分子生物学课程论文
基因治疗与基因诊断的研究与发展
邓小红临床医学08级3班200805090346
摘要：基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于分子生物学的理论及技术方法，特别是重组DNA技术的迅速发展，使人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。因此在20世纪70年代末诞生了基因诊断(gene diagnosis)；随后于1990年美国实施了第一个基因治疗(gene therapy)的临床试验方案。可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和技术与医学相结合的范例。
关键词：基因治疗基因诊断重组DNA
英文题目：Molecular biology course in dissertation
Molecular biology curriculum paper gene treatment and gene diagnosis research and developmen t
Deng Xiaohong clinical medicine 08 levels of 3 classes 200805090346
Summary: gene-diagnosing and gene therapy in the relatively short time from theoretical ideas into reality, mainly due to the molecular biology of theory and techniques, in particular the recombinant DNA technology is developing rapidly, so that people can build a variety of carriers in the laboratory, cloning and analysis of target genes. The disease can drill down to the molecular level research and has made significant progress. Thus, in the late 1970s was born gene diagnosis (gene diagnosis); subsequently, in 1990, United States implemented the first gene therapy (gene therapy) clinical trials programme. V isible, genetic diagnosis and gene therapy is a modern molecular biology of theory and technology combined with the medicine.
Keywords: gene therapy gene-diagnosing recombinant DNA
1．引言
20世纪后半叶以来，由于分子生物学的崛起，人们进入了合成代谢与代谢调节的研究。这一阶段，细胞内两类重要的生物大分子---蛋白质与核酸，成为研究焦点。20世纪50年代初期发现了蛋白质的α螺旋的二级结构形式；更具里程碑意义的是1953年提出的DNA双螺旋结构模型，为揭示遗传信息传递规律奠定了基础，是生物化学发展进入分子生物学时期的重要标志。
20世纪70年代，重组DNA技术的建立不仅促进了对基因表达调控机制的研究，使基因操作无所不能，而且使人们主动改造生物体成为可能。基因诊断和基因治疗也是重组DNA技术在医学领域应用的重要方面。
随着对各种疑难疾病的深入研究，和分子生物学日新月异的发展，传统的诊断治疗手段无法解决的一些重要问题。通过对生物体在分子水平上的研究，基因诊断与治疗的作用逐渐显露出来，尤其是许多遗传疾病。
传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。现知各种表型的改变是由基因异常造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA 水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或DNA诊断(DNA diagnosis)。基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。
2．基因诊断的原理与方法
2.1 基因诊断的原理
疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异常有关。基因诊断的基本原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。由于DNA的突变、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结构变异，因此，可以直接检测上述的变化或利用连锁方法进行分析，这就是DNA诊断。对表达产物mRNA质和量变化的分析为RNA诊断(RNA diagnosis)。
2.2 基因诊断的方法
基因诊断是以核酸分子杂交(nucleic acid molecular hybridization)和聚合酶链反应（PCR）为核心发展起来的多种方法，同时配合DNA序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为一种很有用的基因诊断方法。
DNA诊断
常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。
⑴斑点杂交：根据待测DNA 样本与标记的DNA探针杂交的图谱，可以判断目标基因或相关的DNA片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。
⑵等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide probe, ASO probe）杂交：是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交条件下，只有该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受检的DNA样本只能与突变ASO探针，不与正常ASO探针杂交，说明受检二条染色体上的基因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，说明一条染色体上的基因发生突变，另一条染色体上为正常基因，为这种突变基因的杂合子；如果只能与正常ASO探针杂交，不能与突变ASO杂交，说明受检者不存在该种突变基因，如图21-1所示。
若与PCR方法联合应用，即PCR/ASO探针杂交法(PCR/ASO probe hybridization)，是一种检测基因点突变的简便方法，先用PCR方法扩增突变点上下游的序列，扩增产物再与ASO探针杂交，可明确诊断突变的纯合子和杂合子。此法对一些已知突变类型的遗传病，如地中海贫血、苯丙酮
尿症等纯合子和杂合子的诊断很方便。也可分析癌基因如H-ras和抑癌基因如p53的点突变。
⑶单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP）分析相同长度的单链DNA因其序列不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不尽相同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时速度就不同，若单链DNA用放射性核素标记，显影后即可区分电泳条带。一般先设计引物对突变点所在外显子进行扩增，PCR产物经变性成单链后进行电泳分析。PCR/SSCP方法，能快速、灵敏、有效地检测DNA突变点，如图21-2，此法可用检测点突变的遗传疾病，如苯丙酮尿症、血友病等，以及点突变的癌基因和抑癌基因。
⑷限制性内切酶图谱（restriction map）分析，如果DNA突变后改变了某一核酸限制性内切酶的识别位点，使原来某一识别位点消失，或形成了新的识别位点，那么相应限制性内切酶片段的长度和数目会发生改变。一般基因组DNA经该种限制性内切酶水解，再做Southern印迹，根据杂交片段的图谱，可诊断该点突变，如图21-3所示。如果用PCR扩增该突变点的外显子，PCR产物经该种酶消化后，进行琼脂糖电泳，溴乙锭染色后可直接观察片段的大小及数目。此法可用于检测有些限制性内切酶识别位点消失的遗传疾病，如镰状细胞贫血。或基因缺失的疾病如α地中海贫血症，单纯性生长激素缺乏症等。
⑸限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism ,RFLP）遗传连锁分析人群中个体间DNA的序列存在差异，据估计每100-200个核苷酸中便有1个发生突变，这种现象称为DNA多态性。有些DNA多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点，因而产生了DNA限制性片段长度多态性。RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定的家庭中，如果某一致病基因与特定的多态性片段连锁，可以遗传给子代，因此这一多态性片段可作为遗传标记，来判断该家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基因，见图21-4，此法可用于诊断甲型血友病、苯丙酮尿症、享延顿舞蹈病等。
⑹DNA序列分析对致病有关的DNA片段进行序列测定，是诊断基因异常（已知和未知）最直接和准确的方法。
RNA诊断
RNA诊断主要是分析基因的表达功能，检测转录物的质和量，以判断基因转录效率的高低，以及转录物的大小。
⑴RNA印迹（Northern blot）RNA印迹是检测基因是否表达，表达产物mRNA的大小的可靠方法，根据杂交条带的强度，可以判断基因表达的效率。
⑵RT-PCR是一种检测基因表达产物mRNA灵敏的方法，若与荧光定量PCR结合可对RT-PCR产物量进行准确测定。
3．基因诊断的应用
3.1 遗传病的预防
·产前诊断产前诊断可以通过胎儿组织活检、羊膜腔穿刺、羊膜绒毛样品及母体血液循环中的胎儿细胞进行。可以进行染色体组型分析，发现染色体异常，但利用PCR技术结合DNA诊断学方法分析特异基因缺陷更宜推广。
·携带者测试基因测试常用于检出隐性遗传病携带者，包括遗传病受累个体家庭的其他成员和有特殊遗传病死亡家庭中的危险人群。例如对３个缺失型和１个非缺失型Ｄｕｃｈｅｎｎｅ假肥大肌营养不良家系缺失ＤＮＡ片段ＰＣＲ定量分析和ＳＲＲ－ＰＣＲ连锁分析，对４个家系１７名成员（患儿５名、女性亲属７名、男性亲属５名）进行了基因检测。检测结果发现了４名女性为致病基因携带者，肯定了７名女性为非携带者，为这些家系提供了可靠的遗传信息。以上检测方法简便易行，利于在临床实验室中开展。
·症状前诊断对于某些单基因紊乱所引起的综合征，仅至晚年才会有明显表现，例如肝豆状核变性的症状前诊断及干预治疗，应用短串联重复序列标记对４０个肝豆状核变性家系进行单体型连锁分析，在先证者的８１例无症状同胞中，检出１１例症状前患者。对其中８例投用硫酸锌治疗，效果良好，在预防症状出现的同时，提高了血清铜蓝蛋白水平。强调症状前诊断及干预治疗的重要性。
·遗传病易感性多基因遗传病是由多个易感性基因累加效应引起的遗传性状，是由多个易感性基因累加效应引起的遗传性状，是多个才会有发病的机会。比如，有LDL受体基因缺陷的个体同时有高胆固醇血症，其冠状动脉患病率要比单纯高胆固醇血症者高。因此，根据DNA诊断，做好疾病的早期预防并注意环境卫生和个人生活方式，可以达到预防的目的。
3.2 感染性疾病
过去对感染性疾病(infectious diseases)的诊断，一是直接分离检查病原体，或者对患者血清学或生物化学的分析。有些病原体不容易分离，有些需经过长期培养才能获得。血清学对病原体抗体的检测虽然很方便，但是病原体感染人体后需要间隔一段时间后才出现抗体，并且血清学检查只能确定是否接触过该种病原体，但不能确定是否有现行感染，对潜伏病原体的检查有困难。
对感染性疾病的基因诊断具有快速、灵敏、特异等优点。80年代建立的PCR技术已广泛应用于对病原体的检测。一般根据各病原体特异和保守的序列设计引物，有的还合成ASO探针，对病原体的DNA可用PCR 技术直接检查，而对RNA病毒，则采用RT-PCR。现在市场已经有许多种病原体的测定药盒供应，每一盒包含扩增某种病原体的特异引物，所需的酶以及配妥的各种反应试剂，并附有可行的操作方法步骤。
?病毒性感染：
多种病毒性感染都可采用基因诊断检测相应的病原体，如甲型、乙型、丙型和丁型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒、可萨奇病毒、脊髓灰质类病毒、腺病毒、EB病毒、疱疹病毒、人巨细胞病毒、乳头状病毒……等。最近新发现的SARS冠状病毒，在基因组（RNA）序列确定后，便很快建立了RT-PCR的基因诊断法。
?细菌性感染：
可应用基因诊断检测多种致病性的细菌，如结核分枝杆菌、痢疾性大肠杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、绿脓杆菌……等。
?寄生虫：
恶性疟原虫、克鲁斯锥虫、利什曼原虫、血吸虫、弓形虫……等都有基因诊断的方法
其它:如衣原体、支原体、真菌性感染也均用基因诊断。
3.3 恶性肿瘤
分析一些原癌基因的点突变、插入突变、基因扩增、染色体易位和抑癌基因的丢失或突变，可以了解恶性肿瘤的分子机制，有助于对恶性肿瘤的诊断，对肿瘤治疗及预后有指导意义。
4.基因治疗
4.1 基因治疗的定义
从基因角度可以理解为对缺陷的基因进行修复或将正常有功能的基因置换或增补缺陷基因的方法。若从治疗角度可以广义地说是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。导入的基因可以是与缺陷基因相对应的有功能的同源基因或与缺陷基因无关的治疗基因。
基因治疗有两种形式，一种是改变体细胞的基因表达，即体细胞基因治疗（somatic gene therapy），另一种是改变生殖细胞的基因表达，即种系基因治疗（germline gene therapy），从理论上讲，若对缺陷的生殖细胞进行矫正，不但当代可以得到根治，而且可以将正常的基因传给子代。但生殖的生物学极其复杂，且尚未清楚，一旦发生差错将给人类带来不可想象的后果，涉及一系列伦理学的问题，目前还不能用于人类。在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞，基因型的改变只限于某一类体细胞，其影响只限于某个体的当代。
4.2 基因治疗的方式
基因治疗的方式（type of gene therapy）主要有3类，一类为基因矫正或置换，即对缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因，因此不涉及基因组的任何改变，目前尚无体内成功的报道。另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的导入，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。再有一类为基因封闭，有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵（decoy）转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达。除上述3大类外，近日发展其它多种形式，如导入病毒或细菌来源的所谓“自杀基因”或经过改造的条件性复制病毒，只能在p53缺陷的肿瘤细胞繁殖以达到溶解肿瘤细胞。
4.3 导入的方式
导入基因有两种方式，一种是体外导入（ex vivo）,即在体外将基因导入细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使这种带有外源基因的细胞在体内表达，从而达到治疗或预防的目的。被用于修饰的细胞可以是自体，同种异体或异种的体细胞。合适的细胞应易于从体内取出和回输，能在体外增殖，经得起体外实验操作，能够高效表达外源基因，且能在体内长期存活。目前常用的细胞有淋巴细胞、骨髓干细胞、内皮细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、肌细胞、角朊细胞（keratinocyte）、多种肿瘤细胞等。另一种是体内导入（in vivo），即将外源基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。
4.4基因治疗的临床试验
目前临床基因治疗试验的方案已达9百多个，受治疗的患者已有数千例
表21-3可见当前临床基因治疗（gene therapy）或广义地称基因转移（gene transfer）试验，有三种类型，即治疗性、基因标记及非治疗性试验。后者将腺病毒载体注射于健康自愿者的体内，观察机体对腺病毒载体的反应。这些方案的临床试验期（trial phases）极大多数为Ｉ期临床试验，Ⅲ期者仅仅４个方案。说明基因治疗临床试验尚处于未成熟阶段。
·基因标记
目前常用的基因标记方法是将含neo R基因的重组逆转录病毒载体在体外转导细胞，然后回输至病人体内，可以很方便地跟踪这种标记细胞的命运，用来研究许多其他方法不能回答的体细胞移植的生物学问题。
美国第一个被批准基因标记的临床研究计划是NIH的Rosenberg等的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes, TIL）基因标记实验。他将恶性黑色素瘤组织或转移的淋巴结制成单细胞悬液，在IL-2的作用下淋巴细胞可成倍增殖而肿瘤细胞及其他类型细胞则死亡。这种TIL能特异杀伤肿瘤细胞。先在体外将含有neo R基因的逆转录病毒载体转导TIL，该载体能整合至TIL的基因组，故子代的TIL也含有neo R基因，能在含抗生素G418的培养液中生长，便于筛选；也可用PCR检测neo R基因是否存在，以跟踪回输体内的TIL的去处。
将这种基因修饰过的TIL注射于黑色素瘤患者，可以研究TIL在体内各组织器官、血循环细胞、淋巴结、肿瘤组织的分布情况；特别感兴趣的是观察TIL是否能靶向肿瘤组织；同时也可以研究TIL在体内存活期的长短；以及了解这种体外基因修饰过的TIL是否会自主生长和恶变？注射后对人体是否有害？这些问题的阐明可为基因治疗打基础。结果发现基因修饰过的TIL在体外不会自主增殖，说明没有恶变。在注射后的头3周，用PCR
可测出外周血存在着含有neo R基因的单核细胞，有的长至60d尚可测出。在注射后3d活检的肿瘤组织也可测出有基因修饰过的TIL的存在。有人对其他细胞如骨髓细胞、肝细胞和细胞毒淋巴细胞等进行标记研究。
·单基因疾病
遗传性单基因疾病（monogenic diseases）是基因治疗的理想侯选对象，设计治疗方案时应考虑下列几点因素：⑴对造成该疾病有关的基因应有较详细的了解，并能在实验室克隆适合真核细胞表达的有关基因的cDNA序列，供转导用。⑵经有功能基因转导的体细胞，只要产生较少量原来缺少的基因产物就能矫正疾病。例如腺苷脱氨酶（ADA）缺乏的严重联合免疫缺陷（SCID），由于淋巴细胞缺乏ADA酶，造成腺苷及dATP的堆积，可破坏免疫功能，患儿很少活至成年。若淋巴细胞ADA恢复至正常水平的5%～10%
即能维持免疫系统的功能，对病人症状就有改善，这是第一个基因临床治疗的方案。血友病B，是由于凝血因子Ⅸ缺乏所致。现知只要因子Ⅸ水平达到正常的10% ～20%就能缓解严重的血友病。对血友病A而言，只要因子Ⅷ
达正常水平的5%就能缓解症状，血友病已开始基因治疗临床试验。⑶即使导入基因过度表达，对机体应无不良作用。⑷有些遗传疾病是某些特殊细胞基因缺损造成的，但那有关的细胞不易取出供体外基因工程操作用。例如Parkinson症是脑黑质细胞（substantia nigra）的酪氨酸羟化酶缺乏，不能产生多巴胺（dopamine），给病人注射多巴胺可减轻症状。动物模型试验表明，将酪胺酸羟化酶基因转导成纤维细胞，再移植至脑内，可以减轻动物模型的异常行为。⑸现在采用的以正常有功能的同源基因来增补体内的缺乏基因，因此要求增补的基因在病人寿命期间能稳定表达，或重复治疗，所以应考虑构建能长期持续稳定表达外源基因的载体，并考虑将外源基因转导干细胞，如造血干细胞以望回输体内后其子代细胞也含有外源基因。
目前应用基因治疗的单基因疾病已有二十多种。
·恶性肿瘤
恶性肿瘤属复杂基因疾病(complex genetic diseases)，可能涉及多种基因的异常，发病过程是多步骤的，至今虽有不少有关的基因被鉴定，但肿瘤发病的分子机制尚未清楚，因此治疗时应选择何种靶基因不明确，多数是根据不同的环节，设计不同的治疗策略，目前临床恶性肿瘤的基因治疗策略有十余种之多。见表21-4。
?免疫基因治疗(immunogene theray)
分体外转导和体内转导二种。体外转导将一些能刺激免疫反应的细胞因子基因，如
IL-2、IL-12、IFN-γ等转导肿瘤细胞作为基因工程“瘤苗”，给肿瘤患者注射，宗旨为提高肿瘤细胞的免疫原性，有利于被机体免疫系统识别及排斥；由于转导细胞因子基因的肿瘤细胞在体内能持续不断分泌细胞因子，能增强抗肿瘤的特异免疫和非特异免疫反应，在肿瘤局部形成一种较强的抗肿瘤免疫反应微环境，并能通过局部免疫反应，引发全身的抗肿瘤免疫机能，此策略已应用于多种恶性肿瘤的临床试验。本实验室研究了IL-2基因转导的人肝癌和胃癌细胞“瘤苗”，后者已被中国药物管理局批准用于临床研究。另一种策略是将细胞因子基因或MHC I类基因直接体内注射于肿瘤局部，以促发抗肿瘤免疫反应。
?自杀基因系统
自杀基因（suicide gene）来源于病毒、细菌或真菌，例如单纯性疱疹病毒的胸苷激酶（thymidine kinase,TK）基因，能将一种对哺乳动物无毒害的嘌呤核苷的类似物甘苷洛韦（gancilovir, GCV）转变成三磷酸形式，后者可掺入新合成的DNA链，造成DNA链的断裂和抑制DNA聚合酶的活性，从而造成细胞死亡。所以将HSV-tk基因体内转导肿瘤细胞，然后再给患者
服用GCV药物，肿瘤细胞表达TK基因能使无毒的GCV转变成有毒的三磷酸GCV，达到杀伤肿瘤细胞的目的。
?抑癌基因 (tumor suppressive gene)
抑癌基因p53的突变与多种肿瘤的发生有密切的关系。将野生型(正常)的
p53转导
p53缺陷的恶性肿瘤，使其能表达正常的p53产物，后者具有强大的抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，从而达到抗肿瘤效果。
?裂解肿瘤病毒（oncolytic virus）
利用基因工程改造过的腺病毒突变体，如EIB基因缺失的腺病毒能选择性在p53缺
陷的恶性肿瘤细胞中进行复制、繁殖，并最终杀伤肿瘤细胞。而正常细胞能表达p53，使这种病毒不能复制和繁殖。
·病毒性感染
目前病毒性感染主要治疗对象为人免疫缺陷病毒（HIV）感染的艾滋病，接受基因治疗的患者约4百余例。主要有二种治疗策略。
?增强机体的抗HIV免疫反应
?抑制HIV的复制
有人研究利用反义核酸来封闭HIV的基因，使mRNA不能翻译蛋白质，并发生降
解，或制备有关的核酶来破坏HIV的mRNA，使HIV不能复制繁殖，确切的疗效尚不能肯定，许多科学家尚在研究其他更有效的抑制HIV复制的方法。
·心血管疾病
目前心血管疾病中基因治疗最多的临床方案为外周血管疾病造成的下肢缺血，及心脏冠状动脉阻塞造成的心肌缺血。通过转移血管内皮细胞生长因子（VEGF）或成纤维细胞生长因子（FGF）或血小板衍生生长因子（PDGF）等基因于血管病疫部位，通过这些因子的表达，以促进新生血管的生成，从而建立侧肢循环，改善血供。
5. 问题及展望
基因治疗无疑是近30年来生命科学发展的一种结果。从理论上讲，若能将与疾病
发生有关的基因进行矫正或修复，应是一种有效的根治方法，可惜目前还不能达到此目的，这应是今后研究的一个重要方向。在这当中，其中最具有挑战性的问题是运送治疗基因的载体系统，理想载体应具备下列条件：安全无毒害；不引起免疫反应；高浓度或高滴度；能高效转移外源基因；持续有效表达外源基因；可靶向特定组织细胞；可调控；容纳外源基因可大可小；可供体内注射（包括全身性静脉注射）；便于规模生产供临床应用，可惜目前所应用的载体尚没有一个能符合上述全部的条件。这是今后努力研究的方向。
6．结论
随着“人类基因组计划”的完成（即在阐明人类基因组DNA3*109核苷酸的序列，阐明所有人类基因并确定其在染色体的位置）和“后基因计划”的实施（即是对基因功能的研究和基因与人体疾病的研究），分子生物学技术将会越来越普及，方便地运用到基因诊断领域。
虽然目前对DNA芯片的应用仍大多停留在实验室研究阶段，由于技术复杂、成本高、离临床检验及疾病诊断的普及性应用还有一段距离。但是可以预见，随着现代生物科学和其他学科技术的不断发展和完善，在不久的将来，即可把所有的基因都固定于1块芯片上时，就成了一块多基因疾病检测得万能芯片，它可适用于任何多基因疾病的检测，为临床检测工作带来极大的便利。
总之，分子生物学和分子遗传学的飞速发展必将极大地促进基因诊断技术的进步，有理由相信，以基因诊断为基础的基因治疗必将成为人类治疗自身疾病的主流技术，并极大地促进人类卫生事业的进步。
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分子生物学与基因工程复习重点 第一讲绪论 1、分子生物学与基因工程的含义 从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。 基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 2、分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由 上个世纪50年代，Watson和Crick提出了的DNA双螺旋模型； 60年代，法国科学家Jacob和Monod提出了的乳糖操纵子模型； 70年代，Berg首先发现了DNA连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA分子； 80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术； 90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”； 目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代”。 3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用：从专业基础课角度阐述对专业课程的支 撑作用 第二讲核酸概述 1、核酸的化学组成（图画说明） 2、核酸的种类与特点：DNA和RNA的区别 （1）DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖； （2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），RNA含有的碱基前3个与DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替； （3）DNA通常是双链，而RNA主要为单链；
（4）DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。 3、DNA作为遗传物质的直接和间接证据； 间接： （1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。 （2）DNA在代谢上较稳定。 （3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA。 （5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。 直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验 4、DNA的变性与复性：两者的含义与特点及应用 变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100oC）时，它就失去生理活性。这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。简而言之，就是DNA从双链变成单链的过程。增色效应：它是指在DNA的变性过程中，它在260 nm的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应。 复性：它是指热变性的DNA如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。复性的速度与DNA的浓度有关，因为两互补序列间的配对决定于它们碰撞频率。DNA复性的应用-分子杂交：由DNA复性研究发展成的一种实验技术是分子杂交技术。杂交可发生在DNA和DNA或DNA与RNA间。 5、Tm的含义与影响因素 Tm的含义：是指吸收值增加的中点。 影响因素： 1）DNA序列中G + C的含量或比例含量越高，Tm值也越大（决定性因素）；2）溶液的离子强度 3）核酸分子的长度有关：核酸分子越长，Tm值越大
现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学：以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程，也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术（基因工程） ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间：19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一：肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二：噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括： ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些？ ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5～10位获诺贝尔奖的科学家，简要说明其贡献。
生物芯片研究进展 摘要 生物芯片是切采用生物技术制备或应用于生物技术的微处理器是便携式生物化学分析器的核心技术。通过对微加工获得的微米结构作生物化学处理能使成千上万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的芯片上。生物芯片发展的最终目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个生化分析过程集成化以获得所谓的微型全分析系统或称缩微芯片实验室。生物芯片技术的出现将会给生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品和环境卫生监督等领域带来一场革命。本文主要阐述了生物芯片技术种类和应用方面的近期研究进展。 关键词 生物芯片，疾病诊断，研究运用，基因表达 基因芯片的种类 基因芯片产生的基础则是分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术、激光技术和计算机科学的发展及其有机结合。根据基因芯片制造过程中主要技术的区别，下面主要介绍四类基因芯片。 一、光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列 开发并掌握这一技术的是Affymetrix公司，Affymetrix采用了照相平板印刷技术技术结合光引导原位寡聚核苷酸合成技术制作DNA芯片，生产过程同电子芯片的生产过程十分相似。采用这种技术生产的基因芯片可以达到1×106/cm2的微探针排列密度，能够在一片1厘米多见方的片基上排列几百万个寡聚核苷酸探针。 原位合成法主要为光引导聚合技术（Light-directed synthesis），它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术（photolithography）与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽列阵提供了一条快捷的途径。 Affymetrix公司已有诊断用基因芯片成品上市，根据用途可以分为三大类，分别为基因表达芯片、基因多态性分析芯片和疾病诊断芯片，基因表达分析芯片和基因多态性分析芯片主要用于研究机构和生物制药公司，可以用来寻找新基因、基因测序、疾病基因研究、基因制药研究、新药筛选等许多领域，Affymetrix公司主要生产通用寡聚核苷酸芯片；疾病诊断芯片则主要用于医学临床诊断，包括各种遗传病和肿瘤等，目前Affymetrix公司生产
分子生物学复习题(有详细答案)
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绪论 思考题：（P9） 1.从广义和狭义上写出分子生物学的定义？ 广义上讲的分子生物学包括对蛋白质和核酸等生物大分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。 狭义的概念，即将分子生物学的范畴偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等过程。其中也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 2、现代分子生物学研究的主要内容有哪几个方面？什么是反向生物学？什么是 后基因组时代？ 研究内容： DNA的复制、转录和翻译；基因表达调控的研究；DNA重组技术和结构分子生物学。 反向生物学：是指利用重组DNA技术和离体定向诱变的方法研究已知结构的基因相应的功能，在体外使基因突变，再导入体内，检测突变的遗传效应，即以表型来探索基因结构。 后基因组时代：研究细胞全部基因的表达图式和全部蛋白质图式，人类基因组研究由结构向功能转移。 3、写出三个分子生物写学展的主要大事件（年代、发明者、简要内容） 1953年Watson和Click发表了“脱氧核糖核苷酸的结构”的著名论文，提出了DNA的双螺旋结构模型。 1972~1973年，重组DNA时代的到来。H.Boyer和P.Berg等发展了重组DNA 技术，并完成了第一个细菌基因的克隆，开创了基因工程新纪元。 1990~2003年美、日、英、法、俄、中六国完成人类基因组计划。解读人类遗传密码。 4、21世纪分子生物学的发展趋势是怎样的？ 随着基因组计划的完成，人类已经掌握了模式生物的所有遗传密码。又迎来了后基因组时代，人类基因组的研究重点由结构向功能转移。相关学说理论相应诞生，如功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学。生命科学又进入了一个全新的时代。 第四章 思考题：（P130） 1、基因的概念如何？基因的研究分为几个发展阶段？ 概念：基因是原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遗传效应的核苷酸序列，是遗传的基本单位和突变单位以及控制形状的功能单位。 发展阶段：○120世纪50年代以前，主要从细胞的染色体水平上进行研究，属于基因的染色体遗传学阶段。 ○220世纪50年代以后，主要从DNA大分子水平上进行研究，属于分
分子生物学课程论文
PCR技术发展与应用的研究进展 王亚纯 09120103 摘要：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增．定量PCR技术是克服了原有的PCR技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等，快速PCR技术快速PCR在保证PCR反应特异性、灵敏性和保真度的前提下，在更短时间内完成对核酸分子的扩增．mRNA 差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一．近年来已经开展了许多这三方面的研究工作，本文就定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。 关键字：定量PCR；荧光PCR；快速PCR；DNA聚合酶；mRNA差异显示PCR 0 前言 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术由于PCR简便易行、灵敏度
高等优点，该技术被广泛应用于基础研究。但是，由于传统的PCR技术不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其在临床上的应用受到限制[1]。鉴于此，对PCR产物进行准确定量便成为迫切的需要。几经探索，先后出现了多种定量PCR (quantitative PCR，Q-PCR)方法，其中结果较为可靠的是竞争性PCR和荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)。 随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR反应特异性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR)。快速PCR 技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速诊断等方面将会有重要的应用前景。例如，快速PCR在临床检测中可大大加快疾病的诊断效率；在生物恐怖袭击时能有效帮助快速鉴定可疑物中有害生物的存在与否；同时，由于PCR已经渗入到现代生物学研究的各个方面，快速PCR的实现必然可以使许多科学研究工作的进展显著加快，最终影
分子生物学笔记 ? ?第一章基因的结构第一节基因和基因组 一、基因(gene) 是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列． 一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon) ②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron) ③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。 二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和， 基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。 人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划（human genome project, HGP） 基因组学（genomics）,结构基因组学（structural genomics）和功能基因组学（functional genomics）。蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics）
第二节真核生物基因组 一、真核生物基因组的特点：， ①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中． ②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2—3％)， 二、真核基因组中DNA序列的分类？ (一)高度重复序列(重复次数>lO5) 卫星DNA(Satellite DNA) (二)中度重复序列 1．中度重复序列的特点 ①重复单位序列相似，但不完全一样， ②散在分布于基因组中． ③序列的长度和拷贝数非常不均一， ④中度重复序列一般具有种属特异性，可作为DNA标记． ⑤中度重复序列可能是转座元件(返座子)， 2．中度重复序列的分类 ①长散在重复序列(long interspersed repeated segments．)LINES ②短散在重复序列(Short interspersed repeated segments)SINES SINES：长度<500bp，拷贝数>105．如人Alu序列 LINEs：长度>1000bp(可达7Kb),拷贝数104-105，如人LINEl (三)单拷贝序列(Unique Sequence) 包括大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列， 三、基因家族(gene family)
现代分子生物学 第一章 DNA的发现： 1928年，英国Griffith的体内转化实验 1944年，Avery的体外转化实验 1952年，Hershey和Chase的噬菌体转导实验 分子生物学主要研究内容（p11） DNA的重组技术 基因表达调控研究 生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学 基因组，功能基因组与生物信息学研究 第二章 DNA RNA组成 脱氧核糖核酸 A T G C 核糖核酸 A U G C 原核生物DNA的主要特征 ①一般只有一条染色体且带有单拷贝基因； ②整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列组成； ③几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。 染色体作为遗传物质的特点： （1）分子结构相对稳定（贮存遗传信息） （2）通过自我复制使前后代保持连续性（传递遗传信息） （3）通过指导蛋白质合成控制生物状态（表达遗传信息） （4）引起生物遗传的变异（改变遗传信息） C值以及C值反常 C值单倍体基因组DNA的总量 C值反常C值往往与种系进化的复杂程度不一致，某些低等生物却有较大的C值。如果这些DNA 都是编码蛋白质的功能基因，那么，很难想象在两个相近的物种中，他们的基因数目会 相差100倍，由此推断，许多DNA序列可能不编码蛋白质，是没有生理功能的。 DNA的中度重复序列，高度重复序列 中度各种rRNA，tRNA以及某些结构基因如组蛋白基因都属于这一类 高度卫星DNA 核小体 是由H2A H2B H3 H4 各2分子生成的八聚体和约200bp的DNA构成的，H1在核小体外面。 真核生物基因组的结构特点 ①基因组庞大； ②大量重复序列； ③大部分为非编码序列，90％以上； ④转录产物为单顺反子； ⑤断裂基因； ⑥大量的顺式作用元件； ⑦DNA多态性：SNP和串联重复序列多态性； ⑧端粒（telomere）结构。
现代分子生物学总结(朱玉贤、最新版)
一、绪论 两个经典实验 1、肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验：先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀活性以后、以及活的粗糙型细菌（R型）分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力；当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死亡。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌。实验表明，死细菌DNA 进行了可遗传的转化，从而导致小鼠死亡。 2、T2噬菌体感染大肠杆菌：当细菌培养基中分别带有35S或32P标记的氨基酸或核苷酸，子代噬菌体就相应含有35S标记的蛋白质或32P标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌，经过1~2个噬菌体DNA 复制周期后进行检测，子代噬菌体中几乎不含带35S标记的蛋白质，但含30%以上的32P 标记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA而不是蛋白质。 基因的概念：基因是产生一条多肽链或功能RNA分子所必需的全部核苷酸序列。
二、染色体与DNA 嘌呤嘧啶 腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶 染色体 性质：1、分子结构相对稳定；2、能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性；3、能指导蛋白质的合成，从而控制生命过程；4、能产生可遗传的变异。 组蛋白一般特性：1、进化上极端保守，特别是H3、H4；2、无组织特异性；3、肽链上氨基酸分布的不对称性；4、存在较普遍的修饰作用；5、富含赖氨酸的组蛋白H5 非组蛋白：HMG蛋白；DNA结合蛋白；A24非组蛋白
真核生物基因组DNA 真核细胞基因组最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能蛋白质所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值，在真核生物中C 值一般是随着生物进化而增加的，高等生物的C 值一般大于低等动物，但某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大，这就是著名的C值反常现象。真核细胞DNA序列可被分为3类：不重复序列、中度重复序列、高度重复序列。 真核生物基因组的特点：1、真核生物基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组；2、真核基因组存在大量的的重复序列；3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90%以上，这是真核生物与细菌和病毒之间的最主要的区别；4、真核基因组的转录产物为单顺反之；5、真核基因组是断裂基因，有内含子结构；6、真核基因组存在大量的顺式元件，包括启动子、增强子、沉默子等；7、真核基因组中存在大量的DNA多态性；8、真核基因组具有端粒结构。
生物芯片研究进展 摘要：生物芯片是便携式生物化学分析器的核心技术。通过对微加工获得的微米结构作生物化学处理能使成千上万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的芯片上。采用生物芯片可进行生命科学和医学中所涉及的各种生物化学反应，从而达到对基因、抗原和活体细胞等进行测试分析的目的。生物芯片发展的最终目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个生化分析过程集成化以获得所谓的微型全分析系统（micro total analytical system）或称缩微芯片实验室（laboratory on a chip）。生物芯片技术的出现将会给生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品和环境卫生监督等领域带来一场革命。 关键词：生物芯片，缩微芯片实验室，疾病诊断，基因表达 正文：人们利用人类基因组计划中所发现的已知基因对其功能进行研究，把已知基因的序列与功能联系在一起的功能基因组学研究。另外，与疾病相关的研究已从研究疾病的起因向探索发病机理方面转移，并从疾病诊断向疾病易感性研究转移。由于所有上述这些研究都与DNA结构、病理和生理等因素密切相关，因此许多国家现已开始考虑在后基因组时期，研究人员是否能用有效的硬体技术来对如此庞大的DNA信息以及蛋白质信息加以利用。为此，先后已有多种解决方案问世，如DNA的质谱分析法、荧光单分子分析法、阵列式毛细管电泳、杂交分析等。 但到目前为止，在对DNA和蛋白质进行分析的各种技术中，发展最快和应用前景最好看的技术当数以生物芯片技术为基础的亲和结合分析、毛细管电泳分析法和质谱分析法。此外，在此基础上，通过与采用生物芯片技术和样品制备方法（芯片细胞分离技术和生化反应方法（如芯片免疫分析和芯片核酸扩增）相结合，许多研究机构和工业界都已开始构建所谓的缩微芯片实验室。 建立缩微芯片实验室的最终目的是将生命科学研究中的许多不连续的分析过程，如样品制备，化学反应和分离检测等，通过采用象集成电路制作过程中的半导体光刻加工那样的缩微技术，将其移植到芯片中并使其连续化和微型化。用这些生物芯片所制作的具有不同用途的生化分析仪具有下述一些主要优点，即分析全过程自动化、生产成本低、防污染（芯片系一次性使用）、分析速度可获得成千上万倍的提高、同时，所需样品及化学药品的量可获得成百上千倍的减少、极高的多样品处理能力、仪器体积小、重量轻、便于携带。 一．生物芯片的微加工制备 生物芯片的加工借用的是微电子工业和其他加工工业中比较成熟的一些微细加工工艺，在玻璃、塑料、硅片等基底材料上加工出用于生物样品分离、反应的微米尺寸的微结构，如过滤器、反应室、微泵、微阀门等微结构。然后在微结构上施加必要的表面化学处理，再在微结构上进行所需的生物化学反应和分析。 生物芯片中目前发展最快的要算亲和结合芯片（包括DNA和蛋白质微阵列芯片）。它的加工除了用到一些微加工工艺以外，还需要使用机器人技术。现在有四种比较典型的亲和结合芯片加工方法。一种是Affymetrix公司开发出的光学光刻法与光化学合成法相结合的光引导原位合成法。第二种方法是Incyte pharmaceutical公司所采用的化学喷射法，它的原理是将事先合成好的寡核苷酸探针喷射到芯片上指定的位置来制作DNA芯片的。第三种是斯坦福大学所使用的接触式点涂法。该方法的实现是通过使用高速精密机械手所带的移液头与玻璃芯片表面接触而将探针定位点滴到芯片上的[11]。第四种方法是通过使用四支分别装有A、T、G、C核苷的压电喷头在芯片上作原位DNA探针合成的。
中国因大豆最新研究进展报告（专题三） 摘要：大豆是重要的油料作物和饲料作物，也是人类的主要食用蛋白和工业原料的来源。而转基因是一种将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰的现代技术。目前，越来越多的转基因技术运用到食品医药行业当中。大豆的转基因研究是国内外植物分子生物学研究的热点之一，通过将目的基因整合到大豆基因中，可获得抗虫大豆，其出油率也高于普通大豆。转基因大豆已成为世界大豆主产国大豆产业发展的主要动力。本文概述转基因大豆依据的主要理论，目前国内研究进展，转基因大豆的现状及其安全问题等等。 关键词：转基因大豆食品安全研究进展外源基因现状 前言：大豆是重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物，含有丰富的蛋白质、脂肪和多种人体有益的生理活性物质。随着基因工程研究的升入，用转基因来改变大豆的性状已被广泛应用。转基因大豆最早的报道是1984年De Bloke等和Horsch 等的研究结果。1988年，McCabe和Hinchee分别用基因枪轰击大豆未成熟胚生长点和用农杆菌侵染大豆子叶节的方法获得转基因植株。1994年5月，美国孟山都公司培育的抗草甘膦除草剂转基因大豆首先获准在美国商业化种植。1997年，杜邦公司获得美国食品药物管理局批准推广种植高油酸转基因大豆。1998年AgrEvo公司研制的抗草丁膦大豆被批准进行商业化生产。转基因大豆品种的育成和推广是世界大豆科技史上具有里程碑意义的重大突破，已成为世界大豆发展生产的主流趋势。 1转基因大豆简介 转基因大豆最早来源于美国，1996年春，美国伊利诺伊西部许多农场主种植了一种大豆新品种，这种大豆是移植了矮牵牛的一种基因。这个新大豆品种可以抵抗杀草剂——草甘膦（毒滴混剂）。草甘膦会把普通大豆植株与杂草一起杀死。这是人类历史上第一次成功培育转基因大豆。 转基因大豆包括抗草胺膦转基因大豆，抗磺酰脲类除草剂转基因大豆，抗草甘膦转基因大豆等等。目前以抗草甘膦为目标而创制出的抗除草剂作物占绝对优势，其中尤以抗草甘膦大豆在世界范围内种植面积最广。 2转基因大豆的主要理论 2.1 转基因技术理论
分子生物学笔记第一章基因的结构 第一节基因和基因组 一、基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列. 一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控 序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene) ，外显子不连续。 二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划( human genome project, HGP ) 基因组学( genomics ),结构基因组学( structural genomics )和功能基因组学( functional genomics )。 蛋白质组( proteome )和蛋白质组学( proteomics ) 第二节真核生物基因组 一、真核生物基因组的特点：， ①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中. ②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2 —>% ), 三、基因家族(gene family) 一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因. 可能由某一共同祖先基因(ancestral gene) 经重复(duplication) 和突变产生。 基因家族的特点： ①基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因(tandemly repeated genes)，如 rRNA、tRNA和组蛋白的基因；②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；③有些成员不产生 有功能的基因产物，这种基因称为假基因(Pseudogene) . ￥ a1表示与a1相似的假基因. 四、超基因家族(Supergene family ，Superfamily) 由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同． 第四节细菌和病毒基因组 一、细菌基因组的特点。 1 ．功能相关的几个结构基因往往串联在—起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构，2．结构基因中没有内含子，也无重叠现象。 3 .细菌DNA大部分为编码序列。 二、病毒基因组的特点 1 .每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA ; 2 .病毒核酸大小差别很大，3X10 3 一3X106bp ; 3.除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。 4 .大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成. 5. 真核病毒基因有内含子，而噬菌体(感染细菌的病毒)基因中无内含子. 6. 有重叠基因. 第五节染色质和染色体 (二)组蛋白(histone): 一类小的带有丰富正电荷<富含Lys，Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力. (二).端粒(telomere) ：真核生物线状染色体分子末端的DNA 区域端粒DNA的特点： 1、由富含G的简单串联重复序列组成(长达数kb). 人的端粒DNA重复序列：TTAGGC。
分子生物学（molecular biology ）从分子水平研究作为生命活动主要物质基础的生物大分子结构与功能，从而阐明生命现象本质的科学。 重点研究下述领域： （1）蛋白质（包括酶）的结构和功能。 （2）核酸的结构和功能，包括遗传信息的传递。 （3）生物膜的结构和功能。 （4）生物调控的分子基础。 （5）生物进化。 分子生物学是第二次世界大战后，由生物化学,`遗传学,微生物学,病毒学,结构分析及高分子化学等不同研究领域结合而形成的一门交叉科学。目前分子生物学已发展成生命科学中的带头学科。 随着DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由RNA转录表达的以后，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。 如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA 重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。 这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 生物学的研究可以说长期以来都是科研的重点，惟其所涉及的方方面面与人类生活紧密相连。本世纪50年代以前的生物学研究，虽然有些已进入了微观领域，但总的来说，主要是研究生物个体组织、器官、细胞或是亚细胞这些东西之间的相互关系。50年代中期，随着沃森和克里克揭示出DNA分子的空间结构，生物学才真正开始了其揭开分子水平生命秘密的研究历程。到70年代，重组DNA技术的发展又给人们提供了研究DNA的强有力的手段，于是分子生物学就逐渐形成了。顾名思义，分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类；分子生物学以遗传学、生物化学、细胞生物学等学科为基础，从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究；分子生物学在理论和实践中的发展也为基因工程的出现和发展打下了良好的基础，因此可以说基因工程就是分子生物学的工程应用。现在基因工程所展现出的强大生命力和巨大的经济发展潜力完全得益于分子生物学的迅猛发展，而且有证据表明，基因工程的进一步发展仍然要依赖于分子生物学研究的发展。 分子生物学是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。自20世纪50年代以来，分子生物学一直是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系和蛋白质-脂质体系。 生物大分子，特别是蛋白质和核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。现代化学和物理
《分子生物学与基因工程》 结课论文 Real-Time PCR在分子生物学中的应用 姓名： 学号： 院系： 班级： 任课教师： 二零一二年十二月
Real-Time PCR在分子生物学中的应用 东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 摘要：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）可对特定基因进行扩增，因此被广泛应用于分子生物学领域中获取特定基因或基因片段。定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR（real-time quantitative PCR）。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，且与常规PCR相比，它具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点，目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，成为了分子生物学研究中的重要工具。 关键词：实时定量PCR；基因扩增；分子生物学 1971年Khorana等最早提出PCR理论：―DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA 基因‖。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana 等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR ，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序,最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。 自从PCR技术问世便很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统PCR技术在应用中一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出的实时荧光定量PCR技术，上述问题才得到较好的解决[1]。实时荧光定量PCR（real-time fluoro-genetic quantitative PCR，FQ-PCR）是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[2]。
列〃一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon) ②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron) ③5'-端和 3'-端非翻译区(UTR) ④调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断 裂基因(split-gene)，外显子不连续。二、基因组(genome) 一 特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小 用全部 DNA 的碱基对总数表示。 人基因组 3X1 09(30 亿 bp)，共编码约 10 万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部 DNA 量称为 C 值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划（human genome project, HGP）基因组学（genomics）,结构基因组学（structural genomics）和功能基因组学（functional genomics）。 蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics） 第二节真核生物基因组一、真核生物基因组的特 点：， ①真核基因组 DNA 在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中〃 ②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2—3％)， 二、真核基因组中 DNA 序列的分类 • (一)高度重复序列(重复次数>lO5) 卫星 DNA(Satellite DNA) (二)中度重复序列 1〃中度重复序列的特点
①重复单位序列相似，但不完全一样， ②散在分布于基因组中〃 ③序列的长度和拷贝数非常不均一， ④中度重复序列一般具有种属特异性，可作为 DNA 标记〃 ⑤中度重复序列可能是转座元件(返座子)， 2〃中度重复序列的分类 ①长散在重复序列(long interspersed repeated segments〃) LINES ②短散在重复序列(Short interspersed repeated segments) SINES SINES：长度<500bp，拷贝数>105〃如人 Alu 序列 LINEs：长
生物小论文：进化理论的确立 达尔文的进化论已经创立140余年了，在其诞生之初，是作为一种假说被提出来的。除达尔文本人从对一些植物，动物形态的观察得出的推论外，并没有什么化石证据。达尔文在《物种起源》书中论及化石时，标题为“不完美的地质记录”。他承认在当时的化石研究中并未有证据显示有物种间过渡类型的存在，并指出这可能是最易于检验而又具有杀伤力的反进化论的理由。他看到了进化论的先天缺陷，并希望后人能予以验证。但是时至今日，进化论已成为一个公理；一个信仰；甚至一个宗教。不能讨论，更不能批判，只能无条件接受，否则就将招致无情的围剿，甚至被贴上“伪科学”，“反科学”的标签而断送自己的研究前程。在当今任何一本生物学杂志上，已经找不到任何质疑进化论的论文了。SCOTT和COLE在八十年代初，检索了当时的4000多种学术刊物，未发现任何一篇反进化论的论文，在68种与生物起源有关的学术期刊中，也未发现任何一篇是质疑进化论的。GEORGE W. GILCHRIST在1997年调查了世界上最大的五种期刊数据索引，也未发现反进化论或非进化论的论文。进化论者自豪地宣称，进化论对神创论已取得了决定性的胜利。似乎进化论的合理性及不言自明性又得到了一次证明。事实真的如此吗？进化论已是绝对的真理了吗？其实不然，SCOTT和COLE的工作还发现，在1985年提交的135000篇论文中，确有18篇论文是反进化论的和非进化论的。而这18篇论文无一例外地遭到拒绝发表。进化论并非无懈可击，而是它的维护者不允许任何针对它的挑战。这更加给人一种印象：进化论并非确立于自身学说的科学性和完美程度，而是确立于众多崇拜者的信仰。进化论并非KARL POPPER意义上的“经验科学”(EMPIRICAL SCIENCE)，而是一个假说，信仰和并不完美的证据的杂合体。事实上，我们今天科学研究所发现的东西，已经足以让人们重新考虑进化论的正确性了。但这些事实要么被回避，要么被抹杀，人们在思维定式的驱使下，自觉或不自觉地成为盛行理论的卫道士，而丧失了独立思考的能力。这是不符合理性的科学精神的。一个真正的科学家，应正视旧理论的缺陷及其面临的挑战，并勇于摆脱束缚。只有这样，科学才能向前发展，人类才能向前推动。 一、达尔文主义自身的缺陷(一)比较解剖进化论者通过动物的器官在形态和功能方面的类比，定了所谓的同源器官，并由此说明在进化树中某一谱系的动物该器官在进化中发生的形态与功能的变化是自然选择的结果。首先，同源器官的定义就非常牵强，你必须首先承认动物是进化的，才能找到同源器官。因此这绝不能算做进化论中的一个证据，而只能是一个推论。即我们只能说因为进化论正确，所以进化树中某一谱系中的动物存在同源器官，而不能说同源器官的存在证明进化的存在。现代基因学和遗传学诞生后，对生物体形态与功能的关系在更本质的层次－－基因及分子水平有了崭新的认识。形态和功能只是表相，它们是由基因决定的，相同的形态可能对映于完全不同的基因。如果认为从鸟类的翅到哺乳动物的前肢是进化的话，那么它们的基因也应表现为对映于形态相同程度的进化。但实际上并非如此，如果现在仍有人试图从表面现象说明问题，只能被认为是肤浅的。(二)古生物学1. 凌乱的化石证据无论是进化论者还是反进化论者，都希望古生物化石能辅证自己的观点。如果说达尔文时代缺少化石记录的话，那么到今天为止，人类已收集了数以万吨记的化石，是否已证明进化论的正确了呢？事实上依然不能。CHICAGO的FIELD MUSEUM OF NATRURAL HISTORY的古生物学家RAUP本是进化论者，但后来不得不放弃自然选择学说，而支持幸运者生存说。他说该馆拥有现有已知化石物种的近五分之一，可是已经确证的中间过渡类型的化石比达尔文时代还少。现有化石记录混乱不堪，人为按进化论组成的谱系漏洞百出，根本不能说明问题。进化论者们所使用的分类方法及标准又不同，因此对某一化石的断代也经常争论不休，得不到一个统一的结论。进化论者常用的一个较为完备的进化
分子生物学课程论文 基因治疗与基因诊断的研究与发展 邓小红临床医学08级3班200805090346 摘要：基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于分子生物学的理论及技术方法，特别是重组DNA技术的迅速发展，使人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。因此在20世纪70年代末诞生了基因诊断(gene diagnosis)；随后于1990年美国实施了第一个基因治疗(gene therapy)的临床试验方案。可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和技术与医学相结合的范例。 关键词：基因治疗基因诊断重组DNA 英文题目：Molecular biology course in dissertation Molecular biology curriculum paper gene treatment and gene diagnosis research and developmen t Deng Xiaohong clinical medicine 08 levels of 3 classes 200805090346 Summary: gene-diagnosing and gene therapy in the relatively short time from theoretical ideas into reality, mainly due to the molecular biology of theory and techniques, in particular the recombinant DNA technology is developing rapidly, so that people can build a variety of carriers in the laboratory, cloning and analysis of target genes. The disease can drill down to the molecular level research and has made significant progress. Thus, in the late 1970s was born gene diagnosis (gene diagnosis); subsequently, in 1990, United States implemented the first gene therapy (gene therapy) clinical trials programme. V isible, genetic diagnosis and gene therapy is a modern molecular biology of theory and technology combined with the medicine. Keywords: gene therapy gene-diagnosing recombinant DNA 1．引言 20世纪后半叶以来，由于分子生物学的崛起，人们进入了合成代谢与代谢调节的研究。这一阶段，细胞内两类重要的生物大分子---蛋白质与核酸，成为研究焦点。20世纪50年代初期发现了蛋白质的α螺旋的二级结构形式；更具里程碑意义的是1953年提出的DNA双螺旋结构模型，为揭示遗传信息传递规律奠定了基础，是生物化学发展进入分子生物学时期的重要标志。 20世纪70年代，重组DNA技术的建立不仅促进了对基因表达调控机制的研究，使基因操作无所不能，而且使人们主动改造生物体成为可能。基因诊断和基因治疗也是重组DNA技术在医学领域应用的重要方面。 随着对各种疑难疾病的深入研究，和分子生物学日新月异的发展，传统的诊断治疗手段无法解决的一些重要问题。通过对生物体在分子水平上的研究，基因诊断与治疗的作用逐渐显露出来，尤其是许多遗传疾病。