谈钩藤散浸膏对亚急性衰老模型小鼠的影响
日期： 08月25日
黄厚才1，胡元亮2，胡春萍1，彭蕴茹1，丁永芳 【摘要 目的 观察钩藤散浸膏对衰老模型小鼠智力、乙酰胆碱酯酶（ACHE）、抗氧化酶（SOD）、自由基（MDA）的影响，探索其抗衰老功能及机制。方法 小鼠随机均分为6组，除正常对照组外，各组天天皮下注射D-半乳糖（0.05g/kg），连续注射6周。从注射的第7天开始，3个实验组同时灌胃高、中、低剂量的钩藤散浸膏，阳性对照组灌以维生素E（0.05g/kg）模型对照组和正常对照组天天灌胃等量的蒸馏水，连续给药5周后测定小鼠的练习成绩、记忆成绩及血清SOD、ACHE和脑组织MDA的含量变化。结果 实验组的练习成绩显著（P＜0.05），测试成绩极显著（P＜0.01）好于、血清SOD、ACHE活力极显著（P＜0.01）高于、脑MDA含量极显著（P＜0.01）低于模型对照组；和正常组比，除ACHE偏高外，其余各指标相近。结论 钩藤散能提高抗氧化能力，降低自由基含量，增强胆碱能神经系统功能，从而防止衰老。
【 D-半乳糖；钩藤散；衰老；小鼠
【Abstract Objective To observe the effects of Goutengsan extract on memory，malondiadehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD），ACHE in mice to study therapeutic effects and mechanism of Goutengsan on aging model.Methods Mice were randomly divided into 6 groups. All groups，except the control，were administrated （ip） with D-galactose （0.05g/kg） for successive 6 weeks. The 3 experimental groups were administrated （ig） with high，middle and low dosages of Goutengsan extract respectively after 7th day of the injection of D-galactose whereas vitamin-E at 0^05g/kg body weight served as a positive control. The model and control groups were daily adminisered with D.D.W. for continuous 5 weeks. After treatments，the SOD，ACHE activity in serum and MDA in brain of rats were determined，the training score and memory grade were also recorded.Results Goutengsan extract effectively increased the training scores and memory grades. Also，the serum SOD，ACHE activities in Goutengsan extract-treated mice were higher than that in control group. However，the brain MDA content in Goutengsan extract-treated mice was lower than that in control group.Conclusion This data suggested that Goutengsan extract had a significant anti-oxidative effect by reducing the free radicals as well as an anti-aging effect through the enhancement of cholinergic nerve system.
【Key words D-galactose; goutengsan; aging; mice
老年痴呆是威胁人类健康的重大疾病之一，对其的防治一直是全球关注的焦点。钩藤散源于《本事方》，由钩藤、石膏、陈皮、麦冬、半夏、茯苓、人参、防风、生姜、甘草、菊花等11味药组成，原为治疗肝厥头晕之证的经典方剂。本次实
验进行了钩藤散浸膏的抗衰老实验，以观察钩藤散浸膏在抗衰老方面的影响及机制。
1 材料
1.1 药品和试剂 （1）钩藤散摘要：由本院中药制剂室按传统方法水提、浓缩、消毒等制成浸膏。临用前每19ml钩藤散浸膏加蒸馏水配至100ml，变成0.5g生药/ml清膏溶液，实验中所用剂量均以生药量计。（2）维生素E胶丸摘要：厦门鱼肝油厂（批号摘要：10842002）。用前将维生素E胶丸用蒸馏水按10粒/100ml蒸馏水配成溶液。（3）D-半乳糖摘要：国药集团化
学试剂有限公司（批号摘要：20050121）。（4）乙酰胆碱酯酶（ACHE）活性测定试剂盒摘要：南京建成生物工程探究所（批号摘要：20050225）。（5）超氧化物歧化酶（SOD）活性测定试剂盒摘要：南京建成生物工程探究所（批号摘要：20041221）。（6）丙二醛MDA活性测定试剂盒摘要：南京建成生物工程探究所（批号摘要：20041224）。
1.2 动物 清洁级KM小鼠摘要：18-22g，雌雄各半，由中科院上海实验动物中心提供，许可证号摘要：SCXK（沪）2002-0010。
1.3 仪器 （1）MG-2迷宫摘要：张家港市生物医学仪器厂生产。（2）高速冷冻离心机摘要：贝克曼产品。（3）721分光光度计摘要：上海第三分析仪器厂产品。（4）高速分散器XHF-1摘要：上海金达生化仪器厂产品。
1.4 实验环境 清洁级，合格证号摘要：SYXK（苏）2002-0007。
2 方法
2.1 分组、造模、给药 将小鼠分为6组，每组12只，雌雄各半，先进行造模，正常对照组皮下注射等体积生理盐水（1ml/kg），其余各组天天皮下注射D-半乳糖，0.05g/kg体重，连续注射6周。注射7天后开始给药，实验高剂量组天天灌胃给10g生药/kg体重，中剂量组5g/kg，低剂量组2.5g/kg，阳性对照组天天给维生素E 0.05g/kg体重，模型对照组和正常对照组天天给等量的蒸馏水，天天灌胃1次，每次0.2ml/10g体重；连续给药5周。
2.2 学习练习［1］ 最后1天给药后1h进行学习练习，练习时，将小鼠放入Ⅰ臂起步区停留3 min后给予电击（35V），按Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ或Ⅰ→Ⅲ→Ⅱ→Ⅰ连续试验摘要：a项摘要:小鼠到达平安区停留0.5 min，然后取出放回原臂，1 min后给予下次电击，达到连续2次直接逃至平安区后，以逃入的平安区作为起步区进行电击练习。当小鼠在三臂均达到连续2次直接逃至平安区后，进行b项试验摘要：小鼠在Ⅰ臂起步区停留1 min后给予电击，逃至平安区停留0.5 min，再以此区作为起步区予以电击，连续循环电击练习（每两次电击之间休息1min），以小鼠连续10次（或9/10）正确反应（直接逃入平安区）作为空间辨别记忆指标，每回连续学习的电击总次数一般不超过30次。最后将a项和b项相加作为练习成绩
。
2.3 记忆测试 练习后24h进行测试，测试方法同练习，将a项和b项相加作为学习成绩。
2.4 血中SOD、ACHE测定 测试后眼眶取血，3000r/min离心，取上清液按试剂盒说明书所述步骤操作，测定ACHE、SOD活力。
2.5 脑中MDA的测定 小鼠取血后处死取脑，置匀浆器中，加入预冷生理盐水制成10%（g/ml）的脑匀浆，按试剂盒说明书所述步骤操作，测定蛋白质含量和MDA含量。
2.6 统计学分析 数据用x±s表示，组间比较用t检验。
3 结果
3.1 对学习记忆的影响 模型组练习、测试成绩都极显著差于正常组（P＜0.01），说明造模成功；实验组练习、测试成绩都和正常组相近，而极显著地好于模型组（P＜0.01），说明给药后钩藤散浸膏抑制了D-半乳糖所致的衰老，使记忆恢复如常，见表1。
表1 钩藤散浸膏对D-半乳糖衰老模型小鼠记忆的影响 （x±s，n=12）
Tab.1 Effects of GTS extract on memory of mice doddery models created by D-galactose
注摘要：和模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；和正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001；“/”灌以等量的蒸馏水，下同3.2 对血清中SOD活力的影响 见表2。
表2 钩藤散浸膏对D-半乳糖衰老模型小鼠血清中SOD活力的影响 （x±s，n=12）
Tab.2 Effects of GTS extract on activity of SOD in serum of mice doddery models created by D-galactose
从表2可知，实验组血清中SOD活力显著高于模型组（P＜0.05），和正常组较近无明显差异，而模型组血清中SOD活力显著小于正常组（P＜0.05）。说明钩藤散浸膏有助于D-半乳糖所致衰老模型小鼠SOD活力的恢复，从而增强清除自由基的能力。
3.3 对脑中MDA含量的影响 从表3可知，实验组MDA含量显著小于模型组（P＜0.05），和正常组比较接近，差异无显著性，而模型组则显著高于正常组（P＜0.05）。说明钩藤散有助于降低自由基MDA的含量，从而延缓衰老。
表3 钩藤散浸膏对D-半乳糖衰老模型小鼠脑中MDA含量的影响 （x±s，n=12）
Tab.3 Effects of GTS extract on content of MDA in brain of micedoddery models created by D-galactose
3.4 对血清中ACHE活力的影响 见表4。
表4 钩藤散浸膏对D-半乳糖衰老模型小鼠血清ACHE活力的影响 （x±s，n=10）
Tab.4 Effects of GTS extract on activity of ACHE in serum of mice doddery models created by D-galactose
从表4可知，实验组血清中ACHE极显著高于模型组（P＜0.01），和正常组比较差异无显著性，而模型组则显著低于正常组（P＜0.05）。说明钩藤散浸膏有助于维持ACHE含量，确保神经递质处于正常水平，从而保证神经功能的正常进行。
4 讨论
D-半乳糖造成动物的老化效应早有报道，青年小鼠长期注射D-半乳糖后，由于其代谢产物半
乳糖醇不能被进一步代谢而堆积在细胞内，影响渗透压，导致细胞肿胀，代谢紊乱，体内活性氧水平升高，细胞脂质受损，以致产生气体多器官、多系统的功能减退，这些变化均和老龄小鼠相似。D-半乳糖还会引起脑神经元的一系列退行性变化，包括神经元数目减少，脑组织中SOD活性下降，MDA、脂褐素水平上升，表现为学习记忆下降［2］。因此现代探究常用D-半乳糖所致亚急性衰老模型进行抗衰老药物功能机制的探究。
众所周知，乙酰胆碱（ACH）是进行及维持中枢胆碱能神经系统功能的一种重要介质。它传导的信号和认知、学习和记忆有关，其代谢过程和老年性痴呆（AD）紧密相关［3］。它由胆碱乙酰化转移酶（ChAT）催化合成，乙酰胆碱酯酶（ACHE）催化分解。多数探究表明AD患者脑内ChAT 和ACHE活性降低，ACHE含量不足，导致中枢神经系统功能障碍，学习记忆能力下降［4］。显示了AD和胆碱能系统功能紊乱密切相关。ACHE活性的下降反映了乙酰胆碱的代谢转换率减慢。因此测定ACHE含量能反映胆碱能系统的状况，更好地探究钩藤散对衰老模型小鼠的功能机制。
自由基可引发肿瘤、心血管疾病、神经变性疾病、皮肤衰老等退行性疾病，脂质过氧化的终产物是MDA。SOD是机体内清除自由基的重要抗氧化酶之一，其活力和含量反映了机体清除氧自由基的能力［5］。探究表明，随着年龄的增长，SOD清除氧自由基能力的下降，引起氧自由基及脂质过氧化物（LPO）日益增多，由于生物膜中不饱和脂肪酸被氧化成过氧化物时，可使细胞膜的通透性改变，线粒体、微粒体膜膨胀破裂，造成细胞代谢和功能形态的改变，最后导致机体衰老和老年性疾病的发生［1］。因此，目前SOD活性的测定被认为是抗衰老药物的重要指标之一。
本实验复制了老年小鼠模型，结果显示摘要： ACHE摘要：模型对照组含量显著低于正常对照组，实验组含量极显著高于模型对照组而和正常对照组相近，说明小鼠老化后ACHE活力有显著下降，而实验组能反抗这种下降，维持正常水平。练习和学习成绩摘要：实验组均显著好于模型对照组，说明给药后小鼠的记忆有了很大的改善，而模型对照组显著低于正常对照组，说明模型复制是成功的。SOD摘要：实验组活力显著高于模型对照组。MDA含量摘要：实验组显著低于模型对照组，而和正常对照组相近，说明给予钩藤散后，小鼠的抗氧化能力有了很大的改善，清除自由基的能力有了很大的提高。
由此可见摘要：（1）实验中衰老模型小鼠的复制是成功的；（2）钩藤散浸膏能反抗D-半乳糖所致小鼠的衰老；（3）提示钩藤散浸膏抗小鼠衰老的
机制摘要：反抗ACHE活力的下降，维持胆碱能神经系统功能的正常，恢复机体抗氧化能力，增强清除自由基的能力，从而能够抗衰老，恢复记忆功能。
【参考文献
1 陈勤. 抗衰老探究实验方法. 北京摘要: 中国医学科技出版社，1996，91-466.
2 罗焕敏，陈子晟.一种新的老年痴呆动物模型.中国老年学杂志，2003，23（3）摘要:181.
3 韩大雄，杨频.老年痴呆的分子病理机制.化学通报，2003，2摘要:96.
4 罗焕敏，陈子晟.一种新的老年痴呆动物模型.中国老年学杂志，2003，23（3）摘要:179-182.
5 王春霖，郭芳，王永利.自由基和衰老.河北医科大学学报，2005，26（4）摘要:308-310.