛋白试剂盒，由北京利德曼生化技术有限公司出品。 4.2试剂盒保存：未开瓶的试剂储存在2～8℃可稳定至有效期。试剂开瓶后，在仪器冰箱试剂仓中可保存28天。开盖后避免污染。当试剂变混浊，或者未开盖的液体有沉淀，或起始吸光率>0.8时，表明试剂已变质，不能继续使用。 4.3试剂盒准备：液态双试剂型，即开即用，无特殊准备。 4.4试剂盒主要成分：
浅析我院人血白蛋白的临床应用 发表时间：2012-03-19T09:13:23.843Z 来源：《中外健康文摘》2012年第1期供稿作者：杨显丽[导读] 在美国的《白蛋白临床应用指南》中指出不合理的临床应用为：补充营养、肾病综合症、慢性肝硬化。 杨显丽（云南省大理州永平县医院云南大理 672600）【中图分类号】R927 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）1-0127-02 【摘要】目的分析人血白蛋白的临床应用情况，以促进其正确合理应用。方法从我院2010年6—9月应用人血白蛋白的住院患者病例中，每月随机抽15例，对共计90例患者的年龄、住院科室、所患疾病、人血白蛋白的适应症、不良反应、禁忌等内容统计分析。结果 90例患者中，以内科、外科分布较多，老年人偏多，联合用药品种多为抗菌药、扩容药、利尿药等，主要用于脑水肿及脑损伤引起的颅内压升高36例，低蛋白血症31例，肝硬化及肾病引起的水肿或腹水8例，营养支持12例等。结论我院人血白蛋白在使用过程中还是存在一些不合理现象，只有准确掌握人血白蛋白的相关资料，本着安全、有效、经济、合理用药原则，才能获得最佳的疗效[1]。【关键词】人血白蛋白临床应用人血白蛋白是从健康的新鲜血浆或保存期不超过2年的冰冻血浆中提取的，可直接静脉注射到病人体内，主要用于失血创伤、烧伤引起的休克、脑水肿及脑损伤引起的颅内压升高，肝硬化及肾病引起的水肿或腹水、低蛋白血症、癌症术后恢复等方面的治疗，是临床急救的一种特殊药品。本文通过对我院2010年6月—9月临床应用人血白蛋白情况进行调查、分析，旨在促进其临床合理用药。 1 资料与方法 从我院2010年6月—9月住院病人应用人血白蛋白中每月随机抽取15例，共计90例。对90例患者的性别、年龄、所患疾病、人血白蛋白的应用指征、用法、用量联合用药、不良反应等内容进行统计与分析。 2 结果 2.1 患者的基本情况 90例患者中，男性52例，女性38例；最大的87岁，最小的6岁，平均住院天数为30d，最长的101d，最短的为1d；治愈41例，好转34例，未愈的7例，死亡的8例。 2.2 用法用量 90例患者中，人血白蛋白的使用方法均为静脉滴注，每日最小用量为10g，1次d-1，最大用量为30g，分2次滴注。用药时间在1—20d 内，平均用药时间为3.6d，其中用药1d的有20例，2d的有20例，3d的有17例，4—10d的有25例，＞7d的有8例。 2.3 临床应用指征 90例患者人血白蛋白的临床使用指征情况见下表：临床指征例数百分比% 脑水肿及脑损伤引起的水肿或腹水 36 40 低蛋白血症 31 34 营养支持 12 13 胸腹水或肝腹水 8 9 其它 3 3 2.4 联合用药情况 在90例应用人血白蛋白的患者中未见药品不良反应发生。在人血白蛋白使用过程中，联合用药最多达17种，最少1种，联合用药品种类多为抗菌药，扩容药、利尿药、营养药、调节血糖和电解质平衡药。 3 分析与讨论 3.1 人血白蛋白用量分布 从应用人血白蛋白的科室分布来看，我院人血白蛋白的使用以神经外科、大内科最多，共67例，占总例数的70.4%，因我院是小型综合医院，以神经外科、大内科为主，技术力量雄厚，患者来源广，而且病症从颅脑损伤、颅内疾病为多，手术时间长、病情严重，故用量较大。 3.2 疗程因病情而定 近年来，多项临床和基础研究都证实人血白蛋白用于脑水肿及脑损伤引起的颅压升高方面优于甘露醇等其它脱水剂，其优势在于半衰期长，约为15—19d，能够维持较长时间的脱水作用，且作用温和，不易渗漏到脑循环外或因突然停药出现反跳。但由于脑水肿可在脑损伤后1—14d内呈渐进发展，故尽早和持续应用人血白蛋白至关重要，但单次大剂量人血白蛋白治疗脑损伤疗效欠佳。 3.3 老年患者用药 在90例应用人血白蛋白的患者中，平均为57a，以老年患者偏多，这与我国老年人口日益增多和老年人随年龄增长，机体抵抗疾病的能力减弱有关，此外老年人高血压、心脏代偿减弱、脑血管发病率离并发症多，因此联合用药亦增多，故不良反应发生率也较高，所以老年人患者用药值得注意。 3.4 单纯营养支持应用不合理 在美国的《白蛋白临床应用指南》中指出不合理的临床应用为：补充营养、肾病综合症、慢性肝硬化。我院90例应用人血白蛋白的患者中，用于单纯营养支持的有12例，人血白蛋白的分解产物内缺乏合成其它蛋白质的重要氨基酸之一的色氨酸，而且人血白蛋白的半衰期长，人体仅能利用降解而成的氨基酸，当日输注的白蛋白并不能发挥作用；目前，已有多种氨基酸制剂和肠外营养疗法可供选用，另外，人血白蛋白不但不能提高机体免疫力，而且其中的某些成分可使机体免疫力下降，输注人血白蛋白还可抑制机体自身白蛋白的合成，加速其分解，并可引起循环负荷过重，血钠增高等不良反应，所以把人血白蛋白作为营养补品，用于癌症或把人血白蛋白作为强身剂，用于提高免疫力的用法是错误的。 3.5 合理应用人血白蛋白
关于重组人血白蛋白的系统性表述 人血白蛋白（HSA）作为一种重要的临床急救药物及重要的药物辅料，在医药，科研及化妆品生产等领域应用广泛。随着国内医疗水平及居民收入水平的提升和对血液制品认知度的提高，血液制品的临床使用量不断增加，市场容量不断增长，行业快速发展。根据国家医药管理局的报告，2010年全国16城市医院血液系统用药金额约62亿元，其中白蛋白类药物占据了血液制品的主要份额（大于50%）。但作为一种血液制品，HSA同时也面临原料短缺及病毒污染等缺陷的影响。 用基因工程重组人血清白蛋白（rHSA）替代HSA是国际上公认的最有前途的高新技术途径。 一．什么是重组人血白蛋白 1.定义 通过基因重组的技术将目的蛋白的基因克隆后，将该基因插入到某种生物（如细菌、酵母、植物，哺乳动物细胞等）中进行复制，然后收集的白蛋白称为重组人血白蛋白。 2.rHSA的等级分类 按不同的质量标准分为了培养基级、药用辅料级和药用注射级（药用级）三类，三类级别的重组人血白蛋白生产工艺相同，但最终控制参数不同，药用级白蛋白质量标准最高。 3.rHSA的表达系统分类 白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是一组复杂的大分子蛋白质，必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰，才能赋予其特定的结构和功能，表达系统是重组人血白蛋白生产过程中极其重要的环节。 （1）原核表达系统 HSA基因最早就是在原核生物大肠杆菌(E.coli)中表达成功的，Lawn等于1981
年首次报道了rHSA的cDNA序列并首次构建了第一个表达rHSA的表达载体pHSA，然后在E.coli中表达成功，表达量为细胞总蛋白的7%，但E.coli表达系统体外很难正确折叠和组装结构复杂的HAS，缺乏翻译后的修饰和加工，表达的蛋白多形成包涵体，且纯化较难，所以未能得到有生物功能的蛋白，细菌细胞壁脂多糖还会造成热反应。因为HSA在原核生物中表达量不高且分泌效果不够理想，所以研究的重点转向其在真核生物细胞中的表达。 （2）酵母表达系统 酵母作为单细胞真核生物，既具有原核生物的容易培养、生长繁殖快、相对易于进行基因工程操作等优点，还具有原核生物缺少的其他优点，如蛋白质翻译后修饰和加工以获得有生物活性的重组蛋白，表达量和分泌量较大，易于产业化培养，非常适合白蛋白及其他非糖基化血浆蛋白的大规模制备。 研究者们用到的酵母表达系统有毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)等。在酿酒酵母中，Okabayashi等通过构建在染色体LEU2和HIS4位点上整合的质粒获得能连续分泌rHSA的稳定转化株，每升培养基达到85mg rHSA。 毕赤酵母表达量和分泌量高且稳定，自身分泌蛋白量小，作为基因表达系统研究和使用的最多，已基本掌握其生长规律及大规模高密度发酵技术，被认为是最有发展前景的蛋白质生产工具之一。毕赤酵母非常适合人血白蛋白等非糖基化血浆蛋白的大规模制备，成为目前rHSA的主要表达系统。 （3）其他表达系统 作为“生物反应器”的转基因动物自1987年以来就引起学者们广泛的关注。就生产rHSA来说，最理想的表达场所是乳腺，因为乳腺是外分泌器官从而不会影响转基因动物本身的生理，表达的蛋白能经过充分的翻译后修饰加工，组织细胞密度高从而分泌水平高，目标蛋白纯化相对容易。2000年黄淑帧等通过
人血白蛋白是临床常用的一种天然血液制品。按照《中国生物制品规程》标准制造和检定的产品，是 由乙型肝炎疫苗免疫健康人的血浆或血清，经低温乙醇法分离纯化，并经60℃10小时加温灭活病毒后制成，白蛋白含量在96%以上，含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素，供静脉输注。随着我们对危重病人病理生理过程的进一步深入了解，临床中使用白蛋白引起越来越多的争议。白蛋白具有很多生理学功能，在临床中应用的范围很广。在1998年世界范围内白蛋白的用量为300－400吨，很多医院白蛋白的用量占药房营业额的30％强。现在随着药物经济学的发展，对这种昂贵药物不加限制的使用引起了广泛的争议。 1. 蛋白的代谢血浆蛋白是血浆中主要固体物质，约占血浆总量的6－8％。可以分为白蛋白和球蛋白二大类。白蛋白含584个氨基酸，平均分子量69000道尔顿，易溶于水，表面带负电荷。血浆中白蛋白总量约为120g，浓度为40－50g/L。除了分布在血浆中，白蛋白还存在于组织液中，组织液中的白蛋白约为160g，浓度比血浆中的要低，为血浆中白蛋白浓度的一半。正常人体肝脏每天生成9-12g 白蛋白，其生成的速度受血浆胶体渗透压、组织液胶体渗透压的影响。严重的蛋白缺乏症会降低白蛋白的生成。另外一些药物如胰岛素，可的松等会刺激白蛋白的生成，但生长激素对白蛋白的合成没有影响。正常情况下，白蛋白在体内还存在一个循环过程，在血浆中白蛋白通过毛细血管壁间隙进入 组织液中，然后通过淋巴系统重新进入血浆中，白蛋白的循环半衰期为16小时。外源性白蛋白进入人体后，有一个快分布期，从血浆中迅速消失进入组织间隙，分布半衰期约为15小时，之后是一个缓慢的消除过程，消除半衰期约为19天。白蛋白的分解代谢主要发生在血管内皮中，代谢速率为9-12g/天，约为总量的4%。影响白蛋白代谢的主要因素为血浆中白蛋白浓度，人体热量和蛋白的不 足也会加速白蛋白的代谢。感染，外伤，或手术引起炎性级联反应进会释放出许多炎性介质活化白细胞，这一过程引起了血管内表皮细胞的损伤，使毛细血管通透性增加，血管中的成分包括白蛋白渗透到组织中去，这加速了白蛋白的泄漏，炎性介质还会抑制了白蛋白的合成，促进了白蛋白的分解，因此从总体上降低了白蛋白的含量。 2. 白蛋白的生理作用 2.1 扩血容作用 每克白蛋白可结合18ml水，能阻止液体从血管内向血管外扩散。但是白蛋白的扩血容作用并不一定 与理论值相等，还与患者的血容量，蛋白水平，毛细血管的通透性等有关。白蛋白还能聚集到血管水肿孔隙较大的地方，阻止液体的扩散。需要特别指出的是对于毛细血管通透性明显增大的病人，白蛋
四经验交流四肝硬化患者血小板与血清前白蛋白联合检测的分析 戴宏华 ?摘要?一目的一分析肝硬化患者血小板与血清前白蛋白检测的意义三方法一采用日本光电MEX- 7222K全自动五分类血液分析仪检测82例来自我院2010年9月至2012年9月传染科肝硬化患者血小板 4项参数(PLT二MPV二PDW二PCT),用透射免疫比浊法检测血清白蛋白(PA)并与70名正常对照组进行比 较三结果一肝硬化患者的PLT二PCT和PA较正常对照明显降低,差异具有统计意义(P<0.01?;MPV及 PDW明显升高与正常对照差异有统计意义(P<0.01?三并且随着Child-Pugh分级的增加PLT,PCT及PA 降低程度更加明显三结论一血小板4项参数对评估肝硬化的严重程度及出血倾向有重要意义,血清前白 蛋白PA异常变化可反映肝脏损伤程度对肝硬化患者的临床诊断二治疗具有一定的参考价值三 ?关键词?一肝硬化;一血小板;一血清前白蛋白 Clinical significance of the platelet test and the elevated serum PA forpatients with Liver cirrhosis一DAI Hong-hua.一Department of clinical laboratory,Hospital of traditional Chinese medicine,Jurong,Jiangsu,212400, China ?Abstract?一Objective一To analyse the clinical significance of platelet and PA test for patients with liver cirrhosis.Methods一Levels of platelet(PLT),mean platelet volum(MPV),platelet distribution width(PDW), plateletcrit(PCT)for82patients with liver cirrhosis,those whowere selected as the research objectfrom June2010 to June2012in our hospital,were tested by using Japanese photoelectric MEK-7222K automatic five classification blood analyzer.The level of serum prealbumin was detected by transmissionimmunoturbidimetry method.And compared the levels with the control group.Results一The levels of PLT,PCT,PA of patients with liver cirrhosis were significantly reduced and the levels of MPV,PDW of patients with liver cirrhosiswere significantly increased compared with control group(P<0.01).The levels of PLT,PCT,PA of patients with liver cirrhosisdecreased significantly as the Child-pugh degreeraised.Conclusions一The detection of PLT,PCT,PA had great significance for evaluation of cirrhosis severity and bleeding tendency.And levels of PA in serum could reflect the condition of liver damnification,and helpful for clinical diagnosis and treat for patients with liver cirrhosis. ?Key words?一Liver cirrhosis;一Platelet;一PA 一一肝硬化是一种常见的由不同原因引起的以肝组织弥漫性纤维化二假小叶和再生结节形成的慢性肝病三该病后期会出现不同程度的门静脉高压和肝功能障碍,直至出现消化道出血及肝性脑病而导致死亡三我国肝硬化发病率占同期住院患者总数的1%左右,严重影响患者的生命健康三血小板参数为临床肝硬化患者出现不良进展如出血及预后的主要指标[1]三本研究通过Child-Pugh各级与PLT四项参数及血清前白蛋白(PA)关系的研究,探讨在不同程度肝脏功能的肝硬化患者血小板减少及血清前白蛋白下降的情况三对防止可能出现的出血二指导治疗及其预后都具有预后都具有十分重要的意义,同时也可作为肝功能损害程度评估的一项参考指标三现报道如下三 一二资料与方法 1.一般资料:选取我院2010年9月至2012年9月传染科门诊及住院的肝硬化患者82例,男性51例,女性31例三全部患者均符2009年版‘传染病诊断标准汇编“的诊断标准三全部病例排除自身免疫病二血液病二血小板疾患二重要脏器病变二未使用对血小板有影响的药物三将患者分为三组:肝硬化A级组(41例),肝硬化B级组(25例),肝硬化C级组(16例)三另选取同期进行体检者70例作为对照组,无肝病 一一作者单位:212400江苏,句容市中医院检验科及血液系统疾病,均为体检健康者为研究对象,其中男41例,女29例,年龄18~72岁,平均年龄为45岁三 2.方法:PLT参数采用日本光电MEK-7222K全自动五分类血液分析仪及配套试剂,清晨空腹静脉血1~2ml,加入EDTA-K2抗凝管内,混匀按仪器操作要求进行测定,得到PLT二PCT二MPV二PDW相应的结果三血清前白蛋白(PA)采用免疫比浊法仪器为VITALAB selectra E全自动生化分析仪,试剂由上海生物制品研究所提供三所有标本于2h内测试完毕三 3.统计学处理:用SPSS13.0统计软件三计量资料以(?x?s)表示,组间用t检验比较,以P<0.05为差异有统计学意义三二二结果 肝硬化组PLT二PCT两项指标和PA值降低,MPV二PDW 两项指标升高与健康成人组比较差异有统计学意义(P <0.01)三如表1随着Child-Pugh分级的增加PLT及PA下降程度越来越加重(P<0.01)三见表2三 一一讨论一本研究结果显示82例肝硬化患者的血小板功能均存在不同程度的改变,而且随病情的进展和加重及严重出血,血小板的4项指标都会发生明显变化三血小板4项指标的变化表明肝硬化患者血小板不但数量减少,而且功能也存在异常三肝硬化患者变化更为显著,特别是PLT和PCT二者 万方数据
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910276004.5 (22)申请日 2019.04.08 (71)申请人 北京蛋白质组研究中心 地址 102206 北京市海淀区中关村生命科 学园生命园路38号 (72)发明人 钱小红 张养军 余谦 张普民 高方圆 焦丰龙 夏朝双 张汉卿 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (51)Int.Cl. C07K 14/765(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/30(2006.01) (54)发明名称 一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法 (57)摘要 本发明公开了一种重组人血清白蛋白的分 离纯化方法。该方法首先采用热乙醇沉淀法从转 基因猪血浆中对重组人白蛋白进行粗提纯，再利 用两种色谱方法以串联方式进一步精纯化，即先 用阴离子交换色谱法进行第一步精纯化，再采用 反相色谱法或者凝胶色谱法进行二次精纯化。结 果表明，本发明能从转基因猪血浆中分离纯化出 高纯度的重组人血清白蛋白，并有望替代人血清 白蛋白用于临床用药和生化研究中。权利要求书2页 说明书5页 附图3页CN 109810185 A 2019.05.28 C N 109810185 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109810185 A 1.一种对含有重组人血清白蛋白的血浆中的重组人血清白蛋白进行分离纯化方法，包括： 1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原后，将所得血浆上清液用热乙醇沉淀法进行粗提纯，得到rHSA粗提取液； 2)将所述rHSA粗提取液脱盐浓缩后，用阴离子交换色谱柱洗脱，收集洗脱液即为第一步精纯化rHSA溶液； 3)将所述第一步精纯化rHSA溶液脱盐浓缩后，用反相色谱柱或凝胶色谱柱进行二次精纯化，即得到rHSA溶液，完成所述重组人血清白蛋白的分离纯化。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有重组人血清白蛋白的血浆按照如下步骤制得：对含有重组人血清白蛋白的血进行血浆抗凝处理后离心，收集上清液而得； 具体的，所述血浆抗凝处理步骤中，所用抗凝剂为柠檬酸钠水溶液；所述含有重组人血清白蛋白的血与抗凝剂的体积比为15:1～20:1；所述抗凝剂的浓度为70g/L～90g/L； 所述离心步骤中，离心力为1500-2500×g；具体为2000×g；时间为20-40min；具体为30min。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原的方法包括：将所述含有重组人血清白蛋白的血浆冷冻沉淀，解冻后离心，收集上清液，即为所述血浆上清液； 具体的，所述冷冻沉淀步骤中，温度为-30--10℃；具体为-20℃； 所述解冻步骤中，温度为0-10℃；具体为4℃； 所述离心步骤中，离心力为4500-5500×g；具体为5000×g；时间为10-20min；具体为15min。 4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)热乙醇沉淀法包括：将所述血浆上清液与由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液混匀后，调节pH至 5.0～7.0，在55℃～80℃，恒温保持20～60min，冷却至室温后调节pH至4.0～5.0，静置，一次离心，收集上清，淋洗所得沉淀，再进行二次离心，收集上清，合并两次上清，即为所述rHSA粗提取液。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蛋白保护剂为辛酸钠；所述辛酸钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～10g/L； 所述变性剂为有机溶剂；具体为乙醇；所述氯化钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～9g/L；所述由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液的体积用量与所述血浆上清液相同； 所述变性剂的用量为所述血浆上清液体积的8％～12％； 所述静置步骤中，温度为室温；时间为1-3h；具体为2h； 所述淋洗步骤中，所用淋洗液为pH值为4.8的蒸馏水； 所述一次离心和二次离心步骤中，离心力为4500-5000×g；具体为5000×g；时间为50-70min；具体为60min。 6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所用流动相A为0.02mol/L Tris-HCl，流动相B为0.02mol/L Tris-HCl+0.3mol/L NaCl； 所用阴离子交换色谱柱为DEAE弱阴离子交换色谱柱；流速为1mL/min；柱温为室温；检 2
前白蛋白测定试剂盒(免疫比浊法)标准化操作规程 1 目的 规范实验室操作，保证检验工作顺利有效进行特制定此规程。 2 授权操作人经培训且考核通过的实验室检验人员。 3 适用范围本试剂适用于体外定量检测人血清中前白蛋白的浓度。 4 检验方法 本试剂盒采用免疫透射比浊法测定人血清中前白蛋白的浓度。 5 检验原理 样本中前白蛋白与抗体结合产生免疫复合物的浊度，根据浊度的高低与样本中前白蛋白的含量成正比。在340nm处测定吸光度的变化值，即可计算出样本中前白蛋白的含量。 6 标本要求 6.1标本类型: 新鲜血清标本，避免溶血。 6.2标本运输: 室温条件下运输。 6.3标本保存: 若不能及时测定，请尽快置于-20℃保存，避免反复冻融。 7 试剂及配套品 7.1试剂来源 长春迪瑞医疗科技股份有限公司前白蛋白测定试剂盒 7.2试剂组成 7.3试剂的稳定性与贮存 在2℃～8℃条件下，干燥、避光、密封贮存，有效期12个月；启用后在2～8?C可稳定30天，试剂不可冰冻。 8 实验仪器及性能指标 8.1 实验仪器 迪瑞CS系列全自动生化分析仪 8.2试剂性能指标 8.2.1 空白吸光度：A≤0.30。 8.2.2分析灵敏度：测试30 mg/dL被测物时，吸光度变化△A≥0.015。 8.2.3 线性范围：11mg/dL～56mg/dL，线性相关系数r值≥0.9900；[11，19] mg/dL
区间内，线性绝对偏差应不超过±3.36mg/dL；（19，56] mg/dL区间内，相对偏差不超过±15％。 8.2.4 准确度：相对偏差应在±20%范围内。 8.2.5 测量精密度： 重复性：CV≤7.0%。 批间差：R≤8.0%。 8.2.6空白限≤11.00mg/dL。 9 校准 9.1校准品 前白蛋白校准品 9.2校准品存贮及使用注意事项 参见前白蛋白校准品使用说明书。 9.3 校准程序 建议使用试剂盒配套的校准品：进行5点校准测定，测定后仪器自动拟合成校准曲线。当试剂批号更换或质控失控时，需要重新校准。 10 质量控制 10.1质控品 前白蛋白质控品 10.2质控品存贮及使用注意事项 参见前白蛋白质控品使用说明书。 10.3质量控制 建议使用迪瑞公司质控品，进行质量控制。实验室应自行建立质控区间和限值，若质控值失控，应采取纠正措施。 11操作程序 11.1试剂配制 试剂1和试剂2均为液体试剂，可直接使用。 11.2 项目参数： 11.3 样本测试步骤：
转基因水稻大规模生产重组人血清白蛋白 由武汉大学生命科学院教授、武汉禾元生物科技有限公司董事长杨代常领衔的研发团队从2006年开始进行植物源替代血浆来源的医药蛋白的 研究与开发，现已取得突破性进展并已跨入规模化生产的阶段，填补了国际上此项技术空白。相关论文于2011年10月31日在线发表于《美国 科学院院报》。该论文在线之际，受到国外Scientist ，Nature news, The Australian, Thomson Reuters, Fox News, Agence France Presse (AFP法新社)等美国、英国、俄罗斯、德国、巴西、印度各专业杂志及媒体的广泛关注和报道。 该研究表明由转基因水稻种子生产的重组人血清白蛋白(OsrHSA)在生理生化性质、物理结构，生物学功能、免疫原性与血浆来源的人血清白 蛋白一致；并建立了大规模生产重组人血清白蛋白的生产工艺，获得了高纯度和高产量重组人血清白蛋白产品。利用大量数据证明了转基因 水稻种子可取代现有基于发酵的表达技术来生产重组蛋白质是经济有效的。正如PNAS 审稿人对该文章的评价：“这篇文章解决了在科学上振 奋人心、在经济上都非常重要的议题－－即用转基因植物生产血浆产品或其他蛋白产品的技术平台，可代替其他基于发酵的表达技术，其重 要性也不言而喻……这篇文章近乎完美地证实了植物生产的医药蛋白和批准临床使用的血浆来源医药蛋白是完全相同的，并提供了翔实数据 证明植物系统规模化容易和成本优势。” 目前，人血清白蛋白(human serum albumin)广泛应用于临床治疗和细胞培养领域。常见的人血清白蛋白大多数从人的血浆中提取，这样的生 产方式不仅受到血浆供应的限制，而且还具有携带病毒传播的高风险性。国际上以重组人血白蛋白替代血源产品的应用已成为趋势，国内市 场需求也逐年扩大，2010年已达150吨。尽管市场广阔，但高纯度重组人血白蛋白的规模化生产技术和质量控制技术却是世界性难题。武汉禾 元历经多年的技术攻关，利用水稻胚乳表达技术平台，研发出国际先进水平的重组人血白蛋白产品生产技术，并成功实现重组人血白蛋白规 模化和产业化，完全摆脱了相关制约，具有纯度更高、无动物组分、安全、高效、绿色环保、廉价、无限量供应等优势。随着植物源重组人 血清白蛋白的发展，我国人血清白蛋白日益紧张的局面必将得到缓解。
人血白蛋白临床应用研究进展分析 摘要】在休克、脑梗死、烧伤以及腹水等疾病患者的治疗中使用人血白蛋白都 能够起到良好的效果，除了上述具有确切治疗效果的疾病之外，人血白蛋白在肾 病综合征等疾病治疗中的应用价值，必须经过深入的探讨。而探讨的结果则显示，在重型肝炎中应用人血白蛋白仍需慎重，而在肾病综合征等疾病的治疗中，不建 议使用人血白蛋白对患者营养进行补充。 【关键词】人血白蛋白；临床应用；研究进展 【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）27-0344-02 作为一种人工分离提取的制剂，人血白蛋白来源于对乙型肝炎疫苗免疫的健 康人群，将其血浆进行收集，并通过低温乙醇蛋白分离法将其中的有效成份进行 提取，再经过病毒灭活才能够形成人血白蛋白制剂[1]。在上个世纪四十年代中， 人血白蛋白在临床中得到了有效的应用，该物质能够增加循环血容量，同时维持 血浆胶体渗透压，具有转运以及解毒的作用[2]。如果患者存在氮代谢障碍的情况，使用人血白蛋白还能够提供营养成分来维持氮源组织的活动。因此，在临床中， 人血白蛋白具有极大的使用价值。不过在一些领域，应用人血白蛋白仍然具有争 议性，因此需要更深入地研究和探讨。 1.临床应用人血白蛋白 1.1 危重病治疗 危重病患者，可能会出现低蛋白血症的情况，增加患者的病死率以及并发症 发生率，另外其症状持续的时间以及病情严重程度，与疾病预后存在一定的关系。而对于严重烧伤患者来说，其病死率与低蛋白血症与白蛋白和球蛋白的比值倒置 等因素有直接关系。 1.1.1人血白蛋白治疗与死亡率 有学者对人血白蛋白治疗ICU患者的效果进行了研究，通过相应的对照试验 发现，对于危重症患者，如果使用人血白蛋白进行治疗，那么就会增加其死亡风险，增加的程度为6%左右[3]。风险增加患者就一定会病死么？该学者的研究只 不过说明病死的可能性有所提高，并没有对实际的病死率进行研究。而另有研究 结果显示，将人血白蛋白应用于危重症患者的液体复苏中，并不会使其病死率增加。2004年，新西兰及澳大利亚危重病学会对比研究了，分别使用人血白蛋白和 生理盐水对危重症患者进行液体复苏的效果和价值。结果显示两组间差异并无显 著的统计学意义。后两项研究结果证实，在危重症患者的复苏中，应用人血白蛋 白并不会使患者的病死率有所增加[4]。随着医学研究的不断发展，有研究发现， 使用人血白蛋白进行液体复苏，对降低脓毒症患者病死率有一定价值。上述结论 经总结可知，对于危重病患者，使用人血白蛋白对其病死率的影响不大，只在脓 毒症等特定疾病中有应用价值。人血白蛋白并不会增加危重症患者病死率，只是 增加了死亡风险。对于除患有脓毒症的其他危重症患者，使用人血白蛋白治疗不 会影响病死率。 1.1.2人血白蛋白治疗与并发症 有学者的研究结果证实，对于心脏手术、腹水患者以及非心脏手术患者等， 使用人血白蛋白代替人工胶体，能够在一定程度上降低并发症的发生率。另外对 于脑损伤患者，使用人血白蛋白，能够极大地改善其预后效果[5]。 1.2 人血白蛋白应用于脑梗死
人前白蛋白(PA)检测试剂盒(透射比浊法) 简介： 前白蛋白(prealbumin ，PA)相对分子量54000万，由肝细胞合成，电泳时迁移在白蛋白之前，故得此名。测定血清前白蛋白(prealbumin ，PA)大多采用免疫化学技术，常用的方法有免疫单扩散法、散射比浊法、透射比浊法。免疫单扩散法虽然简便易行不需要特殊设备，但费时，精密度和准确性不佳。散射比浊法灵敏度高，但需要特殊蛋白分析仪。 Leagene 人前白蛋白(PA)检测试剂盒(透射比浊法)其检测原理是PA 与抗PA 抗体在液相中反应生成PA 抗原抗体复合物，使反应液呈一定浊度。当一定量抗体存在时，浊度与PA 的含量呈正比，利用透射浊度法与相同处理的PA 标准比较，求得样本中PA 的含量。本试剂盒专门用于人血清、血浆、组织样本中的前白蛋白含量测定，特别适用血清和血浆样本。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 分光光度计或酶标仪 2、 离心管、小试管或96孔板 3、 恒温箱 操作步骤(仅供参考)： 1、 TP 测定操作：分光光度计手工或半自动生化分析仪检测，按下表依次加入试剂： 2、 混匀,孵育。 3、 分光光度计测定吸光度。以空白管调零，读取标准管和各待测管的吸光度。 编号 名称 TC068550T Storage 试剂(A): PA 标准液(400mg/L) 0.2ml -20℃ 试剂(B): PA 抗体工作液 50ml -20℃ 试剂(C): PA 生理盐水 1ml RT 使用说明书 1份 空白管 标准管 待测管 PA 生理盐水(μl) 20 PA 标准液(400mg/L)(μl) 20 待测样本(μl) 20 PA 抗体工作液(ml) 1.0 1.0 1.0