易错PCR技术应用于酶体外进化的研究进展
沈思军1*，马春萍2，哈杰提2，马全磊1
(1. 石河子大学动物科技学院，新疆，石河子，832003；2. 新疆西部牧业股份有限公司，新疆，石
河子，832000)
摘要：易错PCR技术是通过调整PCR反应条件，产生随机错配而引入多个突变。由于该技术操作简单易行，广泛应用于酶工程改造研究中。本文介绍了易错PCR技术的影响因素及近几年在酶工程改造中的应用进展。
关键词：易错PCR技术；影响因素；酶工程改造
在体外进行酶分子改造的常用采用分子体外定向进化技术。常用的方法有易错PCR （error-prone PCR）、DNA重排（DNA shuffling）、交错延伸法（staggered extension process, StEP）、随机引物体外重组（random-priming in vitro recombination, RPR）、易错滚环扩增法（error-prone rolling circle amplification, EP-RCA）、序列饱和诱变（sequence saturation mutagenesis, SeSaM）、随机插入/删除的链交换突变（random insertion/deletion strand exchange mutagenesis, RAISE）等[1]。基本原理都是通过导入突变获得大量含有不同突变的酶，在不同环境条件下定向筛选有益突变菌株。易错PCR是通过改变PCR条件，提高扩增产物的三大错配率，从而获得与原来不同的DNA序列或基因[2]，其操作简便易行，成为体外酶工程应用较为广泛的技术之一。本文就易错PCR 过程中影响突变率的因素和易错PCR技术在酶分子进化中的应用这两个方面，综述国内近几年的研究进展。
1. 影响易错PCR突变率的因素
易错PCR技术是结合随机突变与定向筛选，利用Taq DNA 多聚酶不具有3`→5`校对功能的特点，在PCR反应中通过调节离子浓度等方法引入随机突变，在特定培养基或培养条件下定向选择所需酶的方法。从而获得天然生物催化剂所不具备的某些优良特性或产生新的催化能力[2]。为提高易错PCR 引入突变的效率，常采用改变Mg2+、Mn2+离子浓度、调整4种的dNTPs比例、多轮扩增等方法。
1.1离子浓度
在PCR反应过程中，离子浓度对PCR扩增效率影响很大。Mg2+浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，稳定非互补配对的碱基对，增加产量；浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。Mn2+是很多DNA聚合酶的诱变因子，加入Mn2+可以降低聚合酶对模板的特异性，提高错配率。调整Mg2+和Mn2+离子浓度，可以获得不同突变频率的多样性文库[3]。标准易错PCR 中Mg2+浓度为7mmol/L，而Mn2+浓度根据不同的模板和扩增片段长度的要求，浓度范围在0.1-0.5mmol/L之间。刘治江等[4]利用易错PCR方法进行酶体外进化研究，在优化易错PCR 条件时设定了不同的Mg2+和
Mn2+离子浓度，通过扩增片段电泳检测结果确定了最佳扩增效率的Mg2+和Mn2+离子浓度分别为7mmol/L和0.5mmol/L。由于Mn2+浓度受扩增片段的大小和扩增片段碱基组成等因素的影响，所以没有固定推荐的Mn2+浓度，建立不同Mn2+浓度梯度的PCR反应是优化易错PCR体系中最常采用的方法[5-9]。
1.2四种dNTPs比例
易错PCR体系中，4种dNTPs比例不是1:1:1:1 ，改变4种dNTPs 的平衡，主要的目的是提高碱基错配的倾向性，降低扩增过程中聚合酶的保真性，获得更多的突变。易错P F的变化带有强烈的倾向性，碱基A、T突变为G和C的变异率高。有研究表明增加dTTP和dCTP浓度的致突变效果优于增加dATP和dGTP的效果[10,11]，因此在标准的易错PCR体系中4种dNTPs比例dATP\dGTP:dTTP\dCTP=1:5。为了简化易错PCR 优化过程，高义平等[12]检测了在不添加Mn2+、不调整其它任何PCR 成分，只降低1种dNTP 浓度的条件下体外诱变，结果显示随着dATP 浓度的降低，序列变异率和碱基突变率均成升高趋势，且主要引起AT→GC 的变异。
1.3 多轮PCR
易错PCR是一种简便快速的在DNA序列中随机引入突变的方法，是最常的无性突变技术。该技术的关键是控制诱导片段的突变率[13]。为了有效地积累有益突变，常采用二轮PCR的方法，以第一轮易错PCR产物为模板，不改变PCR体系的扩增条件进行第二轮PCR[14-16]。
2.易错PCR在酶体外定向进化中的应用
随着分子生物技术的发展，利用基于PCR 的方法进行酶分子改造已经取得了大量突破性成果。通过定向进化对酶进行改造后显著提高了酶的特性，获得了特定功能的工业酶。利用该方法产生的突变型β-葡聚糖酶的最适pH由7.7变化至5.5，且保持了原有的耐热性和比酶活[17]。SPT3定向进化的菌株M25在10%的乙醇中生长良好，且提高了利用125g/L的葡萄糖进行乙醇发酵时的乙醇产量[9]。黄瑛等利用易错PCR 方法得到的突变型脂肪酶其比活力比野生型脂肪酶提高了1.31倍[18]。β-甘露聚糖酶是一种半纤维素酶类，可水解半乳甘露聚糖等，可广泛用于造纸、印染等行业，吴秀秀等从易错PCR 方法建立的β-甘露聚糖酶突变文库中筛选耐酸、耐高温的菌株，并结合DNA改组技术获得了特定条件下高酶活的菌株[19]。越来越多的研究利用易错PCR进行酶体外进化，这表明该技术是改造酶分子切实有效的方法，在酶的体外高效定向进化研究中有较好的应用前景。
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PCR技术的种类及其应用 1PCR技术的基本原理 PCR技术是在模板DNA引物和四种dNTP等存在的条件下,依赖于DNA聚合酶(T aq酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25?30次循环DN数量可达2X106~7拷贝数。 2PCR技术的种类 2.1反向PCR( Inverse PCR, IPCR技术 原理：反向PC是克隆已知序列旁侧序列的一种方法.主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I) NA?后酶切片段自身环化?以环化的DNA 作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA再通过反向PCR获得未知片段。 该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶 DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid 中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就 有可能与多个基因序列杂交。 2.2锚定PCR( Anchored PCR, APCR)技术 用酶法在一通用引物反转录cDNA3 '末端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增，称为APCR。 应用：它可用于扩增未知或全知序列，如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。 2.3不对称PCR(asymmetric PCR)技术 两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR在扩增循环中引入不同的引物浓度，常用50?100T比例。在最初的10?15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA 应用：可制备单链DNA
PCR技术的发展及应用 平骏 14112822276摘要：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是1985年由美国PE- Cetus 公司的科学家Kary Banks Mullis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。经历了近30年的技术发展，现如今PCR技术在生命科学研究以及相关的很多领域都得到广泛的应用。本文主要对PCR的基本原理、反应组份作简要的介绍；同时也对在PCR基础上发展起来的相关技术作简要综述。 关键词：PCR技术；PCR原理；PCR新技术 对核酸的研究己有100多年的历史，20世纪70年代初人们就致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想，该设想在1985年被Mullis等人实现，他们发明了具有划时代意义的聚合酶链反应[6]。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内从试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠，被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了深远的影响[18]。发明人Kary Banks Mulis也因此荣获了1994年的诺贝尔化学奖。 1、PCR 技术的原理[1,2] PCR技术是模拟细胞内DNA的天然复制过程，DNA 聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3，- OH 末端，并以此为起始点，沿模板5，→3，方向延伸，合成一条新的DNA互补链。简言之，其基本原理包括3个基本反应过程：变性→退火→延伸。PCR 反应的基本成分包括：模板DNA( 待扩增DNA )、引物、4种脱氧核苷酸( dNTPs)、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。每一循环中所合成的新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR 合成的特定的DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，每完成一次循环需2-4min，2-3h就能将目的基因扩增，从而达到迅速大量扩增的目的。 2、PCR技术的反应组份 2.1 模板DNA PCR反应的模板可以是单链DNA也可以是双链DNA，可以是基因组DNA 或cDNA，
PCR 技术的种类及其应用 1PCR 技术的基本原理 PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下, 依赖于DNA聚合酶(T aq酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。2PCR技术的种类 2.1反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术 原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA 作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。 该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid 中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。 2.2锚定PCR(Anchored PCR, APCR)技术 用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。 应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。 2.3不对称PCR(asymmetric PCR)技术 两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但
PCR 技术的种类及其应用 1 PCR 技术的基本原理 PCR 技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下, 依赖于DNA聚合酶(T aq 酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。 2PCR技术的种类 2.1 反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术 原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。 该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶 切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。 2.2锚定PCR(Anchored PCR, APCR)技术 用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。 应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。 2.3不对称PCR(asymmetric PCR)技术 两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。 应用：可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。 2.4反转录PCR(reverse transcription, RT- PCR)技术 当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT - PCR应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。 2.5修饰引物PCR技术 为达到某些特殊应用目的, 如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等, 可在引物的5’-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等。 2.6巢式PCR(NEST PCR)技术 先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二 次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR( drop-in, drop-out PCR)。上述三种方法主要用于极少量DNA模板的扩增。 2.7等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR, ASPCR)技术 ASPCR依赖于引物3’- 端的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。 2.8单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技术SSCP- PCR是根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来