第一章植物的快速繁殖技术
一、快速繁殖的概念
植物一般通过有性繁殖和无性繁殖两种方式繁衍后代。很多花卉、果树林木和一部分粮食作物，由于它们的高度杂合性，常通过扦插、埋条、压条、嫁接或种植特殊的营养器官等方法进行营养繁殖，从而得到和亲本遗传性一致的后代；有些种子休眠期特别长的作物，用营养繁殖可以加快繁殖的速度；某些多年生作物用种子繁殖时要经过一个很长的幼年期，如用成年植物材料进行营养繁殖，常可大大缩短生长期。这些都是无性的营养繁殖。用组织培养繁殖植物的技术是一种特殊的营养繁殖方式，现在一般称之为“快速繁殖技术”（rapid propagation）或“微繁殖技术”（mic-ropropagation）。它是在无菌条件下，利用植物体的一部分，包括细胞、组织或器官，在人工控制的营养和环境条件下繁殖植物的方法。这可以看作是常规营养繁殖方式的一种扩展和延伸，它不但保持了常规方法的特点，而且还具有以下几个明显的优点：（1）使用的植物材料极少，往往只要少量的茎尖、叶片、剪切段或其他器官就能在试管中建立起反复增殖的系统。这样就可以节省常规营养繁殖时所需要的大量母本植株和因栽培和保持这些母株所需的土地和人力，对于珍贵稀有的植物材料还可能做到不毁坏原有的植株。(2)由于每个外植体产生的芽或胚状体常多于常规繁殖方法，每一个繁殖周期又比常规繁殖短得多，一般只要1一2个月，加上可以不受季节和气候条件的影响进行周年生产，所以繁殖速度往往比常规方法要高得多，繁殖的数量在一年中常可达几万、几十万甚至上百万倍。另外，由于试管中芽、植株或胚状体的小型化和利用多层的集约化培养架，可以在有限的空间生产大量的植株。在实际应用中，某些技术较完善的作物，每平方米培养面积一年约可生产一万到几万株，一个熟练工人一年约可生产数试管苗。如萱草，从30个外植体开始，在1.8平方米的培养面积上，8个月可以生产二万棵试管苗。（3）由于快速繁殖是在无菌的容器中进行的，在繁殖过程中不受病虫的侵害。如果和去病源技术相结合，可以大量生产高质、均一的无病苗木，而这一点用常规方法是很难做到的。这样的无菌无病的试管苗在远距离的运输中和国际交流中都是极安全和方便的，既可以防止病害的传播又可以免去复杂的检疫手续。（4）对于某些植物，组织培养产生的植株的表现型和从种子或常规营养繁殖方法得到的植株会有所不同，其性状要优于原植株。如波士顿蕨的试管植株由于不表现强烈的顶端优势而能形成更多的分枝，使植株形态更美观。非洲紫罗兰的试管植株呈莲座状，而用常规叶插方法得到的植株，叶柄长，整个植株更为直立，园艺性状也较差。
快速繁殖技术除了有上述明显的优点之外，和常规的营养繁殖方法相比也有其固有的一些特点，这方面常常容易被人们忽视而造成工作的失败或资金的浪费。首先，和常规方法相比较，要建立一个比较完整的组织培养实验室，需要相当的投资。在发达国家目前约要几万美元，在我国如建立一个包括实验室、培养室和有一定温室面积的系统也要投资几万、十几万以至几十万元，而且如完全使用电能调控光照和温度的话，运转费用也是相当可观的（我国大部分地区夏天需要降温，冬天需要升温，潮湿地区又需去温，以及培养的光照，都要消耗大量的电）。其次，此项工作对人员的要求比较高，除了要求能熟练和严格地进行无菌操作之外，对培养物的生长、分化和它的控制方法要有所了解。在探索一种新的植物的快速繁殖时需要进行大量的系统研究，这就要求有一定的理论知识和实践经验。另外，由于这种方法有可能在短时期内从极少量的外植体产生大量的新植株，所以在材料的选择、工艺流程稳定性的控制、周年生产中的各个环节的安排和衔接上要作精心的组织，否则常可能由于某一环节的失误而导致整个工作的失败。如由于选择了不良的原始材料（不良的基因型、未发现的变异体等），或在培养过程中由于培养方法不当，或因其他原因产生的遗传变异未能及早发现等，而导致最后产生大量的具有严重缺陷的植株。这一点在多年生木本植物中的后果
些性状要经过几年以至几十年的时间才表现出来。在某些培养系统中还会出现对于生产不利的遗传变异，如试管苗中残留的细胞分裂素效应常使分枝过多而影响某些作物的经济性状。
二、快速繁殖技术发展史简略
和应用概况
从本世纪初哈伯兰特（Haberlandt）提出植物细胞组织培养的设想到六十年代，通过长期的科学研究，植物细胞的全能性和器官分化、体细胞胚胎发生的激素调节都得到了证实。同时对试管植物的营养研究发展了各种适合于不同植物细胞组织培养的培养基，基本完善了原生质体培养、单细胞培养、细胞悬浮培养、组织和器官培养（包括愈伤组织、胚培养、花药培养、茎尖培养）等各种技术，积累了几百种植物的器官发生和体细胞胚胎发生的资料。这些成果为六十年代以后细胞组织培养技术在生产上的应用奠定了坚实的理论和方法的基础。
最早使用细胞组织培养技术进行植物快速繁殖的是法国科学家莫里尔（Morel），六十年代他用茎尖培养的方法大量繁殖生花获得成功，从而引起了人们的极大兴趣．促使了七十年代这方面工作的迅速发展。七十年代，穆拉希格（Mu-rashige）作出了较为突出的贡献,他首先提出了快速繁殖技术应分成外植体的建立、芽的增殖、生根和试管苗移栽前的锻炼等三个阶段，每一个阶段又需要不同的培养基成分和环境条件。使用这种技术在很多草木园艺作物上获得了成功，并很快地投入了生产。草本园艺作物较易获得成功的原因：一方面是由于对它的器官分化和体细胞胚胎发生研究较多，同时它本身经济价值较高，易引起人们重视，另一方面在茎尖培养时由于顶端优势不强，侧芽增殖较快和容易生根。和草木园艺作物相比，木本植物的快速繁殖的研究发展较慢，这是由于很多木本植物的外植体在培养初期的褐变和
不易打破茎尖的休眠状态，器官分化和体细胞胚胎发生的例子较少，以及诱导生根困难较多。直到七十年代后期这方面的研究才逐渐发展起来。其中有代表性的是琼斯（Jones）等人关于苹果茎尖培养的工作，1976年他们发现了一种酚类物质——根皮苷，在苹果成年树茎尖培养和诱导生根中有良好的促进作用，这项工作促使果树、木本经济作物和观赏树种的快速繁殖有一个较大的发展。大多数木本造林树种都是用种子繁殖的，但是由于育种周期太长和大规模杂交制种的困难等原因，现在越来越重视在自然界已有群体中或杂种一代中选择优良单株发展无性系的工作，因此对快速繁殖技术提出了迫切的要求。但至今这方面成功的例子不多，只限于桉树、杨树和麻栗树等少数树种。
目前快速繁殖技术已用于一些苗木的大规模商业化生产中，其中多数是观赏植物，如兰花、波士顿蕨、非洲菊、百合、唐菖蒲、菊花、香石竹、花烛和大岩桐，还有草莓、芦笋、香蕉、桉树和桃树砧木等。其中相当大部分的年产量在100万株以上。正在进行田间试验而在不久的将来可能投入商品化生产的除了各种观赏植物之外，还有不少果树和经济林木，如油棕、苹果及其砧木、苹果和柑桔的无病毒苗等。我国这一方面的工作从七十年代开始，起步较晚但发展较快，现在除甘蔗和马铃薯无毒苗已进行了大规模的试验之外，在兰花、香石竹、月季、菊花、唐菖蒲、大花萱草、非洲紫罗兰、大岩桐、重瓣玉簪、花叶竽、瑞香、无籽西瓜、草莓、茶花、桉树、杨树、醋栗如葡萄等也进行了中间试验或一定规模的商品化生产。估计今后几年可能有较大的发展，并逐渐形成我国的试管苗产业。
三、快速繁殖技术的适用范围
到目前为止可以通过组织培养方法在试管中形成植株的植物已有几百种。因此可以说很多植物都具有进行快速繁殖的潜力。但是由于各种各样的原因，如某些技术环节还未突破、效率不高、成本过高、市场需要不大等，真正比常规繁殖方式优越而用于实际生产的只是其中一小部分。在今后一个相当长的时间内它还只能用于某些作物或用于一些特殊目的的繁殖上。主要包括以下几个方面。
（1）用于加速某些难繁殖或繁殖速度低的植物，如珍稀名贵的花卉、一些需要发展的濒危植物的繁殖上。
（2）某些植物虽然容易繁殖但很易感染病毒，像香石竹、百合、草莓、马铃薯等，可以先用分生组织培养的方法去除病毒，经鉴定后确认是无病毒的植株再用此法大量繁殖，得到的无毒苗可用作原种或直接栽种。这样可以大大减少繁殖过程中再感染的机会，节省大量的时间和精力。
（3）有些杂合的园艺作物，如非洲菊、花烛等用常规种子繁殖时，由于后代分离而不能得到性状一致的后代，用快速繁殖的方法可以产生均一的个体基因型无性系。
（4）用于需要加速繁殖的特殊基因型，如由常规育种或通过生物工程产生的新品种、国外引人的优良品种、果树中的芽变品系、木本植物的优选单株、雌雄异株作物中有经济性状或经济性状较好的植株等的快速繁殖，以减少进行推广或投入市场所需的时间。也可用于育种过程中需要迅速扩大的自交系、原始材料、亲本和杂种子代的繁殖上，以缩短育种周期。
随着科学研究的发展，相信会有越来越多的植物可使从快速繁殖技术来进行繁殖。
四、快速繁殖的一般技术
快速繁殖过程一般可包括四个阶段，即无菌培养物的建立、芽的增殖、诱导生根和试管苗的移植。：
1．无菌培养物的建立
（1）外植体的选择。选择适当的外植体对于快速繁殖能否成功是极其重要的。而选择什么样的外植体首先决定于第二阶段芽的增值所采用的途径。
通过腋芽的形成来增加芽的数量时，应从带有营养芽的都分得到外植体，并注意以下问题。第一，外植体的大小。这要由培养的目的来决定，如为了得到无病毒植株需使用分生组织（生长锥带1—2个叶原基），如为一般繁殖或原材料经鉴定是不带病毒的可使用茎尖（除分生组织外还带有少量幼叶）、芽或带芽的切段作为外植体。外植体越小，带病毒和其他的病源体就越少，但是难培养；反之，则带病毒越多也越容易污染，但容易培养。第二，取材植株的生理状态对培养的成败也是极重要的。一般在春天植物开始生长，芽已膨大但芽鳞片还未张开时最为合适。此时芽生长旺盛，并有芽鳞片的保护，不易污染。为了避免季节的影响，在有条件时也可以将植物放在光、温条件稳定的人工气候箱或温室中，使植株保持营养生长状态。对某些需要低温或高温或特殊论同期处理才能打破休眠的块茎、鳞茎、球茎，常常要处理后才可剥取茎尖进行培养。第三，芽在植株上的部位也是需要注意的。在一些草本植物（如菊花和香石竹）中，使顶芽或上部的芽作分生组织或茎尖培养时的成功率常常比侧芽或基部的芽要高，这可能和它们生长较旺盛有关，但由于顶芽数量有限也常使用侧芽作材料。第四，多年生的木本植物随着年龄的增加，分生组织、茎尖和芽的培养越困难，特别是成年树较幼态树的培养要困难得多。此时，常使用部分返幼、阶段年龄较低的根孽苗或不定芽做材料，或采取某些措拖，如将芽嫁接在实生苗上、修剪、保持高水平的施肥、进．行营养繁殖或用细胞分裂素喷洒植株等方法。”
在通过不定芽途径使芽增殖时，可以根据不同的植物采用不同的外植体，如根、茎、叶或花器官的各部分。在自然界中能够产生不定芽的器官应首先被采用。如非洲紫罗兰、大岩
桐、番茄、秋海棠等植物可用叶片，某些兰花和蕨类可以用茎尖，有些针叶树可用子叶、下肢轴；很多种植物，特别是单子叶植物，可以使用花器官，如萱草、鸢尾、玉簪、小菖兰、非洲菊和菊花等；还有，单子叶植物鳞茎的鳞片和叶基部也常用来作为外植体诱导不定芽的形成。
在使用体细胞胚胎发生途径时，常使用胚、分生组织或生殖器官作为外植体。
（2）植物材料的消毒。由于大多数植物的内部是无菌物，所以只要进行彻底的表面消毒就可以得到无菌的材料。一般先用水将材料表面的尘土洗去（但不要用刷子洗刷植物材料的表面），然后用表面消毒剂消毒灭菌。最常用的表面消毒剂是5—10％的安替福民（含有效氯5．25％的次氯酸钠溶液）、10％左右的漂白粉（次氨酸钙）或千分之一的升汞。使
用的浓度和时间要根据植物材料而改变。幼嫩的组织时间要短，老的组织、有芽鳞片保护的芽或种子时间可以长些，范围在几分到十分钟左右。为了使消毒剂能更好地浸润表面，常在消毒剂溶液中加入0．01—0．1％的表面活性剂，如吐混20、吐混80等，或者在植物材料浸入消毒剂之前先用70—75%的酒精浸几秒到几十秒钟，这一点对于表面不光滑、多毛的植物材料来说尤为重要。消毒后要用无菌水将材料冲洗干净，特别是用升汞消毒后更要多洗几次。
能否得到无菌的培养物不但决定于所使用的表面消毒剂的种类和时间，更重要的还要决定于植物材料的状况，应尽可能使用在培养室和温室中栽种的健康、生长旺盛的植株。从田间取回的材料的消毒常是很困难的。有人将枝条采回室内扦插后利用新生的芽，。或用抗生素溶液和杀菌剂预先处理植株，或用塑料袋包裹枝条等方法，可能得到较好的效果。
无菌培养物的获得也和正确的操作方法有关。如切除和剥去植物材料的外层（如种皮芽鳞片、老叶等）、在接种过程中经常消毒工具、避免各个外植体和组织块之间的交叉感染等也是极重要
的。
（3）褐变及其防止。很多植物合有丰富的多酚化合物，接种时由于切割和剥离使组织受到伤害，这些化合物在多酚氧化酶的作用下氧化发生褐变，此现象在很多木本植物的
成年初中尤其严重。这些氧化产物能使外植体和培养基变黑并严重抑制外植体生长和分化的能力，褐变常使最初培养物的建立受到阻碍。
现在采用各种方法试图防止褐变的发生，并在某些植物上得到一定的效果，但还没有普遍适用的有效方法。常用的方法有：在培养基中加入抗坏血酸、柠檬酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇或聚乙烯吡咯烷酮（PVP，有可溶和不溶性的两种）等抗氧化剂，或用抗氧化剂溶液预先处理外植体，或在抗氧化剂溶液中切割、剥离外核体，有时将以上几种处理结合使用，第二种方法是将外植体不断地转移到新鲜的培养基上，第三种方法是在培养基中加入1％左右的活性炭，但由于活性炭同时也能吸附培养基中的激素等物质，因此常会影响外植体的生长和分化。第四，开始阶段在黑暗中或弱光下进行培养，因为光照能促进多酚化合物的氧化。
（4）基本培养基和培养条件。现在用于快速繁殖的基本培养基有很多种，常用的有MS、B5等（表1）。通常在整个培养过程的各个阶段使用同一种基本培养基，但有时在第三阶段诱导根的形成时使用盐浓度较低的基本培养基会得到更好的效果。在各种各样的基本培养基中用得最多的是MS培养基和它的改良形式。
对激素的要求，不同的外植体在各个培养阶段和采用不同增殖途径时，常是很不相同的，关于这方面的情况将在下文中分别叙述。但在第一阶段和第二阶段常常使用同一基本培养基和激素成分。
由于培养物在培养基中不进行光合作用，需要培养基提供碳源。用得最多的碳水化合物是蔗糖，有时也使用葡萄糖和果糖及其他糖类化合物，浓度一般在2—3％左右。在大量培养时，为了节省成本使用食糖往往也能得到同样的效果。目前在快速繁殖中使用得最多的是固体培养基，以琼脂作为固化剂。由于琼脂来源不同，用量也不相同（0.5-0.8%左右），以掌握到容器倾斜时固体培养基不迅速变形为宜。
其他培养条件包括光照、温度和湿度等。除特殊要求外，一般在整个过程中都采用日光灯或日光灯加白灼灯的混合光作光源，光强度在1000—3000勒克司左右。光周期使用24小时连续光照或16小时光照，8小时黑暗。在快速繁殖中光照的作用不是满足培养物光合作用的需要，而是用于植物的光形态建成。常用的培养温度在25℃左右，但因植物不同有时也使用较低或较高的温度。一般认为恒定的温度对生长有利，较少采用日夜变温的培养方法。由于在培养容器内的相对湿度接近于100％，对于培养室温度的控制要求不十分严格。但在北方空气过于干燥时，培养基水分可能丧失过快（特别是在培养容器用棉塞或通气性能较好的纸张封口时），要适当提高空气湿度；在南方潮湿季节和地区，由于湿度过高，在棉
塞或封口纸上霉菌生长加快以至透入容器引起污染，此时要用去湿器和其他方法降低空气湿度或改用不霉变的封口膜。
2．芽的增殖
这是快速繁殖技术最重要的一环。在这一阶段潜在的植物个体（芽或胚状体）通过腋芽的形成和生长、外植体或愈伤组织上不定芽的形成和胚状体发生三条途径（图1）在数量上得以迅速增殖。由于植物种类的不同，在增殖时可能采用不同的途径。目前在快速繁殖中使用得最多的是第一条途径和第二条途径中的外植体上不定芽的形成。
（1）促进腋芽的形成和生长。在高等植物的每一个叶液中通常都存在着腋芽，每一个腋芽在一定的条件下都能生长并形成一个枝条。在自然条件下，按照植物种类的不同，一般腋芽要保持一个或长或短的休眠期。顶端优势很强的植物只有在去除顶芽之后，腋芽才能生长。现在已经知道这一现象是由几种内源植物激素（如细胞分裂素、生长素等）调节控制的。使用外源的细胞分裂素常可以打破顶端优势，促使腋芽生长，但这种作用是暂时的，在外源细胞分裂素作用消失时，腋芽的生长就停止了。在培养条件下，为了促使腋芽生长，需在基本培养基中加入一定浓度的合适种类的细胞分裂素（有时同时加入少量的土长素）。由于细胞分裂素的持续作用，腋芽生长成枝条，新产生的枝条的腋芽在细胞分裂素的作用下又可生长，这样反复数次就
可以形成一丛嫩校．将它们切割成带有几个芽的小块接种到同样的培养基上，这一过程又能重复进行，这样就可以在短时间内产生大量的芽。
有些植物即使在含有细胞分裂素的培养基中顶端优势也不易被打破，接种的茎尖只能长成不分校的一根枝条，此时可以用切段法（每个切段带有一个腋芽）加以繁殖。在马铃薯和目前国内所用的葡萄快速繁殖中就是采用这种方法。
用促进腋芽生长的方式进行增殖时，一般速度较其他两种方法要慢一些，1一2个月可增加5—10倍；但在有的植物中速度也极快，如草莓，每2周约可增加10倍左右，从一个芽开始，。一年可增加到几百万个。使用这种方法的优点主要是适合于用这种方法繁殖的植物种类较多。并且由于茎尖的细胞是均一的二倍体，又不易受培养条件的影响而发生变异，所以能保持遗传的稳定性，同时对于保持嵌合体的特性也是一个好办法。目前已有近百种植物可用这种方法进行快速繁殖（包括草莓、苹果、葡萄、唐菖蒲、非洲菊、月季、甜菜、凤梨等等）。
在所有的这类培养中，培养基中几乎都要加入细胞分裂素以克服顶端优势。所使用的浓度多数在0．1—10．0毫克／升（一般1—2毫克／升）就足够了，但是偶然也使用更高的
浓度。在几种细胞分裂素中，6一苄基腺瞟吟（BA）用得最多，其次是激动素（K）和异戊基腺漂冷（Zip)，玉米素（Z）用得最少，这和它的价格过于昂贵也有一定关系。对于具体的植物到底使用哪一种更为合适，要参考已发表的资料或通过试验才能决定，如杜鹃和大蒜等植物的培养中zip最为有效。
除了细胞分裂素之外，在培养基中还经常加入低浓度的生长素以促进腋芽的生长，但要防止浓度过高引起愈伤组织化。常用的生长素有萘乙酸（NAA)、吲哚丁酸（IBA）和吲哚乙酸（IAA），一般浓度在0．1—1．0毫克／升。另外，在某些系统中也加入低浓度的赤霉素（GA）以促进腋芽的伸长。腋芽的增殖除了和培养基中的激素成分和浓度有关之外，另一个重要因素是外植体的生理状态。现已发现在有些多年生本本植物的茎尖培养中，如杜鹃、苹果和苹果砧木、桦树等。随着继代培养次数的增加，腋芽增殖的速度会逐渐提高。某些植物的外植体预先用低温处理或者在液体培养基中振荡培养几天也可以促使腋芽的增殖。
（2）诱导不定芽的形成，从现存的芽（腋芽和顶芽）之外的任何组织器官上通过器官发生重新形成的芽称为不定芽。在自然条件下，很多植物的器官（特别是根、茎、叶）上都可以产生不定芽，如从苹果、醋栗的根、风信子的鳞片、秋海棠、非洲紫罗兰的叶和从许多树木的茎上等等。有文献记载的能从叶上产生不定芽的植物就有300多种。这种形成不定芽的现象已被广泛地用于生产实践。用组织培养的方法可以使这种能力大大得以扩展，这是因为在培养条件下由于激素的作用和只需要很小的外植体，因此可以使不定芽形成的数量大大地增加。如秋海棠和非洲紫罗兰用一般的叶插方法，每片叶上只能产生几个芽到十几个不定芽，但是用叶切段作为外植体时，从一片叶上可以产生成百上千个芽。
在培养条件下，还可以使一些常规方法不能形成不定芽的器官形成不定芽，如甘蓝和番茄的叶片，菊花的叶和花器官等等。某些蕨类植物的无菌组织块甚至在用匀浆器捣碎后还能产生大量的不定芽。
通过不定芽形成途径进行快速繁殖，对于很多有贮藏器官（如鳞茎、球茎）的单子叶植物，像百合、水仙、萱草、风信子、唐菖蒲等是很合适的。因为这些植物在自然条件下的营养繁殖速度一般不太快，而它的鳞片、叶基部或花梗等在培养时都容易产生不定芽或小鳞茎、，小球茎等不定器官，而且这一过程常可在试管中反复进行。
以上所述的不定芽形成是指从外植体上直接产生的不定芽（芽通常是从表皮细胞或表皮以下的几层细胞中产生的，有时带有少量的愈伤组织）。这样的系统只要控制好使用的激素的种类和浓度，避免浓度过高和使用2，4－D、2，4，5-T等活性极强的生长素，常常可以防止发生遗传性变异，而得到和原材料性状一致的后代。但是和促进腋芽生长途径相比，后代的变异可能要大些，特别是对于遗传嵌合体，不定芽的形成常使嵌合性状受到破坏，而此时只能使用分生组织或茎尖培养的方法。
不定芽也可以在愈伤组织上产生，但如果经过愈伤组织阶股，特别是多次继代的愈伤组织，不但器官发生的能力会逐渐降低以至完全丧失，而且后代的遗传性不能稳定，所以在快速繁殖
中除少数作物外（如菊花、小菖兰、萱草、百合等）常不使用这种方法。
对于不定芽的形成，除特殊情况外一般都要在培养基中同时加入适当的细胞分裂素和生长素。常用的细胞分裂素是6-苄基腺嘌呤，激动素和玉米素（0.l—10.0毫克／升），生长素是吲哚一3一乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸（0.1—10.0毫克／升）。斯科克（Skoog）和米勒（Miller）1957年提出的器官发生的激素调节的概念对不定芽的形成是普遍适用的，主要有：器官发生的性质决定于培养基中细胞分裂素和生长素的比值；细胞分裂素与生长素比值高时有利于芽的分化，低时有利丁根的分化。但外源供应的激素只是一个方面，器官分化的性质还要决定于内源激素的状况。对于不同的植物，使用的激素种类和浓度常有较大的变化。在具体操作时一方面可参考已有的资料或相近种类（同种、同属、同科）的已有结果，另一方面也可能要进行大量的筛选以找到适当的配比。在诱导外植体上不定芽的形成时，除使用高细胞分裂素低于生长素比值的激素配比之外，也经常采用比例接近于1的配比。
（3）诱导胚状体的形成。在自然界只有少数植物，如芸香科，尤其是柑桔属的植物可以通过体细胞胚胎发生而产生胚状体（珠心胚）。但在培养条件下现在已知有30多个科，150多种植物可以产生胚状体。诱导胚状体形成时一般使用胚、分生组织和生殖器官的组织作为外植体。在一个含有丰富还原态氮的基本培养基上（使用最多的MS和它的各种改良形式），在存在生长素，特别是2，4-D时诱导胚状体的发生，然后转移到降低浓度或没有生长素的培养基上使胚状体成熟和生长。
通过胚状体发生途径可以在一个很小的容器中产生比前两种增殖方法高得多的增殖速度，而且由于胚状体是双极性的（同时具有胚根和胚芽），可以免去诱导根的步骤，加上它容易分散，可以减少前两种增殖方法中因分离、切割、接种所需消耗的大量人力．有利于将来实行机械化的操作。如果能够控制好胚状体发生和生长的同步性，诱导休眠和制造人工种子的技术无疑将是最理想的快速繁殖方法。但是目前除柑桔、枣椰、油棕和咖啡等少数作物外，这种方法使用并不普遍。这是因为很多重要的经济作物还不能诱导胚状体的发生，或者产生的胚状体难以形成植株，或成苗率太低。另外遗传性的变异和由胚状体形成的植株的返幼（多年生植物胚状怀长成的植株和实生苗一样要经过一个幼年期才能开花结果）也是重要的障碍。
3．根的诱导
这一阶段的目的是使第二阶段通过腋芽生长和不定芽形成途径得到的嫩枝生根产生小植株，以便移植。如果第二阶段增殖是通过胚状体途径，由于所形成的胚状体本身已存在胚根，只要使胚状体生长就可以形成小植株。有时在第二阶段形成的芽由于细胞分裂素的作用不能伸长，此时可以附加一个芽生长的阶段，将芽接种在去除或含浓度较低的细胞分裂素的培养基中或同时加入少量赤霉素以促使芽长成嫩枝。
很多草本植物不定根的形成是很容易的，但本本植物一般要困难些，其中从成年树得到的材料就更困难。由于生长的嫩枝本身能合成丰富的生长素，所以一部分植物可在无激素的培养基上生根。有的植物需要在培养基中加入适量的生长素类物质来诱导根的形成，一般浓度在0．1—10．0毫克／升，其中使用最多的是NAA，其次是IBA和IAA，很少使用2，4－D。生长素浓度过高时容易引起愈伤组织化和抑制根的生长。对于用上述方法不易诱导其生根的植物可以试用以下几种方法：例如，先用高浓度（100毫克／升左右）的生长素溶液处理嫩枝几小时到一天，用无菌水洗净生长素后再接入培养基；蔷薇科果树，如苹果、苹果砧木、梨等，可在生根培养基中加入适量的根皮苷（Phloglucinol）或根皮酚（间苯三酚）以促进根的形成，浓度约150毫克／升；将第二阶段得到的嫩枝从容器中取出，在有菌条件下进厅扦插，此时也可结合使用生长素粉剂处理，或在试管中诱导休眠器官（如小块茎、小球茎、小鳞茎、地下茎等）的形成，但使用这种办法时，在移栽前往往要进行激素处理或冷
藏一段时间以促进它们的萌发。
目前在第一、第二阶段使用的基本培养基如MS，B5等大都总盐浓度较高，在生根阶段它们也常被采用，但是对于某些植物来说盐浓度显得过高．所以也经常使用1/2、1/3、1/4浓度的高盐培养基或总浓度较低的White,WPM和Anderson等培养基。一般使用琼脂作为支持物，但由于琼脂培养基的通气性能不佳和对抑制物质扩散的速度过慢，所以在使用琼脂培养基效果不
佳时可试用液体培养基加滤纸桥或加入适量的活性炭（1％左右）。也有人使用侄石和其他颗粒状多孔材料作支持物，以改善通气状态，便根系发育良好。
在生根阶段的培养基中蔗糖的浓度常降低到1.0-1.5%,以促使植株增强自养能力。培养条件一般和第一、二阶段相似，有时为提高小植株的光合能力常常将光强度增加到3000-10000勒克斯。
4、移栽
这一阶段是将第三阶段试管中形成的小植株转移到土壤的过程，是极关键的一步，常常由于掌握不好，使试管苗移栽成活率不高而导致整个工作的失败。在这一过程中试管苗要从一个无菌的、光照温度恒定、湿度饱和的培养条件下转移到一个有菌的不稳定的环境条件中。植株要从异养（试管苗依靠培养基中的蔗糖作碳源，不进行光合作用）转变到自养，叶片的光合能力、气孔的适应能力和根的主动吸收能力需逐渐发展；叶片表面的角质层和措质层逐渐形成。所以这一过程尾—个剧烈的转变过程，需要小心控制，使小植株经过逐步锻炼后最终能在土壤中成活。
一般的方法是等到试管中小植株长大并形成大量根时（但在多数本本植物中最好的移栽时间常是在根原基刚刚突起或根长在几毫米时。此时将首取出时不会伤害很，同时带琼脂少移栽后根能迅速生长，很快就固着于土壤并吸收营养），将小植株小心取出后洗去附在根上的琼脂，移栽到加有少量培养液的侄石、珍珠岩、草炭、河沙等人工介质中，或直接种入盆内。有时在移栽前先将培养器皿的盖子打开或弄松，使空气进入容器，待锻炼3一4天后再进行移栽，会得到较好的结果。试管苗移栽后要保持高湿度，放置在散射光下避免阳光直射，温度的波动也不宜过大。许阶段可以在培养室或温室中进行，待试管首根系生长并长出新叶后（一般要2一4周左右）可逐渐通风锻炼，成活的幼苗分栽火盆中或移植到田间。
五、展望和问题
自五十年代快速繁殖技术开始用于生产之后，发展极为迅速。七十年代国际上已经广泛用于园艺作物和其他经济作物。随着技术的不断改进可以进行快速繁殖的植物种类越来越多，特别是近年来对木本植物中的果树。经济材木和造林`树种的研究愈益深入，有可能在不久的将来取得更大的效益。因此，一方面这项技术已基本成熟，应用的前景良好，另一方面它还正处在不断的发展之中，还有很多问题有待于研究解决。
到目前为止，国际上已经积累了大量和快速繁殖技术有关的文献。我国的有关工作虽然起步稍晚，但发展很快，已经形成了一支有一定规模的研究队伍。它包括植物、植物生理、细胞、遗传、农学、林学、园艺和病理等比较广泛的专业，有利于对这个涉及面比较广泛、综和性较强的技术开展多方面的研究。近年来国内已发表了几百篇有关文章和资料，涉及到数百多种作物，包括花卉、蔬菜、经济林木和药用植物等各个方面，并开始应用于生产。农村多种经营的开展和外贸出口的增加，对于优良品种的花卉、苗木的需求量将会迅速地增加，这种形势将快速繁殖技术的研究和推广应用产生越来越大的推动作用。但是由于目前我国这方面的研究成果中可直接应用于大规模生产的还不够多，工作还有特深入，所以在发展中应避免盲目性，防止一哄而起。
为使今后更好地应用和发展快速繁殖技术应该注意以下几个问题：
（1）自六十年代以来，快速繁殖技术以及和它有直接有关系的研究在国内外已经积累了大量的资料。因此，在应用时首先经应该尽可能收集、总结和参考已有文献，避免不必要的重复。但是由于种种原因，资料所反映的方法不完善、效率低，或由于商业上的原因而有所保留等，往往即使已有可以参考的文献资料，对具体的对象仍要进行大量工作，以确定最佳的工艺流程，以免盲目投入生产造成浪费。
（2）由于快速繁殖技术本身还正在发展之中，还有许多问题有待进一步研究解决，需要对以下几方面加强研究。
第一，分化的控制。已知经器官发生和胚状体形成途径而形成植株的已有几百种植物，但仍有想当一部分有重要经济价值的植物（如不少豆科、禾本科和木本植物，特别是成年树）至今仍不能分化或分化频率太低。特别是重要作物的胚状体——人工种子（胚状体包裹营
养成分和人工种皮制成的种子）途径具有效率高，易于自动化、机械化生产等优点，应作为一个长远的课题来进行研究。
第二，离体茎尖的休眠和生长缓慢常常是腋芽增殖方式加速繁殖不能成功的原因，这一点在木本植物特别是成年树中尤为严重。虽然已发现在某些植物（如苹果、杜鹃等）随着继代培养次数的增加腋芽增殖增殖速度会逐渐加速，但还不能肯定这一现象是否带有普遍性。
第三，以往对于快速繁殖过程后期（包括试管苗的生长和增殖、均匀健壮和小型化的试管苗的获得、根的诱导和移栽等）的研究不足，而主要集中于对分化的研究，可是后期繁殖的效率和试管苗的质量对于生产过程来说往往是决定性的。
第四，为了得到稳定和高效的工艺流程，需要对如何在继代过程中保持材料的稳定性和各个阶段的最佳环境条件等方面进行大量的工作，否则难以作为一个完好的生产手段。
第五，对防止培养物的褐变、玻璃苗的形成（在培养中出现的半透明的、生长异常的苗，这种苗不易生根，即使生根，移植后也不能成活）和促使多年生植物的返幼，已提出了不少方法，并有一定的效果，但基本上仍未解决。后两个问题的本质仍不清楚。
第六，大规模商品化生产中，容易忽视培养物污染的问题，特别是生长缓慢和肉眼不易发现的细菌，常因疏忽没能及早发现而导致大量培养物的污染。在某些木本植物中还因为系统感染而难以用常规的消毒方法得到无菌的材料。已有报道，某些商品生产的园艺作物的试管苗带有能引起多种植物病害的胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）。所以污染的鉴定、消除和无菌培养物的保持仍是值得重视和研究的问题。
第七，目前国内外对快速繁殖过程中的遗传变异和表型遗传变化的研究还不多，需要加强。（3）为了更好地发挥快速繁殖技术的作用，必须一方面加强它和其他生物技术（特别是去病源技术、突变体选择技水、培养物贮藏技术）的结合；另一方面加强和常规的育种、选种、引种、栽培等技术的结合，使它真正成为完整的生产过程的一个环节。
（4）加速实现工厂化生产。目前多数工作还停留在实验宝和小规模生产的阶段。由于生产上对各种作物的需要量不尽相同，对于某些需要量大的花卉和木本树种应进行高度集约化的工厂化产。在完善这些作物的实验室工作的同时，应注意加速以下几个方面的工作。
第一，加速中试基地的建设，使它成为检查工艺流程的合理性、稳定性，进行成本核算和培训人员的基地。
第二，加速工业化生产所需设备的试制和厂房的设计应包括较先进合理的培养室、温室，适合于不同需要的培养容器，商品化培养基等等）。从现有实验室生产的试管苗的成本分配如何利用日光能、工厂余热、地热等应认真考虑。来看，能源消耗占有极大比重，因此如何节能，第三，加强市场的预测和试管苗产品的包装、运输和销售的研究。
（陈维伦）第二章植物茎尖培养和去除病毒
近年来，由于温室等保护地栽培不断扩大，虽然提高了复种指数和土地利用率，但因植物周年生长，寄主及病原媒介的密度增加，导致病害问题日益严重。其中以病毒病最难控制，成为当前农业生产上的严重问题。病毒的危害是多方面的，浸染的病毒使寄主代谢异常，使激素的正常平衡受到破坏，因此造成植物生长的抑制，或形态畸变，产生皱缩、花叶、杂斑等许多症状，产量大幅度下降，同时品质（如花色、花数、果实商品性等）变劣。病毒对无性繁殖作物，例如薯类、甘蔗、花卉、林木和果树等危害尤甚。这些植物受病毒浸染后，由于病毒能周身分布，可经繁殖用的营养器官传至下一代。这就意味着，一经浸染，病毒能随繁殖代数增加，不仅能绵延不绝，还会日益增加。其结果能使植物发生退化，甚至导致某些品种的绝灭。据资料，浸染马铃薯的病毒多达三十种左右。在我国大田生产中，已难以在许多推广品种中找到无病毒植株，这是我国马铃薯长期低产而难以解决的原因。另外，现在人们越来越多的发现病毒可经种子传递，致使许多有性繁殖作物，特别是豆类作物的病毒病已成为难题，有些良种甚至失去了育种上的价值。由此可见，防治病毒病已是农业生产上十分迫切的任务。
一、防治病毒病的几个方法
大体可将防治病毒病的方法分为三种类型：
1．物理学方法
很多因子，例如X射线、紫外线，超短波、以及高温处理，都能使病毒钝化，其中以热处理最常用，这里稍加详细介绍。
早在1889年，爪哇就有人利用热水浸泡甘蔗种，其好处是能使一种病害（后来知道是病毒病）大为减轻。热处理方法的依据是：病毒和寄主细胞对高温忍耐性不同，利用这个差异，选择一个温度和适当的处理时间，就能使寄主体内病毒失活，而寄主仍然存活，从而达到治疗目的。至今仍有数以万吨计的甘蔗种进行这样的处理。热处理能治疗多种果树黄化病，但最早证明热处理能使病毒失活的是英国科学家卡尼斯（Kassanis,1950），他发现马铃薯块茎经20天贺37℃高温处理，其中存在的卷叶病毒消失了。他统计过，大约一半以上浸染园艺作物的病毒能以此法使其钝化。
处理分热水和热空气，前者对休眠组织更适用，热气对正在生长组织好些，在应用时也更方便。例如将茎切段放在热处理箱中，温度在35—40℃,处理时间因植物种类及器官生理条件不同而异，短至几十分钟，长至几个月。例如有人以38℃处理石竹茎尖，经二个月热处理，使其病毒全部失活。在开始几天，处理的温度应逐渐上升，现在大多数人应用变温交替，并加辅助光照，注意处理时的湿度，这样既能使体内病毒钝化，又能保证一定程度寄主存活率。例如对石竹来讲，处理的湿度应保持在85—95％。热处理只对那些等周病毒以及菌质体引起的病害有效，对线状或杆状病毒的作用不大。
2.化学方法
使用农药是防治植物真细菌病害的主要方法, 理论上讲，也应该是防治病毒病的有效途径。有不少化学物质能抑制病毒复制，例如孔雀绿、硫尿嘧啶、8-鸟瞟呤、以及某些病毒抑制剂，如Virazole以及蛋白质，核酸合成抑制剂。但因病毒生物学特点，以及它与寄主代谢关系密切，致使寻找能区别地抑制二者的药剂十分困难，因为以上药剂都能毒害寄主，而不能在生产上使用。
3、生物学方法
有些病毒不能浸染种子，因此用种籽繁殖能排除大多数病毒，达到复壮目的。但有性过程不能维持无性繁殖作物种性，使这一方法受到限制。茎尖分生组织培养是目前最有效的治疗方法，几乎对所有病毒都有效，周期短，效率高，另外能与快速繁殖相结合。其它组织培养也用来去除病毒，但缺点是常常导致变异。
二、茎尖培养的历史和现状
我们已经知道，在植物体内，病毒随着寄生的辅导组织传遍全身，但是，它分布并不均一，这种不均一的现象早在三十多年以前，就被人们发现。怀特（White，1943）用离体的方法成功地培养了被烟草花叶病毒浸染的番茄根，他将培养产生的根切成小段，并对每一切段进行病毒鉴定，发现在各个切段内病毒的含量并不一致，在近根尖的小段中，病毒的含量很低。在根尖部分，则全然不能发现病毒。利马塞特（Limasset)和科纽特（Cornnet）（1949）发现在茎中也有同样的现象。愈接近茎顶端病毒的浓度愈低。
植物病毒在体内分布的不均一性促使人们进行一系列试验，企图利用无病毒组织产生无病毒植株。开给有人用嫁接或扦插的方法。在有些植物上，这种方法是有效的，产生的植株症状大为减轻，或完全消失，但对大多数病毒来讲，这种方法是不适用的，因为只有在茎的分生组织部分才维持无病毒，这样的部分一般来讲是很小的。仅在0.5毫米以下，因此直接用这样小的组织作接穗或插枝是不大可能的，必须创造更有效的方法。
现在为大家所熟悉的植物组织培养方法，在当时已得到迅速的发展。一系列培养上的困难的解决，为离体培养茎尖无病毒组织的成功提供了可能。首先用这种方法获得成功的是法国人莫里尔和他的同事们，他们用大丽花为材料，在952年试验产生了无病毒植株。在1955年又以马铃薯为材料产生了无病毒植株。
莫里尔等人的成功，引起了人们极大的兴趣，有人评价这是为治疗植物病毒病打开了一个新的途径。继法国之后，很多国家也开展了大量研究，实验的材料除马铃薯外，还有白薯、甘蔗、兰花、石竹、葡萄、草莓、菊花、花椰菜以及其他重要经济作物等60多种。很多植物都用
于生产实际，成为植物组织培养解决生产问题的突出例子。植物组织培养产生无病毒原种是植物组织培养领域中的重要内容。这里需要对目前使用的名词作一说明，文献中经常采用的名词有“分生组织培养”、“生长点培养”、“茎的分生组织培养”、
“茎的顶端培养”、“茎尖培养”。这些名词的实际含义相似，其实，在实际操作中，并不单纯培养分生组织，而包括一个或几个叶原基，还附带茎的部分组织。因此严格地说，用“茎尖培养”一词较为合适。
马铃薯茎尖培养是其中最成功的例子之一，现在，几乎所有生产马铃薯的主要国家，都在生产中使用着一技术，有人统计至1975年为止，用这种技术产生无病毒马铃薯的品种已达150个左右，以前那些长期难以产生无病毒植株的品种，也很快获得了成功。
在我国，这方面的工作也已开展，最初，吉林农业大学、辽宁省农业科学院和黑龙江克山农业科学研究所进行了某些初步试验，取得了一定进展。从1974年开始，中国科学院植物研究所相继和黑龙江克山农业科学研究所、内蒙古乌盟农业科学研究所，以及中国科学院微生物研究所、遗传研究所、动物研究所和内蒙古大学等单位协作，开展了马铃薯茎尖培养为中心的实用化研究，取得了很快进展。
三、茎类培养用于防治病毒病的
一般过程
治疗病毒病大体需经历以下四个阶段：
1．诊断
首先需了解治疗对象患的什么病，有哪些病原，哪几种病毒。
2．治疗
根据存在病毒种类，采用合适的治疗方法，是采用单一茎尖培养，还是结合化学处理，或高温处理。
3．复查
处理以后，还会有少数有病毒植株存在，而且大多数植物，往往经治疗后，大多数再生植株仍患有病毒病，只有少数是无病毒的，有时无病毒植株只占千分之几，所以复查是十分必要的。还有的因经处理后，体内病毒浓度大大降低，以致开始地机检查时都不能发现，但实际上并没有除于净，经一定时间繁殖又增加到危害程度。因此，治疗后的复查应多次以多种方法进行，确实证明不存在病毒时，才能进入第四阶段。
4、繁殖
治疗植物与治疗动物病不同，它是一个群体，也就是说，必须达到一个足够数量，对有些作物，这个数字是巨大的，必须经过长时间的繁殖。我们知道，浸染病毒很多，途径很多，因此，在繁殖过程中，仍很易受病毒再浸染而失去无病毒植株应用价值。如何防止繁殖中再受侵染问题，是去除病毒工作能否用于生产的更难解决的问题，尤其是需要量很大的大田作物和一些树木。这里涉及到三个工作：一是合理扩大繁殖体系，根据繁殖系数，以及最终生产上需要量等因子确定体系；二是防止再浸染的保种措施，核心是防止传病毒媒介侵袭，特别是防止昆虫；三是对各次繁殖的植株应进行检验。只有完成上述几方面工作，才达到克服病毒造成危害的目的。图2表示茎尖培养去除病毒克服病毒病危害的一船过程。
四、几个环节的技术细节
不同植物在技术细节上是不同的，但原则上有其共同点。这里以马铃薯茎尖培养为例，介绍具体操作方法。
1．茎尖培养再生植株的方法
整个操作可以分以下几个过程：
（1）取材和消毒。原则上讲，所有茎尖都可用以培养。在生长季节，剥离茎尖的芽可直接取自大田，顶芽和腋芽都可适用，但缺点是不易消毒。
另一种方法是取室内萌芽，这里必须特别强调的是注意品种的可靠性，应选择品种性状典型的植株，收获其所结薯块，作为进一步培养的材料。将这样的薯块经过一定时间贮藏，播于室内土箱或砂箱中萌发，因为有些品种很易形成花芽，因此在芽长至4—5厘米，还未充分展叶
时，就应剪取。
剪取2—3厘米的壮芽，剥去外面叶片，放在自来水下冲洗1小时左右，即于无菌室进行严格消毒。我们常用的方法是先用95％酒精迅速蘸浸组织，即用5％漂白粉溶液（或用市售的次氯酸钠溶液稀释为5％）浸泡5～10分钟，然后用无菌水冲洗2—3次，消毒效果可达90％以上。（2）剥离和接种。在无菌室内，把消毒好的芽放在解剖镜下进行仔细剥离，用自制的解剖针效果较好（最细的绣花针固定在玻棒立即行，也可将市售的解剖针进一步磨制）。剥去幼叶，最后暴露圆滑生长点，用自制的解剖刀（取双刃刀片的一部分固定在金属棒上）仔细切取所需茎尖，随即接种子培养基上。
（3）培养。植物组织培养成功的关键，首先寻找合适的培养基，茎尖培养常用培养基列于表2。
对培养器皿无特殊要求，但以此15XZ厘米的试管为宜，每试管装10毫升培养基，每管接种一个茎尖。
接种的茎尖放在培养室内培养，温度25℃，光照1000一3000勒克斯，以日光灯为光源，每天照光16小时为宜。
2．影响茎尖成活的因子
能否通过茎尖培养产生无病毒植株取决于两点：首先，离体茎尖能否成活；其次，成活的茎尖还有没有病毒。
影响茎尖成活的因子很多，主要有两点。
(1) 茎尖大小。离体茎尖的大小是一个关键因子，一般说来离体茎尖愈大，愈易成活，但病毒愈难去除。我们知道，对大多植物来讲叶原基。在我们工作中，一般带1—2个叶原基，使生长点附近的组织尽量少带，这样的茎尖，既保证一定的成活率，又能排除大多数的病毒。我们应尽量使这部分更大些，如果把署块放在较低的温度，较强的光照下进行萌发，并取其粗壮的顶芽，就能获得较大的离体茎尖，提高培养的成活率。
(2) 培养基成分和培养条件。前面提到，基本培养基中提高铵盐及钾盐浓度，有利茎尖成活。表2所列成分是比较合适的，但是附加成分，特别是植物生长调节剂的种类和浓度对茎尖生长和发育具有重要作用。我们常用6-苄基腺嘌呤，浓度为0.05ppm;在培养前期，少量的赤霉素有利于茎尖成活和伸长，但如浓度过高或使用时间过久，会产生不利影响，使茎尖不易转绿，最后叶原基迅速伸长，生长点并不生长，整个茎尖变褐而死掉。生长素的作用是不可缺少的。我们常用奈乙酸，浓度范围为0.1—1ppm。
不同品种对生长调节剂的反应十分不同，因此必须结合培养条件灵活掌握。
离体的茎尖有以下三种生长发育的类型：
生长太慢。接种的茎尖不见明显增大，但颜色逐渐变绿，最后形成绿色小点。有人认为这时茎尖进入休眠状态，我们认为这是由于生长素浓度偏低，或培养温度低所造成，如果立即转入稍高生长素浓度的培养基中，或适当提高培养温度，就能促进茎尖生长。
生长过旺。接种后茎尖明显增大，一周内即在茎尖基都产生愈伤组织，很少看到茎尖伸长，颜色一直较淡，这说明所用生长素浓度偏高，或光照大弱．温度过高，在这种情况下应立即转入生长素浓度较低的培养基中，或降低温度，提高光照强度，不然最后形成半透明的一团愈伤组织。丧失发育能力。
生长正常。在正常情况下，接种茎尖颜色逐渐变绿，基部逐渐增大，有时形成少量愈伤组织，茎尖也逐渐伸长，大约一个月左右，即可看到明显伸长的小茎，叶原基形成可见的小叶，说明各因子都很合适，这时可转入无调节剂的基本培养基中，茎尖继续伸长，并能形成根系，最后发育成完整小植株。
根据不同的茎尖生长类型，改变生长调节剂（主要是生长素）的浓度及处理时间，结合合适的培养条件能使茎尖成活率大大提高，有时达到80％以上。
培养基硬度也很重要，因为琼脂不同，用量也有差异，培养基较软有利于茎尖成活，有时琼脂用量可降到4.0克／升。
为了得到良好的根系，有人建议用液体培养，用滤纸桥做支持物，效果较好，但比较费事。
3．影响病毒去除的因子
不同种类的病毒去除难易的程度不同，奎克（Quick）发现，由只带一个叶原基的茎尖所产生的植株，全部除去了马铃薯卷叶病毒，而其中有80％植株除去了马铃薯A病毒和Y病毒，从茎尖获得的500株植物中，只有一株是除去了马铃薯x病毒的。作者推测这和病毒在茎尖附近的分布有关。
根据一些资料，有人按去除的难易列了一个顺序，它们是：马铃薯卷叶病毒、马铃薯A病毒、马铃薯Y病毒、奥古巴花叶病毒、马铃薯M病毒、马铃薯X病毒、马铃薯S病毒和纺锤块茎病毒，以上顺序并不是绝对的，会因不同的培养条件及品种而异，而且同一病毒，不同株系也有很大差异。有人做了这方面试验，结果如下表：
前面已经说过，化学治疗还未用于生产，但能用于提高茎尖培养中去除病毒的能力。例如在培养基中加入碱性孔雀绿、2，4－D和硫尿嘧啶等病毒抑制剂，能显著提高产生无病
毒植株的百分数。
热处理也可以提高培养中去除病毒的能力（表4），现在已被人们广泛采用，取得了很好效果，下面介绍各类病毒对于高温预处理的反应。
马铃薯卷叶病毒、马铃薯A病毒和马铃薯Y病毒，对于这三种病毒，如果不进行高温预处理，所得无病毒植株的百分数也相当高（可达80％左右）。因此，如果只是除去它
们，并不必进行这样的处理。
高温预处理显著提高对奥古巴花叶病毒的除去。
对于马铃薯X病毒和马铃薯S病毒，使用常规的茎尖培养方法，所得无病毒植株的百分数是相当低的，通常在1％以下。经过高温预处理，能大大提高无病毒植株的百分数。
纺锤块茎病毒是最难以除去的，用一般的方法很难获得无病毒植株，但经过热处理则可以将它除去。斯特斯一斯密思（Stace－Smith）等人用经过2一14周热处理的茎尖进行培养，在所产生的66株植物中，62株仍存在有纺锤块茎病毒强系，其余4株存在有弱系，他们把这4林的其中一株，进一步处理，经过2—12局的热处理以后，从茎尖产生的植株中，仍然有很高百分数的植物中存在病毒，但是从248株植物中产生了2株无这种病毒的植株。
必须重复强调指出，对病毒去除的结果，有很大的差异，介绍这些资料为了给大家设计茎尖培养试验的方法时参考。有很多人发现，马铃薯X病毒去除的百分数超过1％，
这可能和培养的条件有关。
去除病毒的难易还受其他病毒的影响。有人发现，只有一种马铃薯X病毒存在时，从茎尖培养产生的42株植物中，有34株是无这种病毒的，但是当植物受马铃薯X病毒及其他病毒复合浸染时，从茎尖培养产生的34株植物中只有2株是无马铃薯X病毒的，这就是说病毒之间存在着干扰作用。影响病毒去除的因子是多样而复杂的，以上资料大都是经验性
的。
五、试管苗繁殖方法及其
培养条件的简化
通常，小植株高3—5厘米时就移栽入土，然后进行病毒鉴定。但是，这方法费时费事有时还因移栽死亡而得不到结果。因此，我们先进行再繁殖，方法是把小植株切成每节带一个叶片的切段，平放在三角瓶的培养基上，1—2天中，在基部生出根。然后长出腋芽。半月内又形成带有3一5片叶的小植株，待一定数量后，用其中部分植株直接进行
病毒鉴定。
切段繁殖方法还大大提高了繁殖系数，在我们条件下，每年可达107-8切段长成植株，根系发达。
为了便于进一步推广，我们进行了简化马铃薯无毒幼苗培养条件，目前采用的培养基除蔗糖和洋菜以外，其中有大量元素、微量元素，以及有机成分配制培养基用水为无离子
水。考虑到有些单位不能完全满足以上条件，设计了以下简化培养条件的试验。
（1）配制培养基时用蒸馏水或自来水代替无离子水的试验。结果证明，只要PH调至5.8左右，蒸馏水或自来水对幼苗生长没有什么影响，因此可用蒸馏水或自来水代替无离子水。但事
先要作试验，如北京的自来水因含钙盐较高，长期使用，会造成培养器具混浊，透明性变差，影响照光。
（2）培养基中减掉有机成分的试验（即糖、大量元素、微量元素、洋菜）。考虑到有机成分较难买到（如生物素等），培养基中除去有机成分，若能使幼苗生长正常，将对幼苗繁殖推广工作十分有利。试验证明，去掉有机成分对幼苗生长没有多大影响。
（3）培养基中减掉微量元素成分的试验（即糖、大量元素、有机成分、洋菜）。试验证明，培养基中除去微量元素也不影响幼苗的生长。至于继代培养，长期缺乏这些元素，是否会使幼苗造成微量元素缺乏症，尚无试验证据，有条件购到微量元素加上去为更好。
（4）用食用蔗糖代替试剂蔗糖的试验。培养基中所用蔗糖，能否从食用糖代替化学纯蔗糖。试验证明，两种糖效果完全一致。
（5）自然光照试验。室内无灯光或灯光条件较差的情况下，能否将待培养的幼苗放到室外用自然光照培养，试验，只要气候适宜（10o-30℃）,在散射的太阳光下（遮阴）幼苗生长比室内灯光下健壮得多。
（6）培养基中减去蔗糖及有机成分和微量元素的试验（即大量元素、洋菜）。为朝着敞开培养迈进，我们试图在培养基中除去糖、有机成分、微量元素，只加洋菜和大量元素。试验证明，若在室外自然光照下培养，幼苗能够成活，并能生长，但比有糖的要差的多。这种幼苗是在缺乏碳源供应条件下生长的，自养能力应当是强的，推测移栽于土壤中成活率也会高。
以上试验仅是初步的，简化培养基中的一些成分后，主要表现在对根的长度有一定影响，对地上部分生长影响不大，特别是在自然光照条件下生长的幼苗，叶片比室内对照（完全培养基）要大得多，而且叶色深绿，整个植株比较健壮。
六、无病毒植株的栽培管理
无病毒试管苗是十分细弱和幼嫩的，因此要成功地大量栽培这样的苗子，是一件复杂繁重任务，稍有疏忽．会导致很大损失。我们体会到，要提高无病毒植株移栽成活率，应注意下面几个环节。
1．培育壮苗
移栽成活率主要和苗子健壮有关，尤其受绿色叶片发育情况所影响。我们常用两种方法进行壮苗处理，一是改变培养的条件，降低培养温度在20℃以下，增强光照，在3000勒克斯以上，可使小苗粗壮，叶片扩大，有时甚至可出现复叶。但这种条件很难达到，也难以大量培养，因此常采用的第二种方法是使用生长延缓剂，在最后一次繁殖用的培养基中加入延缓剂B9，浓度为10—50PPm，可视培养条件而变化，经B9处理的苗子明显比对照粗壮，叶色深绿，根系也发育很好，移栽时很易成活。
2．假植
因原种基地都属冷凉地区，，小苗生长期大大长于薯块产生的植株，为了延长生育期，并创造合适的移栽环境，一般采用扣塑料棚进行假植，具体做法是：
（1）扣棚。根据经验，我们扣的棚是南北方向简易塑料拱型棚，每个棚宽2.2米，长5.5米，高1.5米，这样即能便于人在其中操作，又节省材料，也有利保温。
用10个圆的钢筋做棚的支架，每棚纵向一根，横向8根，支架底端弯成钩形，埋土0.5米。实践证明，这样结构较结实，能经得住内蒙初春大风袭击，扣上塑料棚布后，四周用土埋好，在南北端都留有小门。根据从4月5日一15日10天的观察、不同方向的棚，棚内温度相差较大，例如南北方向棚内，中午气温为32—34oC,东西方向的为36.5—39.2oC早晚温度差异不大，这说明南北万向扣的棚内日温差较小，尤其中午温度不会太高，有利无毒苗成活和生长。
扣棚的时间要适当提前，这样可使地温逐渐升高。在1976年，我们在栽苗前20天扣棚，20天内最高气温为36.5oC,最低在零下9.6oC,土温平均每天递增0.14oC，到棚内平均气温稳定在5oC左右。即可移栽。为了使棚内温度上升，夜间应加覆盖物。
（2）假植。如棚后五天灌水一次，每厘地铺施腐熟羊粪50斤，细砂100斤，撒施6％666粉剂5钱，浅翻一次，然后整地作畦，每棚作两个南北向小畦，畦埂宽20厘米。小苗移栽的行距为5. 2厘米，株距为5厘米，棚南端空开20厘米不栽苗。防止阳光烧苗，这样每棚约栽3500
株苗。移栽时先用三角小锄开2厘米的沟。在沟内浇水，以不存水为宜，然后把小苗栽到沟中。覆土后立即用喷壶浇水。使5厘米左右的表土层经常保持湿润。
（3）定植以后的管理。大体可分三个阶段。第一，定值以后5天内，这是关键。这时幼苗非常细弱，从三角瓶到土壤中，环境条件有较大变化，光照、温度和湿度都不如以
前，植株从异养为主变成完全目养，这时植株只有很小的叶片，根系并不发达而且几乎没有根毛，原来的根在吸收无机盐方面是基本没有作用的，稍有不慎，可能死亡。因此，应创造条件促使成活，维持小苗不萎蔫，不经过返苗阶段。在这时期应特别注意光照、温度和湿度，合理地因首因气候掌握这三个因素。一般来说，小苗需要强光，光照是迅速成活的必要因子，有利植株健壮，并使叶片行光合作用。土壤湿度是根系成活的关键，但不宜过湿，必须维持良好的通气条件；空气湿度亦很重要，这时根系主要靠蒸腾作用吸水，如果空气湿度太小，易缺水而造成干枯。应该说较高温度有利成活和生长，但温度不宜过高，在这个阶段应维持相对低的温度，在实际操作中往往不易得到理想的适宜条件，因为保证足够的湿度，除经常浇水，或喷水以外，塑料棚基本是密闭的，这样在白天，尤其是中午，经太阳一晒，棚内温度很易超过35℃，这样不利成活，因此用麻袋在中午遮光，遮光长短根据棚内温度．在内蒙古乌盟原种场即使在5月份，天气仍十分寒冷，有时寒流一到，气温可降至零下10℃以下，因此我们特别注意防寒，除了根据历年气温资料，合理确定移栽时间以外，还采用种种防寒措施，例如在塑料布外面再覆盖麻袋，或棉被，寒流来时，在小窗上加盖牛皮纸，这种方法效果很好。有时虽然棚外气温降至零下10℃以下，棚内空气温度降至零下3℃左右，牛皮纸下由于上温逐渐放热，形城一个小气候，可保持零上，即使这样，我们仍密切注意天气变化，天天定时观察棚内温度，夜里也有人值班，土壤湿度以不使表层上发白为宜，开始浇水应以喷壶喷浇，防止大水冲苗露根。第二，在假植以后5一15天左右，这时，幼苗已产生新根，形成新的叶片，老的叶片自养功能增强。一般说来留下的苗子基本都成活，因此主要目标是维持所留苗子成活，同时应该注意促进其生长，这时可逐渐增加光照和透气时间，基本每天都应浇水，经常用三齿钩轻轻松土，适当施肥。如喷民0.2％磷酸二氢钾作根外追肥，有利发苗。第三，假植后15一35天。植株已开始正常生长，因棚内温度、湿度较高，很易出现旺长，因此除加强水肥管理外，应注意适当蹲苗，控制水分，增强日照，降低温度，可逐渐开始揭棚，但还需注意天气变化，伤止大风暴雨袭击，造成死苗，在这个阶段的后期，应完全如大田一样管理，作好定植以前的准备，在假植阶段获得较为理想的苗子，应是株高
3一4寸，有5片以上发育良好的叶片。
3、定植保苗
定植的大田应选择排灌方便，通风良好，肥力中等的砂壤土，认真做好秋翻、冬灌、施肥、土壤消毒、平地作畦和整地工作。
在内蒙古马盟原种场，6月8日开始第一批定植按行距1.6尸，株距1.4尺的方式挖穴。先挖直径30厘米，深20厘米的“丰产坑”，施入适量的肥料，加入适当的杀虫剂，充分和土混和，再用手挖一小坑，浇上底水，然后移栽，用手复土按实，再点浇水，开始几天需经常注意浇水，这样定植成活率可达90％以上。
在定植以后．仍有地下害虫危害，如金针虫和地老虎，因此仍需注意防治，我们用敌百虫和敌敌畏继续防治。
七、除去病毒以后的应用效果
斯通（Stone，1973）以茎尖培养除去水仙花中拟南芥菜花叶病和水仙退化病毒，所产生的植株比用已经受侵染的球茎产生的植株，花朵更大，花色更艳丽，每茎花数更多，无疑大大提高了水仙的商品价值。
有人报道大黄经去病毒后，叶柄产量增加了60—70％．花椰菜的种籽采自无性繁殖母株，因多年种植而发生退化，经去除病毒又恢复了旺盛生长势。有人得到无病毒无竺葵，通过营养繁殖形成植株的产量提高35％。近年来英国东茂林公可利用热处理和茎尖组织培养，生产了许多无病毒苹果、梨的植株，提高了果树产量和改良了果实品质，该公司为重要无病种苗中心。
人们对马铃薯病毒病的研究历史最长，积累了丰富的病毒引起产量损失的资料。例如马铃薯
X、S病毒，可引起5一75％的减产。马铃薯卷对病毒和Y病毒则更严重，减产幅度为90％左右。复合浸染的后果更严重。
我们系统地研究了去病植株和病株的生理和产量的差异，健株的明显特点是生长势旺盛，与对照相比，健株株高增加63.一186.3％，叶面积114.3一257.1％，茎粗11.1一180.0％，茎叶鲜重50. 0—1l1.1％，并显著促进根和匍匐茎的生长，健株生育期比对照提前，生育期略有延长，健株具有更多更大的花。
由于健株具旺盛生长势，叶色浓绿，叶面积增加，因此，植株较早形成了较大光合作用系统，有利于同化产物产生。又由于健株开花，和结薯都有所提前，有利于同化产物转移至块茎，并在其中积累，明显促进了块茎产量。不仅增加了块茎数量，还显著增加了块茎重量，使商品率明显提高。
（陶国清）第三章花药培养在作物
改良上的潜力
离体培养花药，可以诱导花粉改变正常的有限分裂次的配子体发育途径，而转向无限分裂的产生完整植株孢子体发育途径。我们知道，经过减数分裂产生的花粉植（配子体）细胞的染色体数目比原来体细胞减少了一半，叫做单倍体细胞，由这种单倍体花粉生长分化出的植株，其细胞中染色体只有正常的二倍体植株的一半，这样的植物就叫“单倍体植物”。因此单倍体植物最本质的特征是其细胞的染色体数目和配子体的染色体数目一致，即其细胞中只有一套染色体。这一特点使单倍体植物在作物改良上具有两个极大的用途：第一，当用秋水仙素对单倍体进行人工加倍成为同源二倍体之后，就变成了“纯合系”，这在自交作物杂交有种时加速纯合化和在异交作物的杂种优势利用中迅速获得纯系是极为有用的。第二，单套染色体不存在显性基因掩盖隐性基因的现象，因此将单倍体用于突变育种将会大大提高工作效率。然而，自从1921年首次发现自然界存在着单倍体植物以后的近半个世纪中，单倍体植物实际上并没在人类的经济生活中作出什么重要的贡献。原因在哪里呢？原来自然界发生单倍体的频率很低，只有千万分之一至万分之一，这样低的发生率，当然很难用于育种实践。
随着生物技术的发展，特别是植物组织培养技术进步，植物细胞具有“全能性”的概念已被广泛接受。因此在六十年代中期印度德里大学的两位植物学家古哈（Guha）和马赫施瓦里（Mahehwari) 偶然发现，培养的毛叶曼陀罗（Datura innoxia) 花药中长出的胚状体是来源于花粉的单倍体植物，从此之后，很快引起了各国遗传育种学家的重视。接着有人在烟草和水稻上相继进行了离体培养花药的试验并得到了单倍体花粉植株。从此之后，利用花药培养获得单倍体植株的报道迅速增多，在国际上形成了一股热潮，至今这一领域的研究仍呈发展趋势。这种趋势可从表5中列出的花药培养获得成功的物种数目增长速率上反映出来：
1966年一1976年的10年间，通过花药培养获得单倍体的物种只有39种，平均每年接近4种；而1976年一1980年的4年间为70种，平均每年18种；1980—1983年的3年间猛增
至140种，平均每年47种。这样高速度的发展趋势，反映了国际上对植物单倍体研究工作的浓厚兴趣。因为大家认识到，具有配子体染色体数目的单倍体不仅为遗传学、细胞学的许多基础研究提供了一个便于操作和分析的优良系统，而且更重要的是它在植物改良和育种上有着实际应用的价值。
一、获得单倍体植物的方法
自然界中的单倍体主要是民双胚种子中得到的。所谓双胚种子，是指在一颗种子内同时存在着两个胚。由这种双胚种子长出的两个实生苗不仅有二倍体-二倍体双生、二倍体- 四倍体双生，也有二倍体-单倍体双生。在后一种情况下，两棵实生苗中往往一大一小，小的一株就是单倍体，它们多数是经过无融合生殖，由助细胞、极细胞、反足细胞直接发育来的。双胚种子在自然界的发生率大致在00001—001％，而其中仅有1—10％为二倍体-单倍体双生。可见单倍体在自然界的发生率是很低的。
为了提高单倍体的发生率，曾经试验了不少方法，例如用远缘花粉授粉、先用射线照射花
粉后再授粉、去雄后延迟授粉、授粉后变温处理等。这些方法虽然都有一定的效果但频率仍不高，且不稳定。从六十年代中期以来，在人工诱导单倍体的方法上取得了两项突破性的进展，这就是花药培养法和染色体消除法。
1．在花药培养法
花药培养技术的细节，不同植物有些差异，但概括说来主要要注意两个因素，即内因和外因。内因方面要注意供体植物的遗传差异（基因型）和花粉的发育时期；外因方面主要要掌握好培养条件（培养基的成分、激素水平、温度和光照等）和培养方法（预处理、液体培养等）。经过20年的研究，现在对上述因素已有一定的了解和认识，使花药培养诱导单倍体的频率不断提高。例如，在培养温度上最初多用25℃，现在知道在接种后开始2一8周内，将温度提高到30℃以上可大幅度地提高油菜花粉胚的生成率。如果在最初8—5天将花药置于33℃的高温下，不但可提高小麦花粉愈伤组织和绿苗率，而且还可提高染色体的自然加倍频率。在培养基的改进上，效果也是明显的。最初，水稻和小麦的花药培养多用Miller
培养基和MS培养基，虽然都能成功，但效率较低。为了提高诱导率，我国科学工作者研制成功了N6培养基和马铃薯培养基，大大提高了水稻和大麦花药培养的效率。在培养方式上，开始只用琼脂固化的培养基，后来改用液体漂浮培养花药，使愈伤组织诱导率有所提高。如将预先培养过花药的液体培养基（条件培养基）再次用来进行花药培养，则可使花药培养效率有更大的提高。最近加拿大华裔学者高国楠在液体培养基中加入Ficoll（菲科尔，水溶性聚蔗糖），不仅可以获得大量的花粉愈伤组织，还获得了大量的绿色花粉植株。另外，在接种前对花药进行低温预处理，也是提高花药培养效率的行之有效的方法。
上述所有培养条件和培养方式方法的改良，都是以刺激离体小孢子改变正常发育途径转向雄核发育的途径为目标的。因此对雄核发育过程的研究，从一开始就受到了各国学者的重视。现已查明，离体培养下小孢子的雄核发育方式并没有统一的模式，即便是在同一种植物，甚至是同一药室中的小孢子，雄核发育的途径也不是千篇一律的。图8综合对比了小孢子在活体及离体条件下各种不同的发育模式。在活体中花粉母细胞经减数分裂形成四分体，然后四分体散开，释放出小孢子。新形成的小孢子细胞质浓厚，细胞核处于小孢子中央。随着小孢子和液泡体积的增加，细胞核被挤压到靠近花粉壁，然后小孢子进行第一次有丝分裂，形成一个大而密度低的营养核和一个小而密度高的生殖核，经过一定的静止时期之后，生殖核分裂为两个精子（图3，A）。
在离体培养条件下，虽然四分体时期或双核花粉时期的花药都有成功地诱导雄核发育的报告，但对大多数植物来说，最合适的诱导时期是花粉处于单核中、晚期的花药，即小孢子的细胞核由中央移向花粉壁的时期。离体条件下小孢子雄核发育有如下几种主要方式：
（1）小孢子第一次有丝分裂后，形成一个营养核和一个生殖核。营养核不断分裂形成单培性的愈伤组织或胚状体，生殖核败育。
（2）营养核和生殖核分别分裂，共同建造单倍性的愈伤组织或胚状体。
（3）生殖核分裂形成单倍性的愈伤组织或胚状体，营养核败育。
（4）有时小孢子第一次有丝分裂后形成两个大小和染色性质方面都相似于营养核的子核，这两个子核可分别分裂，形成单倍性的愈伤组织或胚状体。
（5）如果这两个相似的子核间无细胞壁间隔，它们可相互融合，最后形成的愈伤组织或胚状体则是纯合二倍体。
尽管小孢子的雄核发育途径多种多样，但最终形成植株的方式却只有两种，一种是胚胎发生，另一种是器官发生。在胚胎发生方式中，小孢子的行为像一个合子，经过类似活体中胚胎发生的各个时期，最后子叶展开，从花药中直接长出单倍体小植株，烟草、曼陀罗、颠茄等植物多采取这种方式。在器官发生方式中，，小孢子不经历胚胎发生，而是经过几次分裂形成愈伤组织，将愈伤组织转移到降低了生长素水平的培养基上之后，可以分化形成芽和根，最后形成完整植株。这第二种方式（器官发生方式）是花药培养形成花粉植株的最常见的方式。经由胚胎发生途径形成的植株倍性比较稳定，而经过愈伤组织再分化形成的植株经常发生染色体畸变和其他遗传性变异。
2．染色体消除法
用普通大麦（Hordeum vulgare 2n=2x=14）和球茎大麦(H.bulbosum 2n=旦x=z4)进行杂交时，不论正交或反交，总是得到普通大麦的单倍体。经过细胞、胚胎学的研究证明，授粉后受精作用和形成合子都是正常的，但受精卵分裂、发育，形成胚的过程中，来自球茎大麦的染色体很快被排除掉，只留下普通大麦的一组染色体、杂种胚乳在受精后的2—5天也停止了发育。由于单倍性的胚生长势弱、发育迟缓，加之胚乳的过早解体，使得幼胚发育不良，极易败育夭折。因此必须将幼胚解剖出来进行离体培养，才能完成其发育，长成单倍体植株，然后经染色体加倍，得到纯合二倍体植株。实验证明，普通小麦与球茎大麦杂交也会发生同现象，即最后得到普通小麦的单倍体。例如，用“中国春小麦”为母本分别和二倍体及四倍体球茎大麦杂交，并伴以幼胚培养，都可得到“中国春小麦”的单倍体，而以四倍体球茎大麦为父本效果较好（表6），其成功率高达23.2％。这样高的单倍体植株的诱导率，在小麦花药培养中是很难达到的。
球茎大麦为一种多年生野生型的异花传粉植物，弱冬性。为诱导其开花需要经低温（10℃或更低些）和短日照（8一10小时）处理约8周左右。如用它和普通小麦杂交时，为了提高结实率和有胚种子的百分率，于授粉后的1—3天每日用75PPm的GA3（赤霉素）给每朵小花喷雾，延续2—3日，然后剥取幼胚进行离体培养。
二、单倍体的用途
单倍体为遗传学和细胞学研究提供了一种理想的实验材料。例如在研究单个等位基因的表现及其对植物的生理学和形态学剂量效应时，单倍体植株可以说是一种独一天二的好材料。在研究非同源染色体之间是否发生配对时，单倍体同样是无与伦比的好材料，这类研究可以阐明种内染色体的重复水平，是了解物种系统发育的很有意义的资料。除此之外，单倍体在植物改良上具有多方面的应用前景。
1．在自交作物育种中，加速纯合化和提高选择效率
在自交作物常规育种的谱系方法中，杂交后得到F1种子一般要通过连续大约5一7代的自交，方可达到高度纯合。因此，这一方法的缺点是费时、费工和占用较多的土地，并且早代的杂合优势往往使育种者发生误选，从而大大影响了选择效率。
单倍体育种法是从杂交后的F1诱导单倍体并进行染色体加倍得到纯合二倍体，这样在一个世代中就可得到纯系。它和传统的谱系法相比大大加快了得到纯合系的时间，因此可节省时间、土地和劳力。不仅如此，加倍单倍体在育种中更大的效益可能表现在提高选择效率上，单倍体加倍成纯合二倍体以后，其表现型和基因型是一致的，因此从表现型上就可以容易地区分不同的基因型，这样可以大大降低误选的频率。图5表示了单倍体用于杂交育种时提高选择效率的一般情况。
2．在异变作物中快速获得纯系
利用异交作物（如玉米、高粱等）的杂交优势可以大幅度地提高其生物产量，但首要的条件是必须取得一定数量的自交系（纯系）。用常规方法要花费大量的人力和时间，进行多代人工自交（一般需6代以上）。如对异花授粉的作物进行花药培养，产生花粉植株，经加倍后就得到纯合系，这样只要一个世代就可以得到自交系，大大缩短了选育自交系的年限。
经花药培养得到的花粉植株，也可直接用作杂交亲本，最好的例子是利用马铃薯的杂种优势。栽培马铃薯是四倍体，具有48条染色体（2n=4x＝48）。通过花药培养可以得到24条染色体的双单倍体植株（2n＝2x=24），这种双单倍体是部分可育的。用双单倍体和双单倍体杂交，或四倍体和双单倍体杂交，某些组合的块茎产量可显著提高。虽然目前对这种双单倍体杂交所产生的杂种优势的遗传基础尚不清楚，但这一事实已被利用。有些作物的基因组关系与马铃薯类似，也可以考虑利用双单倍体杂交产生杂种优势。
3．提高突变育种的效率
用辐射方法或化学方法进行诱变育种，通常只能得到百万分之几的诱变率。由于在诱变过程中很难使等位基因的两个成员同时发生变异，而单个的隐性基因的突变往往被显性基因掩盖，在处理的当代表现不出来。为了使这些隐性变异不致被淘汰，处理当代的种子要全部收下，连续播种，工作量之大是可以想像的。即便如此，也有许多有用的突变基因被显性掩盖而被淘汰，
这是很可惜的。如果用单倍性细胞或植株进行诱变处理，由于不存在第二套染色体，单个基因突变能直接表现出来，可大大加快获得突变体的速度。例如艾
贝尔（Abel）曾用X射线照射金鱼草单倍体和正常二倍体的幼苗，结果在单倍体幼苗中出现了大量叶色嵌合变异，颜色的变化从黄、绿一直到白色都有，而二倍体没有发生任何可以觉察的变化。在矮牵牛花色的变异中也发现了和金鱼草中发生的类似现象。田中用射线照射单倍体水稻植株，从440棵被处理的植株中得到了约40％的突变体。我国有人用Y射线照射烟草单倍体愈伤组织，用较低的剂量就能得到很高的突变率，变异类型甚为丰富。从上述几个例子可以看到，将单倍体细胞用于诱变是获得变异体的最简单、快速、有效的方法。单倍体突变育种常用的方法有；
（1）用大剂量的X射线或Y射线处理花药，或用化学诱变剂处理花药，然后进行花药接种。
（2）在培养花药的培养基中加入化学诱变剂。
（3）用大剂量的化学诱变剂处理单倍体小植株
（4）将单倍体小植株长时期（如100天）暴露在Y射线之下。
4.获得异源附加系、代换系和易位系
远缘杂交后进行回交，再对杂种花药进行离体培养，在花粉加倍单倍体植株中可以获得异源附加系、代换系和易位系等各种重组体，使有用的异源基因或染色体片断或整条染色体转移到栽培作物。例如，用普通小麦和黑麦进行属间杂交，得到八倍体小黑麦，再用普通小麦对其进行回交，然后取F1 花药进行离体培养，在花粉植株中可以得到稳定的异源代换系和异源附加系（图6）。再如水稻“取手2号”为秘粳杂种，带有抗稻瘟病的Pi-Z t基因。用“取手2号”和丰产栽培品种“京系17号”水稻杂交，回交后对F1进行花药培养，只用了两年时间就将Pi－Z t 抗稻瘟病基因转移到“京系17号”，从而有成了抗病、高产的“中花8号”和“中花9号”水稻优良品种。
5．超雄植株的获得
石刁柏（Asparagus offcinalis）是一种高档蔬菜，在欧洲很受人们欢迎。此植物为雌雄异株，雌株的性杂色体为XX，雄株的性染色体为XY。雄株质量好，产量高，在自然交配的情况下后代中雌雄株各占1／2。用花药培养方法培养维株花药，单倍体植株染色体加倍后，除可得到正常的雌株（XX）之外，还可以得到自然界不存在的超雄植株（YY），经无性繁殖，可以得到大量超雄植株的试管苗。用这种超雄植株和正常的雌株交配，得到的后代将全部为雄株（X Y）。
三、我国花药培养的成就和问题
由于花药培养诱导单倍体的目标明确，技术好学，设备简单，因此这一技术传入我国后在七十年代初期很快形成了花药培养高潮。七十年代后期这种高潮逐渐平息下来，一些条件较差的基层单位下马了，基础比较好的单位坚持下来，工作向纵深发展，并在理论和应用两方面都取得了很好的成绩。但纵观花药培养的现状，仍有不少问题需要研究解决。
1．花药培养在应用方面的成就
据我国科学工作者胡含统计，目前（1984年）用花药培养方法已育出80多个水稻花粉新品种和新品系，其栽培面积在250万亩以上，其中“花寒早”、“中花8号”、“中花9号”都已大面积推广。小麦方面也已获得20多个新品种和新品系，其中以“京花一号”栽培面积最大，已达100万亩左右。在玉米自交系和优良组合的选育上，应用花药培养也已取得了很好的成绩。玉米花粉植株的诱导难度较大，至今国外的诱导率仍很低。经我国科学家的努力，已在约100个玉米材料上得到了花粉单倍体植株，经染色体加倍获得了许多具有很好配合力的玉米自交系。例如“群花”便是一个加倍的玉米花粉单倍体，它和411配合，显示出高产和抗病的特性，是一个优良杂种，被命名为“花育一号”。
2．花药培养和单倍体育种的几个问题
促成我国花药培养七十年代初期的高潮和七十年代末八十年代初的低潮的原因是多方面的，其中有人为因素，也有科学发展规律本身的必然性。有趣的是，单倍体育种所经历的道路和遇到的问题同多倍体育种有很多相似之处。当1937年发现秋水仙素可以诱导多倍体之后，不少人将其视为大幅度提高作物产量的灵丹妙药，在各种作物上进行了广泛的试验，结果收效甚
微，因而失去了信心。经过近半个世纪的探索，现在似乎可以明确地说，多倍体育种虽然在某些作物（如小黑麦）上不失为最有希望的方法之一，但它并不是植物改良的万灵药方。利用花药培养诱导单倍体，加倍之后用于育种，如上所述在我国已取得了很好的开端，但如果对这种方法期望过高，脱离实际，甚至企图用它取代常规育种，将是一种不切实际的想法，因为对单倍体育种法，在理论上尚有不同的观点，在技术上也远未达到尽善尽美的地步。概括起来，花药培养单倍体育种存在以下几个问题需要解决。
（1）有人指出，作物的许多重要农业性状是由多基因控制的，而单倍体育种只经过一次减数分裂，基因重组的机会也只有一次，因此很难将优良性状分离出来。也就是说用单倍体育种法不太可能培育出优良的新品种。
（2）花药培养的效率目前普遍较低（烟草除外），有些重要的经济作物如棉花至今尚未成功。而诱导率的高低主要受作物本身遗传因素的控制，目前尚无根本的解决办法。这就大大地限制了花药培养在育种上的普遍应用。
（3）禾本科有些重要的经济作物如小麦、水稻等的花粉单倍体植株中，白化苗的比例较高。白化苗不能进行光合作用，无法自养，在育种上没有利用的价值，因此是一种很大的浪费。目前只知道白化苗的形成和培养温度有关，特别是花药接种后最初几天内的培养温度甚为重要，温度高白化苗出现的比率就高，此外，白化苗在植物的种间差异也很明显，水稻、小麦大致有50％为白化苗，小黑麦有的品系高达9o％为白化苗，而玉米花粉植株中白化的比率极低。虽然对白化苗的成因国内外都曾进行了一些研究，但至今尚无控制制其发生的有效的措施。
（4）花药培养单倍体育种和常规育种结合得不够紧密，在有的单位中甚至相互对立，无法合作。这样一来，做花药培养的人不得不花很多时间去做杂交和后代选育工作使花药培养本身存在的问题得不到深入的研究。做得好的单位是将花药培养纳入常规育种的计划之中，作为常规育种的一个环节。搞花药培养的人只负责诱导单倍体和染色体力加倍，杂交组合由做常规育种的人提供，得到的加倍单倍体交回搞常规育种的人去选育，实行一套材料，两种手段。这样两方面都可扬长避短，工作进展自然会加快。
（5）过去对花粉植株的纯合性强调的过多，而对其变异现象重视不够。越来越多的事实说明在花粉植株中存在着广泛的变异，这实际上也是一种体细胞无性系变异，今后应有意识的加强研究和利用这一现象，使其在作物改良中发挥应有的作用。
（6）如前所述，单倍体在诱变育种上潜力很大，然而我国进行花药培养的目标多为得到纯合系，对单倍体用于诱变育种注意不够。今后应加强这方面的研究，特别是将单倍体突变育种用于那些多年生营养繁殖的观赏园艺花卉植物上，将会取得很好的效果。
（孙敬三）
第四章植物胚胎培养
精卵结合产生了结合子，结合于经过多次分裂形成胚。双子叶植物的胚分为原球胚、心
形胚、鱼雷形胚和成熟胚等四个时期。成熟胚具有胚芽、胚根、胚轴和子叶等。植物胚胎培
养就是采用人工的办法从种子中把胚分离出来，然后放在人工合成的培养基上培养，使它发
育成正常的植株。在植物细胞和组织培养中，发现许多细胞和组织能够产生许多与胚相似的
结构，我们把它称为胚状体，它起源于非合子细胞，因此也称它为体细胞胚。
一、植物胚胎培养的历史
植物胚胎培养技术早在1994年由汉宁（Hanning）首先做了试验。他把萝卜和辣根属植
物未成熟的胚培养在含有蔗糖、无机盐、氨基酸和植物提取物的各种培养基上，结果胚得到
了充分发育，并获得了可移植的实生苗。由此证明了胚可以离开母体在人工合成的培养基上
生长发育。早期胚胎培养工作的目的性不明确，所以胚胎培养技术发展不快。二十年代以后，胚胎培养工作紧密联系育种实践，才得到了迅速的发展。莱巴赫（Laibach）首先用胚胎培
养技术培养了亚麻的种间杂种胚，得到了杂种植株，克服了杂交不亲和性。它的工作给从事
远缘杂交工作者一个很好的启示。在远缘杂交中往往由于胚发育不全而败育或者胚不能萌发
等而使远缘杂交不能成功，如果将这类胚在适当时期取出，放在人工合成培养基上，就能使胚
发育成正常的植株。图基（Tukey）（1934）进行了核果类的桃胚培养，克服了核果类
胚的后熟作用，提高了杂种胚的萌发率，缩短了育种周期，为胚胎培养应用于生产实际奠定了基础。范奥弗比克（Van Over-beek，1942）等在培养蔓陀罗早心形胚的时候，在培养基中加入椰子乳，发现可以使胚迅速生长，在六天内由0.15毫米长至8.0毫米，增加了500倍，因而确定了椰乳对幼胚的发育和分化具有显著作用。他们称椰子乳中能促进胚生长和分化的因素为“胚素”，并发现椰乳经高压消毒后“胚素”即失去效用。这个发现对幼胚的培养起了很大的推动作用。
我国植物胚胎培养工作起步并不晚，李继桐等（1934）成功地培养了银杏的离体胚，并发现银杏胚乳提取物对胚生长具有促进作用。罗士韦等（1943）也成功地进行了云南油衫和铁杉的幼胚培养研究。解放后我国科学工作者已广泛地应用幼胚培养方法，先后成功地开展了向日葵、桃、柑桔等二十多种植物胚胎培养工作。特别在杂种离体幼胚培养工作中与生产实际紧密结合，获得了大白菜x甘蓝，萝卜x大白菜，栽培棉X野生棉，栽培大麦x普通小麦等十多种属间或种间的杂种植株，并获得了一批新品种。如中国农业科学院蔬菜研究所从1963年开始培养大白菜和甘蓝的远缘杂种胚，培育出了“白蓝”新品种。中国科学院植物研究所与北京市农业科学院协作，用胚胎培养技术培育出早熟桃新品种“京早三号”。这些工作说明了胚胎培养工作在生产实践中起到了一定作用。目前植物离体幼胚的培养方法已成为杂交育种工作中的一个常规育种的手段，并广泛应用于育种实践。
二、胚胎培养技术及其条件
植物胚胎是否能在培养基中生长，培养条件起着重要作用。而胚胎培养最主要条件是选用合适的培养基，以保证胚继续生长和萌发成幼苗。虽然培养多要根据不同种类的植物而异，但一般来说，愈小的胚所需的营养物质愈复杂，除一般无机盐外，必须加入氨基酸、维生素、生长激素以及天然提取物才能使幼胚正常生长，而比较大的成熟胚只要有无机盐和蔗糖等物质，胚就能正常生长。现将常用培养基及培养技术简单介绍如下：
1．培养基
国外幼胚培养的培养基已经规格化，从市场上就可以买到合成好的人工培养基。常用的培
养基有Tukey(1934)White（1943）、Rondolph－Cox（1943）、Rijven（1952）、Rappaort（1954）、Nitsch（1959）、Nor- stog（1963）、Ranga、Swamy（1961）。
培养基的化学成分主要包活以下几类物质：
（1）无机盐。包括各种大量元素和微量元素，这是胚胎培养中所必需的物质。随着培
养基的改进，其中无机盐的成分和比例也不断变动着，现有的几种配方，无机盐的配合都不
尽相同。
（2）碳水化合物。蔗糖是最好的碳水化合物，一方面作为碳源，另一方面起着调节渗
透压的作用。多尔平格豪斯（Derpinghous,1947）把十种蔓陀罗的胚培养在含蔗糖、葡萄糖、
果糖、甘露糖、甘油等五种不同培养基中，结果证明蔗糖对于大多数种来说是最好的碳源。
里杰温（Rijven,1952）研究荠菜胚的发育，同样肯定蔗糖是最好的碳源。加里宁（Knjinhnh。.JI.,1959）研究小麦胚在不同发育时期的糖代谢，发现在各期中，无论胚或胚乳中蔗糖的含量都比单糖高得多，例如蔗糖与单糖之比，在胚乳中约为5倍，在胚中约为10倍。由此可见，在培养基中加入蔗糖对子胚的生长是有利的。
在红色甘蓝和四季萝卜离体胚的培养中，发现在不同糖类的影响下，花青素的合成和胚生长之间存在着负的相关性，即利于花青素合成的糖类不利于胚的生长。根据利于花青素合成的程度，可以把不同糖类排列如下；甘露精＞鼠李糖＞麦芽糖＞葡萄糖＞乳精＞蔗糖。这点也可以证明蔗糖是最有利于胚的生长的。其他的葡萄糖、果糖、甘露糖等都有人应用，但如果浓度过高对胚有毒害作用。
（3）维生素。常用的维生素有硫胺素、毗哆醇、烟酸、肌醇、生物素等。科格尔（Kogel）和哈根斯米特（Haagensmit）（1936）报道了硫胺素和生物素对胚胎培养有重要作用，而抗坏血酸则不重要。而里杰温（1952）报道了在未成熟荠菜胚中加入各种维生素反而有负的结果。赖来展（1983）在水稻幼胚培养中证明了维生素B1和维生素B6能促进幼胚的生长和发芽。可能
植物的组织培养技术 【学习目标】 1、指导植物组织培养技术的基本原理和基本技术。 2、掌握植物培养过程中使用的无菌技术（重点）。 3、掌握植物知识培养的基本过程及操作。 4、说出被子植物花粉发育的过程及花药例题培养产生花粉植株的两种途径。 5、说出花药离体培养的因素，学习话要例题培养的基本技术。 【要点梳理】 要点一、植物组织培养的基础知识【高清课堂：植物的组织培养技术 高清未发布 课题1：基础知识】 1、植物组织培养的基本过程： 离体的植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化（去分化）。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫再分化。再分化形成的试管苗移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物组织培养的过程可以简要归纳为： 离体的植物器官、组织或细胞（外植体）???→脱分化愈伤组织???→再分化根、芽—→植物体。 2、植物组织培养的理论基础：细胞的全能性 要点诠释： 细胞的全能性与植物组织培养间的关系 ①细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。 植物组织培养的理论基础是细胞的全能性。植物细胞只有脱离了植物体，在一定的外部因素作用下，经过细胞分裂形成愈伤组织，才能表现出全能性，由愈伤组织发育、分化出新的植物体。 ②高度分化的植物细胞仍具有全能性的原因是所有体细胞均来自受精卵的有丝分裂，均有和受精卵相同的一整套遗传信息。 ③植物体的组织、器官的形成，是基因选择性表达的结果，其细胞的全能性受到限制，在离体状态下，其全能性才容易得以表达，表达的过程须经过脱分化和再分化。 ④容易进行营养繁殖的植物细胞，其全能性容易表达，易进行植物组织培养。 要点二、影响植物组织培养的因素 1、无机营养 （1）大量元素：除碳（C ）、氢（H ）、氧（O ）外，还有氮（N ）、磷（P ）、钾（K ）、钙（Ca ）、镁（Mg ）、硫（S ）等元素。 （2）微量元素：包括铁（Fe ）、铜（Cu ）、钼（Mo ）、锌（Zn ）、锰（Mn ）、钴（Co ）、硼（B ）和碘（I ）等。 2、有机营养 （1）维生素类：植物组织培养中经常使用维生素C 、维生素B 1（盐酸硫胺素）、维生素B 6（盐酸吡哆醇）、维生素H （生物素）、叶酸和烟酸等，一般使用浓度为0.1～10 mol ／L 。 （2）氨基酸：有甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白（CH ）和水解乳蛋白（LH ）等，是重要的有机氮源。 （3）有机添加物：是一些成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等的复杂化合物，它们对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。 3、植物生长调节物质 植物生长调节物质是培养基中的关键物质，对植物组织培养起着重要、明显的调节作用。植物生长调节物质包括生长素、细胞分裂素及赤霉素等。
植物组织培养报告内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）
大蒜茎尖的组织培养 谢婷婷江宋青万嫣文吕凌宇一、实验目的 掌握植物组织培养的相关理论知识及操作方法； 通过自行设计并完成实验，提高动手能力和思维能力； 利用植物细胞的全能性，使大蒜茎尖经过脱分化作用形成愈伤组织，再分化为有结构的组织和器官，最终增殖培育出大量品质优良的大蒜试管苗。二、实验原理 植物组织培养是利用植物细胞的全能性原理。植物组织培养是在无菌环境下，将离体的植物器官、组织以至单个细胞，在人工配置的培养基上培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化”。已经脱分化的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化”。 三、实验材料、试剂和器材 1 供试材料 以购于府前菜场的大蒜为实验材料，实验在丽水学院生态学院组培实验室进行。 2 仪器与设备 超净工作台、培养事、电子天平、烧杯、容量瓶、玻璃棒、量筒、移液
管。 3 试剂 70%酒精、95%酒精、0.1%升汞、蔗糖、琼脂条、6-BA（1.5 mg/L；2.0 mg/L）、2,4-D（2.0 mg/L）、NAA（1.0 mg/L；）、IBA（2.0 mg/L）、10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的铁盐、100倍的有机物。 四、实验步骤 1.培养基的配制及灭菌 诱导培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L 出芽培养基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L 生根培养基：MS+IBA 2.0 mg/L （1）将MS母液（10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的铁盐、100倍的有机物）按顺序排列、检查是否失效。 （2）在装有3/4蒸馏水的容器中加入0.7%琼脂和3%蔗糖，加热溶化。（3）依次吸取适量各种母液移到容器中。 （4）用蒸馏水定容到相应体积。 （5）调节pH值(用0.1M的NaOH或HCl调节)至5.8-6.0。 （6）向培养基中加入适量激素。 （7）将配制好的培养基进行分装（20-30ml/瓶）。 （8）用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121 ℃下灭菌 20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（烧杯、培养皿、灭菌水等），需同时灭菌。 （9）将灭菌后的培养基于常温下放置一星期，观察有无污染。
1.（2014广东卷）（16分）铁皮石斛是我国名贵中药，生物碱是其有效成分之一，应用组织培养技术培养铁皮石斛拟原球茎（简称PLBs，类似愈伤组织）生产生物碱的实验流程如下： 在固体培养基上，PLBs的重量、生物碱含量随增殖培养时间的变化如图17所示，请回答下列问题： ⑴选用新生营养芽为外植体的原因是，诱导外植体形成PLBs的过程称。 ⑵与黑暗条件下相比，PLBs在光照条件下生长的优势体现在，，。 ⑶脱落酸（ABA）能提高生物碱含量，但会抑制PLBs的生长。若采用液体培养，推测添加适量的ABA可提高生物碱产量。同学们拟开展探究实验验证该推测，在设计实验方案是探讨了以下问题： ①ABA的浓度梯度设置和添加方式：设4个ABA处理组，1个空白对照组，3次重复。因ABA受热易分解，故一定浓度的无菌ABA母液应在各组液体培养基后按比例加入。②实验进程和取样：实验50天完成，每10天取样，将样品（PLBs）称重（g/瓶）后再测定生物碱含量。如初始（第0天）数据已知，实验过程中还需测定的样品数为。 ③依所测定数据确定适宜的ABA浓度和培养时间：当某3个样品（重复样）的时，其对应的ABA浓度为适宜浓度，对应的培养时间是适宜培养时间。
【答案】（1）细胞分化程度低，容易诱导形成PLBs（2分）；细胞的脱分化（2分）（2）生长起始快（2分），快速生长时间较长（2分）；PLBs产量较高（2分）；（3）①灭菌、冷却（2分）；②75（2分）；③PLBs重量和生物碱含量乘积的平均值最大（3分） 【解析】（1）新生营养芽分裂能力强，全能性容易表达；根据题干可知，PLBs类似愈伤组织，外植体形成愈伤组织的过程是脱分化。（2）据图分析，光照下PLBs的重量高于黑暗条件下，原因可能是光照有利于细胞增殖、叶绿体的形成和进行光合作用制造有机物。（3）①由于ABA受热易分解，所以各种液体培养基灭菌后，冷却，再加入不同浓度的ABA ②根据题干可知，实验50天完成，每10天取样，需要取样5次，4个ABA处理组，1个空白对照组，3次重复，因此每次取样需要记录15个样品中的数据，共需要测定样品数75 ③适量的ABA可提高生物碱产量，当样品的平均值最大时，所对应的ABA浓度和时间为最适。 2.（2014江苏卷）（9分）为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。请回答下列问题： （1）外植体经诱导后形成愈伤组织的过程称为。 （2）在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如右图所示。细胞干重在12d后下降的原因有；培养液中蔗糖的作用是、。 （3）多倍体愈伤组织细胞产生的次生代谢产物量常高于二倍体。二倍体愈伤组织细胞经处理，会产生染色体加倍的细胞。为检测愈伤组织细胞染色体数目，压片前常采用纤维素酶和酶解离愈伤组织。若愈伤组织细胞（2n）经诱导处理后，观察到染色体数为8n的细胞，合理的解释是、。 （4）为了更好地获得次生代谢产物，生产中采用植物细胞的固定化技术，其原理与酵母细胞固定化类似。下列说法正确的有（填序号）。 ①选取旺盛生长的愈伤组织细胞包埋②必须在光照条件下培养
第一章植物组织培养的基础理论与基本知识 第一节植物组织培养的基本概念及类型 一、教学目标： 通过对植物组织培养的概念和植物组织培养的类型的学习,使同学们对植物组织培养技术有大概的了解和认识,让同学们建立起对该学科学习兴趣。 二、教学效果目标： 1、理解、掌握植物组织培养的概念； 2、掌握植物组织培养的类型。 三、教学重点： 1、理解、掌握植物组织培养的概念； 2、掌握植物组织培养的类型。 四、教学难点： 1、理解、掌握植物组织培养的概念； 2、掌握植物组织培养的类型。 五、教学效果评价： 1、为了激发学生的学习积极性和主动性，不宜采用百分制的方法进行评价，而是采用A、B、C、D四个评价等级进行评价。 2、评价标准： A、能用自己的语言对植物组织培养的概念和类型等几个基本概念进行正确的描述，能熟练的判断植物组织培养的类型。能按时按量甚至超量完成
作业，并且无误。 B、能基本用自己的语言植物组织培养的概念和类型等几个基本概念进行正确的描述，能基本会判断植物组织培养的类型。能按时按量完成作业，基本无误。 C、在老师的指引下或参照课本基本用自己的语言对植物组织培养的概念和类型等几个基本概念进行正确的描述，能基本判断植物组织培养的类型。能按时按量完成作业，但错误较多。 D、基本不认真听课，课堂很随意，基本不听老师教导，对所学内容基本不懂，很少作作业。 六、采用理论教学。 七、教学时数： 2学时 教学过程 一、新课导入：约（10分钟） 以同学们感兴趣的动物克隆技术人手，向同学讲述克隆技术基础技术，然后转到植物组织培养技术上来。 二、新课：（约80分钟） 板书： 第一章植物组织培养的基础理论与基本知识
国内外植物组织培养技术的差距 姓名：*** 学号：********* 指导教师：*** 专业班级：生物工程2009级1班 完成日期：2012-06-05
摘要 植物组织培养技术是农业生物技术中最早实现产业化并取得显著经济效益和社会效益的领域，在理论研究和生产实践中具有广泛的应用价值。通过对国内外植物组培的发展概况以及技术差距的分析，指出了我国植物组织培养技术的发展现状、目前存在的主要问题和应采取的措施，并对植物组织培养技术的发展作了展望。 关键词：组织培养概况差距展望 Abstract The plant tissue culture technology is agricultural biotechnology as the first realized industrialization and get a remarkable economic and social benefits of the field, in the theoretical research and production practice has wide application value. Through the domestic and international plant tissue and the development situation of the technology gap analysis, and pointed out the plant tissue culture technology's development present situation, the existing problems and the measures should be taken, and the development of plant tissue culture technology are discussed. Key words：Tissue culture situation gap looking
植物组织培养实验室组培室规划设计 一、实验室要求理想的组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染 源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。规模化生产的组织 培养实验室最好建在交通方便的地方，便于培养产品的运送。实验室的建设均 需考虑两个方面的问题：一是所从事的实验的性质，即是生产性的还是研究性的，是基本层次的还是较高层次的；二是实验室的规模，规模主要取决于经费 和实验性质。无论实验室的性质和规模如何，实验室设置的基本原则是：科学、高效、经济和实用。一个组织培养实验室必须满足3个基本的需要：实验准备(培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌)、无菌操作和控制培养。此外，还可根据从事的实验要求来考虑辅助实验室及其各种附加设施，使实验室 更加完善。在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的 设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规 模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养 程序来没计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格 无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同 时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。二、实验室组成(一)基本实 验室基本实验室包括准备室、洗涤灭菌室、无菌操作室、培养室、缓冲间，是 组织培养实验所必须具备的基本条件。如进行工厂化生产，年产4万-20万， 需3-4间实验用房，总面积60平方米。1、准备室(化学实验室)功能：又叫化 学实验室，进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、 称量、溶解、器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养 材料的预处理等。要求：最好有20平方米左右。要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。分类：分体式-研究性质实验室，分开的若干房间将准备室分解为药品贮藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌 室等，功能明确，便于管理，但不适于大规模生产。通间式-规模化实验室，准备室一般设计成大的通间，使试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。 准备试验的过程在同一空间进行，便于程序化操作与管理，试验中减少各环节 间的衔接时间，从而提高工作效率。此外还便于培养基配制、分装和灭菌的自
植物组织培养的应用及 发展前景 集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]
植物组织培养技术应用及进展 摘要：本文综述了植物组织培养理论的发展，重点论述其再脱毒、快繁、育种与有机化合物工业生产以及种质资源的保存等方面的应用，并对应用的前景作简单的展望。 关键词:植物组织培养；应用；进展 中图分类号： 1.理论起源 19世纪30年代，德国家施莱登和德国动物学家创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特在的理论是植物组织培养的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从传向世界各地，美国植物学家斯等人，用韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。 植物组织培养的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。 植物组织培养的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工上进行培养，这些器官或组织就会进行，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。 植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科 2.植物组织培养发展简史 植物组织培养是20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。它是在人工配制的培养基上，于无菌状态下培养植物器官、组织、细胞、原生质体等材料的方法。 植物细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。20世纪初，曾有人提出能否将植物的薄壁细胞培养成完整植株研究者从胡萝卜根的韧皮部取下一块组织，并在液体培养基中培养，使其分化出了愈伤组织，从愈伤组织又得到胚状体，胚状体转移到固体培养基上继续培养后，获得了完整的胡萝卜试管植株。经过栽培，此植株能够正常生长并开花结果，其种子繁衍出来的后代与正常植株的种子所繁衍出的后代别无二致。根据此实验可以得出以下结论：即不经过有性生殖过程也能将植物的薄壁细胞培养出与母体一样的完整植株。由于植物的每个有核细胞都携带着母体的全部基因，故在一定条件下，它们均能发育成完整植株，这就是所谓的植物细胞全能性。
植物组织培养的基本步骤 成熟细胞离体——（脱分化）——分生细胞——（分裂）——愈伤组织——（再分化）——形态建成————完整植株。 培养基的主要成分 【水分】 【无机盐】1.大量元素：N，P，K，Ca，Mg，S（由相关的无机盐提供） 2.微量元素：Fe，B，Cu，Mn，Mn，Zn，Co 【有机营养成分】1.糖类 2.维生素 3.氨基酸 4.肌醇 5.天然有机物【植物生长调节剂】1.生长素 2.细胞分裂素 3.其他生长调节剂 【凝固剂】琼脂 【其他物质】1.活性炭 2.抗生素 3.抗氧化物质 4.硝酸银 培养基和组织培养用具的灭菌方式 【培养基，无菌水】高压蒸汽灭菌，0.105MPa灭菌15~30分钟 【移栽基质】曝晒，甲醛熏蒸或高压蒸汽灭菌0.14MMPa灭菌1~2h 【接种室，缓冲室】紫外线灯照射30min，或气雾消毒剂 【超净工作台】紫外线灯30min，之后打开风机过滤除菌 【外植体】不同的化学消毒剂浸泡消毒 【接种工具】70%乙醇浸泡或擦拭，之后用火焰灼烧灭菌 【培养室】3%来苏尔喷雾，或甲醛，气雾消毒熏蒸 【皮肤】先用肥皂洗手，接种前用70%乙醇擦拭 【瓶口，管口】70%乙醇擦拭，用火焰封口
【培养瓶表面】70%乙醇擦拭 【台面，桌面】70%乙醇擦拭或喷雾消毒 植物外植体的灭菌方式 【茎尖，茎段，叶片】1. 用70%乙醇浸泡30秒，再用无菌水冲洗1次。 2.用2%次氯酸钠浸泡15min或0.1%升汞浸泡5~10min。 3.若材料有绒毛，最好在消毒液中加入几滴吐温。 4.消毒时要不断震荡，使植物材料与消毒剂充分接触。 5.最后用无菌水冲洗3~5次。 【果实】1.用乙醇迅速漂洗一下，再用无菌水冲。 2.用2%次氯酸钠浸泡10min，用无菌水冲洗2~3次。 【种子】用10%次氯酸钠浸泡20~30min，或0.1%升汞消毒5~10min，然后再用无菌水冲洗3~5次。 【花蕾】1.用70%乙醇浸泡10~15秒，无菌水冲洗一次。 2.在漂白粉中浸泡10min，用无菌水冲洗2~3次。 【根及地下部器官】用0.1%升汞浸泡5~10min 或用次氯酸钠浸泡10~15min，再用无菌水冲洗3~5次。 【消毒后的外植体应及时按照无菌操作技术接种在适宜的培养基上】
第一章 1、植物组织培养：是指在离体条件下，利用人工培养基对植物的器官、组织、细胞、原 生质体等进行培养，使其长成完整植株 2、外植体：在植物组织培养中，由活体（in vivo）植物上提取下来的、接种在培养基上的 无菌细胞、组织、器官等均称为外植体。 3、愈伤组织：指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。 4、应用 一、农业上的应用 1. 种苗快速繁殖(rapid propagation) 2.无病毒苗(virus free)的培养 3.在育种上的应用(breeding) （1）倍性育种，缩短育种年限，杂种优势明显； （2）克服远缘杂交的不亲合性和不孕性（胚培养）； （3）保存种质 （4）创造变异 二、在遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工程、生物工程等方面的应用。用于基因工程技术创造植物新种质。用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。 三、利用组织培养材料作为植物生物反应器 第二章 1、细胞全能性（Totipotency）：指任何具有完整的细胞核的植物细胞都拥有形成一个完整植 株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 2、细胞分化（cell differentiation）：指导致细胞形成不同结构，引起功能或潜在的发育方式 改变的过程。 3、脱分化（Dedifferentiation）：指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构 和功能而恢复分生状态，形成无组织结构细胞团或愈伤组织 的过程。 4、再分化（Redifferentiation）：指脱分化的细胞重新恢复分化能力，形成具有特定结构和功 能的细胞、组织、器官甚至植株的过程。 5、植物组织培养中常遇到的问题以及解决措施 一、污染及防治： 1、真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉。但若是细菌污染，只 要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可使用。 2、用抗生素等杀菌药剂的处理，会影响植物材料正常生长。 二、褐变及防止 （1）选择合适的外植体 （2）合适的培养条件 （3）使用抗氧化剂 （4）连续转移 三、玻璃化问题及其防止
植物组织培养实验室 (组培室规划设计 2009年 05月 31日星期日 10:18一、实验室要求 理想的组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方, 最好在常年主风向的上风方向, 尽量减少污染。规模化生产的组织培养实验室最好建在交通方便的地方, 便于培养产品的运送。 实验室的建设均需考虑两个方面的问题:一是所从事的实验的性质, 即是生产性的还是研究性的, 是基本层次的还是较高层次的; 二是实验室的规模, 规模主要取决于经费和实验性质。 无论实验室的性质和规模如何,实验室设置的基本原则是:科学、高效、经济和实用。一个组织培养实验室必须满足 3个基本的需要:实验准备 (培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌、无菌操作和控制培养。此外,还可根据从事的实验要求来考虑辅助实验室及其各种附加设施,使实验室更加完善。 在进行植物组织培养工作之前,首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解, 以便因地制宜地利用现有房屋, 或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的,实验室规模太小,则会限制生产,影响效率。在设计组织培养实验室时, 应按组织培养程序来没计, 避免某些环节倒排, 引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件, 需要一定的设备、器材和用具, 同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。 二、实验室组成 (一基本实验室 基本实验室包括准备室、洗涤灭菌室、无菌操作室、培养室、缓冲间,是组织培养实验所必须具备的基本条件。如进行工厂化生产,年产 4万 -20万, 需 3-4间实验用房,总面积 60平方米。
器官培养：即离体器官的培养。植株培养：对完整植株材料的培养。 组织或愈伤组织培养:是对植物体的各部分组织进行培养或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株. 细胞培养:是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养. 原生质体培养:是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。 初代培养：芽、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程植物组织培养：是指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。 愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面上产生。 外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。 植物细胞全能型：任何具有完成细胞核的植物细胞，能拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 脱分化:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。 再分化:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。胚状体：在离体过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。 褐变现象：指在接种后，其表面开始褐变，有事甚至会使整个培养基褐变的现象。 继代培养材料的玻璃化：当植物材料不断的进行离体繁殖时，有些培养物的嫩芽，叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常成为玻璃化。 人工种子：通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外被有特定的物质，在适宜的条件下可以发芽成苗的植株幼体。 植板密度：形成的细胞团数/植板的细胞总数×100% 对称融合：双方原生质体均带有核基因组和细胞质基因组的全部遗传信息。 非对称融合：指一方亲本的全部原生质与另一方亲本的部分核物质及细胞质物质重组产生不对称杂种。 继代培养：是初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。目的：繁殖出相当数量的无菌苗，最后达到边繁殖边生根的目的。 细胞悬浮培养：将游离的植物细胞按一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。根据培养基的类型分为: 固体培养（琼脂、卡拉胶等固化），半液半固体培养(固液双层)，液体培养（震荡、旋转或静置培养）。 液体培养的优点：不使用凝固剂，节约生产成本，营养吸收充分；操作过程简化。 组织培养按培养对象可分为：植株培养，器官培养，组织培养，细胞培养，原生质体培养。 植物组织培养一般过程:初代培养，继代培养，生根培养，驯化移栽。 植物组织培养的特点：培养条件可以人为控制，生长周期短，繁殖率高，管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。 组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。 1902年，德国著名的植物生理学家和植物学家哈伯兰特提出了高等植物细胞全能性。1958年，美国植物学家斯图尔德等人，用胡萝卜根韧皮部的细胞进行培养，得到了完整植株，证明了细胞全能性。 怀特于1943年发表了《植物组织培养手册》专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。 腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一，这一比例高时，产生芽，这一比例低时，则形成根，相等则不分化。 标准的组培实验室包括：1、洗涤室，器具的洗涤，干燥和消毒，2、配置室，进行药品的保存，配置，消毒，分装等，3、灭菌室，培养基及使用器具的消毒与灭菌，4、接种室，进行材料的接种，内置超净工作
第2章植物组织培养技术 第二节植物组织培养概述 一、授课章节 第二节植物组织培养概述。 二、学时安排 2学时。 三、教学目标 1．掌握植物组织培养的含义。 2．了解植物组织培养的类型划分。 3．理解植物组织培养的应用原理。 4．掌握植物组织培养的特点和应用。 四、教学重点、难点分析 重点： 植物组织培养的含义、特点和应用。 难点： 植物组织培养的应用原理。 五、教具 电化教学设备，植物组织培养试管苗。 六、教学方法 讲授法，多媒体课件。 七、教学过程 Ⅰ.导入 前面我们学习了有关植物育种的一些知识，今天，请看我给同学们看一样东西(教师拿出试管苗)，问同学们这是什么呢？这就是我们要学的植物组织培养。 II.新课
一、植物组织培养的含义 植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体培养在人工培养基上，给予适宜的培养条件，使其长成完整植株的过程。由于培养物脱离母株在试管内培养，故又称离体培养、试管培养。 二、植物组织培养的类型 植物组织培养由于分类依据不同可划分为不同的类型。 三、植物组织培养的应用原理 （一）植物细胞全能性 植物细胞全能性，是指植物体上每个具有完整细胞核的植物细胞，都具有该植物体的全部遗传信息和产生完整植株的能力。植物的体细胞一旦脱离所在器官或组织的束缚成为离体状态时，在一定的营养、激素和外界条件作用下，就可能表现出全能性，而生长发育成为完整的植株。
（二）细胞的分化和形态建成 （三）植物的再生功能 四、植物组织培养的特点 （一）研究材料来源单一，无性系遗传信息相同 （二）试验经济，管理方便，工作效率高 （三）培养条件人为控制，可周年连续进行试验或生产 （四）生长快，周期短，繁殖率高 五、植物组织培养的应用 （一）优良品种的快速繁殖 （二）脱毒及脱毒苗的再繁育 （三）植物新品种的培育 （四）种质资源的保存和交换 （五）有用次生代谢产物的生产 III.作业 1.简述植物组织培养的概念和培养类型。 2.植物组织培养技术有哪些特点？ 3.植物组织培养在生产上有哪些方面的应用？ 4.通过学习，你对植物组织培养技术是怎样理解的？ 第二节植物组织培养厂房的设计与构建一、授课章节 第二节植物组织培养厂房的设计与构建。 二、学时安排 2学时。
组培复习材料 一、名词解释 1、培养基：是离体植物（外植体）赖以生长、分化的基础，是根据植物的需求，人工配制的含有各种营养成分的营养液。 2、液体培养：把细胞或生物体的一部分，置于液体培养基中使其发育，并不断振荡，使之均匀地在悬浊液中进行培养的一种方法。 3、种子培养：是成熟种子和发育不全的未成熟种子的无菌培养。 4、叶培养：从母体植株上将叶组织（包括叶原基在内）切下，放在无菌的人工条件下使其生长发育形成植株的技术。 5、热处理脱毒：在一定范围内，用高温处理可部分或完全钝化植物组织中的某些病毒而不伤害或很少伤害植物本身的脱毒方法。 6、花药培养：是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花粉的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成杯状体，然后再生植株，或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。 7、连续培养：是利用特别的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。（培养过程中，不断注入新鲜培养基，排掉等体积用过的培养基，或者抽取悬浮培养物，使培养物的营养物质得到不断补充，从而保持其恒定体积的培养。—— 8、分批培养：指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，建立单细胞培养物的培养方式。（细胞生长在固定体积的培养基中，当主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即停止。） 二、简答题 1、MS培养基特点。 答：MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，具有高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐用量大，还有一定数量的铵盐，其养分的数量和比例合适，不需要添加更多的有机附加物，就能满足植物组织对矿质营养的要求，加速愈伤组织和培养物的生长，当培养物就不转移时仍可维持其生存。目前应用最广泛。 2、植物组培生产特点。 答：①和传统的生产方式相比，具有不占耕地、生产不受季节限制而且能够整年连续进行、不受灾害性天气和病虫害影响的特点； ②具有人为可控性，可采用更适合于植物生长的“培养基”代替土壤提供养分和生长调节物质；
名词解释 1.外植体：由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官。 2.愈伤组织：在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松、 无规则）。 3. 植物细胞的脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。 4. 植物细胞的再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化根或芽等器官的过程。 5. 试管苗的玻璃化 植物组培玻璃化苗的1、叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状； 2、整株矮化肿胀、失绿； 3、叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎； 4、叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海 绵组织。 玻璃化现象的预防措施： 1、适当控制培养基中无机盐浓度 2、适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度 3、适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 4、增加自然光照，控制光照时间 5、改善培养皿的气体交换状况 6、控制好温度 7、在培养基中添加其他物质 6.胚性感受态：体胚发生的相对容易程度。 7.人工种子又称合成种子或体细胞种子。任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均可称人工种子。 8.微室培养法：即将细胞培养在很少量的培养基中。 9.看护培养法：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 10.植板效率：已形成细胞团的百分数，即每100个铺在平板上的细胞中有多少个长出细胞团。 11.试管外生根：将生根诱导与驯化培养结合在一起. 试管内生根：茎芽生根诱导有2条途径，其中一途径为试管内生根，在试管内诱导枝条生根叫试管内生根 12.植物离体保存：将离体培养的植物细胞、组织、器官或试管苗，保存于人工环境下，一般需要在低温或超低温条件下进行，以抑制其生长，达到长期保存的目的。 13．超低温保存：低温从4℃往下推，－80℃（干冰温度），－196℃以下的低温称为超低温。 问答题 1. 母液：为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，将培养基中的各种成分按质量的特定倍数称量配制成的浓缩液。 2.植物激素 ⑴生长素类 生长素主要促进细胞分裂的生长，促进细胞脱分化，有利于诱导愈伤组织的产生，生长素与细胞分裂素同时使用有协调作用，在离体培养分化调节中，生长素促进根的形成抑制芽的形成，液体培养中利于体细胞胚胎发生。常用IAA、IBA、NAA、2,4-D。 ⑵细胞分裂素类：促进细胞分裂和扩大，调解器官分化，延缓组织衰老，增强蛋白质合成，能改善其它激素作用，离体培养中，促进不定芽的发生，与生长素协调作用可有效控制培养物的生长与分化。常用6-BA、ZT、KT、2iP。 ⑶赤霉素类：促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠以及诱导单性结实等生理功能。有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。离体培养下，还与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞胚进一步发育成植株。 （4）脱落酸：对某些植物体细胞胚发生的特异基因表达起调控作用，激活相关基因的表达，大量合成贮藏蛋白、晚期胚胎丰富蛋白和少量胚胎发生特异性蛋白。通常低浓度促进体细胞胚发生，高浓度抑制体细胞胚的发生。 3.芽的增殖途径 （一）通过愈伤组织 利用植物细胞在培养中无限增殖的可能性以及它们的全能性，可以对若干种植物类型进行快速繁殖。由这些植物的器官或组织诱导形成的愈伤组织，通过器官发生或体细胞胚胎发生都可以分化出植株。 （二）不定芽形成：产生不定芽的器官：根（福禄考属植物、苹果的某些无性系、悬钩子属植物）、鳞茎（风信子—基部受伤以后）、叶（秋海棠、天竺葵等）。通过培养基中适当配比激素的影响，就是那些在正常情况下不能进行营养繁殖的植物，如芸苔属
植物组织培养实验室设计 一、实验室基本组成 （一）基本实验室 1.准备室： 进行一切与实验有关的准备工作，完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。 要求：最好有25平方米左右。要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。 设备：准备室应具备实验台、药品柜、水池、仪器、药品、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器等。 2、洗涤灭菌室 完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。 要求：洗涤灭菌室根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在25平方米。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿，地面应耐湿并排水良好。 设备：水池、落水架、中央实验台、高压灭菌锅、超声波清洗器、干燥灭菌器等。 3、缓冲间 是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌室和培养室。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。 要求：缓冲间需5-10平方米，可建在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；墙顶用1-2盏紫外灯定时照射，对衣物进行灭菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。 设备：1-2盏紫外灯、水槽、实验台、鞋帽架、柜子、灭菌后的工作服、拖鞋、口罩。
题型：填空15分 选择20分 判断10分 名词解释20分 简答35分 附加题未知 一般培养基不含哪种维生素：培养基中的维生素属于B 族维生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生素 B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。 培养基部分 名称解释： 微室悬滴培养：利用表面张力将细胞培养液置于一张盖玻片表面制成悬滴，将组织或器官外植块接种 培养液中，然后翻转盖玻片使外植块及培养液悬挂在盖玻片下，再置放于一凹形载片之上，最后用熔蜡密封盖玻片四周后放入培养箱中培养的技术。 外植体 由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官。外植体是指植物离体培养中的各种接种材料。包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质体等。 愈伤组织在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松、无规则）。 体细胞胚（体胚） 体胚-离体培养下没有经过受精过程，但经历了胚胎发育过程所形成的胚的类似物，统称为体细胞胚或胚状体。 体胚还可以从花药或花粉培养、离体器官培养、单细胞悬浮培养中产生。 体胚来源于根、茎、叶和它们的组织和细胞，经离体培养而发生的类胚结构，染色体组为两套，可发育成为正常植物体。 胚性感受态 植物组织或器官对外界环境条件所存在的特殊反应状态。 脱分化再分化 脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化根或芽等器官的过程。 指示植物 对病毒反映敏感，症状特征显著的植物 指示植物法 将一些对病毒反映敏感，症状特征显著的植物作为指示植物，用以检验待测植物体内特定病毒的存在。即指示植物法。特点：条件简单，操作方便，经济而有效，只能测出病毒的相对感染力。 试管内生根试管(瓶)内诱导茎芽生根形成小苗时期 试管外生根 瓶外生根技术把生根诱导与驯化培养有机地结合起来，有效缩短育苗周期，节约生产成本，提高了移栽成活率，是一项值得应用与推广的技术。 植物离体保存 将离体培养的植物细胞、组织、器官或试管苗，保存于人工环境下，一般需要在低温或超低温条件下进行，以抑制其生长，达到长期保存的目的。 植物&种质保存 种质保存:在适宜的环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。一般有两种方式，即就地保存与迁地保存。 植物种质资源低温保存意义:防止资源灭绝、节约人力物力、便于交流 范与规
植物组织培养知识点总结第一、二章 1植物组织培养概念、分类、应用、创始人、奠基人 2实验室各分室名称、主要设备、主要功能 3无菌操作技术流程 4表面消毒剂种类及作用效果 5培养基成分及各成分的作用 6植物组织培养三大难题 7那些成分要抽滤灭菌 第三、四章 8植物细胞全能性原理 9名词解释：愈伤组织、脱分化、体细胞胚、人工种子 10体细胞胚的特点 11愈伤组织形成发育的三个时期，两种类型，良好愈伤组织的特点 12植物离体微繁，一般过程，各阶段注意事项 13褐变，影响褐变的因素，克服褐变的措施；玻璃化，无糖培养技术第五、六、七章 14植物脱毒方法、原理 15脱毒率包括两种方面含义 16人工诱导单倍体的三种途径 17花药培养得到的再生植株倍性如何，为什么 18花药培养的应用，花药培养力，一般培养过程。 19离体幼胚培养，胚发育有几种类型各有何特点 20离体授粉离体受精 21简述胚乳培养的意义
第八、九章 22原生质体概念，两种分离方法，纯化方法。 23酶法分离植物原生质体的酶液组成及作用 24简述植物原生质体培养基的特点 25原生质体融合，融合的主要方法 26体细胞杂交过程 27融合产物的种类及特点 28植物细胞无性系变异，特点 29提高植物细胞无性系变异频率的方法 30细胞突变体的类型及对应的筛选方法 植物组织培养知识点总结 第一、二章 1植物组织培养概念、分类、应用、创始人、奠基人 概念：是一种将植物的器官、组织或细胞在适当的培养基上进行无菌培养，并重新再生细胞或植株的技术。 分类：（1）按外植体来源和特性分：植株培养胚胎培养器官培养组织或愈伤组织培养细胞或原生质体培养；（2）按培养方法分：固体培养液体培养固体液体两相培养 应用：（1）克服远缘杂交中杂种不育性，种子无活力或配发育不全的植物获得后代，一年多代育种（2）培育三倍体（3）单倍体育种（4）提高突变频率，筛选变异类型（5）经过细胞融合得到体细胞杂种（6）种质资源保存 2实验室各分室名称、主要设备、主要功能 化学实验室（准备室）
课题1 菊花的组织培养 ★课题目标 （一）知识与技能 1、熟悉植物组织培养的基本过程 2、理解细胞分化的概念及离体植物细胞的脱分化和再分化 3、通过联系农业生产实际，培养学生活学活用，理论联系实际的能力[来源:学|科|网] （二）过程与方法 归纳MS培养基的配制方法，并设计表格比较微生物培养基与MS培养基的配方的异同。 （三）情感、态度与价值观 通过阅读植物组织培养技术的发展史，课下查阅植物组织培养技术在生产实践中应用的资料，关注学生科学态度的教育，拓展学生视野，感受科学技术在生产实践中的重要价值。★课题重点 植物组织培养过程中使用的无菌技术 ★课题难点 植物组织培养过程中使用的无菌技术 ★教学方法 启发式教学 ★教学工具 多媒体课件 ★教学过程 （一）引入新课 上节课我们探讨学习了如何从土壤中分离出尿素分解菌和纤维素分解微生物及其计数方法。这节课我们来学习研究植物的组织培养技术。
（二）进行新课 1．基础知识 知识回顾：联系“植物细胞工程”，回答下列问题： 1．1具有某种生物全套遗传信息的任何一个活细胞，都具有发育成完整个体的能力，即每个生物细胞都具有全能性。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在特定的时间和空间条件下，通过基因的选择性表达，构成不同组织和器官。 1．2植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。 活动1：阅读“植物组织培养的基本过程”，讨论并完成以下问题： 1．3细胞分化：个体发育中细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。 〖思考1〗细胞分化是一种持久性的变化，它有什么生理意义？ 使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。 1．4愈伤组织是通过细胞分裂形成的，其细胞排列疏松而无规则，高度液泡化呈无定形状态的薄壁细胞。 〖思考2〗填表比较根尖分生组织和愈伤组织的异同： 1．5植物组织培养的过程可简单表示为： 活动2：阅读“影响植物组织培养的条件”，讨论并完成以下问题： 1．6材料：植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开化植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。