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过滤式微流控芯片上的循环肿瘤细胞分选

过滤式微流控芯片上的循环肿瘤细胞分选
过滤式微流控芯片上的循环肿瘤细胞分选

过滤式微流控芯片上的循环肿瘤细胞分选

刘大渔1,2★ 严伟1 张琼1 马薇2 梁广铁1 Yi-Kuen Lee 2

[摘 要] 目的 本研究加工了一种封接有多孔聚碳酸酯薄膜的过滤式微流控芯片用于循环肿瘤细胞分选。 方法 依据肿瘤细胞与血细胞在粒径和变形能力方面的差别,这种微过滤式芯片可以选择性截留肿瘤细胞。循环肿瘤细胞分析整个过程,包括细胞过滤、固定、标记和计数,均在芯片上完成。使用8 μm 孔径滤膜,可以选择性截留Hela 细胞。以Hela 细胞为模型,实验优化了肿瘤细胞的分选条件并考查了分选效果。 结果 在500 μL/min 流速下,Hela 细胞的回收率可以达到85%, 而血细胞残留可以控制在3000个以下。截留细胞使用微小染色体维持蛋白7 抗体标记,可以有效辨别肿瘤细胞与血细胞。 结论 基于过滤式微流控芯片上的循环肿瘤细胞分选方法简单、快速、廉价,有望成为一种实用的循环肿瘤细胞检测技术。

[关键词] 循环肿瘤细胞;微流控芯片;多孔薄膜;过滤

A microfilter device for circulating tumor cell enrichment from blood

LIU Dayu 1,2★, YAN Wei 1, ZHANG Qiong 1, MA Wei 2, LIANG Guangtie 1, Yi-Kuen LEE 2

(https://www.doczj.com/doc/264418664.html,boratory of Clinical Chemical Technology, Guangzhou First Municipal People's Hospital Affiliated to Guangzhou Medical College, Guangdong, Guangzhou 510180, China; 2.Department of Mechanical Engineering, the HongKong University of Science & Technology, Clear Water Bay, Kowloon, HongKong.)

[ABSTRACT] Objecti v e We fabricated a micro ?uidic device with embedded porous ?lm for circulating tumor cell (CTC) enrichment from blood. Methods The micro ?lter can separate tumor cells from whole blood on the basis of differences in the size and deformability between tumor and hematologic cells. All the steps related to CTC analysis, including cell ?ltration, ?xation, labeling and enumeration, were integrated on the same device. Our results demonstrated that Hela cells can speci ?cally trapped on the porous ?lm with 8 μm pore-size. Using Hela cell as a model, operation conditions of the micro ?lter assay were optimized. Results At 500 μL/min ?ow rate, the capturing ef ?ciency of Hela cell was 85% and the number of unspeci ?c trapped hematologic cells can be limited to ~3000 per test. Conclusions Using minichromosome maintenance protein 7 as the CTC characterization marker, the trapped Hela cells can be distinguished from the background blood cells. The micro ?lter-based CTC detection assay proposed here is simple, fast and low-cost, thus hold the potential to be developed into a practical CTC detection tool.

[KEY WORDS] Circulating tumor cell, Micro ?uidic chip, Porous ?lm, Filtration

基金项目:国家自然科学基金(No.81171418);国家国际科技合作项目(No.2010DFB33880);广州市医药 卫生科技项目(Nos.201102A213046,20121A021002)作者单位:1. 广州医学院附属市一人民医院检验科研究室,广东,广州510180 2.香港科技大学机械工程系,香港,九龙清水湾★

通讯作者:刘大渔,E-mail: ruark@https://www.doczj.com/doc/264418664.html,

循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC )是指脱离原发位置进入循环血中的肿瘤细胞[1]。近期大量研究证实,CTC 可以在肿瘤发生早期出现,是造成肿瘤转移的原因。CTC 的检测不仅有助于病情监测

和预后转归判定,还有可能成为肿瘤早期诊断的手段。由于CTC 数量稀少且混杂在大量血细胞中,其检测极具难度[2]。对于CTC 分析,

需要考虑到多个因素,如:回收效率、分选细胞纯度、分析时间、细胞活

?论 著?

性的维持以及测试成本等。目前已有的商品化CTC 检测装置,如CellSearch[3],不仅分析时间长,操作繁琐且运行成本高,这些问题限制了其推广。与这种大型设备相比,基于微流控装置CTC分选装置具有分析速度快、分选效率高以及功能集成的优势[4~6]。前期报导的微流控CTC分析装置大多使用免疫亲和分选方法[5, 7, 8],即用抗体识别肿瘤细胞表面特异性标志(如EpCAM)实现肿瘤细胞的分选。这类方法的不足之处包括:1.由于抗体价格昂贵导致分析成本高;

2.适用对象有限,比如对于非上皮来源或者发生上皮间质转化的EpCAM(-)肿瘤细胞无效;

3.分选时为保证抗原-抗体的有效结合,需要使用较低流速,因而限制了分析通量。

由于肿瘤细胞在粒径和变形能力方面与血细胞存在差别,可以使用过滤方法将二者加以分离。例如,目前已经商品化的ISET[9]和ScreenCell[10]方法,就是采用这种分离技术,其优势是无需使用抗体,分选时可以使用较高流速因而分析速度较快。目前,过滤式CTC分选方法的不足之处在于其分析包含多个离线操作步骤,不仅繁琐而且会造成细胞的损失。例如,Tao M等[11]报导使用ISET方法分选乳腺癌细胞,获得的回收效率只有13%。针对上述问题,本工作报导了一种基于过滤式微流控芯片的循环肿瘤细胞分选方法。实验加工了一种封接有8 μm孔径滤膜的多层复合式微流控芯片,用于选择性截留肿瘤细胞。利用这种微过滤方法,CTC分析整个过程,包括细胞富集、标记、检测和计数,均在芯片上完成。实验结果显示,这种微流控芯片对于肿瘤细胞具有较好的分选效果。该芯片制作简单、成本低廉,并具有操作简便和分析快速的优势,因而有望走向实际应用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

细胞呈像使用倒置荧光显微镜(IX71, Olympus)。微量注射泵(TS-2A)购自保定兰格。聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)前体及引发剂购自美国Dow Corning公司。3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane, APTES)、多聚甲醛和Triton X100购自美国Sigma公司。聚碳酸酯(Polycarbonate,PC)薄膜购自英国Whatman公司。吖啶橙(Acridine orange, AO)和溴化乙锭(Ethidium bromide, EB)购自美国Amresco公司。荧光染料DAPI, CellTracker Green和CellTracker Red购自Life Technologies。微小染色体维持蛋白抗体anti-MCM7和Cy3标记二抗购自Abcam。

1.2 芯片加工

微流控芯片包含3层结构:顶层和底层为PDMS 层,中层为PC滤膜(孔径8 μm)。芯片具有12个辐射排列状的过滤单元,包含进样通道、引流通道以及过滤池(6 mm×4 mm)。PDMS层使用标准软刻蚀方法加工,剥离后在入口和出口处打孔。按照文献[12]报导方法,将PDMS层等离子处理后与APTES处理的多孔PC膜封接,得到完整结构芯片。

1.3 样品

实验选用子宫颈癌(Hela)细胞进行芯片测试。Hela细胞收获后配置成细胞悬液并计数。取不同数量细胞(50, 100, 200和400),加入2.5 mL PBS溶液或健康人血液稀释液(PBS 1:1稀释)中混匀后用于实验。实验中,Hela细胞使用CellTracker Green荧光染料标记,血细胞使用CellTracker Red标记。

1.4 细胞过滤与标记

芯片入口和出口端插入聚四氟乙烯毛细管,入口端毛细管插入含有样品的试管,出口端毛细管则与微量注射泵连接。设定微量注射泵参数,将含有Hela细胞的溶液以不同流速引入芯片,样品耗尽后再用2 mL PBS冲洗。截留细胞标记,方法是首先使用含4%多聚甲醛的PBS在100 μL/min流速下冲洗滤膜2 min,完成细胞固定,继而用含0.1% Triton X100

图1 过滤式CTC分选芯片

Figure 1 The micro?lter device for circulating tumor cell enrichment a.芯片实物图。芯片包含辐射状分布的12个过滤单元,外缘是入口,中央为出口,分别与过滤池连接。图中标尺长度1 cm;b.过滤单元结构示意图,芯片顶层和底层为包含流路结构的PDMS层,中间层为多孔PC滤膜。微通道高度为100 μm,宽度 250 μm 。1.入口;2.过滤池;3.出口。a. The microchip contains 12 ?ltration units arranged in radiation, each with an inlet at the outer edge and an outlet at the center. Scale bar: 1 cm; b. Schematic representation of the ?ltration units. The micro?lter contains a layer of porous polycarbonate ?lm sandwiched between a top and a bottom PDMS layer with patterned microchannels. Size of the microchannel is 100μm in height and 250μm in width. 1. Inlet; 2. Filtration chamber; 3.Outlet.

的PBS冲洗滤膜2 min进行细胞透膜。之后是一抗(anti-MCM7,鼠抗人)冲洗10 min,2 mL PBS洗涤和二抗(Cy3标记,羊抗鼠)冲洗10 min,2 mL PBS洗涤。

1.5 实验结果判定

完成细胞标记之后,将芯片置于荧光显微镜上观察并拍照。细胞计数使用Image J 软件的Cell Counter程序。分析含有Hela细胞的血液标本时,肿瘤细胞的鉴定标准为:(1)MCM7阳性;(2)细胞直径大于5 μm。

2 结果

2.1 过滤式微流控芯片对Hela细胞的选择性回收

实验使用微过滤芯片分别处理了2 mL Hela (104 细胞/mL)细胞悬液和全血稀释液。显微镜下测定Hela细胞粒径范围是16~25 μm,明显大于红细胞(平均直径6 μm)和白细胞(平均直径10 μm)。在500 μL/min流速下过滤上述样品,实验结果显示绝大部分Hela细胞被截留在滤膜上(图2左),而血细胞残留数量非常有限(图2右)。

2.2 流速对于细胞分选的影响

实验考察了流速对于肿瘤细胞回收效率的影响,图3显示降低流速有利于提高肿瘤细胞回收效率,在100 μL/min流速下细胞回收率最高,可以达到91%。由于肿瘤细胞大小不一,以及实验中不可避免的管壁残留等因素,CTC回收率难以达到100%。当流速增高至1000 μL/min时回收率仅有55%,因为高流速条件下部分肿瘤细胞可以被压挤穿过滤孔。

除回收率外,流速同样影响肿瘤细胞的回收纯度。实验使用CellTracker Green标记Hela细胞,CellTracker Red标记血细胞,二者混合后进行过滤。荧光显微镜下观察芯片滤膜上捕获的细胞。观察发现,低于500 μL/min流速下,较多血细胞会沉降在滤膜上,显著影响回收肿瘤细胞的纯度。当流速提高至500 μL/min或以上,滤膜上血细胞残留总量下降到3000个左右(图4)。我们选择了500 μL/min的流速。在此条件下,处理2 mL样品仅需要4分钟,而Hela 细胞的回收率可以达到80%。

2.3 肿瘤细胞的鉴定

为证实微小染色体维持蛋白(Minichromosome maintenance proteins, MCMs)作为CTC鉴定标记物的可行性,实验测试了36例非肿瘤患者血中白细胞的MCM7表达,均为阴性,而在Hela细胞表达接近100%阳性。分析混有肿瘤细胞的血液样品时,可见MCM7(+)的Hela细胞和MCM7(-)的血细胞,二者非常容易区分(图5)。

3 讨论

因为肿瘤细胞在粒径和变形能力方面与血细胞存在不同[13],

因而有可能使用过滤将其与血细胞加

图2 Hela细胞悬液(左)和全血稀释液(右)过滤后细胞截

留情况

Figure 2 Hela cell suspension (left) and blood dilution (right)

were ?ltered using the micro?lter device

Hela细胞使用CellTracker Green染色(绿色),血细胞使用CellTracker Red染色(红色)。图片使用10倍物镜拍摄,图中标尺均为50 μm。Hela cells were stained with CellTracker Green, while blood cells were stained with CellTracker Red. The photos were taken using 10× objective lens. Scale bar: 50 μm.

图3 流速对于细胞回收效率和血细胞残留数量的影响Figure 3 Effects of ?ow rate on cell recovery and number of blood cells unspeci?c trapped on the ?lter

图4 使用微过滤芯片处理混有Hela细胞的血液结果Figure 4 Filtration of blood sample with spiked Hela cells using

the micro?lter device

Hela细胞使用CellTracker Green标记,血细胞使用CellTracker Red标记。使用物镜放大倍数为10,图中标尺长度为50 μm

Hela cells were stained with CellTracker Green, while blood cells were stained with CellTracker Red. Objective lens:10×

. Scale bar: 50 μm.

以分离,这是使用过滤方法分选肿瘤细胞的依据。实验结果表明8 μm 孔径滤膜对于Hela 细胞具有选择性截留作用。流速控制对于基于过滤的细胞分选效果至关重要,高流速能够缩短过滤时间,但过高的跨膜压力也会挤压肿瘤细胞通过滤孔从而影响肿瘤细胞回收率,而流速过低又会造成分选特异性的降低。由于肿瘤细胞粒径大小不一、滤孔尺寸的偏差以及实验中不可避免的管壁残留等因素,CTC 回收率难以达到100%。我们的结果显示,随着流速增加Hela 细胞回收率有所下降而血细胞的残留量则有所增加。综合考虑当流速增高至1000 μL/min 时回收率仅有55%,因为高流速条件下部分肿瘤细胞可以被压挤穿过滤孔。综合考虑细胞回收效率、纯度以及操作时间,我们选择了500 μL/min 的流速。比较富集前后血细胞数量,估算肿瘤细胞的富集效率超过105倍以上。

使用过滤方法分选循环肿瘤细胞时,不可避免地出现非特异性血细胞残留。因此,有必要采用一种标记方法区分肿瘤细胞和血细胞。先前实验多使用

细胞角蛋白(cytokeratin, CK )结合CD 45作为肿瘤细胞识别标记。但是,一些文献指出,CK 标记仅能辨别细胞是否为上皮来源,而不能作为恶性标记。此外,由于CTC 普遍存在上皮-间质转化,上皮标记表达在这些细胞下调甚至缺失。因此,CK 并非理想的肿瘤标记物[9]。本研究尝试使用MCMs 进行肿瘤细胞识别。MCMs 在DNA 复制起始和延伸过程中起DNA 解旋酶作用,因而是DNA 复制的标志。MCMs 已经被证明在肿瘤细胞中普遍表达而在成熟细胞中

没有表达[14]。我们的实验结果在非肿瘤患者血中白细胞的MCM7表达均为阴性,而在Hela 细胞表达接近100%阳性。对于滤膜截留细胞, MCM7标记可以有效区分肿瘤细胞与非肿瘤细胞,因而有潜力用作CTC 鉴定标记。

目前用于CTC 分离的微流控方法主要包括免疫捕获、磁免疫捕获以及过滤法[2, 4]。由于CTC 数量稀少因而所需样品体积较大,

因此免疫和磁免疫捕获法均存在试剂消耗大和分析通量有限的问题。此外,为保证抗原-抗体的有效结合,基于免疫分选的方法不能使用高流速,因此造成分析时间较长。为解决该问题,先前的研究报导了一系列基于微加工工艺的CTC 过滤芯片,其材质包括Paralin [9, 15, 16]、硅[17]和镍[18]等。这些微过滤装置具有阵列化排列的滤孔,不仅避免了因滤孔交错造成的滤孔尺寸偏差,而且阵列化排列的捕获细胞也便于细胞识别和计数。当然,过滤法也存在不足之处,例如其不适用于小粒径肿瘤细胞,并且分选细胞纯度有限。我们的进一步实验将使用批量临床实际样品,测试该芯片装置用于CTC 分析的可行性。先前报导的过滤芯片的另一缺点是加工工艺复杂且造价高。相比之下,本研究发展的基于多孔滤膜的过滤式微流控芯片结构简单、制作容易、测试通量高且分析成本低。我们的初步结果显示这种微流控芯片有能力从大量血细胞中分选微量CTC 。

亲和分选过滤分选

分选原理依据肿瘤细胞表面特异性标记,使用相应配体捕获细胞依据肿瘤细胞与血细胞在粒径和变形能

力方面的差别

分选特异性

较高,会有少量血细胞(<1000)残留较低,有较多血细胞(>3000)残留

分选速度较慢,一般1~3 h 较快,一般10 min 以内影响因素受细胞表面标志表达水平影响受细胞粒径影响测试成本

需要使用分选配体,成本较高无需使用分选配体,成本较低

表 使用亲和与过滤方法分选循环肿瘤细胞的比较

Table Comparison of af ?nity-based and ?

ltration-based methods for the isolation of CTCs

图5 显微镜下观察芯片滤膜上的肿瘤细胞捕获

Figure 5 Characterization of Hela cells trapped on the micro ?lter

a. 明场观察图;

b.CellTracker Green 染色(绿);

c. MCM7染色(红);

d. a~c 合并图。使用物镜放大倍数为10,图中标尺长度为50 μm

a. Photo taken in bright filed;

b. Cells labeled with CellTracker Green;

c. Cells labeled with MCM7 (red);

d. a composite picture of b and c. Objective lens:10×. Scale bar: 50 μm.

4 结论

本研究加工了一种封接有多孔聚碳酸酯薄膜的微流控芯片用于过滤式循环肿瘤细胞分选。实验结果显示该芯片可以选择性截留Hela细胞,实现肿瘤细胞的高效富集。通过优化流速,过滤式肿瘤细胞分选可以达到较为理想的回收率和回收纯度。截留细胞使用微小染色体维持蛋白7 抗体标记,可以有效辨别肿瘤细胞与血细胞。这种过滤式微流控芯片加工简单,成本低廉并能实现肿瘤细胞的高效快速分选,因而有望成为一种实用的CTC检测技术。我们计划在后期工作中利用这种微过滤芯片批量分析肿瘤病人血液样品,考察其实际应用价值。

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循环肿瘤细胞研究进展任文君

循环肿瘤细胞研究进展 任文君,孙国平 (安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科,安徽合肥230022) 摘要:循环肿瘤细胞(CTCs)存在于患者外周血中,是造成肿瘤转移和复发的主要原因。外周血中的CTC是非常罕见的,要求检测方法具有高敏感性及高特异性,成为临床常规检测的巨大挑战,但是检测CTC在协助诊断、早期发现肿瘤的微转移、指导个体化治疗、评价治疗效果及预后方面上具有重要的临床意义。该文将对其检测方法及临床应用进行探讨。 关键词:循环肿瘤细胞;检测;治疗 Ashworth曾在1986年首次发现并提出循环肿瘤细胞(CTCs)的概念[1]。CTC定义为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞[2]。肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程,肿瘤细胞由原发灶脱落,侵入循环系统,大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡,只有极少数存活下来,在远隔脏器或原发脏器中定居,发展为转移灶[3-4]。有些播散的肿瘤细胞和微小转移灶在切除原发灶后可以保持休眠状态并在若干年后形成转移灶[5]。因此,在外周血中检测到CTC提示可能有早期转移存在,尤其是临床尚未发现的微转移病灶。 CTC的检测包括以下2个步骤:(1)富集,方法包括形态学或免疫学为基础的技术。(2)检测,方法包括细胞计数和核酸检测技术。因为CTC在外周血中是非常罕见的(1个CTC/106 107个单核细胞),富集细胞可提高检测的敏感性,富集之后则通过细胞计数或核酸检测技术利用肿瘤特异性标志物对CTC进行检测及分析。 1富集 1.1以形态学为基础的富集膜滤过分离肿瘤细胞技术(ISET)通过肿瘤细胞体积大小进行富集[6],就像一个微孔过滤器根据CTC的大小差异使其分离,其隔离灵敏度阈值接近每毫升全血一个癌细胞[7],其优势在于不破坏CTC的形态,利于后续对单个CTC进行形态学、免疫细胞学及遗传学特征的研究,但只适合部分肿瘤,不适合那些体积小于2倍粒细胞大小的肿瘤细胞。 基于密度梯度分离,单核细胞较其他血液成分密度低,因此可依据密度梯度差异将肿瘤细胞和单核细胞从其他血液细胞中分离出来,如Ficoll-Hypaque和Oncoquick。与传统的Ficoll 通信作者:孙国平,男,主任医师,博士生导师,研究方向:消化系统肿瘤,E-mail:sunguoping@anhmu.edu.cn 程序相比较,Oncoquick增加了多孔屏障,使得分离出的细胞更加纯化,检出率更高[8]。 由于这两种富集方法是借助细胞的物理特性,因此缺乏特异性,易导致缺乏相应体积大小及密度梯度的肿瘤细胞的丢失,同时所富集的细胞不仅含有肿瘤细胞,还存在不同种类的其他细胞(特别是单核细胞),在后续检测过程中可能会因为肿瘤细胞的异质性和基因标志物的非特异性,造成假阳性结果。 1.2以免疫学为基础的富集免疫磁性分离技术(IMS),基于特异性免疫识别原理的富集技术,是目前应用最广泛的方法,通过特异性抗体包被的磁珠与细胞表面抗原特异性结合,形成细胞抗原-抗体-磁珠免疫复合物,在外加磁场作用下,将CTC从血细胞中分离出来。免疫磁性分离方式有2种:阳性分选和阴性分选。阳性筛选获得目的细胞,阴性筛选去除无关细胞使目的细胞得以纯化,也可将两种模式结合,提高富集效率。这项技术最大的优势在于可保证分离靶细胞的形态和功能的完整,有利于下一步CTC的计数、免疫细胞化学、PCR 等检测。目前,免疫磁珠可达纳米级,结合时间短,灵敏度高10-7 10-6。 CellSearch系统是目前FDA唯一批准用于临床富集及检测分析的技术,是一种半自动技术,集合了免疫磁分选技术和免疫细胞化学法的分离检测技术。涂有抗EpCAM抗体的磁珠与靶细胞结合,在外加磁场作用下被保留下来,接着采用荧光标记(CK8/18/19,DAPI,CD45)来区别CTC与血细胞,CTC 标记为CK8/18/19、DAPI(+),CD45(-),随后采用半自动荧光显微镜Cell-Spotter Analyzer检测分析细胞大小和形态,最终确定CTC,只需要7.5mL血液样本,即可从400多亿血细胞中检测到一个CTC。这种半自动系统能快速分析样本,并有良好的重复性。一个多中心研究,有学者提出Cell Search系统有82%的高富集率,且在乳腺癌CTC检测上有极 [34]Ikeda T.Stem cells and neonatal brain injury[J].Cell Tissue Res,2008,331(1):263-269. [35]尹国才,张长征,张淼涛,等.人胎脑神经干细胞在年幼大鼠脑内的成神经元分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(12):2281-2284. [36]Toda H,Takahashi J,Iwakami N,et al.Grafting neural stem cells improved the impaired spatial recognition in ischemic rats[J].Neu- rosci Lett,2001,316(1):9-12. [37]吴芳,杨佳勇,张敏,等.脐血间充质干细胞移植对脑性瘫 痪儿童神经系统功能的影响:20例分析[J].中国组织工程研究 与临床康复,2008,12(16):3198-3200. [38]张敏,杨万章,吴芳,等.神经生长因子配合脐血源神经干细胞移植对脑瘫患儿运动功能的影响[J].中国误诊学杂志,2008,8(23):5596-5597. [39]杨万章,吴芳,张敏,等.脐血源神经干细胞移植治疗神经系统疾病临床总结和分析[J].中西医结合心脑血管病杂志,2009,7(3):287-290. (收稿日期:2012-05-25,修回日期:2012-10-26) · 9 · 安徽医药Anhui Medical and Pharmaceutical Journal2013Jan;17(1)

人外周血循环肿瘤细胞检测试剂盒使用说明书

人外周血循环肿瘤细胞检测试剂盒使用说明书 (免疫磁捕获、免疫细胞化学鉴定) 简介: 本试剂盒利用免疫磁球捕获肿瘤病人全血中极少量的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC),并通过免疫细胞化学鉴定所捕获的细胞,从而实现对CTC的灵敏检测。其中免疫磁球表面修饰有抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体。免疫细胞化学鉴定是通过异硫氰酸荧光素标记的细胞角蛋白抗体(FITC-anti-CK19)、Alexa Fluor594标记的抗白细胞共同抗原抗体(AF594-anti-CD45)和DAPI对细胞进行免疫荧光染色,DAPI染色阳性,CK19表达阳性,CD45表达阴性(DAPI+/CK19+/CD45-)的细胞被鉴定为CTC。本试剂盒对目标细胞的捕获效率高达90%,简便快速、特异性强、非常可靠,可以在3小时内完成对全血中CTC的检测。 试剂盒所含试剂:(10人份/盒) 试剂标号组分用途状态规格配制 试剂A牛血清白蛋白封闭固体粉末 试剂B免疫磁球磁捕获悬液200μL即用型试剂C4%多聚甲醛固定细胞液体5mL即用型试剂D1%Triton X-100通透细胞液体5mL即用型试剂E DAPI细胞染色液体50μL即用型试剂F FITC-anti-CK19细胞染色液体20μL即用型试剂G AF594-anti-CD45细胞染色液体50μL即用型试剂H1×PBS洗涤液体25mL即用型*保存条件:4-8℃ 用户自备试剂和材料: 1.试剂L:通透封闭液 于0.05g试剂A中加入0.5mL试剂D溶解待用,或按照此用量比配置所需用量的通透封闭液,标为“试剂L”。

2.试剂M:染色液 于0.01g试剂A中加入190μL试剂H溶解后,向其中加5μL的试剂E,2μL 的试剂F,5μL试剂G,或按照此用量比配置所需用量的染色液,标为“试剂M”,4℃避光保存待用。 4.磁力架(推荐Dynal公司123-20D) 5.移液器(吉尔森)、涡旋仪、超声波清洗器、进口耗材(离心管、枪头等)、恒温水浴摇床、荧光倒置显微镜等。 6.96孔板或PDMS小槽 检测步骤: 1.捕获 抽取约1.5mL病人血液于EDTA抗凝真空采血管中,将全血样品转移到2 mL的离心管内,加入20μL试剂B(试剂B预先用超声仪超声分散均匀),手摇或涡旋分散均匀后,置于恒温摇床上,150rpm,37℃下孵育30min。 2.细胞固定 将步骤1中的样品置于磁力架上,吸引约5min,用移液器延外侧轻轻吸出清液,再用400μL的试剂C重悬样品,室温放置10min。 3.细胞通透封闭 将步骤2中的样品于磁力架上,吸引约3min,用移液器去掉清液,再取400μL的试剂L重悬样品,室温放置20min。 4.细胞染色 将步骤3中的样品置于磁力架上,吸引约3min,用移液器去掉清液,再取200μL的试剂M重悬样品,37℃避光孵育30min。待孵育结束后,将样品置于磁力架上,吸引约3min,用移液器去掉清液;再用200μL的试剂H重悬,再磁吸引,去掉清液,用试剂H重复洗涤3次,最后用100μL的试剂H分散样品。 5.检测 将步骤4得到的样品转移到96孔板底部或者PDMS小槽内,磁富集到底部后用倒置荧光显微镜观察。 三通道同时观察并用CCD采集图片,其中DAPI+/CK19+/CD45-的细胞即为CTC。

关于循环肿瘤细胞(CTC)的一些认识

关于循环肿瘤细胞(CTC)的一些认识 摘要:通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell)。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入,尤其是伴随现代检测技术的广泛应用,CTC逐渐被人们所重视。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断,化疗药物的快速评估,个体化治疗包括临川筛药、耐药性的检测,肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。检测CTC 有着良好的应用前景,随着这一研究领域的不断发展,必将产生新的诊疗手段,从而使肿瘤的治疗提高到一个崭新的阶段。 关键词:循环肿瘤细胞;CTC;检测方法;临床意义 早在1896年,Ashworth曾报道1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞,并首次提出循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)的概念[1]。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入,尤其是伴随现代检测技术的广泛应用,CTC逐渐被人们所重视。 1、概述 CTC指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿瘤细胞的不断增殖,部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质,增加其运动能力并使之与肿瘤母体脱离。这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶,以破坏周边宿主结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。 2、检测方法 2.1免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC) 这一检测方法基于抗原抗体结合反应的原理,利用单克隆抗体(McAb)与特异的肿瘤标记物结合,并通过酶与底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。检测的肿瘤标志物主要分三类:①上皮细胞角蛋白(CK),如CK19;②上皮细胞膜特异性抗原,如黏蛋白类,包括EMA、HMFG、HEA125等;③肿瘤相关糖蛋白(TAG),如TAG12。1980年,Sloane等首次 采用ICC的方法检测乳腺癌患者骨髓中的肿瘤细胞。该方法可以进行形态学分析,但是检 测的细胞量少,敏感性只有10-4~10-5(即在1万~10万个单核细胞中发现一个肿瘤细胞),而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原,而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性,故特异性不高。Braun等[2]认为由于CTC不表达白细胞共同抗原CD45,采用CD45-/CK+双标技术可以提高ICC检测的特异性。 2.2多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR) 该方法的原理是特异性扩增出肿瘤细胞中因癌基因、抑癌基因突变或染色体重排而产生 的DNA异常。这类基因的改变应满足以下条件:①该基因的突变在待检肿瘤中发生率较高,至少应达50%左右;②基因内发生碱基突变的部位应相对集中,如果过分分散,目前临床 应用有困难。这一方法检测肿瘤细胞的敏感性约1×10-6左右,比Southern印迹杂交法约提高10 000倍。应用PCR技术检测CTC受到缺乏肿瘤特异性和高表达标记的限制,该方法敏感度高,易出现假阳性,同时由于癌细胞的异质性亦可出现假阴性。目前多应用突变等位基因扩增(mutant allelie specific amplification, MASA)的PCR技术,检测大肠癌和胰 腺癌患者外周血中具有K-ras癌基因突变的肿瘤细胞。 2.3逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

循环肿瘤细胞(CTC)检测

循环肿瘤细胞(CTC)检测 一、什么是循环肿瘤细胞(CTC)? 循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称,因自发或诊疗操作从实体瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落,进入外周血循环的肿瘤细胞。 CTC非常稀少,每毫升血液中109血细胞只有几个CTC。大部分CTC在进入外周血后会发生凋亡或被吞噬,少数能够逃逸并发展成为转移灶,增加恶性肿瘤患者的死亡风险。 二、肿瘤的发生及检测诊断 全国肿瘤登记中心发布的2015年年报显示,2011年我国新增癌症病例约337万例,比2010年增加28万例——这相当于每分钟有6人被诊断为癌症。然而,令人担忧的是这样的情势似乎仍未到达峰顶,未来可能还会不断增加。 美国约翰-霍普金斯大学Kinmel 癌症中心的Bert-Vogelstein 等专家在2013年3月份的一篇综述文章中写道:在今年将死于癌症的一百万人里,绝大部分是因为他们的癌症没有在发生、发展的前90%的时间内被发现。因此,我们需要明确一点:癌症是一种慢性病,它只是被突然发现,并非是突然发生的。我们需要尽可能早的发现它,从而提高治愈率。 伴随肿瘤的发生过程,肿瘤细胞的大小也随之增大。传统方法诊断出癌症的时候,大部分已经是晚期。晚期癌症的治愈率极低,其五年生存率也很低。在肿瘤的发生过程中,早期到中期之间是最佳治疗期,因此,如果在早期就可以发现肿瘤的存在,必然可以提高治愈率。临床癌症研究(Clinical Cancer Research)杂志上发表的荟萃分析(Meta-analysis)证实CTC

在乳腺癌预测中的价值,结果表明早期和转移性乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC检测是一个稳定的预测和预后工具。 如果将肿瘤易感性基因检测和循环肿瘤细胞检测完美结合,那么能够将肿瘤的早期发现率提高数倍。肿瘤易感性检测是对未来可能患有癌症的一种风险预测。如果风险等级高,除了改变生活方式外,还可以定期做循环肿瘤细胞检测,即CTC检测,而且检查频率可以适当增加,每2-3个月检查一次,从而达到实时监控的目的。 三、CTC 检测临床意义有哪些? CTC 检查的临床意义主要表现在体外早期诊断,血液中肿瘤在1mm时,即可检出CTC,抓住最佳治疗期;另外还可以进行预后判断,根据治疗前后CTC个数判断预后与存活时间,制定最佳治疗方案;此外,还有肿瘤复发检测、耐药性检测、化疗药物的疗效评价以及新药的研发等。 四、哪些人需要做CTC检测? 1. 普通健康人:通过检查血液中是否存在循环肿瘤细胞来早期检测肿瘤的发生,建议每年检测一次,以期在肿瘤萌芽阶段就能检测到,从而保证早期治愈率。 2. 肿瘤易感人群:有癌症家族史人群,患有HPV阳性、慢性肝炎、慢性胃炎、慢性肠炎等人群,长期吸烟者,经常接触有毒有害物质者,生活压力大、精神高度紧张的亚健康人群,以及基因检测肿瘤易感性风险等级高者,建议每3个月或者半年检测一次。 3. 癌症患者:已经确诊的癌症患者,通过CTC计数,用于预后判断、疗效评价、复发检测等;通过CTC单细胞基因组分析,选择精准治疗方案,实现真正的液体活检。

cellsearch循环肿瘤细胞ctc)试剂盒说明书自译中文版

7900001 16人份试剂盒 Cell Search 循环肿瘤细胞检测试剂盒 (上皮细胞) IVD 使用须知 本试剂盒仅用于体外诊断 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞(CTC)的计数,这些细胞来源于上皮细胞,即表现为CD45阴性(CD45-),EpCAM阳性(EpCAM+),细胞角蛋白8,18阳性(CK8,18+)和(或者)CK19阳性(CK19+)的细胞。 用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的CTC,存在于外周血中,这类细胞与乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌*转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此,CTC可以用来监控乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。CTC应该进行持续检测,并与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段,对CTC数量进行评估,可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。 *在该研究中,转移性前列腺癌患者定义为血清标志物PSA在标准激素基准上,高于参考水平具有两次连续增加。这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性,激素抗性,或去势抗性的前列腺癌。 摘要说明 肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后,这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的远端定植生长的情况。血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞,而这

类细胞在血液循环系统中是极罕见的。基于此,本公司推出的细胞自动化捕获仪(CELLTRACKS○R AUTOPREP○R System)通过预设程序并配合使用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒(CELLSEARCH○R Kit)可以对样本进行标准化和自动化检测。用CELLTRACKS II分析仪或者CellSpotter分析仪,一种半自动荧光显微镜,可以对肿瘤细胞进行分析和计数。这种方法只计具有上皮细胞特性(EpCAM+, CK8,18+,和/或者CK19+)的细胞数量。 检测原理 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别EpCAM抗原的抗体,EpCAM是CTC特异性抗原。因此,该磁微粒可以捕获CTC。经过免疫捕获和富集后,荧光试剂用来鉴定CTC和CTC计数。荧光试剂包括以下组成:抗CK-藻红蛋白(PE)的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋白抗体(上皮细胞特性);DAPI,用于细胞核染色;和抗CD45-别藻蓝蛋白(APC)白细胞特异性抗体。 试剂/样品混合物被CELLTRACKS○R AUTOPREP○R系统分配到一个插入在MAGNEST?细胞呈现装置的暗盒中。所述MAGNEST?装置具有强磁场,能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗盒的表面上。CELLTRACKS ANALYZERII?分析仪,或者CellSpotter?分析仪自动扫描暗盒的整个表面,获取图像并向用户显示所有事件,其中CK-PE和DAPI荧光染料进行共定位。图像进行最终分类,并以画廊格式呈现给用户。所检测分析的事件当其形态学特征与肿瘤细胞一致并表现出EpCAM+,CK+,DAPI+和CD45-表型时,才被分类为肿瘤细胞。 试剂盒提供的材料 试剂说明 1. 3ml 包被抗EpCAM抗体的磁流体:含有浓度为0.022%的磁微粒,这些磁微

循环肿瘤细胞CTC检测及临床应用

循环肿瘤细胞C T C检测及 临床应用 Prepared on 22 November 2020

循环肿瘤细胞检测及临床应用 中文摘要:循环肿瘤细胞是从原发肿瘤扩散,进入到血液或淋巴系统的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞在血液中含量稀少,一般先将循环肿瘤细胞富集,然后再进行检测,现在已经开发了多种细胞富集和检测技术。本文主要对CTCs的富集和检测技术研究进展,以及CTCs在临床分析和研究上的应用进行了综述。 关键词:循环肿瘤细胞富集检测临床 Abstract:Circulatingtumorcellscomefromtheprimarytumorproliferation,andprolife ration,癌症转移的过程是循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells,CTCs)从原发肿瘤分离,通过循环系统扩散,进入血液或者淋巴系统,在远处形成新的肿瘤,最终导致大多数的癌症病人死亡。1869年,Ashworth在一例癌症死亡患者的外周血中发现了类似肿瘤的细胞,并首次提出了CTCs的概念。从此,越来越多的研究表明,CTCs的出现与癌症密切相关。通过上皮-间质转化(EMT),实体瘤的上皮细胞进行细胞的变化,使他们通过增加流动性和侵袭性脱离组织,进入到血液中,附着,、发展成远端转移。由于CTCs能够代表原发肿瘤的表型和遗传组成,并能够作为任何转移性肿瘤的”液体活检”,CTCs的富集分离和特征研究,十分具有吸引力。CTCs的富集和计数技术已经建立,其中CTCs的计数可以成为预测指标,当其大于已知的阈值时,就预示着病人就患有转移性乳腺癌,、前列腺癌,、结直肠癌等。 基于临床试验,美国FDA批准了一种临床检测CTCs的CellSearch技术,用于上述癌症的CTCs的富集和计数。CellSearch技术成功的证明了CTCs确实表征了疾病的活跃,CTCs数量的增加预示着病情的恶化,可以通过CTCs了解原发性和转移性肿瘤,以CTCs为基础的分析,可以帮助人们实时诊断和预测,对病情做出决定,并取样检测耐药性。大多数常规的癌症治疗方法在治疗转移性癌症方面难以成功,CTCs的可能促进肿瘤的临床研究。 CTCs在血液中极其稀少,数十亿的外周血细胞也阻碍了对CTCs的分离和分子鉴定。现在已经开发了大量的技术用于富集和检测CTCs,其中有些已经成功的用于测试或者临床评估。本文主要综述CTCs的富集和检测技术的研究进展,以及对CTCs的在临床分析和研究上应用。 1CTCs富集技术 为了从大量血液细胞中捕获数量稀少的CTCs,富集分离技术必须足够敏感性,可重复性,可靠,、快速,、便宜,并且所需获取血液量要尽量少,方便实现过程自动化,方便下游分析。此外,富集分离的CTCs要能够保持他们的活性,在富集分离的过程受到的干扰要尽量小,因为这可能改变CTCs的状态和表型。 CTCs富集的技术有很多种,这些技术使用多个性能参数评估(即捕获效率,纯度,细胞活力,富集速度,血液样本容量等),然后通过检测临床样本进行验证。最佳的富集分离方法可能需要之间的性能参数的折衷,而且可能依赖于下游的应用。CTCs的富集技术主要根据免疫亲和性,物理性质和直接分析分为三类。 1.1免疫亲和性(Immunoaffinity)

cellsearch循环肿瘤细胞(CTC)试剂盒说明书自译中文版

7900001 16 人份试剂盒 Cell Search 循环肿瘤细胞检测试剂盒(上皮细胞) IVD

使用须知 本试剂盒仅用于体外诊断 Cellsearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞( CTC )的计数,这些细 胞来源 于上皮细胞,即表现为 CD45 阴性( CD45- ), EpCAM 阳性( EpCAM+ ),细胞角 蛋白 8,18 阳性( CK8,18+ )和(或者) CK19 阳性 (CK19+) 的细胞。 用CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的 CTC ,存在于外周血中,这类细胞与乳腺癌、 结直肠癌和前列腺癌 *转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此, CTC 可以用来监控 乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。 CTC 应该进行持续检测,并 与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段, 对 CTC 数量进行评估,可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。 *在该研究中, 转移性前列腺癌患者定义为血清标志物 PSA 在标准激素基准上, 高于参考水 平具有 两次连续增加。 这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性, 激素抗性, 或去势抗性的 前列腺癌。 摘要说明 肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后, 这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的 远端定植生长的情况。 血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞, 而这类细胞在血液循环系统 中是极罕见的。基于此,本公司推出的细胞自动化捕获仪 (CELLTRACKS R? AUTOPREP System ) 通过预设程序并配合使用 CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒 (CELLSEARCH Kit ) 可以对样本进行标准化和自动化检测。 用 CELLTRACKS II 分析仪或者 CellSpotter 分析 仪,一种半自动荧光显微镜, 可以对肿瘤细胞进行分析和计数。 这种方法只计具有上皮细胞 特性( EpCAM+, CK8,18+ ,和/或者 CK19+ )的细胞数量。 检测原理 CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒 包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是 一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别 因此,该磁微粒可以捕获 CTC 。经过免疫捕获和富集后,荧光试剂用来鉴定 计数。荧光试剂包 括以下组成:抗 白抗体(上皮细胞特性); DAPI , 胞特异性抗体。 试剂 /样品混合物被 CELLTRACKS 呈现装置的暗盒中。所述 MAGNEST ? 装置具有强磁场,能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗 盒的表面上。 CELLTRACKS ANALYZERII ? 分 析仪,或者 CellSpotter ? 分析仪自动扫描暗盒 的整个表面, 获取图像并向用户显示所有事件, 图像进行最终分类, 并以画廊格式呈现给用户。 胞一致并表现出 EpCAM+ , CK+, DAPI+ 和 试剂盒提供的材料 试剂说明 1. 3ml 包被抗 EpCAM 抗体的磁流体: 含有浓度为 0.022% 的磁微粒,这些磁微粒表面偶 联有抗表 皮细胞表面标志物 EpCAM 的鼠源单克隆抗体。缓冲溶液中含有 0.03% 的 BSA 和 0.05% ProClin 300 作为保护剂。(棕色瓶盖) EpCAM 抗原的抗体, EpCAM 是 CTC 特异性抗原。 CTC 和 CTC CK-藻红蛋白(PE )的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋 用于细胞核染色;和抗 CD45-别藻蓝蛋白(APC )白细 ?AUTOPREP ?系统分配到一个插入在 MAGNEST ?细胞 其中 CK-PE 和 DAPI 荧光染料进行共定位。 所检测分析的事件当其形态学特征与肿瘤细 CD45- 表型时,才被分类为肿瘤细胞。

循环肿瘤细胞检测系统(CTC)仪器购买可行性报告

循环肿瘤细胞检测系统(CTC)设备购置 可行性报告 一、制造商基本情况 美国强生(Johnson & Johnson)成立于1886年,是世界上规模最大,产品多元化的医疗卫生保健品及消费者护理产品公司。1999年全球营业额高达275亿美元。强生在全球60个国家建立了250多家分公司,拥有约11万5千余名员工, 产品销售于175个国家和地区。 强生公司是世界上最具综合性、分布范围最广的卫生保健产品制造商、健康服务提供商,产品畅销于175个国家地区,生产及销售产品涉及护理产品、医药产品和医疗器材及诊断产品市场等多个领域。 美国强生公司研发的循环肿瘤细胞检测系统(CTC)2012年进入中国市场,立即被运用于肿瘤科研和临床检测,并受到业界好评。二、项目意义 随着循环肿瘤细胞检测技术的不断发展,循环肿瘤细胞(CTC)在肿瘤临床实践以及肿瘤基础科学研究领域得到了越来越多的重视。CTC数目已经被证实与晚期转移性乳腺癌,结直肠癌,前列腺癌等各种患者的无进展生存期和总生存期密切相关,CTC已经成为转移性乳腺癌等癌种的一种全新的,独立的预后因子,并被作为一种新的肿瘤生物标志物而广泛应用于新药开发,癌症机制研究等不同的领域。三、国内外研究 CTC是指存在于外周血循环中的肿瘤细胞,其含量非常稀少(1ml血液中可能只能检出1个CTC)。CellSearch系统是目前为止唯一获得FDA批准的可以应用于病人管理的自动化循环肿瘤细胞检测系统。检测技术的不断进步CTC越来越成为国内外癌症领域研究的热点。2004年,Cristofanilli等完成的前瞻性多中心临床研究表明治疗前

(基线期)和首次随访时的CTC水平对于转移性乳腺癌患者的无进展生存期和总生存期都是独立的预测指标。在177例转移性乳腺癌患者中,CTC水平较高者(≥5个/7.5ml全血)的平均无进展生存期只有2.7个月,总生存期只有10.1个月;CTC水平较低者则分别为7.0个月(P<0.001)和超过18个月(P<0.001)。随后又有多个研究证明治疗期间任何时间点CTC水平的升高都提示着疾病的快速进展和较差的预后。同时也出现了越来越多的不同癌种的关于CTC的研究,其结果也提示了CTC在前列腺癌,结直肠癌中也发挥了相同的预后作用。由于FDA 的批准,在美国CTC已经可以与传统肿瘤诊断检测方法相结合用于临床实践。国外也有较多的研究集中在了CTC的生物特性上,例如研究CTC表面的Her2抗体表达情况,进行CTC与原发肿瘤的抗体表达对照研究等。 此前,国内也有一些实验室开展了关于CTC的研究,但局限于手工磁珠法,PCR法等方法学问题,并没有取得国际认可的结果。不过随着CellSearch方法逐渐进入中国,越来越多的学者已经开始了关于CTC的研究。国内正在进行CellSearch的注册临床研究,将会验证CellSearch系统在中国人群中的有效性及安全性。同时一些国内的实验室也已经开始在CellSearch这一平台上进行不同的基础科学研究,包括CTC表面多重生物标志物分析,CTC分子生物学分析,CTC细胞FISH检测等,希望通过CTC这个全新的肿瘤标志物得到更多关于癌症发病机制,癌症转移机制等问题的答案。 四、国内开展现状 基于CellSearch平台的CTC检测技术是一种安全可靠的被美国FDA批准的癌症临床辅助诊断技术,随着中国注册临床试验的进行,CTC检测将会在中国得到越来越多的重视并迎来更加广阔的临床及科研应用前景。目前国内已有解放军307医院,复旦大学附属肿瘤医院,

循环肿瘤细胞销售流程

C an c e r r e s e ar ch Cir c u la t in g T um o r C e l ls D e cisi o n T r ee 内部使用 肿瘤研究 循环肿瘤细胞 起始样品– 外周血/骨髓 您富集 CTC s ? 您直接分选 CTCs? M i cro be a d s Human : CD326 (E p C A M ) M i c r o B e a d s Anti-ErbB-2 M i c r obe ads Anti-Melanoma (MCSP) M i c r obead s I nd irec t M i cro B e a d s 您去除非 CTC s ? C D 45M i cro B e a d s 您做CTC 的分析吗? 您想做先富集再分析吗? H um an CD326 (E p C A M ) tumor c e ll E n r i c h m en t a nd Detection kit ErbB-2 tumor cell E n r i c h m en t a nd Detection kit A n t i -M e l a no ma (MCSP) cell E n r i c h m en t a nd Detection kit MACSQuant 您用流式细胞仪吗? E p C A M a n t i bod i e s , a n t i - E r b B -2 a n t i bod i e s , anti-Melanoma (MCSP) an t i bo di e s , CD45 an t i bo di e s , Available c on j ug a t ed to up to 8 f l uo r o c h r o m e s MACSQuant 您做免疫组化吗 (I H C )? Carcinoma Cell Detection K i t , I n s i de Stain K i t , A n ti -C y t o k e r a ti n Alkaline P h os ph a t a s e ; Anti-Cytokeratin (C K 3-3E 4), A n ti -C y t o k e r a ti n (CK3-6H5), C D 45, 您做分子分析吗? 您做基因表达谱分析吗? mRNA isolation k i t , cDNA isolation k i t , MultiMACS M96 T he rmo M i c r o a rr ay : labeling k i t s , s e rv i c e s , b i o i n f o r ma t i cs , superAMP

循环肿瘤细胞检测的现状及发展

循环肿瘤细胞检测的现状及发展 作者:上海市第一人民医院检验科李莉教授 https://https://www.doczj.com/doc/264418664.html,/news/9/2802534.htm 恶性肿瘤远处转移是临床上实体恶性肿瘤治疗失败或复发的主要原因之一。而循环肿瘤细胞的存在正是实体恶性肿瘤远处转移的根源。肿瘤远处转移的最经典依据是1889年Paget[1]提出的“种子和土壤”学说,该学说认为肿瘤转移的发生和发展,是处于活跃或活化状态的肿瘤细胞作为“种子”,当遇到适合的器官、组织的基质环境,即“土壤”时,就会在此定居、生长即发生肿瘤的转移,从而部分解释了肿瘤原发灶与转移灶之间的关系。但原发部位的肿瘤(种子)是如何到达远处器官或组织(土壤)的这一问题一直困扰着人们。直到1869年,托马斯?阿什沃思(Thomas Ashworth)[2]在1例转移性癌症患者血液中观察到了外周血循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)—从实体瘤中脱离出来并进入血液循环的肿 瘤细胞。他推测,这些细胞在癌症转移过程中发挥了非常重要的作用,并可能提供疾病进展的相关信息,CTCs的概念初步形成。据统计,90%以上的肿瘤病人死于肿瘤的转移和复发,实体肿瘤或转移灶的肿瘤细胞在特定条件下,通过上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),从形态上发生向间充质细胞表型的转变并获得迁移的能力。间充质细 胞与上皮细胞相邻,只是其结构松散,缺乏细胞连接(cell adhesion)和细胞极性,并且具有转移和侵袭能力。因此,脱落的CTCs得以进入外周血液循环,这是肿瘤发生转移的必要前提。脱离原发灶入血的CTCs至少面临着血流剪应力、失巢凋亡、免疫细胞识别杀伤等三重致命考验,进入循环的大部分肿瘤细胞都会失去活性,只有不足0.01%可到达远端器官,通过迁移、粘附、相互聚集形成微小癌栓,并在适合的微环境条件下,CTCs又发生间质- 上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET),生成新的肿瘤,从而导至肿瘤转移的发生。 从提出CTCs概念近一个多世纪的时间里,由于初期实验条件、技术的限制以及学者对CTCs 的认识的局限性,CTCs检测及临床应用进展不大。直至上世纪末尤其是本世纪初,随着分 子生物学、计算机技术的发展,免疫标记技术以及分子生物学技术的突飞猛进,CTCs分离 及分析鉴定技术得以迅速发展,CTCs检测和临床应用取得了重大进步,为早期发现肿瘤的 复发转移、评估手术、放疗、化学等疗效、判断预后、确定肿瘤分子特征、选择合适的个体化治疗等方面提供了重要的实验室依据。目前,学者所共识的循环肿瘤细胞的概念是:自发或受外界因素作用(如诊疗操作等)由原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞。肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是肿瘤转移的最初阶段,并为最终形成肿瘤转移灶提供了可能。进入循环系统的肿瘤细胞大部分在机体免疫识别及杀伤等作用下发生凋亡,有极少数肿瘤细胞在循环系统中存活下来,在一定条件下,进入血液循环而未被清除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓,并在一定条件下发展为转移灶[3]。本文拟就CTCs分离技术、分析鉴定技术、临床应用、CTCs主要分析仪器作一介绍。 1 循环肿瘤细胞分离富集技术 越来越多的分子生物学和临床研究结果表明,肿瘤转移很可能在肿瘤发生的早期就已经出现,在外周血中检到CTCs是预示肿瘤转移最直接、重要的方法,在肿瘤早期转移的临床诊断、预后判断、监测疗效等方面具有重要意义。CTCs的发现有望改变临床上仍依赖于影像学检

cellsearch循环肿瘤细胞CTC试剂盒说明书自译中文版

c e l l s e a r c h循环肿瘤细胞C T C试剂盒说明书自 译中文版 This manuscript was revised by the office on December 22, 2012

7900001 16人份试剂盒 Cell Search 循环肿瘤细胞检测试剂盒 (上皮细胞) IVD 使用须知 本试剂盒仅用于体外诊断 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞(CTC)的计数,这些细胞来源于上皮细胞,即表现为CD45阴性(CD45-),EpCAM阳性(EpCAM+),细胞角蛋白8,18阳性(CK8,18+)和(或者)CK19阳性(CK19+)的细胞。 用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的CTC,存在于外周血中,这类细胞与乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌*转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此,CTC可以用来监控乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。CTC应该进行持续检测,并与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段,对CTC数量进行评估,可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。 *在该研究中,转移性前列腺癌患者定义为血清标志物PSA在标准激素基准上,高于参考水平具有两次连续增加。这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性,激素抗性,或去势抗性的前列腺癌。 摘要说明 肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后,这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的远端定植生长的情况。血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞,而这类细胞在血液循环系统中是极罕见的。基于此,本公司推出的细胞自动化捕获仪(CELLTRACKS○R AUTOPREP○R System)通过预设程序并配合使用CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒(CELLSEARCH○R Kit)可以对样本进行标准化和自动化检测。用CELLTRACKS II分析仪或者CellSpotter分析仪,一种半自动荧光显微镜,可以对肿瘤细胞进行分析和计数。这种方法只计具有上皮细胞特性(EpCAM+, CK8,18+,和/或者CK19+)的细胞数量。 检测原理 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别EpCAM抗原的抗体,EpCAM 是CTC特异性抗原。因此,该磁微粒可以捕获CTC。经过免疫捕获和富集后,荧光试剂用来鉴定CTC和CTC计数。荧光试剂包括以下组成:抗CK-藻红蛋白(PE)的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋白抗体(上皮细胞特性);DAPI,用于细胞核染色;和抗CD45-别藻蓝蛋白(APC)白细胞特异性抗体。 试剂/样品混合物被CELLTRACKS○R AUTOPREP○R系统分配到一个插入在MAGNEST细胞呈现装置的暗盒中。所述MAGNEST装置具有强磁场,能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗盒的表面上。CELLTRACKS ANALYZERII分析仪,或者CellSpotter 分析仪自动扫描暗盒的整个表面,获取图像并向用户显示所有事件,其中CK-

循环肿瘤细胞检测及临床应用的研究进展

?450?肿瘤2008年5月第28卷第5期TumorV01.28,No.5,May,2008 DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2008.05.021 循环肿瘤细胞检测及临床应用的研究进展 Review?综述 黄同海1,王正‘,李富荣2 (暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院1.胸外科;2.临床医学研究中心,深圳518020) [摘要]研究发现,实体瘤患者外周血中存在循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞的检测有助于发现早期肿瘤患者的微转移,重新确定临床分期,监测患者术后肿瘤是否复发与转移,评估预后,选择个体化的治疗策略。由于存在循环肿瘤细胞检测方法、原发肿瘤细胞的不连续脱落、基因组的不稳定性及无效转移等诸多问题,循环肿瘤细胞检测的生物学意义和临床意义仍存在很大争议。本文综述了对实体瘤患者循环肿瘤细胞检测的方法和结果,并探讨当前肿瘤研究领域面临的问题和潜在的进展。【关键词]肿瘤循环细胞;肿瘤转移;诊断技术和方法 [中图分类号]R73-37;R730.43[文献标志码]A[文章编号]1000-7431(2008)05-0450-03 肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程。肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是实现肿瘤转移的最初阶段,并为最终形成肿瘤转移灶提供了可能。深入研究循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTCs)有助于对肿瘤转移机制的了解,为抗转移治疗提供依据。随着检测技术的小断改进,研究者们对CTCs的生物学特性的认识得到不断更新和完善。这可能为肿瘤患者的预后评估、抗肿瘤药物的开发和肿瘤的个体化治疗提供强有力的工具。 CTCs是指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。由于宿主的免疫识别和机械杀伤作用以及肿瘤细胞自身因素,进入循环的肿瘤细胞很大一部分发生凋亡,不能形成转移灶,这种现象称之为“无效转移”¨o。只有极少数具有高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来,相互聚集形成微小癌栓,并在一定条件下发展为转移灶。因此,在外周血中检测到肿瘤细胞预示着有可能发生肿瘤转移。 1CTCs的检测方法 1.1细胞计数法细胞计数法是最早应用于检测外周血CTCs的方法并且是当前鉴定骨髓中微转移的标准方法。细胞计数法的优点是,可在形态学上鉴别恶性表型并在单个细胞水平上进一步检测特定分子,但标准的光学显微镜和免疫细胞化学法存在敏感性低、检测繁琐、费时、易误诊等缺点。随着细胞自动成像和细胞富集方法等的产生,重新激起了研究者对应用细胞汁数法检测CTCs的兴趣。…。数字显微镜能自动扫描以核特征和细胞表面特征为摹础的血标本,而操作者只需确定分选的细胞即可。新近应用的上皮肿瘤细胞容量分离法(isolationbysizeofepithelialtumorcells,ISET),不仅能计数肿瘤细胞,而且能进行免疫形态学和分子特征的分析¨J。FCM广泛应用于血液领域,不仅能鉴定特定标本中细胞抗原性和形态学特征,还能使富集的目的细胞维持细胞形态并保持细胞活力,进一步扩大在体外的功能研究。 [基金项目]国家科技攻关计划项目(编号:2003BA310A23) [作者简介】黄同海(1982一),男(汉族),硕士,住院医师 Correspondenceto:WANGZheng(王正) E—mail:Wangzn0503@163.tom1.2PCR方法PCR方法是检测CTCs最普遍的一种方法。该方法通过设汁获得与目的基因特异性互补的寡核苷酸引物而具有较高的特异性。应用PCR方法可在106一lO7个正常细胞中检测出1个肿瘤细胞,相当于1~10mL血中可发现1个肿瘤细胞,与光学显微镜检测(102一103个正常细胞中发现1个肿瘤细胞)和免疫组织化学方法(104—105个正常细胞中发现1个肿瘤细胞)相比具有更高的敏感性“。然而,由于该方法的高度敏感性,极易产生假阳性的结果。这是冈为外周血白细胞的非法转录、静脉穿刺时血标本的污染及假基因的干扰等造成,但随着实时定量PCR技术的出现,使精确定量靶序列成为可能。 以DNA作为PCR的模板,其优势是它的稳定性和肿瘤细胞异常转录的独立性。但是它的缺点是敏感性低,并且不能鉴别目的基因DNA来源于活细胞还是死细胞。 以mRNA作为模板进行RT—PCR也是CTCs检测最常用的一种方法。首先将mRNA反转录为cDNA,随后用特异性的引物扩增获得日的基因。引物设计时可以跨越2个不同的外显子,为避免整个基因组的扩增,有利于消除假阳性结果。RT—PCR的优点是可以检测原代活细胞,缺点是在某个特定肿瘤细胞内一个基因mRNA的拷贝数量在细胞周期中是不断变化的,并且存在去分化的现象,这可能影响标准PCR的阳性率和实时定量PCR检测的标志物水平,从而较难区别肿瘤细胞数量与mRNA表达水平之I’日J的变化。然而用多位点PCR分别检测来自不同基因家族的mRNA标志物即可解决这个问题一-。 1.3细胞富集方法密度梯度离心法足目前实验室常用的一种收集肿瘤细胞的方法,但该方法缺乏特异性,因而易导致缺乏相应密度的肿瘤细胞丢失。新近发展起来的免疫磁性细胞富集法则具有较高的特异性和富集效率。其基本原理即采用均匀、球形具有超顺磁性及保护壳的纳米微粒制备成免疫磁珠,使之成为既能被磁铁所吸引,又能结合抗体的载体。磁珠上的抗体与含有特异性抗原物质的细胞结合后,则形成细胞抗原.抗体一磁珠免疫复合物,在磁力作用下发生力学移动,使复合物与其他物质分离,达到分离特异性细胞的目的。目前商业化的磁珠包括阳性分选磁珠和阴性分选 万方数据

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