细胞生物学实验报告
细胞原代培养
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一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的方法：
1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。
2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
取材注意事项：
取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
二、实验目的
1、理解细胞原代培养原理
2、熟悉细胞原代培养方法与过程
3、了解细胞原代培养的应用
4、独立进行细胞原代培养操作
三、实验材料
手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。
动物：9-12日龄的鸡胚蛋
四、实验步骤
1、购买9-12日龄鸡胚蛋。放入孵化箱中孵养待用。
2、取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，气室处擦拭两遍，用镊子小心去除气室部分的蛋壳。
3、取D-hanks液按1:100加入双抗。
4、换用洁净的无菌镊子揭开膜，再用洁净的无菌弯头镊子取出鸡胚至灭菌的培养皿中，并用D-hanks液冲洗鸡胚三遍。
5、用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-hanks液充分洗涤躯干部分三遍。
6、将洗涤过的躯干移至干净的培养皿，吸去多余的液体，然后用眼科剪将躯干充分剪碎（约四分之一米粒大小）。
7、向碎块中加入一滴管胎牛血清将组织碎块切散，用滴管将组织碎块接入培养瓶中，静置一分钟，再加入5ml完全培养液，将瓶子翻转倒置后在37度培养箱中放置2-3小时，待组织块微干与瓶壁贴牢后再将瓶子翻转过来，于培养箱中培养。
8、将用过的试剂仪器等摆回原处，将超净台打扫干净，关闭照明灯及抽风机。
9、实验后数小时后去观察组织块中细胞迁移情况，并拍摄照片。
五、实验结果
原代培养过夜后第二天中午一点拍照，观察细胞迁移情况，以下是我们小组的实验结果。
鸡胚成纤维细胞原代培养（倒置显微镜20×）
鸡胚成纤维细胞原代培养（倒置显微镜20×）
显微镜下可观察到鸡胚组织块附近有大量细胞迁移。迁移出来的细胞呈纤维状，贴壁生长。实验结果比较理想，细胞迁移较多，大部分细胞活性较好，呈梭形附着与瓶壁上，且没有污染发生。
操作时应注意的问题：原代培养要注意无菌操作，实验过程中要保持组织块浸润在缓冲液中，接种组织块到培养瓶中后应待组织略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养液接触，翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。如果组织块没有粘壁，则细胞不易生长，既使生长也因没有贴在瓶壁上，而无法收集到。
六、思考题
1、从细胞增殖及调控角度来看哪种组织和器官适用于原代培养实验
取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
2、如何提高原代细胞培养的成功率
取材要注意新鲜和保鲜，取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
操作过程要时刻注意无菌操作，不能污染，仪器尽量靠无菌操作台内放。在处理胚胎的时候要干净利落。在剪碎细胞的时候，尽量剪得碎一点。翻转培养瓶应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。翻转时要轻，勿使组织块漂浮起来。
3、鸡胚成纤维细胞的应用
鸡胚成纤维细胞具有相对容易获得、增殖能力强、适应性强、良好的耐受性，性状比较稳定等特点，使得其广泛的被应用于分子和细胞生物学研究的许多方面。鸡胚成纤维细胞良好的耐受性使之易于进行从基因转染到微注射等较多领域的研究,还被广泛应用于病毒学领域的相关研究,同时也是疫苗生产的一种重要的细胞资源。现在它被用来生产各种鸡的疫苗,如传染性法氏囊病、马立克病、新城疫疫苗等,也被用来表达一些基因工程产物。鸡胚成纤维细胞的原代培养在分子生物学、细胞学、遗传学、免疫学、肿瘤学及细胞工程学等领域,已发展成为一门重要的生物技术,并取得显著成就。
【参考文献】
[1] 桑建利, 谭信. 细胞生物学实验指导. 北京:科学出版社, 2010.
[2] 北京师范大学生命科学学院.细胞生物学实验.北京:北京师范大学生命科学学院,.
细胞生长曲线的绘制实验报告 篇一：实验五微生物生长量的测定及生长曲线的绘制 一、实验目的 学习了解微生物生长量测定的方法 学习了解细菌生长曲线的绘制方法 学习掌握血细胞计数板的使用方法 微生物生长量的测定 计数法重量法生理指标法 1、显微镜直接计数法 利用血细胞计数板计数 涂片计数 2、活菌菌落计数法 3、滤膜法 细菌生长曲线 将单细胞细菌接种到恒定容积的液体培养基中，不补充营养物或移去培养物，细菌以二分裂方式繁殖，以时间为横坐标，细菌数目的对数值为纵坐标，可画出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线，称为生长曲线 篇二：细胞生长曲线的测定 细胞生长曲线的测定 一、实验目的
掌握测定细胞生长曲线的方法。 二、实验器具 24孔细胞培养板、微量加样器、eppendorf管、吸头、吸头盒、显微镜、细胞计数板、载玻片、盖玻片、吸管、试管架、普通显微镜、细胞悬液、0.4%台盼蓝。 三、实验方法 1. 培养细胞：首先在24孔细胞培养板内分别接种相同数量的细胞，计数并记录接种的细胞悬液密度，接种时间记为0小时。 2. 计数细胞密度：从接种时间算起，每隔24小时计数3孔的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2-3次，如此操作至第七天结束。 3. 绘制曲线：以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。 篇三：MTT法绘制生长曲线 实验材料： 1，5%FBS-L-DMEM, 5x104个/ml细胞悬液，5mg/mlMTT溶液，DMSO,0.01M PBS,2, 96孔板共7个,酶标仪,50ml离心管，1.5ml离心管，0.22μm滤膜，锡箔纸，MTT工作液 实验步骤： 1，分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5x104/ml。接种到96孔板，每孔接种200μl 细胞悬液进行培养。
原代细胞的培养与建系 凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。 原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。 一、取材的基本要求 .1．取材要注意新鲜和保鲜 .2．应严格无菌 .3．防止机械损伤 .4．去除无用组织和避免干燥 .5．应注意组织类型、分化程度、年龄等 .6．作好记录 二、各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材 血液细胞的取材 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 动物组织取材 人胚体组织取材 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘
米。 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 动物组织取材 1、鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚肾（或肺）取材 幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合 【实验题目】 动物细胞融合 【实验目的】 1.了解动物细胞融合的常用方法。 2.学习化学融合的基本操作过程。 3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为与变化。 【实验材料与用品】 1、材料 鸡血红细胞 2、试剂 50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。 3、器材 倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸、滴管等。 【实验原理】 细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括：病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。 1、病毒诱导融合 仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。 2、化学诱导融合 很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG 是广泛使用的化学融合剂。 3、电激诱导融合
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合 包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。 【实验步骤】 在本次实验中采用的是化学诱导融合的方法，利用PEG使鸡血红细胞发生融合。具体实验步骤如下： 1、取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4℃保存）【老师已做好，可直接使用】 2、取（1）中悬液1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理： ①在1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； ②1000-1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； ③1000-1200r/min下离心7min 【因时间关系此次实验只离心一次】 3、将离心后的沉降血球（去上清后约0.1-0.2ml）加入GKN至1-2ml，使之成为10%的细胞悬液； 4、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000个； 5、分别取（4）1ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+1.0ml50%PEG，混匀滴片，编号分别为①②③号溶液。在常温下2-3min后，显微镜下观察。 【实验结果】 1、实验中可观察到两个和多个细胞发生质膜融合现象,可看到不同融合状态的细胞： ①两细胞的细胞膜相互接触、粘连； ②接触部分的细胞膜崩解，两细胞的细胞质相同，形成一个细胞质的通道，呈现哑铃状； ③通道扩大，两个细胞连成一体，呈现一个长椭圆形细胞； ④细胞融合完成形成含有双核或者多核的细胞，呈圆形。 比较典型的细胞融合时的形态如下图：
1 原理巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。 2试验材料 昆明种小鼠10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供 公鸡1只 PRMI1640培养基 新生小牛血清 HEPES D-Hanks液 青霉素 链霉素 3试验仪器 无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳5m注射器注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。 二氧化碳培养箱 生物显微镜 高速冷冻离心机 低温冰箱 4实验步骤 4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法: 将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。 鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的1%肝素抗凝剂的三角烧瓶中,混匀,4℃冰箱内保存。使用前,以无菌生理盐水离心洗涤3次,前一次离心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。 培养液的无菌处理： (1)将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水，与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、钢筛、胶管安装好，并高压灭菌。 (2)在净化室内，打开己消毒的zeiss抽滤器，将配制好的RPMI1640培养液进行过滤，开将过滤后的RPMI1640培养液分装，置入4℃冰箱中备用。
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
一.细胞培养的基本原理 细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块(0.5～1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)，而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。在组织培养中，细胞自组织块周围移出并生长，细胞在生长过程中总有移动(运动)或其它变动，这样就使被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长，发生变化的可能性越大，结果常使单一类型的细胞保存下来，最终成了细胞培养。在细胞培养中，细胞生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存的，呈现一定的组织特异性，所以组织培养和细胞培养实际上无严格区别。 细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，该方法能排除神经体液因素的影响及肝、肾解毒功能的干扰，观察某些因素或药物对培养细胞的直接作用。通过实验可获得某一类型细胞的纯培养。如心肌组织中心肌细胞约占50%，非心肌细胞占50%;而经纯化分离的心肌细胞悬液中，心肌细胞可达95%以上，这样，心肌细胞原代培养实验基本不受其它细胞的干扰。在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程;用定时显微摄影记录可发现一些肉眼观察不到的生命现象;还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法等来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。此外，还能节约研究费用。如在某些研究中，用100只动物做实验所获得结论与用100张盖玻片或几十个培养瓶而获得结论具有相同的统计学意义，而细胞培养较之大批量的动物饲养花费要小。 但细胞培养方法也存在不足之处：培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响，如胰蛋白酶可破坏细胞表面受体、酶、抗原等。长期体外培养的细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。 二.细胞培养的基本设备与用品 (1)细胞培养的基本设备 细胞培养的基本设备有：CO2培养箱，倒置显微镜，净化台，压力蒸汽消毒器，自动双重纯水蒸馏器，液氮罐，冰箱，电热干燥箱，电热恒温培养箱，电动吸引器，抽气泵等。 (2)常用的实验用品 1.玻璃器皿 细胞培养所用的玻璃器皿应由透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。常用的有以下几种：国产螺旋口培养瓶[有12.5毫升，25毫升，100毫升等规格，国外培养瓶常以底面积(平方厘米)表示];培养皿(直径有3.5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等规格);离心管(5毫升，10毫升);注射器(1毫升，5毫升等);用生理盐水瓶代替的贮存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升);青霉素瓶(5毫升);西力辛瓶(10毫升);其它还有尖吸管和移液管，载玻片(厚度0.8～1.2毫米)，盖玻片(厚度0.12毫米)，贮存尖吸筒用的玻璃筒或金属筒，漏斗，烧杯，量筒，贮蒸馏水瓶，冷冻管(1.5毫升，2毫升)等。
山东大学细胞生物学实验报告 聚乙二醇（PEG ）法诱导的动物细胞融合实验 2012/9/11 实验目的： 了解细胞融合技术的发展过程和主要方法的基本原理，用聚乙二醇(PEG)化学诱导法进行鸡血红细胞的融合实验，掌握实验的基本操作，观察鸡血红细胞融合的不同时期。 实验原理： 1. 细胞融合的概念 两个或两个以上的细胞或原生质体在自然或人为诱导的情况下细胞质膜相互融合，细胞质相互混合成为一个整体杂合细胞的现象被称为细胞融合。细胞融合可以发生在同种细胞之间也可以在不同物种间实现。 2. 细胞人工融合的主要方法及基本原理 细胞体外融合的主要方法分为病毒诱导，化学诱导和物 理诱导。1953年，M. Kuroya 在临床中第一次分离到仙台 病毒（HVJ ）[1]。1958年，日本学者Okada 发现仙台病毒 （HVJ ）能诱导动物细胞融合[2]，其基本原理是仙台病毒 的衣壳上有细胞表面受体的结合位点，可以诱导不同细 胞凝集，最终使不同细胞的细胞膜相互融合。 1974年，加拿大学者高国楠发明了细胞的聚乙二醇 （Polyethyleneglycol ，PEG ）化学融合法，由于该方法对 实验条件要求极低，试剂易得，操作简单，成为应用最广泛 的细胞融合方法。化学诱导细胞融合的基本原理是PEG 等化 学物质能够诱导细胞膜磷脂分子的极性基团发生结构重 排，相互接触的细胞在细胞膜恢复过程中借助磷脂分子的亲和作用和表面张力实现融合。比之于仙台病毒诱导法，PEG 诱导法的效率提高了几百倍。 80年代，科学家发明了细胞电融合法[4, 5] ，电融合法将细胞融合的产率提高到了50%-80%。电融合法的建立是基于细胞膜表面带电荷的性质。当在细胞悬液周围加入特定方向的电场时，细胞表面会发生极化现象，相邻的细胞将吸附在一起。这时突然提高电场强度，细胞间彼此接触的细胞膜会被击穿，细胞膜修复时受到磷脂分子间的亲和作用和细胞膜表面张力的作用将会发生融合。 图2. 以电融合方法得到的3T3-C2融合细胞 （引自J. Teissie 等，1982 )。 图1. 仙台病毒示意图。a 和b 是病毒套膜，c 为糖蛋白，d 为类染色体。
细胞培养实验指导陈轶霞刘俊林
实验报告书写要求： 1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。 2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。 3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况） 实验一细胞培养实验室介绍及使用卫生要求 【目的与要求】 1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局 2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求 【基本原理】 细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。 【内容与方法】 1．通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况 2.使用卫生要求。 （1）实验室的消毒 实验室日常采用紫外灯消毒；按实验室的卫生管理要求对实验室洁净区按周期进行熏蒸消毒；在培养期间发生严重污染时要进行熏蒸消毒。 （2）培养工作开始操作前将所有培养用的物品经专用物流通道通过传递窗放进培养室，开紫外灯消毒30min，关紫外灯后方进入操作。配有空气净化系统的洁净室在风机开启至少30min后才能达到相应的洁净度级别。 （3）操作者进入培养室时要遵守的程序 a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。 b: 换穿无菌室专用鞋，进入更衣室，外衣挂到指定的衣柜里，用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂进行消毒，戴帽子（不露头发）、口罩（应包住胡须），穿已消毒的洁净服，进入缓冲室。再用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂消毒，在其滞留3min后进入培养室。 （4）开超净工作台10min，期间用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭操作台面后可开始具体的操作，同时点燃酒精灯用于临时性的火焰消毒。 （5）实验完毕，关闭超净工作台，及时清理实验用品，废物从通往物流通道的传递窗中传出。工作台面用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭消毒后方可出培养室。 （6）出培养室时，将工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔离鞋柜里，跨过隔离鞋柜，将用过的一次性帽子、口罩、鞋套等放到指定的废物桶，出实验室前用肥皂洗手，关闭空气净化系统，开紫外灯30min。 注：(不写实验报告)
细胞生物学实验报告 实验三细胞原代培养 1引言 1.1 实验目的 1. 理解细胞原代培养原理。 2. 了解细胞原代培养的应用。 3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。 4. 巩固无菌操作技术。 1.2 实验原理 细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 2实验仪器、试剂及操作步骤 2.1 实验仪器 超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒 （头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等 2.2 实验试剂 DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等 2.3 实验材料 动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚 2.4 实验步骤 A.鸡胚成纤维细胞的原代培养 1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。 2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。 3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。 4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。 5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋 壳。 6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。 7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。 8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。 9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。 10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组 织块接种到培养瓶内。在培养瓶中放置10-15个组织块。 11.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。将接种组织块的培养瓶面朝上在
实验5 细胞的传代培养 一、实验目的 熟练掌握动物细胞的传代培养法。 二、实验原理 哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。 三、仪器、材料与试剂 1仪器 CO2培养箱，倒置显微镜，超净台 2材料 培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。 3试剂 完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。 四、实验步骤 1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。 2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。 3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。 4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。 5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。 6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。 8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。
9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。 10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。 五、注意事项 1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。 2.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。 六、实验报告 1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤？ 2.细胞传代培养的目的是什么？
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养 一.实验目的 1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。 2 ?熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。 3?了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。 二.实验原理 自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物 理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。 如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传 代培养。 1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化 培养法。 组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶 中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。组织块培养法操作过程简 便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。 消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。该方法主要使用生物化学手段将 较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接 松散、相互分离，细胞失去与间质的连接，活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液，分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。胰蛋白酶
动物细胞培养 一、试验目的。 1、掌握无菌操作技术。 2、掌握原代和传代细胞培养。 3、掌握细胞冷冻和复苏技术。 4、了解培养成纤维细胞的形态。 二、试验原理。 将动物机体的组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 对具有移动特性的稳定细胞系或细胞株进行长期保存，一方面可以作为细胞研究的试验材料，另一方面可以做细胞制品的生产材料。目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法，。细胞的冷冻保存的原则是慢冻快融，这样做是为了防止细胞由于冷冻过程中产生了冰晶而发生细胞破裂。 三、实验器材及药品。 器材：怀孕的小白鼠、培养箱、培养瓶、培养皿、移液器、眼科剪、镊子、酒精 培养箱、超净工作台、离心管、灯、离心机、水浴锅、倒置显微镜、CO 2 高压灭菌锅、试管架等。 药品：小牛血清、DMEM合成培养基、抗生素、DMSO冷冻剂、胰酶、PBS缓冲液等。 四、实验操作。 1、消毒灭菌。 将实验所需用到的工具（如枪头、培养皿、眼科剪、镊子以及每个人的实验服等）集中灭菌、烘干。配制75%的酒精以备实验时所需。
2、培养基的配制。 分别取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培养基，将两种培养基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混匀就得到了细胞培养的培养液。 3、原代培养。 （1）、准备。将实验过程中会用到的工具以及药品全部放在超净工作台上进行紫外消毒灭菌。实验开始前带好乳胶手套，用酒精对手进行消毒。将怀孕的小白鼠放在酒精中杀死，取出子宫内的胚胎组织。 （2）、剪切与消化。将胚胎组织放于平板中，用眼科剪将组织块剪碎，剪得越碎越好。将剪碎的组织块放于离心管中，加入大约200μl的胰酶进行消化。也可将其置于37度恒温箱中进行消化。 （3）、分离细胞。消化到一定时间时，如果离心管中的溶液中出现了明显的浑浊，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，则应该加入与胰酶等量的培养液终止消化。离心管于离心机中离心，弃上清液，得到分散的细胞。 （4）、转移细胞并培养。向含有分散细胞的离心管中加入配制好的培养液，吹打 箱培养，瓶口少少混匀，将培养液用移液器移到细胞培养瓶中。置于℃恒温CO 2 拧的松一点。 4、传代培养。 （1）、倒置显微镜下观察细胞的形态。倒置显微镜下观察培养细胞的长势及密度，根据细胞密度决定传代的稀释倍数。 （2）、收集原代培养的细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200μl的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止消化。然后离心，收集到原代培养的细胞。 （3）、传代细胞的培养。向离心管内加入大约7—8ml的培养液，吹打混匀。将培养液转移到培养瓶中，置于37度恒温CO 培养箱中培养。培养1—2天后于显 2 微镜下观察细胞的形态。 5、细胞冷冻保存。 （1）、收集细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200μl的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止
细胞生物学实验报告 一．实验名称：细胞凝集反应 二．实验原理： 细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分支状糖外被.目前认为：细胞间的联系，细胞的生长和分化,免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分支状糖分子有关。 凝集素(lectin)是一类含糖的（少数例外）并能与糖专一结合的蛋白质,它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 凝集素是指一种从各种植物,无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球(含血型物质)，故名凝集素。常用的为植物凝集素(Phytoagglutin， PNA）,通常以其被提取的植物命名，如刀豆素 A(Conconvalina,ConA）、麦胚素（Wheat germ agglutinin， WGA)、花生凝集素（Peanut agglutinin, PNA)和大豆凝集素(Soybean agglutinin， SBA）等，凝集素是它们的总称。凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，它们具有的某些“亲合”特性，能被免疫细胞化学技术方法所应用。 血型鉴别实验，也是凝集反应的一种。 三．实验用品： 土豆块茎 显微镜，粗天平，载玻片，滴管2支，离心管2支 PBS缓冲液:称取NaCl7.2g，Na 2HPO 4 1。48g，KH 2 PO 4 0。43g,加蒸馏水，定 容至1000ml，调pH值到7.2. 4。2%的红细胞 四．实验步骤：
1.称取土豆去皮块茎2g，加10mlPBS缓冲液，浸泡2h,浸出的粗提液中含 有可溶性土豆凝集素。 2.以无菌方法抽取兔子静脉血液（加抗凝剂),加生理盐水3ml，在 1000r/min，离心5min，重复3次离心,最后按压积红细胞体积用生理盐水配成1%红细胞液。 3.分别用滴管吸取土豆凝集素和1%红细胞液各一滴,置双凹片左孔内,充分 混匀。 4.同时分别用滴管吸取PBS缓冲液和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片右 孔内，充分混匀，做对照实验。 5.摇晃5-10min后，观察有无发生细胞凝集并置显微镜下观察。 试剂土豆凝集素PBS缓冲液 现象 在振荡过程中，溶液中 的红细胞渐渐凝集成颗 粒状，逐渐聚拢，最后 在液滴中形成一大块血 红色血块。 在振荡过程中，红细胞 不断向中间靠拢，最终 形成中间颜色较深，边 缘颜色较浅的红细胞浑 浊溶液。 结果红细胞发生凝集红细胞未发生凝集 说明结论 土豆凝集素可使血液发生凝集，PBS缓冲液不能使 血液发生凝集。 图左为PBS缓冲液对照图右为土豆凝集素
实验四乳鼠肺细胞原代培养 一、实验目的 1.了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。 2.学习细胞消化、细胞计数方法。 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的地生长及繁殖。 三、实验用品 1.设备 培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、恒温水浴箱、离心机等。 CO 2 2.器材 眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃漏斗、量筒、移液管、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养皿等。 上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，15磅灭菌30min。此外，还需显微镜、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球等。 3.试剂 （1）D-Hanks平衡盐溶液：即无钙、镁离子的Hanks液。 （2）细胞消化液：％胰蛋白酶液（胰蛋白干粉，加D-Hanks平衡盐溶液100mL，溶解后过滤除菌，调pH值） 溶液。 （3）％NaHCO 3 （4）RPMI1640培养液。 以上溶液均经适当包装，除菌后备用。此外，还需胎牛血清和1000U/mL的青、链霉素液（双抗）。在RPMI1640培养液中加入10%胎牛血清，1%双抗，即成细胞培养液。 4.仪器药品 以3-5人为一个小组，每组需备：乳鼠一只；眼科剪、眼科镊各两把；90mm玻璃培养皿3个，用以清洗组织块；50mL离心管1个；5mL、10mL移液管各5支；35mm培养皿1个。 四、材料 出生后2-3天的乳鼠。 五、实验步骤 1.清洗与消毒 操作者首先进行手的清洗与消毒。 2.处死动物 新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟，置平皿中。 3.取肺 左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。用眼科聂取出肺，置于盛有Hanks液（含有200U/ml青链霉素）的玻璃平皿中，冲洗去血。 4.剪肺 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的Hanks液冲洗1遍。用弯头眼科剪，将肾剪成1mm3大小的组织块，大小应尽量均匀一致，再用Hank液洗涤2-3次，直到液体澄清为止。 5.消化及分散组织块 将上步清洗过的Hank液吸掉，按组织块体积的5-6倍量加入消化液。转入50mL离心管，置于37℃水浴中进行消化。消化时间在20-40min左右。每隔10min摇动一次，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变为白色为止。
原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去
细胞膜的渗透性实验报告 篇一：细胞膜通透性实验报告 姓名班级13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目细胞膜通透性实验 【实验题目】细胞膜通透性实验【实验目的】 1、观察溶血现象并掌握其发生机制。 2、了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。【实验材料与用品】 1. 试剂：0.85% NaCl溶液、0.085% NaCl溶液、0.8mol/L 甲醇溶液、0.8mol/L丙三醇溶液、6% 葡萄糖溶液、2% TritonX-100 2. 器具：离心管、试管架、滴管、显微镜、离心机 3. 材料：鸡血红细胞【实验原理】 细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择性屏障，它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，通透性高（肾小管、肠上皮、植物根细胞更高），水分子可以从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象称为渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。 1. 溶血现象将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内使细胞涨破，血红蛋白释放到介质当中，介质由不透明的细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液（此时的细胞膜收缩，会
略有不溶性内容物），这种现象称为溶血。 红细胞在等渗盐溶液中短时间之内不会发生溶血，但是由于红细胞的细胞膜对不同物质的通透性不同，时间久了，膜两侧的渗透压平衡会被打破，也会发生溶血。 姓名班级13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目细胞膜通透性实验 由于各种溶质透过细胞膜的速度不同，因此发生溶血的时间也不相同。发生溶血现象所需的时间，可以作为测量某种物质进入红细胞速度的指标。即溶血时间对应着穿膜速度。 2. 物质穿膜运输的类型（1）被动运输（不耗能）被动运输分为简单扩散（顺浓度梯度扩散）和协助扩散。（通道：载体蛋白、通道蛋白）（2）主动运输（耗能）需要跨膜载体蛋白的协助，这些载体蛋白起到泵的作用，有选择性地把专一溶质逆浓度梯度的穿膜运输。 3. 影响物质穿膜通透性的因素 （1）脂溶性越大的分子越容易穿膜（非极性的物质比极性的物质更容易溶于脂类物质）（2）小分子比大分子更容易穿膜（小的非极性分子，如O2 、CO2等） （3）不带电荷的分子容易穿膜（离子难溶于脂质物质，离子带水膜使体积增大） （4）亲水性分子和离子的穿膜要依赖于专一性的跨膜