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Waters e2695型高效液相色谱仪标准操作程序终稿

Waters e2695型高效液相色谱仪标准操作程序终稿

1 目的:Waters e2695型高效液相色谱仪的一般标准操作程序。

2 范围:Waters e2695型高效液相色谱仪。

3 责任人:相关实验人员

4 设备部件及名称

4.1 Waters e2695分离单元.

4.2 2998型二极管阵列检测器.

4.3 Empower色谱工作站.

各部件可独立操作或通过色谱工作站控制,色谱数据处理由色谱工作站完成,其操作系统为Windows XP Profesional SP3,工作站软件为色谱管理软件。

5 标准操作程序

5.1 开机前准备

5.1.1 检查桌面是否清洁、整齐。

5.1.2 检查设备是否清洁,连接管线是否正常,色谱柱是否需要更换。

5.1.3 检查电源线有无破损。

5.1.4 接通电源,检查插座上各插孔的指示灯是否显示正常。

5.1.5 准备好超声过的流动相和流路冲洗溶剂。流动相和纯水应用微孔滤膜过滤(纯有机相或含一定比便例有机相的用有机系的滤膜,水相或缓冲盐的用水系滤膜)。一次制得的纯水或缓冲盐流动相应在连续24小时内使用完,如未使用完也应弃去不用,并重新配制新鲜的流动相。如需使用,应重新过滤。流动相的pH值应在色谱柱填料允许的范围内。该泵带有真空脱气机,可不超声,但要在泵电源开启后,等脱气机停止工作后(约需5分钟)再进行泵的其它操作。

5.1.6 准备样品。为延长层析柱使用寿命,建议使用流动相溶解样品,如果不是,一定要做预试验,确保样品在流动相溶液中不出现沉淀。如果样品中成份复杂,特别含有强保留成分,建议过C18 小柱预处理。样品在进样前必须经0.45μm的微孔滤膜滤过,根据溶剂性质选择合适的滤膜。过滤完毕

后,置于样品盘上,记录样品所放的位置号。

5.2 开机接通稳压电源,待电压稳定在220V时,依次打开下列仪器的电源:高压泵、柱箱、系统控制仪、色谱工作站。接通2695 分离单元后,约20s 仪器开始自检,约1min 后,显示主屏幕,此时继续各部件的初始化,待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时,仪器进入待命状态。

5.3 溶剂管理系统的准备

5.3.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂,按【Menu/Status 】,进入“Status (1 )”屏幕。

5.3.1.1 湿启动在“ Status (1 )”屏幕下,光标选“ Compomtion ”中欲使用的流动相,输入流动相组成及比例,按【Enter 】再用光标选“ Degasser ”中的“ Normal ”,按【Enter 】。按【Direct Function 】,光标选“ Wet Prime ”,输入流速及时间,按【OK 】。

5.3.1.2当溶剂的管路是干的或存在较多气泡不易排出时,进行干启动。在“ Status (1 )”屏幕下,按【Direct Function 】,光标选“ Dry Prime ”,按【Enter 】,显示“ Dry Prime ”屏幕,按欲启动的溶剂管路的屏幕键,如【OpenA 】,光标选“ Duration ”,按数字键输入5min ,按【Continue 】,待限定时间结束后,重复操作,使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。

5.4 样品管理系统的准备

5.4.1 冲洗自动进样器在“ Status (1 )”屏幕下,光标选“ Composition ”,输入流动相的组成。按【Direct Function 】,光标选“ PurgeInjector ”,按【Enter 】,显示“ Purge Injector ”屏幕,输入“ Sample Loop Volumes

6.0 ” ,光标下移“ Compression Check ”,按任意数字键,按【OK 】。

5.4.2 冲洗进样针在主屏幕下,按【Diag 】,显示“ Diagnositcs ”屏幕,按【Prime Ndl Wash 】,显示“ Prime Needle Wash ”屏幕,按【Start 】,30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。

5.4.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下,按【Diag 】,显示“ Diagnosities ”屏幕,按Prime Seal Wash ,显示“ Prime Seal Wash ”屏幕,按【Start 】,待排放口有水流出,按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。

5.4.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置,打开样品仓门,显示“ Door is Open ”屏幕,装入样品盘,按【Next 】,直至所有样品盘装毕,关仓门。

5.5Empower色谱工作站操作

5.5.1 登录

点击桌面上Empower图标,出现Empower登录窗口,输入用户名和密码,然后单击“确定”,进入Empower。每次登录前必须输入用户名和密码。注:出厂设置的用户名为system,密码为manager。

5.5.2 项目管理

5.5.2.1 新建项目:双击“配置系统”进入,按“新建项目向导”提示建立新项目。

注:项目名中不能出现空格。可使用下划线(_ ) 分隔词。另外,名称不能以数字开头。项目是方法、结果、自定义字段、视图筛选器和原始数据的集合,由用户定义。该集合驻留在Empower 数据库中并在“ 浏览项目” 中显示。项目是为了方便用户归类、管理和检索相应的数据,应根据实际情况来决定是否建立,并不是每次开机都要创建。

5.5.3 数据采集

5.5.3.1 双击“运行样品”进入,在出现的页面的左框中选择欲存储采集数据的“项目”,在右框中选择所需的色谱系统,然后单击“确定”。

5.5.3.2 出现“运行样品”窗口后,选择“单一”或“样品”表单画面中的“创建方法组”快捷键,出现新

方法组-选择仪器方法窗口。可以在现有的仪器方法中选择一个或者单击“新建”来创建新的仪器方法。如果单击了“新建”,会出现仪器方法编辑器。窗口会为所选色谱系统中的每个仪器显示一个图标。选中不同的图标,即可编辑相应的仪器参数。请根据您的实验方法设置相应的每个仪器具体参数。编辑仪器参数完成后单击“文件”> “另存为”,出现“保存仪器方法”对话框。输入仪器方法名,单击“保存”,保存该仪器方法。关闭“仪器方法编辑器”窗口。新建的仪器方法出现在仪器方法列表中。选中所要的仪器方法,单击“下一步”。出现“选择缺省方法”页。选择“处理方法”与“报告方法”(如尚未建立合适的方法,则接受默认设置),单击“下一步”,出现“命名方法组” 页。输入方法组名(缺省设置成与刚建立的仪器方法名相同),必要时输入注释后,单击“完成”。回到运行样品窗口。5.5.3.3 在“方法组”下拉菜单中选择欲使用的方法组,同时在下方的“仪器方法”下拉菜单中,选择欲使用的仪器方法。“监视器”键单击中“监视器”键,观察基线。

5.5.3.4 待系统平衡后,即可单击“停止”键,终止观察基线。随后等到系统空闲后,设定采集的参数样品名、功能、样品瓶以及样品体积与运行时间,最后单击“进样”或“运行”,开始采集数据。进样时状态条会做出指示。色谱数据被采集并显示在“实时”图中。注:如果不知道运行时间,第一次进样应设长一些,如填60min ,进样确认后,进第二针时再改回适合的时间。

注:“ 方法组” 栏中,默认会出现刚刚建立好的方法组的名称,如果需要选择其它已经建立过的适用的采集方法组,则可从此栏的下拉菜单中选中即可。

5.5.4 数据处理

5.5.4.1 单击鼠标左键进入“浏览项目”,选择欲浏览数据所在的项目,然后单击“确定”,进入该项目。

5.5.4.2 在“通道”选项卡中,选中欲修改的标准品和样品信息。注:在Empower 进行处理时,只有标样能够生成校正曲线,然后才能对未知样进行定量计算。如果在进样时没有正确设置样品类型,可在此窗口直接进行修改。也可针对具体情况,修改样品名称、样品重量以及稀释倍数。

5.5.4.3 在“通道”选项卡中选择欲处理的数据,单击(查看)打开。出现“查看-主窗口” 。单击(处理方法向导),出现“处理方法向导”对话框,选择“新建处理方法”,然后单击“确定”。按向导提示完成处理方法的建立并保存。积分并保存全部结果。

5.5.5数据的打印

5.5.5.1 单击鼠标左键进入“浏览项目”。选择欲打印数据所在的项目,然后单击确定,进入该项目。在“结果”选项卡中选择欲打印的结果,单击(预览出版)。

注:如果在非“ 结果” 选项卡(例如通道)中单击预览出版,则无法查看到积分结果。

5.5.5.2 出现“打开报告方法”对话框,选择“使用对选中的数据适用的报告方法”,或者在“使用以下的报告方法”下拉菜单中选择适当的报告方法,然后单击“确定” 。此时若选择“峰综合报告”格式,可计算峰面积/保留时间的重现性等统计信息。如果只需要峰面积等信息,则可选择“缺省单个报告”。5.5.5.3 在屏幕上即出现报告预览窗口,如预览后无误,单击(打印),打印报告。

如果想批处理打印,可以在“项目”窗口中,点击“结果”标签,用“键盘Ctrl +鼠标左键”选黑要出报告的样品,单击(打印)在随后出现的“后台处理及生成报告”页面中(见下图),确认“打印”方框中打勾,“处理”和“导出”方框中为空。选中…使用指定的报告方法?,在其下拉菜单中选择所需的报告方法,点击…确定?即可。

5.6 关机

5.6.1 数据采集完毕后,关闭检测器电源开关。

5.6.2 使用完毕,按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、系统管路、自动进样器、进样针和柱塞杆密封垫,确保2695 分离单元已彻底冲洗干净后,关闭电源开关。

5.6.3 处理数据并打印报告后,关闭计算机和打印机电源开关,并做使用登记。

6 注意事项

6.1 更换溶剂时,若液体流路中有气泡,可用注射器抽吸,彻底排除气泡

6.2 流动相禁止使用氯仿、三氯(代)苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等;慎重使用四氯化碳、乙醚、异丙醚、酮、甲基环己胺等,以免造成对柱塞密封圈的腐蚀。

6.3 柱温箱一旦发生报警,一定要及时找到原因。若实验室湿度太高,则需采取相应的除湿措实。若柱温箱中发生漏液现象,则需及时拧紧色谱柱并擦干漏液,长时间的漏液极易损坏柱温箱中的传感器。

6.4 紫外检测器要“晚开、早关”,在流通池有溶液连续流动几分钟后方可开启。若不需要做样,可设置一个较低的流速(如0.05ml/min)。如果流动池中有气泡,则会提示漂移过大无法通过自检和校正。

7 维护保养规程

7.1检查HPLC的日常操作条件:

7.1.1 检查温度:10—30℃;

7.1.2 检查相对湿度:<80%

7.1.3检查稳压电源是否正常工作;

7.1.4 检查线路连接是否正常;

7.2 泵的保养:

7.2.1 泵的排气:先拧松排气阀,用注射器将气泡抽出,反复进行直到气泡完全排出。

7.2.2 应尽量避免泵在很高的压力下长时间操作。

7.2.2.1当泵出现压力明显高于正常值的情况,应先拆卸掉在线过滤器再连接好流路,观察泵压读数,若泵压读数依然很高,则在线过滤器没有堵塞。预柱、分析柱同样处理。发现哪个部件有堵塞则拆卸掉超声清洗20min,再连接好流路。

7.2.2.2当泵压力不稳定时,需要将单向阀拆卸掉用异丙醇超声清洗20min。

7.2.3 溶剂过滤头要经常超声、清洗;每星期一次。

7.2.4 泵本身没有在线自清洗功能,需要将注射器吸满10%甲醇并连在泵的软管上对泵进行多次清洗。每星期清洗一次。

7.3 柱的保养:

7.3.1 新柱子在使用前一定要写上启用日期。

7.3.2 分析测定结束后,要用适当的溶剂来清洗柱。

7.3.2.1若流动相中不含盐、酸和碱则用纯甲醇冲柱30min。

7.3.2.2有盐、酸和碱则先用10% 甲醇至少冲30min,再用纯甲醇冲30min。

7.3.3 在线过滤器要定时拆卸超声清洗,每月清洗一次。

7.3.4 预柱(保护柱)应拆卸超声清洗,也可在纯甲醇为流动相下低流速的反冲,一个月清洗一次。

7.3.5 长期不使用,应用适当有机溶剂保存并封闭;C18柱用纯甲醇保存并封闭。

7.4 检测器(UV)的保养:

7.4.1 流通池要保养,经常用甲醇冲洗。

7.5 其它:

7.5.1 每两周要清洁一次仪器。仪器长期不用时,应用甲醇冲洗各流路。

7.5.2 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。

7.5.3 防止过滤头滋生细菌和微生物。定期更换溶剂瓶中的溶剂。

7.5.4 不要将排气阀拧得过紧。

7.5.5 应定期对水相及含水相流动相瓶进行清洗,每周一次。

7.5.6 每年要检查一次仪器接地状况。

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