大孔树脂分离纯化银杏黄酮苷元的研究
马朝阳，吕文平，娄在祥，王洪新*
（江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）
摘要：以银杏提取物的酶水解液为实验材料，研究大孔吸附树脂分离纯化其中的银杏黄酮苷元的工艺。通过静态吸附－解吸和吸附动力学实验，从3种大孔吸附树脂中筛选出非极性YWD07a 为最适合分离纯化银杏黄酮苷元的树脂。YWD07a 树脂吸附分离银杏黄酮苷元的最佳工艺条件为：吸附：银杏黄酮苷元的浓度3．26mg /mL ，pH 5．0，流速2BV /h ；解吸：洗脱体积6BV ，流速3．0BV /h ，乙醇浓度70%。在最优条件下得到的银杏黄酮苷元产品中银杏黄酮苷元含量由18．5%提高到80．5%，回收率为73．6%。
关键词：银杏叶；分离纯化；大孔树脂；银杏黄酮苷元
中图分类号：O658．1+1文献标识码：A 文章编号：1000－2324（2013）01－0040－06
收稿日期：2010－08－12
作者简介：马朝阳（1970－），男，博士，工程师。主要从事食品功能因子离纯化、构效关研究。
*通讯作者：Author for correspondence．E －mail ：hxwang1964@yahoo．com．cn
STUDY ON SEPARATION AND PURIFICATION OF GINKGO FLAVONE AGLYCONE
BY MACROPOROUS ADSORPTION RESIN
MA Chao －yang ，LU Wen －ping ，LOU Zai －xing ，WANG Hong －xin
（State Key Laboratory of Food Science and Technology ，School of Food Science and Technology ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，China ）Abstract ：In this study ，the separation effect of macroporous resin for the purification of ginkgo flavonol aglycone prepared by the enzymatic hydrolysis of the Immobilized B －glucosidase was developed．Based on the results of static adsorption and desorption ，adsorption dynamic ，YWD07a resin was the best one for the separation and en-richment of flavonol aglycone．The optimal separation conditions were as follow ：on adsorption ，flavone aglycone concentration of sample solution ，pH ，flow rate was 3．3mg /mL ，5．0，2bed volume （BV ）per hour ，respec-tively．；on desorption ，volume of elution solvent ，flow rate ，enthaol concentration was 6BV ，3BV /h ，70%（v /v ），respectively．Under these conditions ，the content of flavone aglycone increased from 18．5%to 80．5%in the crude product ，and the recovery of flavone aglycone reached 73．6%．
Key words ：Ginkgo leaf ；separation and purification ；macroporous resin ；Ginkgo flavone aglycone
银杏（Ginkgo biloba L．）又名白果、公孙树、鸭掌树，系最古老的中生代孑遗稀有植物之一，仅存一科
一属一种，
有裸子植物“活化石”之称。银杏为我国特产，其种子、根、叶均可药用［1］。近年来，以银杏叶提取物为添加剂制作的保健食品、饮料以及用银杏叶制成的茶已引起了人们的高度重视。在国外，已经出现
添加了银杏叶提取物的口香糖和巧克力，
可预防老年性痴呆［2］。黄酮类化合物是银杏叶的主要生物活性成分［3］，黄酮含量约为2．5 5．91%。目前已分离鉴定出的共有46种，这些黄酮有95%以上是以糖苷形
式存在的。由于黄酮苷元的生物效价要明显高于黄酮糖苷［4，5］。所以将黄酮糖苷水解为苷元，可以有效
提高银杏黄酮的生物活性，提高黄酮类化合物产品的质量。在前面酶法水解制备银杏黄酮苷元的基础上［6］，本研究拟采用大孔吸附树脂的制备纯度较高的银杏黄酮苷元，从而进一步提高银杏黄酮苷元产品的生物效价和质量。
山东农业大学学报（自然科学版），2013，44（1）：40－45Journal of Shandong Agricultural University （Natural Science ）
大孔树脂为吸附性和筛分性相结合的分离材料，根据有机化合物吸附力的不同及分子量的大小，在大孔树脂上经一定的溶液洗脱而分开。与凝胶树脂及天然吸附剂相比，大孔吸附树脂具有吸附量大，选择性好，易于解吸附、机械强度高、再生处理简便、吸附速度快等优点。利用大孔吸附树脂进行分离和纯化中草药中有效成分及其他天然产物的研究已经越来越受到重视。早在上世纪70年代初就有人利用大孔吸附树脂进行植物化学成分的分离纯化。90年代后，开始用大孔吸附树脂用于黄酮类的分离和纯化、生物碱类的精制等［7－10］。目前国内外使用大孔树脂纯化银杏黄酮还未见报道。本研究选择了三种大孔吸附树脂，通过进行静态吸附试验从中选择出最适宜精制银杏黄酮苷元的大孔吸附树脂，并研究此大孔吸附树脂对银杏黄酮苷元的最佳吸附－解吸条件。为银杏叶资源的深度开发提供技术参考。
1材料与仪器
银杏黄酮酶水解液自制；槲皮素标准品上海康九化工有限公司；分析纯的盐酸、氢氧化钠、乙醇中国医药集团上海化学试剂有限公司；大孔吸附树脂沧州远威化工和西安蓝晓科技公司，各种树脂的物理性质见表1。
表1三种大孔吸附树脂的主要物理性质
Table1The main physical properties of three kinds of macroporous adsorp tion resin
树脂型号Type
极性
Polarity
外观
Appearance
粒径范围
Particle size
平均孔径
Average pore size
比表面积
Specific surface area
YWD07a YWD07k LSA－10非极性
非极性
弱极性
淡黄色
淡黄色
乳白色
0．3－1．25
0．3－1．25
0．3－1．2
9
11
14
≥500
≥450
500－540
KQ－50DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；BC－R202B型旋转蒸发仪上海贝凯生物化工设备有限公司；SHB－3循环水多用真空泵郑州杜甫仪器厂DZF－6020真空干燥箱；巩义市英峪予华仪器厂；玻璃层析柱（φ25?500mm）上海青浦泸西仪器厂；BSZ－100自动部分收集器上海青浦泸西仪器厂；HL－2恒流泵上海青浦泸西仪器厂；DELTA320型pH计梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；Waters600高效液相色谱仪美国Waters公司。
2方法与结果
2．1树脂的预处理
先用95%乙醇浸泡24h，使树脂充分溶胀。湿法装柱，用95%的乙醇以2BV/h的流速通过树脂层，洗至流出液加去离子水不变白色浑浊为止。用去离子水以同样流速洗尽乙醇。将5%的盐酸溶液以4－6BV/h流速通过树脂层，并浸泡2 4h，而后用去离子水以同样流速洗至中性。再用2%的氢氧化钠溶液以4 6BV/h的流速进行碱洗，用去离子水洗至中性即处理完毕。
2．2样品溶液的制备
精确称取2g的银杏叶提取物（GBE）溶于柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液中（可加适量甲醇助溶），按0．1g/mL的浓度加入固定化β－葡萄糖苷酶（以海藻酸钙凝胶珠计），40?水浴搅拌加热水解7h。趁热过滤后减压浓缩至100mL备用。
2．3吸附树脂的装柱
采用常规湿法装柱，装柱前向柱内倒入一定量的水。将带水的吸附树脂，沿着玻璃棒一次性加入层析柱中，同时开启柱底活塞，水从底部缓缓流出，使树脂自然沉降而不留气泡，注意在装柱过程中始终保持液面高出树脂层面20cm以上。
2．4静态法筛选大孔吸附树脂
2．4．1大孔树脂吸附容量及吸附率的测定称取预处理好的树脂2g，装入150mL的磨口三角瓶中，准确加入20mL的样品溶液，盖紧瓶塞，在40?的恒温水浴振荡器上振摇6h。充分吸附后，过滤，测定滤液中银杏黄酮苷元的浓度，按下式计算各种树脂的静态吸附量及吸附率：
Q=（C
－C
e
）
W
；E（%）=
（C
－C
e
）
C
式中Q—吸附量mg/g，C e—吸附平衡后滤液中银杏黄酮苷元浓度mg/mL；
·
14
·
第1期马朝阳等：大孔树脂分离纯化银杏黄酮苷元的研究
E —吸附率；C o —原液中银杏黄酮苷元浓度，mg /mL ；
V —吸附液体积，m L ；W —干树脂重量，g 。
2．4．2银杏黄酮苷元解吸率的测定称取预处理好的树脂5g ，装入150mL 的磨口三角瓶中，准确加入20mL 的样品溶液，盖紧瓶塞，在45?的恒温水浴振荡器上振摇6h 。充分吸附后，过滤，向吸附饱和的大孔吸附树脂中准确加入一定体积的95%乙醇溶液，置恒温水浴振荡器上振荡6h ，过滤，测定解吸液中银杏黄酮苷元浓度，按下式计算解吸率：
B （%）=
C 0V 1（C 0－C e ）V
式中B —解吸率；
C 1—解吸液中银杏黄酮苷元浓度，mg /mL ；V 1—解吸液体积，mL ；V 、C 0、C e 同前。
2．4．3银杏黄酮苷元吸附动力学特性的测定根据吸附率和解吸率的结果，选择YWD07a 进行吸附动
力学研究。称取预处理好的树脂2g ，
装入150mL 的磨口三角瓶中，准确加入一定量的原液，在40?的恒温水浴振荡器上振荡，每隔一定时间测定溶液中银杏黄酮苷元含量，绘制吸附动力曲线。
2．5大孔吸附树脂柱层析动态吸附条件的研究
将经过静态吸附试验选择出的YWD07a 树脂装入φ25?500mm 的玻璃层析柱中，进行以下研究。
2．5．1YWD07a 树脂吸附曲线的测定将银杏叶提取物水解液浓缩后加入层析柱中，在流速为2BV /h 下上柱，至树脂吸附饱和为止。实验过程中，以一个柱体积（1BV ）为单位收集流出液，测定流出液中银杏黄酮苷元的含量，绘制吸附曲线。
2．5．2吸附液pH 对吸附效果的影响量取4份银杏叶提取物水解液，用0．5mol /L 的盐酸和0．5mol /L
氢氧化钠调节浓缩液pH 分别为2、3、4、5、6，分别上柱吸附，控制吸附液流速为2BV /h ，收集流出液，定容
至一定体积，
测定其中银杏黄酮苷元的浓度，计算其吸附量。2．5．3吸附液流速对吸附效果的影响量取一定量的银杏叶提取物水解液上柱吸附，分别取流速为1、2、3、4、5BV /h 作比较，收集流出液，定容至一定体积，测定其中银杏黄酮苷元的浓度，按下式计算出泄漏率。
泄漏率（%）=流出液浓度?流出液体积原液浓度?原液体积
?1002．5．4洗脱剂的选择及洗脱工艺的确定量取5份银杏叶提取物水解液，吸附液流速为2BV /h 。吸附
达到饱和后，先用2BV 的去离子水冲洗树脂柱，再分别用10%、
20%、40%、70%、90%乙醇溶液以3BV /h 流速洗脱，分段收集洗脱液，测定洗脱液中银杏黄酮苷元的浓度，考察洗脱剂对树脂洗脱性能的影响，确定出最佳的洗脱工艺。
2．6高效液相色谱测定总黄酮苷元
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱（150?6．0mm ，
5μm ）；柱温：30?；流动相：甲醇?水（0．5%磷酸）梯度洗脱；流速：1mL /min ；检测波长：368nm ；进样量：10μL 。黄酮苷元母体的化学结构相近，
用紫外监测器检测时的吸收信号都是由相同的两个苯环和一个醌式结构的吸收产生的，所以其吸收特性几乎相
同，
三种苷元的定量分析都可以用槲皮素标准物的标准工作曲线进行定量分析［11，12］。其计算公式如下：
A1—槲皮素峰面积（mAu ）A2—异鼠李素峰面积（mAu ）
A3—山奈酚峰面积（mAu ）K —槲皮素标准曲线斜率（mg ·mL －1/峰面积）
B —槲皮素标准曲线截距V —样品溶液体积（mL ）
W —样品重量（mg ）
2结果与讨论
2．1静态筛选大孔树脂的结果
2．1．1树脂吸附—解吸性能的比较选择三种树脂进行静态吸附实验，测定银杏黄酮苷元吸附平衡浓度，得到各种大孔吸附树脂对浓缩液中银杏黄酮苷元的吸附情况，利用95%乙醇对吸附饱和的树脂进行的解吸附能力。不同树脂对银杏黄酮苷元的吸附情况及95%乙醇的解吸率见表2。在大孔吸附树脂吸附分离过程中既要求树脂有较高的吸附率，又要求树脂具有较高的解吸率。综合考虑吸附及解吸两方面
因素，
YWD07a 树脂较理想。·24·山东农业大学学报（自然科学版）第44卷
表2不同树脂对银杏黄酮苷元的吸附情况
Table 2The adsorption Status of different resins taward Ginkgo flawonoid glycosides
树脂种类Type 吸附平衡浓度
Ce （mg /mL ）
Adsorption equilibrium
concentration
吸附量（mg /g ）Adsorbance 吸附率（%）Adsorption rate 1（mg /mL ）Desorptiom liquid Comcentration 解吸率（%）Desorption rate YWD07a YWD07k LSA －100．25
0．22
1．6030．130．416．692．693．250．92．552．011．3284．7265．8079．52
2．1．2静态吸附过程的动力学研究及吸附树脂的确定单用树脂的静态吸附量和吸附率来评价其吸附性能不是很全面，合适的树脂除了具有较大的吸附容量和较高的解吸率外，同时应具有较快的吸附速度，
所以需研究其静态吸附动力学特征。三种树脂的静态动力学曲线见图1。由图可以看出，
YWD07a 和LSA －10树脂对银杏黄酮苷元的吸附都为快速平衡型，大约在3h 基本达到吸附平衡且初始吸附量较大。而YWD07k 树脂要达到吸附平衡则需要较长的时间，约为6h 。综合三种树脂的吸附—解吸性能和静态吸附
动力学特征，
最终选择YWD07a 树脂作为银杏黄酮苷元的吸附剂，再进一步研究其动态吸附特性
。图1三种树脂的静态吸附曲线Fig．1Static adsorption cuwes of three kinds of resins
2．2YWD07a 树脂对银杏黄酮苷元的动态吸附实验
2．2．1YWD07a 树脂的吸附曲线YWD07a 树脂的吸附曲线见图2。如图可知，YWD07a 树脂大约可处
理6BV 的银杏黄酮水解液，200mL 的该树脂共吸附银杏黄酮苷元3912mg ，即湿态YWD07a 树脂对银杏
黄酮苷元的吸附量为19．56mg /mL ，达到饱和时可处理11BV 的样品溶液，吸附量为35．86mg /mL 。
2．2．2吸附液pH 对吸附效果的影响在吸附过程中被吸附物质是以分子状态被吸附剂吸附，因此要达到较好的效果必须使被吸附物质保持分子状态。一般情况下，酸性化合物在适当酸性溶液中可被充分吸
附，
碱性化合物在适当碱性溶液中可被充分吸附，中性化合物可在近中性的情况下被充分吸附。银杏黄酮苷元槲皮素等作为一种多羟基酚酸，在酸性条件下以游离分子形式存在，疏水性增强，树脂对其吸附增强，
故在弱酸性条件下易被吸附。，从图3可以看出，吸附液pH 对银杏黄酮苷元的吸附、分离效果的影响较
大。吸附液pH 为5时可保持树脂的最大吸附。这主要是因为在此条件下黄酮类化合物保持分子状态，又不会形成佯盐结构，以氢键的方式被吸附。而且银杏黄酮水解液因为要保持酶的最佳活性缓冲溶液的pH 就是约为5．0，故实际试验中银杏黄酮水解后不用调节pH 值就可上柱
。
图2YWD 07a 树脂对银杏黄酮苷元的吸附曲线Fig．2The adsorption curve of YWD 07a resin to Ginkgo flavonoid glycoside
·34·第1期马朝阳等：大孔树脂分离纯化银杏黄酮苷元的研究
图3pH 对树脂吸附量的影响Fig．3The effect of PH on the absorbance of resin
2．2．3流速对吸附效果的影响上样量固定，调节不同的流速进行动态吸附实验，结果见图4。如图所示，吸附液随着上柱流速的加快，银杏黄酮苷元的泄漏越来越严重，吸附流速为1BV /h 和2BV /h 时泄漏率较为相近，差异不是很大，但当吸附流速为3BV /h 的泄漏率就明显增大，此后的泄漏率越来越大。吸附流速应以慢速为好，可使树脂充分吸附。但是流速过慢，会造成柱内液相的纵向混返，不利于树脂的吸附，另外也会延长生产周期，从而提高成本。综合考虑，选择吸附流速以2BV /h 为宜
。
图4不同流速对吸附效果的影响Fig．4The effect of differevt flow rate on adlsorption
2．2．4洗脱剂的选择和洗脱工艺的研究不同浓度的乙醇溶液对吸附饱和的树脂的洗脱结果见图5。10%至90%五种不同浓度的乙醇对YWD07a 吸附树脂上的银杏黄酮苷元解吸过程，随着乙醇浓度的升
高，其解吸率也依次增大。由图可知，70%乙醇的解吸率高，解吸曲线尖锐，洗脱峰集中，对称性较好，无
明显的拖尾现象。而且根据10%至90%五种不同浓度的乙醇对YWD07a 吸附树脂上的银杏黄酮苷元解
吸液的高效液相图谱可知，10%的乙醇溶液洗脱液中基本不含黄酮苷元，而是未水解的黄酮和其他成分，
这是因为糖苷型黄酮水解成苷元型黄酮后极性减弱，
10%的乙醇溶液还不足以将其洗脱下来。而20%的乙醇溶液洗脱液中就已经有相当含量的银杏黄酮苷元了。故可以先用6BV 的10%的乙醇溶液洗脱吸附银杏黄酮水解液的大孔吸附树脂以除去未水解的糖苷型黄酮和其他杂质，再用70%的乙醇溶液洗脱
。
图5洗脱剂浓度对解析率的影响Fig．5The effect of eluant concentration on the desorption rate
2．3大孔吸附树脂纯化苷元型银杏黄酮的工艺确定
通过以上的一系列实验研究，可以确定大孔吸附树脂YWD07a 纯化苷元型银杏黄酮的最佳工艺如下：将处理好的YWD07a 树脂120mL 装入φ25?500mm 的树脂柱中。取一定量的银杏黄酮苷元浓度为
·44·山东农业大学学报（自然科学版）第44卷
3．26mg /mL 的浓缩液，以流速2BV /h 上样，使其达到吸附饱和，用6BV 的10%乙醇溶液以3BV /h 的流
速洗脱除杂，
然后用6BV 的70%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，50?真空干燥，得到纯化后的银杏黄酮苷元。经HPLC （图6）检测计算银杏黄酮苷元纯度为80．5%，回收率为73．6%
。
图6纯化后的银杏黄酮苷元高效液相图谱Fig．6HPLC Chromatography of Ginkgo flawonoid glycoside of ter being purified
3结论
通过静态吸附－解吸实验和吸附动力学研究从3种大孔吸附树脂中确定YWD07a 型树脂为最适合银杏黄酮苷元的分离富集的大孔吸附树脂。YWD07a 型树脂吸附分离银杏黄酮苷元的最佳工艺条件为：
吸附液浓度3．26mg /mL ，pH 5．0，上柱流速2BV /h ；先以6BV 的10%乙醇洗脱除杂，再以6BV 的70%
乙醇溶液洗脱，洗脱流速3BV /h 。在此条件下得到的银杏黄酮苷元纯度由纯化前的18．5%，提高到80．5%，回收率为73．6%。吸附分离可以进一步提高银杏黄酮苷元产品的生物效价和质量。
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54·第1期马朝阳等：大孔树脂分离纯化银杏黄酮苷元的研究
大孔吸附树脂技术 2007年06月06日星期三 02:50 P、M、 大孔吸附树脂技术 以大孔吸附树脂为吸附剂,利用其对不同成分得选择性吸附与筛选作用,通过选用适宜得吸附与解吸条件借以分离、提纯某一或某一类有机化合物得技术。 该技术多用于工业废水得处理、维生素与抗生素得提纯、化学制品得脱色、医院临床化验与中草药化学成分得研究。它具有吸附快,解吸率高、吸附容量大、洗脱率高、树脂再生简便等优点。 大孔吸附树脂 它就是一种具有大孔结构得有机高分子共聚体,就是一类人工合成得有机高聚物吸附剂。因其具多孔性结构而具筛选性,又通过表面吸附、表面电性或形成氢键而具吸附性。一般为球形颗粒状,粒度多为20-60目。大孔树脂有非极性(HPD-100,HPD-300,D-101,X-5,H103)、弱极性(AB-8,DA-201,HPD-400)、极性(NKA-9,S-8,HPD-500)之分。大孔吸附树脂理化性质稳定,一般不溶于酸碱及有机溶媒,在水与有机溶剂中可以吸收溶剂而膨胀。 大孔吸附树脂技术得基本装置 恒流泵 吸附原理 根据类似物吸附类似物得原则,一般非极性树脂宜于从极性溶剂中吸附非极性有机物质,相反强极性树脂宜于从非极性溶剂中吸附极性溶质,而中等极性吸附树脂,不但能从非水介质中吸附极性物质,也能从极性溶液中吸附非极性物质。 操作步骤 1)树脂得预处理 预处理得目得:为了保证制剂最后用药安全。树脂中含有残留得未聚合单体,致孔剂,分散剂与防腐剂对人体有害。 预处理得方法:乙醇浸泡24h→用乙醇洗至流出液与水1:5不浑浊→用水洗至无醇味→5%HCl通过树脂柱,浸泡2-4h→水洗至中性→2%NaOH通过树脂柱,浸泡2-4h→水洗至中性,备用。 2)上样 将样品溶于少量水中,以一定得流速加到柱得上端进行吸附。上样液以澄清为好,上样前要配合一定得处理工作,如上样液得预先沉淀、滤过处理,pH调节,
银杏黄酮即银杏叶提取物，它能够增加脑血管流量，改善脑血管循环功能，保护脑细胞，扩张冠状动脉，防止心绞痛及心肌梗塞，防止血栓形成，提高机体免疫能力。对冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压病人均十分有益。 银杏黄酮 银杏黄酮亦称银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E. [本品来源]本品为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶提取物。 [植物分布]全国大部分地区有产，主产湖北、江苏、广西、四川、河南、山东、辽宁等地。. [产品性状]银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E为浅黄棕色可流动性棕黄色粉末，略有银杏叶香味。 [产品含量]总黄酮甙含量：24-26%（HPLC法）,总萜内酯含量8-10%（HPLC法）白果内酯≥2.5% 银杏内酯A≥1.4% 银杏内酯B≥1.2%，银杏内酯C≥0.9% ，银杏酸≤1-5ppm重金属含量≤20ppm AS≤1PPM 干燥失重≤3%，炽灼残渣≤1.5%，溶济残留≤1%。 [产品用途]适用于制药、保健品、日用品、化妆品等各个领域 [适用范围]增加脑血管流量，降低脑血管阻力，改善脑血管循环功能，保护脑细胞，免受缺血损害，扩张冠状动脉，防止心绞痛及心肌梗塞，抑制血小板聚集，防止血栓形成，清除有害的氧化自由基，提高免疫能力，具有防癌抗衰功能。对治疗冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压等病有神奇疗效。 1. 促进循环 银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.能同时促进大脑和身体肢体的循环。银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.的一个主要保健功能就是抑制一种称为血小板活化因子（PAF）的物质，PAF是一种从细胞中释放的介质，其会导致血小板聚集（堆积在一起）。高含量的PAF会导致神经细胞损伤，中枢神经系统血流量降低，发炎，和支气管收缩。与自由基非常相似，高PAF 水平也会导致衰老。银杏内酯和白果内酯可在缺血（体内组织缺少氧气）时期内保护中枢神经系统的神经细胞不受损伤。该功能可能能对苦于中风的患者有辅助治疗的作用。除了抑制血小板粘着外，银杏提取物调节血管张力和弹力。换句话说，其可令血管循环更加有效率。该提升循环效率作用对循环系统中的大血管（动脉）和较小血管（毛细血管）都有同样作用。 2. 抗氧化作用 银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.可能在大脑，眼球视网膜和心血管系统中可发挥抗氧化特性。其在大脑和中枢神经系统中的抗氧化作用可能有助于防止因年龄导致的大脑功能衰落。银杏叶提取物在大脑中的抗氧化功能特别使人感兴趣。大脑和中枢神经系统特别易受自由基攻击。自由基
实验二大孔树脂吸附分离实验 一、实验目的 1、了解大孔树脂的使用方法； 2、掌握利用大孔树脂的静态和动态吸附分离操作； 3、掌握大孔树脂的洗脱方法； 4、学习吸附等温曲线、吸附动力学曲线和洗脱曲线的测定方法。 二、实验原理 大孔树脂是一种具有大孔结构的有机高分子共聚体，是一类人工合成的有机高聚物吸附剂。因其具多孔性结构而具筛选性，又通过表面吸附、表面电性或形成氢键而具吸附性。一般为球形颗粒状，粒度多为20-60目。大孔树脂有非极性（HPD-100,HPD-300,D-101,X-5,H103）、弱极性（AB-8，DA-201,HPD-400）、极性（NKA-9,S-8,HPD-500）之分。大孔吸附树脂理化性质稳定，一般不溶于酸碱及有机溶媒，在水和有机溶剂中可以吸收溶剂而膨胀。 大孔树脂吸附技术以大孔吸附树脂为吸附剂，利用其对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过选用适宜的吸附和解吸条件借以分离、提纯某一或某一类有机化合物的技术。吸附分离依据相似相容的原则，一般非极性树脂宜于从极性溶剂中吸附非极性有机物质，相反强极性树脂宜于从非极性溶剂中吸附极性溶质，而中等极性吸附树脂，不但能从非水介质中吸附极性物质，也能从极性溶液中吸附非极性物质。 大孔吸附树脂吸附技术广泛应用于制药及天然植物中活性成分如皂甙、黄酮、内脂、生物碱等大分子化合物的提取分离以及维生素和抗生素的提纯、化学制品的脱色、医院临床化验和中草药化学成分的研究等。它具有吸附快，解吸率高、吸附容量大、洗脱率高、树脂再生简便等优点。 大孔树脂吸附分离操作步骤： （1）树脂的预处理
目的是为了保证制剂最后用药安全。树脂中含有残留的未聚合单体，致孔剂，分散剂和防腐剂对人体有害。预处理的方法：乙醇浸泡24h→用乙醇洗至流出液与水1：5不浑浊→用水洗至无醇味→5%HCl通过树脂柱，浸泡2-4h→水洗至中性→2%NaOH通过树脂柱，浸泡2-4h→水洗至中性，备用。 （2）上样 将样品溶于少量水中，以一定的流速加到柱的上端进行吸附。上样液以澄清为好，上样前要配合一定的处理工作，如上样液的预先沉淀、滤过处理，pH调节，使部分杂质在处理过程中除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入成品。上样方法主要有湿法和干法两种。 （3）洗脱 先用水清洗以除去树脂表面或内部还残留的许多非极性或水溶性大的强极性杂质（多糖或无机盐），然后用所选洗脱剂在一定的温度下以一定的流速进行洗脱。 （4）再生 再生的目的：除去洗脱后残留的强吸附性杂质，以免影响下一次使用过程中对于分离成分的吸附。 再生的方法：95%乙醇洗脱至无色，再用2%盐酸浸泡，用水洗至中性，再用2%NaOH浸泡，再用水洗至中性。 注意：再生后树脂可反复进行使用，若停止不用时间过长，可用大于10%的NaCl溶液浸泡，以免细菌在树脂中繁殖。一般纯化某一品种的树脂，当其吸附量下降30%以上不宜再使用。 三、试剂及仪器 仪器：紫外可见分光光度计，电子天平，恒温水浴振荡器，玻璃层析柱，恒流泵 试剂：AB-8大孔树脂，大豆异黄酮，无水乙醇，盐酸，氢氧化钠 四、实验内容
高效液相色谱法测定银曲胶囊中银杏总黄酮醇 苷的含量-精品 2020-12-12 【关键字】方法、条件、系统、良好、研究、关键、稳定、作用、关系、分析、凝聚、改善作者：顾燕刘萌张现涛邵文豪 【摘要】目的银曲胶囊中银杏总黄酮醇苷的含量测定。方法用高效液相色谱法（HPLC）和DAD紫外检测器测定银曲胶囊中总黄酮醇苷的含量。结果槲皮素浓度在9.60～76.80 μg /ml，山柰素在7.33～58.62 μg /ml，异鼠李素在1.76～14.08 μg /ml之间浓度与峰面积呈良好的线性关系。结论根据3批样品的检测结果，规定银曲胶囊中总黄酮醇苷的含量不低于6 mg/粒。 【关键词】银曲胶囊总黄酮醇苷高效液相色谱法 Abstract：ObjectiveTo determine the total flavonoid glycosides in Yinqu Capsule．MethodsHPLC was adopted with DAD detection for content determination of the total flavonoid glycosides. ResultsThe concentration of quercetin between 9.60 to 76.80 μg/ml，kaempferol between 7.33 to 58.62 μ g / ml, isorhamnetin between 1.76 to 14.08 μ g / ml had a good linear relationship. ConclusionAccording to the results of three blocks ,the content of total flavonoid glycosides is not less than 6 mg per tablets. Key words：Yinqu capsule; The total flavonoid glycosides ; HPLC
银杏叶黄酮提取及含量测定 一、实验目的 1、掌握银杏叶中黄酮的提取方法 2、了解银杏叶中黄酮的含量测定 二、实验原理 近几年来，随着对黄酮类化合物研究的日益深入与重视，黄酮类化合物提取技术的发展也得到了促进。目前提取黄酮类化合物的方法主要包括有机溶剂浸提法、超声波提取法、超临界流体萃取法、微波提取法和酶提取法等。 １．１有机溶剂浸提法 目前国内外使用最广泛的银杏叶中黄酮的提取方法就是有机溶剂提取法，一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇或某些极性较大的混合溶剂，如甲醇－水（１＋１）溶液。由于甲醇的毒性、挥发性较大，因此一般采用乙醇作为提取剂。银杏叶干燥粉碎后用有机溶剂浸泡、提取、过滤，滤液中的溶剂经减压蒸馏除去后得银杏叶浸膏粗提物。徐桂花等［１］提取银杏叶中黄酮类化合物时，采用乙醇（７０＋３０）溶液为提取剂，提取温度为７０℃，料液质量浓度比为１ｇ比４０ｍＬ，提取时间为４ｈ。由于乙醇提取工艺在安全性、溶剂成本、效率及杂质酚酸去除等方面都不能应对日益严酷的市场竞争，张林涛等［1］提出了以硼砂－ 氢氧化钙碱水为溶剂提取银杏叶黄酮，其黄酮提取率与文献值相近，但提取工艺时间缩短为１ｈ。 １．２超声波提取法 超声波提取法是利用搅拌作用、强烈的振动和空间效应、高的加速度等使药物有效成分进入溶剂，从而提高提取率，缩短提取时间，并能消除高温对提取成分影响的一种提取法。刘晶芝等［2］运用了超声波技术与水浸提取相结合的方法得出超声波提取的最佳工艺条件为：超声频率４０ｋＨｚ，超声处理时间５５ｍｉｎ，料液质量比１比１００，提取温度３５℃，静置３ｈ，提取率为８１．９％。郭国瑞等［3］以水为介质，超声波提取银杏叶中黄酮苷，与常规水浸提法比较，超声波提取效率大大提高，确定超声波提取的最佳工艺为：超声处理时间５５ｍｉｎ，料液质量比１比３０，提取温度５０℃，提取率为８２．３％。 １．３超临界流体萃取法 超临界流体萃取法是一种以超临界流体代替常规有机溶剂对有效成分进行萃取和分离的新技术。可作为超临界流体的物质很多，其中二氧化碳临界温度（ＴＣ＝３１．３℃）接近室温，且具有无色、无毒、无味、不易燃、化学惰性、价廉、易制成高纯气体等优点而被广泛应用，特别在中药材及其制剂中更显示出其独特、简便、快速、具有较高的选择性、提取杂质少、可直接进样分析的优点。邓启焕等［4］探讨了超临界萃取银杏叶有效成分的影响因素，最佳条件为萃取压力２０ＭＰａ、时间９０ｍｉｎ、粒度３．９ｍｍ、温度４０℃，经测定银杏叶黄酮的质量分数为２８％，高于国际公认标准。 １．４微波提取法 微波提取法是利用分子或离子在微波场中的导电效应直接对物质进行加热从而提取植物细胞内耐热物质的新工艺。曾里等［5］的研究表明以乙醇溶液作溶剂比以水作溶剂的效果好，最佳条件为以乙醇 （６０＋４０）溶液为提取剂，解冻处理２０ｍｉｎ。张鹏等［6］对微波法提取银杏叶中黄酮类物质进行了研究，最佳提取条件为以乙醇（５０＋５０）溶液
实验四、银杏黄酮的提取与检测 一、实验目的： 1、了解黄酮类物质的分离提取和检测方法。 2、了解大孔吸附树脂的特性和在生化分离中的应用。 二、实验原理： 1、提取原理 溶剂加到原料中进行提取的过程中，由于扩散、渗透作用，逐渐通过细胞壁透入细胞中，溶剂进入细胞后溶解可溶性物质，造成了细胞内外浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入植物细胞中，可溶性成分不断被提取出来，如此多次反复，直到细胞内外浓度相等，达到动态平衡为止。 2、大孔吸附树脂纯化原理： 大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构人工合成的聚合物吸附剂，是在离子交换剂和其它吸附剂应用基础上发展起来的一类新型树脂，为用于固体萃取而设计。是依靠它和被吸附的分子（吸附质）之间的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作的。 大孔吸附树脂吸附能力高，易解吸，内部微孔即多又大，表面积也大，具有较多的活性中心，使离子、分子扩散速率增大，交换速度加快，在使用上可以缩短生产周期，提高效率，而且大孔吸附树脂可以进行再生重复使用，因此使生产成本大为降低，适于工业化生产。 3、银杏黄酮含量的分光光度法测定原理 黄酮类化合物的测定使用较广泛的是络合—分光光度法，该法的基本原理是，黄酮类化合物分子结构中，凡在C 3或C 5位上有羟基，都会与铝盐形成有颜色的配位化合物，见图：O O O Al 2+O O O Al 2黄酮和铝盐的络合物芦丁因此，银杏叶中的黄酮类化合物包括单黄酮、双黄酮和黄酮苷都能与铝盐形成络合物，比色测定结果 是总黄酮含量。硝酸铝络合分光光度法测定总黄酮的原理为:在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下,黄酮类化合物与铝盐生成螯和物,加入氢氧化钠溶液后显红橙色,在500波长处有吸收峰且符合定量分析的比尔定律,一般与芦丁标准系列比较定量. 如果细说,硝酸铝显色法是先用亚硝酸钠还原黄酮，再加硝酸铝络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成2’羟基查耳酮而显色. 它的显色原理发生在黄酮醇类成分邻位无取代的邻二酚羟基部位,不具有邻位无取代邻二酚羟基的黄酮醇类成分加入上述试剂时是不显色的. 三、仪器： 电子天平（0.1mg ）、紫外分光光度计、恒温水浴摇床、电热恒温水浴锅、索氏提取器、电热恒温干燥箱、微波炉、超声波破碎仪、超声波清洗机、旋转蒸发器、循环水式真空泵、布式漏斗、真空抽率瓶、真空泵。 四、材料与试剂： 银杏叶、甲醇、95%乙醇、丙酮、乙醚、石油醚（30~60℃）、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、芦丁、大孔吸附树脂。 五、操作步骤： 5.1、脱脂 +
收稿日期:2007205225 作者简介:梁 丹(19852),女,河南鹿邑人,贵州大学农药学硕士研究生,研究方向为植物源农药. 第24卷第5期周口师范学院学报 2007年9月Vol.24No.5Jo urnal of Zhoukou Normal U niversity Sept.2007 黄酮类化合物提取和分离方法研究进展 梁 丹1,张保东2 (1.贵州大学农学院,贵州贵阳550025;2.周口师范学院继续教育学院,河南周口466001) 摘 要:黄酮类化合物具有多种生理活性,从天然产物中提取和分离黄酮类化合物,引起了人们的广泛关注,其提取和分离方法也不断地改进和发展.文章主要综述了近几年来不同的提取和分离方法在黄酮类化合物中的应用进展.随着科技的进步,黄酮类化合物的提取和分离方法将更加快速、高效、完善.关键词:黄酮;提取;分离;进展 中图分类号:O652 文献标识码:A 文章编号:167129476(2007)0520087203 黄酮类化合物是植物界分布广泛的天然酚类化 合物,植物中的黄酮大体上可分为“黄酮类”与“黄烷酮类”两大类物质,已知化学结构的黄酮类物质至少有4000余种.黄酮类化合物具有广泛的生理功能, 是许多中草药的有效成分,具有很高的药用价值,如有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用[1,2].黄酮类化合物还在食品、化妆品等行业中广泛应用.随着市场需求量的增加,经济效益的提高,黄酮类化合物提取和分离方法也在不断地改进和提高. 1 黄酮类化合物提取方法的研究进展 1.1 按所用溶剂不同分类 (1)热水提取法(以水作溶剂).热水一般仅限 于提取苷类.在提取过程中要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时间及煎煮次数等因素.此工艺成本低、安全,适合于工业化大生产.郭京波等[3]以水做溶剂,同时提高浸提温度、延长浸提时间和增加液料比(60倍),可以明显提高芦丁的产率.(2)有机溶剂萃取法.乙醇和甲醇是提取黄酮类化合物的最常用溶剂.高浓度的醇(90%～95%)适合提取苷元,60%左右的醇适合提取苷类,提取的次数一般为2～4次[4].胡福良等[5]提取蜂胶液中黄 酮类化合物,以80%乙醇提取的总黄酮的含量最高.其他有机溶剂法是根据相似相溶原理,对不同性质的黄酮选择最佳的有机溶剂进行提取. (3)碱提取酸沉淀法.黄酮类成分大多具有酚羟 基,易溶于碱水(如碳酸钠、 氢氧化钠、氢氧化钙水溶液)和碱性稀醇.因此,可先用碱性水提取,碱性提取液加酸后黄酮苷类即可沉淀析出.提取时应控制酸碱的浓度,以免在强碱下加热时破坏黄酮类化合物的母核.当有邻二酚羟基时可加硼酸保护.此方法简 便易行,橙皮苷、 黄芩苷、芦丁等都可用此法提取.1.2 按提取条件不同分类(1)回流提取法.本法是加热回流提取黄酮类化合物的一种方法.所用回流剂一般有水、 醇及混合溶剂.此法操作简便,但效率不够高,一般很难一次性完全提出黄酮化合物,需要反复回流提取[6,7]. (2)索式提取法.该法是用索式提取器,多次提取黄酮,其溶剂可反复利用,操作方便,价格低廉且提取效率高,但此法所需时间较长.索式提取黄酮类 化合物的方法已广泛为人们所利用[8].(3)微波辅助提取法.该法是利用微波加热的特性对成分进行选择性提取的方法.此法具有快速、高效、高选择性、对环境无危害等特点.刘峙嵘等采用微波萃取银杏叶中黄酮类化合物及唐课文等采用微 波辅助法从黎蒿中提取黄酮类化合物,与传统溶剂萃取方法相比,微波萃取法更简单,而且具有萃取时间短、成本低、萃取效率高等优点[9,10].(4)超声提取法.该法是利用超声波浸提黄酮类 化合物的一种方法.其基本原理是利用超声波的空化作用,破坏植物的细胞,使溶剂易于渗入细胞内,同时超声波的强烈振动能给植物和溶剂传递巨大的
AB-8大孔吸附树脂 一、产品概述： AB-8型大孔吸附树脂是苯乙烯型弱极性共聚体，比表面积高于DM-301型，最适宜用于具有弱极性物质的提取、分离、纯化，例如：甜菊苷、生物碱等。 二、产品技术指标参数： 1、产品名称：大孔吸附树脂 2、外观：乳白色或浅黄色不透明球状颗粒 3、粒径范围：（60~16目）0.3~1.25mm≥90% 4、含水量：65~75% 5、比表面积：≥480 m2/g；比照吸附量（酚/干基）≥45mg/g 6、堆积密度：0.65-0.7g/ml (湿态) 三、产品特性: 1、颜色乳白或浅黄给处理操作带来方便，分离、纯化带色的有机化合物，观察容易。 2、物理化学性质稳定，不溶于任何酸、碱及有机溶剂，方便于吸附剂、解吸剂的选择。 3、对有机物选择性好，不受无机盐存在的影响。 4、再生容易，再生剂可选用水、稀碱、稀酸或低沸点有机溶剂。如：甲醇、乙醇、丙酮等。 5、强度适中、正常使用寿命长。 四、注意事项： 1、该树脂含水70%左右，储存、运输应保持5-40oC的温度，以防低温将球体冻裂、高温产生霉变，影响使用。 2、树脂因暴露在空气中或因故失水，不可直接注水，以免树脂漂浮，可用乙醇浸渍处理，使其恢复湿态，再用水清洗干净。 五、树脂预处理： 工业品级树脂均残留惰性溶剂，故使用前须根据应用需要，进行不同深度的预处理：在提取器内，加入高于树脂层10-20厘米的乙醇浸泡3-4小时，然后放净洗涤液，为一次提取过程。用同样方法反复洗至出口洗涤液在试管中加3倍量水不显浑浊为止，后用清水充分淋洗至无明显乙醇气味，即可进行一般使用。六、强化再生： 当树脂正常使用一定周期后，吸附能力降低或受急性严重污染时，需要强化再生处理，其方法是加入高于树脂层10-20厘米的3-5%盐酸溶液浸泡2-4小时后，用同样浓度5-7倍体积量盐酸溶液淋洗，再用净水充分淋洗，直至出口洗涤液PH值呈中性，然后以5%氢氧化钠溶液按以上方法浸泡2-4小时，并用同样方法淋洗至通完5-7倍体积量氢氧化钠溶液，再用水充分淋洗直至出水PH值呈中性，即可再次投入使用。
β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮糖苷的研究 伍毅1,王洪新1,2* (1.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学食品学院,江苏无锡214012;2.石河子大学食品学院,新疆石河子832003) 摘要采用β-葡萄糖苷酶水解银杏叶提取物(G BE),使糖苷型黄酮转化为苷元型黄酮。通过正交试验得出水解的最佳工艺参数,即温度40℃,酶浓度5×10-3m g/m l,pH值5.0下水解6h。由H P L C图谱可得该条件下水解的苷元得率9.08%,纯度68.24%。酶解产物中还部分保留了银杏内酯等活性成分,有利于保留银杏叶提取物的综合生物活性。 关键词银杏叶提取物;黄酮苷元;β-葡萄糖苷酶;水解 中图分类号Q946文献标识码 A 文章编号0517-6611(2008)01-00030-03 S tud y on H y dro ly z in g G in k go F la v on e G ly c o s id e w ithβ-g ly c o s ida se W U Y i e t a l(S ta te K ey L abo ra to ry o f F o od S cien ce an d T e chn o lo gy,S ch oo l o f F o od S cien ce&T ech n o log y,S ou th e rn Y an g tze U n ive rsity,W u x i,J ian gsu 214012) A b s tra c tβ-g lyco sidase w a s u sed to h yd ro ly ze th e ex tract fro mg in k go lea ves to tran s fo rmflavon e g lyco side in to flavon e a g lycon e.T h e op ti m umtech n o- log ica l pa ram e te rs o f h yd ro lys is w e re obta i n ed th rou gh o rth o gon a l expe r i m en t,w h ich w e re en zym e con cen tra tion o f5×10-3m g/m l an d pH v a lu e o f5.0, h ydro ly sis tem pe ra tu re o f40℃an d ti m e o f6h.It w as k n ow n from H P L C spectrog ramth a t th e ag ly con e y ie ld o f h ydro ly sis u nde r th is con d ition w a s 9.08%w ith pu r ity o f68.24%.In th e en zym o lys is p rodu cts,th e a ctive in g redien ts su ch a s g i n k go la cton e w e re a lso rese rved pa r tly,w h ich w as i nfa vo r o f re se rv in g th e syn th e sized b io activ ity o f g in k go lea ves ex tract. K e y w o rd s G in k go lea ve s ex tract;F la von e ag ly con e;β-g ly cos idase;H yd ro ly sis 银杏(G inkgo b iloba L.)属银杏科银杏属多年生落叶乔木,是冰川时期存活的孑遗植物之一,属我国特产植物,主产于河南、湖北等地,其种子、根、叶均可药用。银杏叶中含有丰富的黄酮类物质,,主要是由山奈酚、槲皮素以及异鼠李素等黄酮苷元与葡萄糖等单糖以O-糖苷键联接而成,具有广泛的药理作用,是极好的天然抗氧剂。现代研究表明,银杏黄酮被水解成苷元后清除人体氧自由基的生物活性要明显高于黄酮糖苷,黄酮苷元的效价是黄酮糖苷效价的7倍[1-2]。因此,改善黄酮的构型是提高银杏黄酮在人体内吸收率的重要途径。笔者采用生物酶法水解银杏黄酮,生成了具有更高生物活性的苷元型黄酮,而且具有环保、反应条件温和等优点。 1材料与方法 1.1材料银杏叶提取物(G BE),黄酮含量≥24%,由上海宝丰生物有限公司提供。β-葡萄糖苷酶由西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司提供。槲皮素标准品,纯度≥99.0%,由上海康九化工有限公司提供。 1.2 GBE的酶解工艺[3]称取5m gβ-葡萄糖苷酶,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH值5.0)定容至100m l。然后,称取一定量的银杏叶提取物,适量甲醇溶解,加入缓冲溶液和酶,置于水浴锅中恒温水解,将水解液高速离心、过滤后,沉淀用无水甲醇溶解,再上旋转蒸发器以除去多余的溶剂,恒重后用10m l无水甲醇充分溶解得样液,0.45μm滤膜过滤后待测定。 1.3 总黄酮苷元的测定方法 1.3.1分析条件[4]。色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱(15 m m×6.0m m,5μm);柱温:30℃;流动相:甲醇∶水(0.5%磷酸)梯度洗脱;流速:1m l/m in;检测波长:368nm;进样量:10μl。1.3.2 计算方法。由文献可知,对照品溶液、换算因子的选用不同对测定结果的影响较小。同时,受对照品来源的限制,3种苷元的定量分析都可以用槲皮素标准物的标准工作 作者简介伍毅(1983-),女,四川通江人,硕士研究生,研究方向:食品功能性成分。*通讯作者。 收稿日期2007-08-21 曲线进行定量分析[5]。计算公式如下: C(%)=[(A1+A2+A3)×K+B]× V W ×100%(1) 式中,A 1 为槲皮素峰面积(m A u);A 2 为异鼠李素峰面积 (m A u);A 3 为山奈酚峰面积(m A u);K为槲皮素标准曲线斜率(m g/m l);B为槲皮素标准曲线截距;V为样品溶液体积(m l);W为样品重量(m g)。 1.3.3 槲皮素标准曲线的制作[6]。准确称取对照品槲皮素0.02g,置于100m l容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得槲皮素标准储备液(0.20m g/m l)。用移液管分别取槲皮素标准储备液 2.5、5、10、20、40m l,用无水甲醇定容至50m l容量瓶,得0.01、0.02、0.04、0.08、0.16m g/m l的标准溶液。分别取标准溶液和储备液进样10μl,测定峰面积。根据标准品的浓度和峰面积可得回归方程: y=7×10-5x-0.0058(2) r=0.99(n=5),线性范围为0.01～0.10m g/m l。 1.4 单因素试验影响酶解工艺效果的因素主要有时间、温度、酶浓度及pH值等[7]。该试验分别研究了不同因素对GB E酶解效率的影响。 1.5 最佳工艺参数的确定在单因素试验的基础上,为了进一步确定反应的最优条件以及影响因素的主次,采用正交试验设计方法进行优化[8]。表1为酶解试验正交试验因素水平表。 表1 酶解正交试验因素与水平 T a b le1 F a c to rs a n dle v e ls o f o rth o g on a l te s t fo r e n zym o ly s is 水平 L ev e l A(温度) T em pe ra tu re ℃ B(时间) T i m e∥h C(pH值) pHv a lu e D(酶浓度) E n zym e co n ce n tra t ion m g/m l 130540.025 240650.005 350760.010 2结果与分析 2.1 酶解单因素试验结果 2.1.1 酶解时间的选择。图1是固定酶解温度40℃,pH值 安徽农业科学,J ou rn a l o f A n h u i A g r i.S c i.2008,36(1):30-32责任编辑刘月娟责任校对马君叶
银杏叶黄酮的提取 一、溶剂提取法：国内外使用最广泛的方法，步骤多、周期长、产率低、产品中有机溶剂易残留。溶剂系统主要有乙醇，水溶液、丙酮-水溶液、NaOH-水溶液、NaOH-乙醇等。精提物常在粗提物制备基础上精制，常用液-液提取法、沉淀法和吸附．洗脱法。 以60％丙酮为起始溶剂粗提取，再脱脂、去银杏酚酸等15道工艺制成提取物。NaOH-水溶液提取效果最好，NaOH-乙醇溶液次之，正丁醇萃取水溶液中银杏黄酮苷，获得最佳萃取条件为萃取5 min温度60℃4次，萃取物中黄酮苷含量为57％。V水：V正丙醇=1:25最佳。银杏叶精提物树脂吸附纯化法以石油醚回流提取，再以80％乙醇回流提取，减压浓缩，新型澄清剂沉降，树脂分级吸附，pH值为3—4酸水和酸性25％乙醇洗涤，75％乙醇洗脱，喷雾干燥 将银杏叶洗净，于60℃烘干至恒重，粉碎，过50目筛。称取粉末25 g，置于索氏提取器中恒重，粉碎，过50目筛。称取粉末25 g，置于索氏提取器中加入60％乙醇至250．0 ml，80℃下回流提取3．0 h，蒸馏回收乙醇，并用活性炭脱色，得银杏叶黄酮提取物。乙醇浓度为50％一70％时,提取率随浓度增加提高，当浓度70％时提取率达最大。随水浴温度升高总黄酮提取率快速增加。当温度80℃时提取率达最大。提取时间为三小时为佳。 二、超临界流体萃取法(SFE法)：利用临界或超临界状态的流体及被萃取的物质在不同蒸汽压力下所具有的不同化学亲和力和溶解能力进行分离纯化的操作。最佳萃取实验工艺条件为萃取压力15 MPa、乙醇浓度90％、萃取温度55℃，此时，黄酮类化合物萃取得率较理想. 三、高速逆流色谱技术提取法：是一种不用任何固定载体的液一液分配色谱技术W=70%的乙醇连续循环喷淋逆流6级萃取，m乙醇：m银杏叶=5:1，总萃取时间240min,萃取温度50~55度，萃取率99%以上。 四、微波提取法：微波提取法能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热，受溶剂亲和力的限制较小，可供选择的溶剂较多及热效率较高，升温快速均匀，大大缩短了提取时间，提高了萃取效率。以水为介质的条件下，对银杏叶进行微波处理。 工艺流程银杏叶一干燥一粉碎一加入适量氢氧化钙溶液一微波预处理一加入适量碱水一调节pH和硼砂含量→恒温水浴浸提—过滤一定容 通过对提取温度、提取时间、液料比、微波功率、微波时间、解析剂比6个因素进行正交实验，优选得到最佳的萃取工艺条件为：提取温度80℃，提取时间60min，液料比．50：1，微波功率700W，微波时问180s，解析剂比7：l。 五、超声提取法：超声技术应用于天然活性产物的提取，具有速度快、提取率高、节省溶剂、节约能耗、不破坏有效成分的特点。最佳操作条件为超声波频率40kHz处理时间10min、静置时间12 h。以水为介质，在较低温度下 六、酶提取法: 加入淀粉部分水解产物及对葡糖基有转移作用的葡糖苷酶或转糖苷酶，使油溶性或难溶于水或不溶于水的有效成分转移到水溶性苷糖中，既提高了有效成分的提取率，又促进难溶于水或不溶于水的有效成分在体内的吸收. 在常规的醇一水浸提之前用纤维素酶对原料进行酶预处理(酶解时间为2h) 七、分子烙印技术:在极性溶剂中，以丙烯酞胺作功能单体，以强极性化合物槲皮素为模板，
槐花中黄酮类化合物分离和鉴定[适用对象] 中药国际交流、中药知识产权、中药制药工程、中药资源专业 [实验学时]9 一、实验目的要求 学习黄酮类化合物的提取、分离和检识，通过实验要求： （1）了解沸水提取黄酮类化合物的原理和操作。 （2）了解由芸香苷水解制取槲皮素的方法。 （3）掌握黄酮类化合物的主要性质及黄酮苷、苷元和糖部分的检识方法。 二、实验原理 由槐花中提取芸香苷的方法很多，本实验是根据芸香苷在冷水和热水中的溶解度差异的特性进行提取和精制。纸色谱的分离原理是利用各种化合物在流动相和固定相中分配系数的不同而达到分离目的。 三、仪器设备 烘箱、水浴锅、铁架台，烧杯，三角烧瓶，滤纸，试管，层析槽，毛细管等。 四、相关知识点 槐花为豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花蕾，主要含芸香苷（芦丁），含量高达12~20%，水解生成槲皮素、葡萄糖及鼠李糖。 芸香苷（rutoside），分子式C27 H30 O16，分子量610.51，淡黄色针状结晶，mp.177~178℃。难溶于冷水（1﹕8000），略溶于热水（1﹕200），溶于热甲醇（1﹕7），冷甲醇（1﹕100），热乙醇（1﹕30），
冷乙醇（1﹕650），难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚等，易溶于吡啶及稀碱液中。 槲皮素（quercetin ），分子式C 15 H 10 O 7，分子量302.23，黄色针状结晶，mp.314℃（分解）。溶于热乙醇（1﹕23），冷乙醇（1﹕300），可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶等，不溶于石油醚、苯、氯仿、乙醚中，几不溶于水。 O O O H OH OH OH OR 五、实验步骤 （一）芸香苷、槲皮素和糖的纸色谱鉴定 1、点样：取新华一号色谱滤纸，规格20 cm ×20 cm ，在滤纸下端约2 cm 处用铅笔画一直线，间隔2 cm 分别点上下列样品或标准溶液： （1）糖样品溶液 （2）标准葡萄糖溶液 （3）标准鼠李糖溶液 （4）芸香苷样品甲醇溶液 （5）芸香苷标准品溶液 （6） 槲皮素样品甲醇溶液 （7）槲皮素标准品溶液 2、展开剂：正丁醇-醋酸-水（4﹕1﹕5）上层上行展开。 3、显色：展开完毕，将滤纸取出，记录溶剂前沿位置。待溶剂挥尽后，在（3）与（4）点之间剪开，分别显色。 （1）糖的显色：喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，在105℃烘10分钟，
广泛用于肾移植、肝移植和心脏移植等患者,使器官移植成功率大幅度提高。由于Cs A的安全范围窄,毒性反应强,体内过程个体差异很大,即使患者服用等量的Cs A,其血药浓度也有很大的差异[2]。同时,Cs A浓度过高会导致严重的肝肾毒性、高血糖和神经损害,还会诱发感染和引发肿瘤等。本研究病例中62%的中毒反应发生于Cs A血药浓度高于400ng/m l的患者中,因此将血药浓度控制在400mg/m l以下,可以明显降低Cs A毒性反应的发生。而浓度过低则达不到治疗效果,产生排斥反应[3]。 312 肾移植后采用以Cs A为主的三联免疫抑制用药方案的优越性已为移植专家广泛认同,但由于各单位Cs A起始剂量及减量方案不同,国内外尚无统一的Cs A 治疗窗浓度。本研究通过对肾移植术后接受Cs A免疫抑制治疗的59例患者715例次Cs A全血谷浓度测定结果的分析,综合临床上出现中毒反应和排斥反应时患者Cs A谷浓度测定结果,推荐肾移植后在三联免疫抑制剂治疗方案中,较为理想的治疗浓度范围为:术后 <30d:250～450ng/m l;30～90d:250～400ng/m l; 90～180d:180～400ng/m l;180～360d:150～300 ng/m l;1年以上:100～250ng/m l。结果证明,将Cs A 血药浓度调整到推荐治疗浓度范围的中毒反应发生率为14.5%,移植排斥反应发生率为4%。高于推荐治疗浓度范围的毒性反应发生率为56%,低于这一范围的排斥反应发生率为50.4%。因此,调整Cs A用药剂量,实施个体化给药方案,既能达到满意的免疫抑制效果,又能有效降低毒性和排斥反应的发生率;同时可以降低病人的医疗费用。这进一步说明,肾移植后治疗过程中的Cs A血药浓度监测对Cs A中毒和排斥反应鉴别具有重要意义。 参考文献 1 方芸,王欣,裴云萍.环孢素A监测指标及治疗浓度的研究进展.中国药房,2006,17(4):307 2 石杰,曹勇,张新惠.年龄环孢素浓度肾移植术后疗效之相关性分析. 中华肾脏病杂志,2006,22(3):165 3 肖艳,李学庆,王成,等.影响环孢霉素A血药浓度的药物研究进展. 黑龙江医药,2005,18(4):279 银杏黄酮纯化工艺研究3 张静泽,曹 波,白淑芳,陈 虹 (中国人民武装警察部队医学院,天津 300162) 摘 要 目的:考查非水体系中ZX-4型配位吸附树脂对银杏总黄酮类成分的分离纯化方法。方法:根据银杏黄酮的结构特征,考查ZX-4型配位吸附树脂的吸附性能,并采用HP LC法对银杏总黄酮进行定量分析。结果:Z X-4型配位吸附树脂对银杏总黄酮类成分吸附选择性高。以5%HAc乙醇溶液作为洗脱剂,银杏黄酮纯度提高至53.2%,起到了纯化精制的目的。结论:以配位吸附树脂ZX-4作为纯化银杏黄酮的吸附剂;吸附容量大,解吸容易,分离纯化方法简便有效。 关键词 配位吸附树脂,非水体系,银杏黄酮 中图分类号:R914.4 文献标识码:A 文章编号:100625687(2008)0320003204 Pur i f i ca ti on of fl avono i ds fro m H ippohae R ham noides L Zhang J ingze1,Cao Bo,Bai Shufang,Chen Hong (1.Depart m ent of Phar macy,Medical College of Chinese Peop le’s A r med Police Forces,Tianjin300162) ABSTRACT OBJECTI V E T o study a method for separating and purifying the t otal flavonoids in Ginkgo leaf with the coordinate ad2 s or p ti on in the none-aqueous syste m.METHODS Coordinate ads or p ti on resin Z X-4was systematically studied f or its ads orbing capability.HP LC was used t o measure the content of flavonoids in Ginkgo leaf.RES ULTS Flavonoids in Ginkgo leaf can be highly abs orbed by ZX-4resin.The purity of the flavonoids was54.66%in the dried part of5%HAc ethanolic eluti on.CONCLUSI O N It is a si m p le and efficient method t o separate flavonoids in Ginkgo leaf.The coordinate ads or p ti on ZX-4has higher abs or p ti on content than the other resins and it can be des orbed easily. KE Y WO RD S coordinate ads or p ti on,non-aqueous syste m,Ginkgo flavonoid 3收稿日期:2007212221
银杏黄酮类化合物的性质 银杏黄酮类化合物的苷元一般难溶于或不溶于水，可按于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂及稀碱溶液中。银杏黄酮苷元与糖结合成苷后，水溶性相应增大，一般可溶于热水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙能中，难溶于乙醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂。银杏黄酮类化合物因分子中具有酚羟基而显弱酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺等。 根据活性成分的特性，本实验中主要采用了简单易行、比较常用的有机溶剂提取法来进行有效成分的提取。由于回流提取法是利用易挥发的有机溶剂进行加热提取，并采用冷却装置使溶剂连续回流，使植物有效成分能充分提出，且此法简单易行，溶剂用量少，提取较完全，故本实验中采用了回流提取法。 通过查找相关文献知银杏绿叶中总黄酮含量约为1.19%，银杏黄叶的总黄酮含量约为0.83%，所以采用绿叶作为原料提取黄酮类化合物，可以提高总黄酮的产量。在60℃时碱性去离子水的提取率为46.2%，纯乙醇的提取率为73.41%，乙醇水溶液的提取率介于两者之间，考虑成本，使用乙醇水溶液作为浸取剂更为合适。且在70%的乙醇水溶液，浸取温度为80℃，料液比为1:15，提取时间为4h的提取条件下黄酮类化合物的提取率为87.54%。 试剂与仪器 试剂：芸香叶苷标准品(纯度≥95％)，银杏叶，乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠。 仪器：紫外—可见分光光度计、粉碎机，烘箱，分析天平，恒温水浴锅，搅拌器，搅拌叶，升降架，冷凝管，温度计(量程100℃)，真空泵，三口烧瓶（100ml）容量瓶（10ml、50ml）。 具体步骤 1、银杏黄酮的提取将银杏叶干燥，粉碎，筛分，精确称量20目的银杏叶样品10g。 （1）将其和35mL70％乙醇水溶液加入到100mL带搅拌、冷凝管和温度计的三口烧瓶中进行回流提取，在50℃搅拌提取2h。 （2）将粗提液过滤、抽滤，再用70％乙醇定容至50mL。
大孔吸附树脂介绍及原理 大孔吸附树脂技术 以大孔吸附树脂为吸附剂，利用其对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过选用适宜的吸附和解吸条件借以分离、提纯某一或某一类有机化合物的技术。 该技术多用于工业废水的处理、维生素和抗生素的提纯、化学制品的脱色、医院临床化验和中草药化学成分的研究。它具有吸附快，解吸率高、吸附容量大、洗脱率高、树脂再生简便等优点。 大孔吸附树脂 它是一种具有大孔结构的有机高分子共聚体，是一类人工合成的有机高聚物吸附剂。因其具多孔性结构而具筛选性，又通过表面吸附、表面电性或形成氢键而具吸附性。一般为球形颗粒状，粒度多为20-60目。大孔树脂有非极性（D101,LX-60,LX-20）、弱极性（AB-8，LX-21,XDA-6）、极性（LX-38,LX-17）之分。大孔吸附树脂理化性质稳定，一般不溶于酸碱及有机溶媒，在水和有机溶剂中可以吸收溶剂而膨胀。
大孔吸附树脂技术的基本装置 恒流泵 吸附原理 根据类似物吸附类似物的原则，一般非极性树脂宜于从极性溶剂中吸附非极性有机物质，相反强极性树脂宜于从非极性溶剂中吸附极性溶质，而中等极性吸附树脂，不但能从非水介质中吸附极性物质，也能从极性溶液中吸附非极性物质。 操作步骤 1）树脂的预处理 预处理的目的：为了保证制剂最后用药安全。树脂中含有残留的未聚合单体，致孔剂，分散剂和防腐剂对人体有害。
预处理的方法：乙醇浸泡24h→用乙醇洗至流出液与水1：5不浑浊→用水洗至无醇味→5%HCl通过树脂柱，浸泡2-4h→水洗至中性→2%NaOH通过树脂柱，浸泡2-4h→水洗至中性，备用。 2）上样 将样品溶于少量水中，以一定的流速加到柱的上端进行吸附。上样液以澄清为好，上样前要配合一定的处理工作，如上样液的预先沉淀、滤过处理，pH调节，使部分杂质在处理过程中除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入成品。上样方法主要有湿法和干法两种。 3）洗脱 先用水清洗以除去树脂表面或内部还残留的许多非极性或水溶性大的强极性杂（多糖或无机盐），然后用所选洗脱剂在一定的温度下以一定的流速进行洗脱。 4）再生 再生的目的：除去洗脱后残留的强吸附性杂质，以免影响下一次使用