第15卷第3期1999年6月
中国生物化学与分子生物学报
Ch inese Jou rnal of B i ochem istry and M o lecu lar B i o logy
V o l.15,N o.3
Jun.,1999
3 国家自然科学基金重点资助项目(39230020)
联系人:季朝能,1970年8月生,博士,讲师
T el:(021)65643958,
E2m ail:chnji@https://www.doczj.com/doc/204960516.html,
收稿日期:1998204206,修回日期:1998206208 Taq D NA聚合酶功能区域的定位3
季朝能 杜汉森 郑佐华 黄啸宇 毛裕民
(复旦大学遗传所 遗传工程国家重点实验室,上海 200433)
摘要 通过参U法定点突变产生了T aq DNA聚合酶N端分别缺失3个,235个,287个和443个氨基酸的4个缺失体,利用B al231连续缺失法产生了T aq DNA聚合酶的C端分别缺失了2个、16个、29个、32个、34个氨基酸的5个缺失体.经DNA聚合酶活性测定表明N端缺失3个,235个,287个氨基酸后活力和完整的T aq相近,而缺失443个氨基酸后则失去了DNA聚合酶活力;C端的5个缺失体都失去了DNA聚合酶活性.据此T aq DNA聚合酶的功能区域被定位在287～832氨基酸之间.关键词 T aq DNA聚合酶,功能区域
Study on the Functiona l D oma i n of Taq D NA Poly m era se
J I Chaoneng,DU H an sen,ZH EN G Zuohua,HU AN G X iaoyu,M AO Yum in
(Institu te of Genetics,F ud an U niversity,S hang hai 200433)
Abstract Fou r truncato rs w ith deleti on of3,235,287and443am ino acids at N2term inu s of T aq DNA po lym erase w ere ob tained th rough u ral2m ediated site direct m u tagenesis.F ive truncato rs w ith deleti on of2,16,29,32and34am ino acids at C2term inu s w ere ob tained th rough con tinuou s deleti on w ith B al231nuclease.T heir DNA po lym erase activity w as m easu red.It w as found that truncato rs w ith deleti on of3,235and287am ino acids at N2term inu s m ain tained the DNA po ly2 m erase activity and their sp ecific activity w as iden tical to that of native T aq DNA po lym erase w h ile o ther truncato rs w ith deleti on at N2term inu s o r C2term inu s lo st their DNA po lym erase ac2 tivity.B ased on these,the dom ain respon sib le fo r the DNA po lym erase activity of T aq DNA po ly2 m erase w as located betw een287am ino acid and832am ino acid.
Key words T aq DNA po lym erase,Dom ain
1985年R andall K.Saik i等利用K lenow DNA 聚合酶建立了聚合酶链式反应(Po lym erase Chain R eacti on,简称PCR技术)[1],并将这一技术应用于镰刀形贫血症的基因诊断.但由于K lenow DNA聚合酶在高温下很快就失活,故每一轮PCR都要追加K lenow DNA聚合酶,这限制了PCR技术的推广与应用.1988年,R andall K.Saik i等从水生栖热菌(T her m us aqua tics)中分离纯化到了T aq DNA聚合酶并将它应用于PCR技术[2],自此以后PCR技术才真正地得到了推广,被广泛地应用于基因诊断、定点诱变、DNA序列测定以及DNA多态性研究等各个方面.随着PCR技术的推广和应用,T aq DNA聚合酶的研究日渐重要,通过对T aq DNA聚合酶的结构和功能之间的关系以及在PCR反应过程中DNA聚合酶的作用机制的研究,可以为改进T aq 聚合酶的各项酶学性能指标和进一步推广PCR技术的应用提供理论指导.蛋白质结构与功能研究的基础工作之一是功能区域在蛋白质上的定位,但T aq DNA聚合酶的功能区域的系统定位至今在国内外杂志上都未见报道.我们已将T aq DNA 聚合酶在大肠杆菌中进行了克隆和高表达[3],在此基础上,我们对T aq DNA聚合酶进行了N端的定点诱变缺失和C端的连续缺失,对T aq DNA聚合酶的活性区域进行了系统的定位.
1 材料和方法
111 材料
大肠杆菌T G1,CJ236;质粒pJLA503(一种热诱导高表达质粒),p T aq01(pJLA503上克隆有T aq DNA聚合酶全基因),pM13m p18T aq(M13m p18上克隆有T aq DNA聚合酶基因5′端900bp左右的片段)均由本实验室保存.各种限制性内切酶、T4DNA 连接酶、B al231核酸酶、K lenow DNA聚合酶均购自美国N ew England B i o lab s或P rom ega公司,T7 Sequence K it购自Pharm acia公司.PCR扩增引物由复旦大学遗传所合成.
112 方法
11211 DNA重组操作
质粒提取,内切酶水解,DNA连接,DNA的转化和鉴定,参U法定点突变等操作参照《M o lecu lar C lon ing》[4].
11212 B al231核酸酶连续缺失法
30Λg的质粒DNA于300Λl的体系中用限制性内切酶单酶切以后,65℃放置15m in灭活限制性内切酶,分装6管,每管50Λl,加入1 10体积的10×B al231核酸酶缓冲液和5单位的B al231核酸酶,分别于37℃放置1m in、2m in、4m in、6m in、8m in、10m in,然后用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提后用无水乙醇沉淀,沉淀得到的DNA干燥待用. 11213 蛋白质表达和分离纯化
将待表达菌株接种于10m l的2YT培养基中, 30℃培养过夜,以2%的接种量接种于100m l的2YT培养基中,30℃培养2h.加入等体积55℃预热的2YT培养基,42℃培养6～7h.收集菌体,以8g m l湿菌体的比例用磷酸缓冲液(5mm o l L ED TA, 10mm o l LΒ2巯基乙醇,20mm o l L K2H PO42 KH2PO4,4mm o l L T ris2HC l,0125N aN3,5%甘油, (pH810))悬浮,超声破碎后,15000r m in离心15 m in,取上清液经70℃变性1h,15000r m in离心15m in.取变性所得的上清液边搅拌边加5%PE l (聚乙烯亚胺)至终浓度为0104%,15000r m in离心15m in,取上清液边搅拌边加(N H4)2SO4至终浓度为40%,15000r m in离心15m in,去除上清液,沉淀加3m l的磷酸缓冲液溶解完全,装入透析袋中于1000m l的磷酸缓冲液中透析两次,每次12h,收集透析好的样品准备上柱.
上柱:用磷酸缓冲液平衡好羟基磷灰石柱(HA),上样3m l经过磷酸缓冲液透析的样品,然后用50mm o l L的PE(50mm o l L K2H PO42KH2PO4 (pH810),1mm o l L ED TA,10mm o l L T ris2
)住的蛋白,再用150mm o l L的PE(100mm o l L K2H PO42KH2PO4(pH810),1mm o l L ED TA,10 mm o l L T ris2HC l,10mm o l LΒ2巯基乙醇)洗脱,收集洗脱峰中的样品用保存缓冲液(300mm o l L KC l,1mm o l L D T T,011mm o l L ED TA,10 mm o l L T ris2HC l(pH814),200Λg m l小牛血清白蛋白,50%甘油)透析两次,每次12h,透析后得到的样品保存于-20℃中以待进一步的分析.
11214 T aq DNA聚合酶的DNA聚合酶活性的测定
T aq DNA聚合酶的DNA聚合酶活性的测定按文献[3]进行.
11215 SD S2PA GE
SD S2PA GE选用L aemm li的高pH不连续缓冲体系,具体操作参照文献[4],分离胶浓度采用10%的聚丙烯酰胺凝胶.
2 实验结果
211 Taq D NA聚合酶基因5′端的缺失研究21111 T aq DNA聚合酶基因5′端的缺失
从克隆有T aq DNA聚合酶基因的M13m p18质粒(M13m p18T aq)出发,抽提参U单链,
取经磷
F ig.1 Som e endonuclease site of pT aq01
N,A,B,E and S rep resent N d e ,A cc ,B am H ,E co R
and S al endonuclease respectively
酸化的突变引物(各引物序列如下,分别在M4, D236,L288,M444位引进一个N d e 酶切位点)进行参U法定点突变,经测序鉴定得到了4个所需的缺失体.对M4位的突变用N d e ,A cc (S50位)酶切克隆入p T aq01(N d e ,A cc )载体, D236,L288,M444位的突变则用N d e , B am H (R593位)酶切后,小片段克隆入p T aq01 (N d e ,B am H )载体,这样得到了4个缺失3个,235个,287个和443个氨基酸的克隆子p T aqND3,p T aqND235,p T aqND287,p T aqND443. 21112 T aq DNA聚合酶N端的缺失对DNA聚合
334
第3期季朝能等:T aq DNA聚合酶功能区域的定位
酶活性的影响
将4个N端有不同程度缺失的克隆子以及T G1(p T aq01)分别热诱导8h,经破菌,变性,PE l沉淀,(N H4)2SO4沉淀,透析,上HA柱后,得到了分
离纯化的酶,纯度在90%以上(其中T aq DNA
聚合
酶的分离纯化的过程见F ig.2).通过测定这几种酶
的DNA聚合酶活性和蛋白的浓度,发现T aqND3,
T aqND235,T aqND287的比活和T aq01相差不多,
而T aqND443则无DNA聚合酶活性(T ab le1).
Table1 Effect of N2term inal deleti on on the activity of T aq DNA po lym erase T aq01T aqND3T aqND235T aqND287T aqND443
A ctivity U?Λg-16716671070106317<01
01
F ig.2 T he course of the purificati on of T aq DNA po ly2
m erase
11Cell extract;2.Supernatant after heat denature;3.Super2
natant of PE l p reci p itate;4.(N H4)2SO4p reci p itati on;5.Pu2
rified enzym e
212 Taq D NA聚合酶基因3′端的缺失研究21211 T aq DNA聚合酶基因3′端的连续缺失在含T aq DNA聚合酶基因的质粒p T aq01上T aq DNA聚合酶基因在1778核苷酸处有一个B am H 酶切位点,在3′末端终止密码子后有紧挨着的一个E co R 和一个S a l 酶切位点,在这两个酶切位点之间有两个读框不同的终止密码子(GAA T TCTA GCTA GTCGA C).用B am H 和S a l 将基因的3′端720bp的DNA片段克隆到pU C118E(E co R 酶切位点被破坏了的pU C118)上,得到质粒pU C118ET,pU C118ET经E co R 酶切后用B al231核酸酶进行连续缺失,缺失所得的DNA再经B am H 酶切后,回收大于200bp DNA 小片段.将pU C118ET经E co R 酶切后用S1酶切、K lenow DNA聚合酶填平,再用B am H 酶切,然后回收大片段作为载体和上面回收的小片段连接,得到一系列的转化子.选取不能被E co R 切动的转化子,用Sanger测序法进一步鉴定.经测序,从10个克隆子中得到了5个有不同程度缺失且在读框上能利用E co R 和S a l 之间的终止密码子的克隆子,分别命名为pU C118ET1、pU C118ET2、pU C118ET3、pU C118ET4和pU C118ET5,它们分别缺失6个、48个、87个、96个和102个核苷酸对.经B am H 和S a l 双酶切后回收DNA小片段,和p T aq01(经B am H 和S a l 双酶切)载体相连接,得到T aq DNA聚合酶基因3′端有不同程度缺失的5个克隆子,它们所编码的蛋白质在C端分别缺失了2个、16个、29个、32个和34个氨基酸,将它们分别命名为p T aqCD2、p T aqCD16、p T aqCD29、p T aqCD32和p T aqCD34.
21212 3′端的缺失对酶活的影响
缺失体在42℃诱导2h后,经破菌,变性,取变性前后的上清液分别用磷酸缓冲液稀释适当倍数,以T G1(pJLA503)为对照,取5Λl样品测酶活(T ab le2).从酶活测定结果来看,无论是变性前还是变性后的样品,都没有DNA聚合酶活性.这说明T aq DNA聚合酶的羧基端的缺失导致了酶蛋白的失活,进而表明了T aq DNA聚合酶的羧端对于保持DNA聚合酶的活性是极为重要的.
Table2 Effect of C2term inal deleti on
on the activity of T aq DNA po lym erase
Befo re heat denature
U?Λl-1
A fter heat denature
U?Λl-1 T G1(pJLA503)<010001<010001
T G1(pT aq01)11581159
T G1(pT aqCD2)<010001<010001
T G1(pT aqCD16)<010001<010001
T G1(pT aqCD29)<010001<010001
T G1(pT aqCD32)<010001<010001
T G1(pT aqCD34)<010001<010001
综合T aq DNA聚合酶基因N端和C端缺失的
434中国生物化学与分子生物学报15卷
结果,可以将T aq DNA聚合酶活性区域定位在L288到E832之间.
3 讨 论
T aq DNA聚合酶的N端缺失蛋白T aqND3、T aqND235和T aqND287仍具有完整蛋白的聚合酶活性,说明L eu288前面的氨基酸残基对聚合酶活性没有影响,不属于聚合酶活性区域;T aqND443完全丧失聚合酶活性,说明聚合酶活性区域的起始氨基酸位于288～444之间.T aq DNA聚合酶属于DNA聚合酶的A族,和E.coli DNA聚合酶 有非常高的同源性.在E.coli DNA聚合酶 中,聚合酶活性区域位于L eu516和H is920之间.通过序列比较可以发现L eu516相当于T aq DNA聚合酶的L eu420,因此推测T aq DNA聚合酶的活性范围可能从L eu420开始.
在我们的实验中,T aq DNA聚合酶C端的缺失使得其丧失了聚合酶活性.从T aq以及同属家族A DNA聚合酶的K lenow DNA聚合酶的高级结构可知,紧靠羧基端的氨基酸形成Α2螺旋的二级结构,位于聚合酶活性中心底部的外侧,可能对活性中心高级结构的稳定起重要作用[1,5,6].T aq DNA聚合酶羧基端的缺失可能破坏了其高级结构,使得酶蛋白失去了DNA聚合酶活性.
本文的研究结果提示,为研究T aq DNA聚合酶的稳定性,酶的C端应是主要的关注对象之一;而研究T aq DNA聚合酶的活性位点时,不用多考虑N端第287个氨基酸以前的区域.
References
1 Saik i R L,Gelfand D H,Stoffel S,Scarf S J,H iguch R,Ho rn G T,M ullis K B.P ri m er2directed enzym atic amp lificati on of DNA w ith a thermo stable DNA po l m erase.S cience,1985,230:1350～1354
2 Saik i R L,Scarf S,Faloona F,M ullis K B,Ho rn G T,E rich H A,A rnhei m N.Enzym atic amp lificati on of beta2globin genom ic sequences and restricti on site analysis fo r diagno sis of sick le cell anem ia.S cience,1988,239:487～491
3 杜汉森,季朝能,徐迈,马匆匆,郑佐华,毛裕民.T aq DNA聚合酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达.生物工程学报(D u
H ansen,J i Chaoneng,Xu M ai,M a Congcong,Zhen Zuohua,M ao
Yum in.C loning and exp ressi on of T aq DN a po lym erase gene in
E scherich ia coli.Ch in J B iotechnol)199612:503～507
4 Sam brook J,F ritsch E F,M aniatis T.M olecu lar C loning,Co ld Sp ring H arbo r L abo rato ry P ress:1989:18.47～18.61
5 K i m Y,Eom S H,W ang J L ee D S,Suh SW,Steitz T A.C rystal structure of T herm us aquaticus DNA po lym erase.N atu re, 1995,376:612～616
6 Ko ro lev S,N ayal M,Barnes W M,D i Cera E,W ak s m an G.
C rystal structure of the large fragm ent of therm us aquaticus
DNA po lym erase I at2152A reso luti on:structural basis fo r thermo stability,P roc N atl A cad S ci U SA,1995,92:9264～9268
534
第3期季朝能等:T aq DNA聚合酶功能区域的定位