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酶法水解对黄芪提取物清除DPPH自由基能力的影响
【摘要】：黄芪是一种传统中药，为豆科多年生草本植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，性温，味甘，有补气固表，利尿托毒，敛疮生肌，益气补中之功效要用于食少便塘，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，气虚水肿，子宫脱垂，慢性肾炎蛋白尿，糖尿病，创口久不愈合，是临床常用中药【1】。
黄芪异黄酮主要以糖苷类型的分子形式存在于黄芪中, 但是其具有生物活性的部分主要是苷元【2】。为了建立一种体外生物转化黄芪异黄酮糖苷为黄芪异黄酮苷元的新方法, 采用纤维素酶水解70 %乙醇提取脱脂黄芪得到的异黄酮粗提物, 对比了水解前后两样品的异黄酮组成差异, 并测定了其清除DPPH 自由基的能力。结果表明: 纤维素酶能水解黄芪苷。纤维素酶处理以后的黄芪异黄酮糖苷混合物达到DPPH 自由基清除率高于未处理的黄芪异黄酮糖苷混合物【3】。
【关键字】：异黄酮; 黄芪; 抗氧化活性; 自由基;
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The effect of Enzymatic hydrolysis on the ability of astragalus extract cleared free radical of DPPH
【Abstract】: Radix astragali is the roots of Astragalus membranaceus(Fisch．)Bge．vat．mongholicus(Bge．)Hsiao，or Astmgalus membranaceus(Fisch．)Bge．，known as Huangqi in China,which belong to Family Leguminosae and is a perennial herb growing in the northeast，northwest and southwest of China．Radix astragali is the most important tonic in the Traditional Chinese Medicine to reinforce”qi”(vitalegergy)，to strengthen the superficial resistance，and to promote the discharge of pus and the growth of new tissue．It has long been used as an anti—perspirant,adiuretic of atonic．It is widespread used in clinical treatment．
Isoflavones occurred in radix astragali are mainly as glycosides. However, their bioactivities lie in the aglycones.Cellulase was used to convert isoflavone glycosides extracted fromdefatted soyean meal with 70 % ethanolinto the aglycones in this study. The compositions and antioxidant capacity of isoflavone extract before and after cellulase treatment were analyzed by HPLC and DPPH free radical scavenging test. The results showed daidzin and genistin could be hydrolyzed into daidzein and genistein by cellulase. But the hydrolysis of malonyl daidzin and malonyl genistin could not be found. The concentration of cellulase treated radix astragali isoflavone extract for DPPH free radical scavenging rate was high than non cellulase treated radix astragali isoflavone extract.
【Key words】: isoflavone; radix astragali; antioxidant activity; free radical; cellulose
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目录
第一章前言 (5)
1.1黄芪简介 (5)
1.1.1黄芪基本介绍 (5)
1.1.2黄芪特性 (6)
1.1.3植物形态 (6)
1.1.4黄芪特征 (6)
1.1.5黄芪的功效 (6)
1.1.6黄芪药材资源 (7)
1.2黄芪的主要化学成分 (8)
1.2.1黄芪多糖 (8)
1.2.2皂苷类成分 (9)
1.2.3黄酮类成分 (9)
1.2.4氨基酸 (11)
1.2.5其他 (11)
1.3.异黄酮简介 (11)
1.3.1异黄酮基本介绍 (11)
1.3.2理化性质 (12)
1.3.3鉴别反应 (12)
1.3.4分布特点 (13)
1.4酶简介 (14)
1.4.1酶的基本介绍 (14)
1.4.2酶的特性 (14)
1.4.3酶促反应 (15)
1.5纤维素酶简介 (15)
1.5.1纤维素酶基本介绍 (15)
1.5.2纤维素酶的组成与功能 (16)
1.5.3纤维素酶降解纤维素的机理研究 (16)
1.6大孔吸附树脂分离原理 (17)
1.7抗氧化性的作用 (17)
第二章实验 (18)
2.1实验材料与设备 (18)
2.1.1 材料 (18)
2.1.2设备 (18)
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2.2实验方法 (18)
2.2.1工艺流程 (18)
2.2.2实验过程 (18)
2.3黄芪提取物DPPH自由基的清除 (19)
2.3.1自由基的作用 (19)
2.3.2清除DPPH 自由基能力的测定原理 (20)
2.3.3清除DPPH 自由基能力的测定方法 (21)
第三章结果与讨论 (22)
3.1数据记录与计算 (22)
3.2DPPH 自由基清除率的计算 (22)
3.3实验讨论 (26)
3.4实验结果 (26)
第四章结论 (27)
致谢 (28)
参考文献 (29)
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第一章前言
黄芪是豆科植物，它是一味常用的中药。它的主要药理作用是“益气固表”，可以“利水”，也可以“托毒生肌”。什么是“益气”呢？凡是中医认为是“气虚”、气血不足”、“中气下陷”的情况，都可以用黄芪【4】。体质虚弱，容易疲劳，常感乏，往往是“气虚”的一种表现。贫血，则常属“气血不足”。而脱肛、子宫下坠这些病状也常被认为是“中气下陷”。有上述症状的人，冬令吃些黄芪有益处。当然最好是在医生的指导下服用。
有些人一遇天气变化就容易感冒，中医学称为“表不固”，可用黄芪来固表。常服黄芪可以避免经常性的感冒。中医有一个有名的方子，叫“玉屏风散”，有三味药，主药就是黄芪，是可以用来治疗经常性感冒的。
因为身体虚弱，或者年纪大了的人，往往下肢有些水肿。如果属于“气虚”，也可以常服黄芪。有慢性肾病的人，也可能常有浮肿，中医治疗时，黄芪有时也是常用的中药。
黄芪有益气固表、敛汗固脱、托疮生肌、利水消肿之功效。用于治疗气虚乏力，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，痈疽难溃，久溃不敛，血虚萎黄，内热消渴，慢性肾炎，蛋白尿，糖尿病等。炙黄芪益气补中，生用固表托疮。
本文利用黄芪为实验材料, 采用DPPH 自由基法对黄芪黄酮的清除自由基活性进行了研究, 以期为黄芪的合理开发利用提供参考依据, 为从天然植物材料中寻求生物活性成分提供一条新的途径。
1.1黄芪简介
1.1.1黄芪基本介绍
黄芪，又名黄耆，为植物和中药材的统称。植物黄芪产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地，为国家三级保护植物。中药材黄芪为豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的根，具有补气固表、利水退肿、托毒排脓、生肌等功效。黄芪的药用迄今已有2000多年的历史，现代研究，黄芪含皂甙、蔗糖、多糖、多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素【5】。有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。但表实邪盛，气滞湿阻，食积停滞，痈疽初起或溃后热毒尚盛等实证，以及阴虚阳亢者，均须禁服。
黄芪(耆)素以“补气诸药之最”著称，是一种名贵的中药材，也是一种最常用中药材。中文名黄芪huang qi含义为"黄色的头"("yellow leader") ，意指其药材根的黄颜色和至要的补药。《中国药典》收载的黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的
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1.1.2黄芪特性
黄芪分布于我国温带和暖温带地区，为深根性植物。喜凉爽气候，有较强的抗旱、耐寒能力，不耐热，不耐涝。气温过高常抑制植株生长，土壤湿度过大，常引起根部腐烂。宜在土层深厚、肥沃、疏松、排水良好的砂质土壤生长，在粘土上则根多，生长缓慢。多生于林缘、灌丛、林间草地、疏林下及草甸等处【6】。花期7～8月，果期8～9月。
1.1.3植物形态
黄芪为多年生草本，株高1米左右。主根直径1～2厘米，长可达1米以上，直插入土壤深处。地上茎直立，具棱；被长毛。叶互生，奇数羽复叶，具小叶21～31片。小叶椭圆形，长7～30毫米，宽4～12毫米，先端圆或微凹，基部圆形。托叶披针形，长6毫米。总状花序生茎上部叶腋，每花序10～20朵。花淡黄色，蝶形花冠，旗瓣倒卵形，顶端微凹，翼瓣与龙骨瓣近等长。子房有柄，花后荚果膨胀，长圆形，长2～3厘米，顶端有短喙，果外被短毛，内有种子3～8粒。
1.1.4黄芪特征
黄芪直根圆柱形、有的有分枝，上端较粗，长30～90厘米,直径1～3.5厘米，表面纵皱色淡棕黄色或淡棕褐色，有不整齐的纵皱纹或纵沟质，硬而韧有粉性，皮部黄白较疏松；木部菊花纹理状，气似豆腥味微甜。老根中心偶有枯朽状,黑褐色或呈空洞。气微,味微甜，嚼之微有豆腥味。质量以根条粗长、菊花心鲜明、空洞小、破皮少者为佳；红芪以皮色红润、根条均匀、坚实、粉性足者为佳。规格一般按粗细、长短分为三个等级。
红芪为野生，根呈圆柱形，大多为直条状，少有分枝，上端略粗，下端渐细，长10-50cm ，直径0.6-2cm；表面灰红棕色，具纵皱纹及少数支根痕，栓皮易脱落而露出淡黄色的皮部及纤维；皮孔横长，色浅，黄色或暗黄色，略突出；质硬而韧，不易折断，断面显纤维性并显粉性；横切面皮部黄白色约占半径1/2-1/3，形成层淡棕色，木质部淡黄棕色具放射状纹理；气微，味甜，嚼之有豆腥味【7】。特征可概括为：红芪单根圆柱形，上粗下细色红棕；质硬而韧富粉性，皮部黄白较疏松；气微味甜豆腥味，补气固表治疽痈。
1.1.5黄芪的功效
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黄芪性微温，味甘，有补气固表、止汗脱毒、生肌、利尿、退肿之功效。用于治疗气虚乏力，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，痈疽难溃，久溃不敛，血虚萎黄，内热消渴，慢性肾炎，蛋白尿，糖尿病等。炙黄芪益气补中，生用固表托疮。
黄芪和人参均属补气良药，但人参偏重于大补元气，回阳救逆，常用于虚脱、休克等急症，效果较好【8】。而黄芪则以补虚为主，常用于体衰日久、言语低弱、脉细无力者。黄芪具而补而不腻的特点，若与人参，党参等补药配伍则效果更好。黄芪可单味使用，也可与其它药物配伍应用，与芍药、甘草、桂枝、良姜、饴糖等药配伍可以治疗脾胃虚寒、慢性肠炎、胃炎、腹泻等症；与升麻、甘草、当归、人参、柴胡等药物配伍可治疗内脏下垂、脱肛、子宫下垂等症；与茯苓、菟丝子、白术、当归等配伍是治疗妇科良药；与防风、麻黄根、浮小麦配伍是治疗年老体弱者所患表虚感冒的良药。由于黄芪而补气利尿、消肿等功效，与茯苓、薏苡仁、防己等药配伍时又是治疗急慢性胃炎的良药【9】。又因黄芪具而托毒、生肌的功能，在治疗疔疮及慢性阑尾炎等疾病时也常常选用黄芪治疗。现代医学研究表明，黄芪内含而多种抗菌有效成分，而且能增强机体的免疫功能，因此还能用于预防某些传染病的发生。无论从中医治疗，还是现代医学观察，黄芪均是一味好药。所以，民间自古就有“冬令取黄芪配成滋补强身之食品”的习惯。
黄芪根入药，常作滋补中药，又可作兽药，销售量大。根茎之10倍水浸液，对马铃薯晚疫有抑制效率。黄芪还有保持水土的作用。
1.1.6黄芪药材资源
药典规定黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜英黄茂的干燥根闭。而其同属近缘植物在有些地区亦被作为黄芪入药。该属植物约种, 分布于除大洋洲外的世界亚热带和温带地区。我国有种以上, 主产于东北, 经北部、西北而至西南, 可充黄芪作药用者有十种左右, 如下表一所示。除上述的植物资源外, 各地均有引种栽培。另外, 实验证明黄芪地下部分和地上部分各成分的药理作用只是强弱不同, 而效果是一致的, 因而有可能将地上部分作为地下部分的代用品, 最近黄芪的组织培养成功为扩大黄芪资源开辟了一条新的可能的途径。
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1.2黄芪的主要化学成分
自七十年代以来，国内外对黄芪及其同属近缘植物中的化学成分进行了大量的研究。研究表明，黄芪的化学成分主要为多种黄酮类和三萜皂苷类化合物【10】。另外还有单糖、多糖、氨基酸等。
1.2.1黄芪多糖
黄芪多糖主要有葡聚糖和杂多糖，其中葡聚糖又有水溶性葡聚糖和水不溶性葡聚糖，黄芪中所含的杂多糖多为水溶性酸性杂多糖，主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，糖醛酸含量少，由半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，而有些杂多糖仅由葡萄糖和阿拉伯糖组成。
黄芪多糖的研究已取得一定进展，其多糖含量处于中上水平。国内学者从黄芪中分离纯化得到白色粉末状多糖，分子量37ku，鉴定为仅一糖苷键结构，多糖水解后检出葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，摩尔比为1：0．95：0．70。秦雪梅等采用酚一硫酸比色法测定了内蒙黄芪地下与地上部分黄芪多糖的含量，测得根部含量最高，茎叶次之，种子最低。由于茎叶产量大，易采收，是很好的黄芪多糖药源【11】。徐凌川口。用分光光度法测定不同来源的黄芪药材多糖的含量，结果发现文登和新泰黄芪基地所产黄芪的黄芪多糖含量分别为8．62％和14．15％，表明了黄芪药材多糖含量的差异
┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊装┊┊┊┊┊订┊┊┊┊┊线┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊性。张善玉¨1等应用比色法测定不同生长年限黄芪的多糖含量，结果发现，生长年限为1、2、3年的黄芪多糖含量分别为32．12、23．42、16．68mg／g，表明随着生长年限的增加，黄芪中多糖的含量逐年降低。
1.2.2皂苷类成分
皂苷类为黄芪中重要的有效成分。目前从黄芪及其同属近缘植物中已分离出加多种皂苷，主要有黄芪皂苷I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V、Ⅵ、Ⅶ，异黄芪皂苷I、Ⅱ、Ⅲ及黄芪皂苷I等。除黄芪皂苷I、黄芪皂苷Ⅷ外，其余均以9，19一环羊毛脂烷型的四环三萜皂苷类为苷元，总称为黄芪皂苷或黄芪总皂苷。潘飞等一1用分光光度法对蒙古黄芪总皂苷含量的动态实验表明：5月初苗期含量最低，此后随着植物生长其含量逐渐上升，至9月达到最高峰，以后逐渐下降。不同种黄芪间总皂苷含量有所差异，金翼黄芪、东俄洛黄芪、单蕊黄芪的总皂苷含量较高，多花黄芪、蒙古黄芪、膜荚黄芪及其青海变种含量居中，马衔山黄芪和多序岩黄芪含量较低。江燕等”1对黄芪药材中黄芪甲苷和总皂苷含量的比较，采用HPLC法测定黄芪甲苷的含量，采用紫外分光光度法测定黄芪总皂苷的含量，并考察两者的相关性。结果黄芪甲苷含量为0．13—1．53mg／g，黄芪总皂苷含量为7．5～17．2mg／g。表明不同产地黄芪药材中黄芪甲苷和总皂苷含量的差异较大，两种含量之间存在相关性。梁伟∞o用药典法测定不同产地及药用部位黄芪的黄芪甲苷的含量，结果发现产地和用药部位的不同，其黄芪甲苷含量亦不同。不同产地黄芪甲苷含量排列顺序为：甘肃>黑龙江>陕西>内蒙>宁夏>青海>山西>山东>河北；相同产地不同用药部位的黄芪，其黄芪甲苷含量均为细根(侧根)高于粗根(主根)。张善玉等。采用比色法测定黄芪中总皂苷的含量，薄层扫描法测定黄芪中黄芪甲苷的含量，结果1、2、3年生黄芪中总皂苷的含量分别为0．793、0．803、0．991mg／g、黄芪甲苷分别为0．163、0．170、0．203mg／g，结论表明，随着生长年限的增加，黄芪中总皂苷和黄芪甲苷的含量都在升高。
1.2.3黄酮类成分
黄酮类成分多达30余种，主要有槲皮素、山奈黄素、异鼠李素、鼠李异柠檬素、羟基异黄酮、异黄烷、芦丁、芒柄花素、毛蕊异黄酮等。赵明等首次对贺兰山黄芪的根进行了系统的化学成分研究，从中分离得到3种异黄烷和1种异黄酮类成分。运用层析手段和波谱解析分别鉴定为：Pendulone(化合物1)、Isomucmnulatol(化合物2)、2’，4'-Dimethoxy-3'-hydroxyisoflavan-6一O一8一gluco—pyranoside(化合物3)和Santal(化合物4)。化合物3为新化合物，化合物1、4在黄芪属植物中首次被发现。王利平{驯等通过冷浸、回流提取、超声提取法分别对山西浑源5年和6年生黄芪中水溶物、槲皮素、5-0一甲基维斯阿米醇苷及芒柄花素进行了提取分离，并进行了含量比较，采用ZorbaxSB．C18色谱柱，以甲醇一0．4％H3PO,(V：V=50：50)
┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊装┊┊┊┊┊订┊┊┊┊┊线┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊为流动相，流速为1．0ml／min，在254nm处同时测定了槲皮素、5—0．甲基维斯阿米醇苷及芒柄花素的含量【12】。结果表明：5年生黄芪中的水溶性物质含量高于6年生黄芪，且均高于药典要求值，采用相同的提取方法时5年生黄芪中的5-0一甲基维斯阿米醇苷含量高于6年生黄芪，而6年生黄芪中的槲皮素和芒柄花素的含量高于5年生黄芪。张善玉等采用比色法测定不同生长年限的黄芪中总黄酮的含量，结果发现l、2、3年生的黄芪总黄酮含量分别为0．303、0．353、0．527mg／g，表明不同生长年限的黄芪中，总黄酮的含量随着年限的增长而增加。陈鑫等以芦丁为对照，采用紫外分光光度法测定黄酮含量，得到不同产地黄芪总黄酮含量：河北5．51l r119／g，山西5．391mg／g，吉林5．300mg／g，甘肃4．755mg／'g，内蒙4．737mg／g，陕西4．404mg／g，青海3．472mg／g。结论是不同产地黄芪总黄酮含量存在明显差异。从样本数据的均值分析，总黄酮含量由高到低依次为河北、山西、吉林、甘肃、内蒙、陕西、青海。白雪梅等引通过HPLC方法，并对不同产地黄芪中山柰素的含量进行分析，采用YWG—C18色谱柱(4．6mm×250mm，101山m)，以甲醇与0．4％磷酸水溶液(70：30)溶剂洗脱，检测波长375nm，柱温30℃，流速1．0ml／min，进样量201．LL。结果发现，不同产地的黄芪山柰素的含量相差较大。
表二.黄酮类化合物的结构式
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1.2.4氨基酸
黄芪中含有氨基酸共25种，如1一氨基丁酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等。赵复中等?1从营养学角度，应用氨基酸自动分析仪对膜荚黄芪中所含氨基酸进行全面分析，分析结果：结合氨基酸8．05％，游离氨基酸0．38％，总氨基酸8．43％。除色氨酸未分析外，含有所有人体必需氨基酸，说明膜荚黄芪除具有药效外，还有丰富的营养价值。吴耕农等I”1将黄芪茎经适当提取分离后，采用6300氨基酸自动分析仪测定其游离氨基酸、结合氨基酸的成分及含量。结果发现，黄芪茎含有17种氨基酸，其中游离氨基酸含量为0．3482％，结合氨基酸总含量为7．035l％。结论为黄芪茎中含有丰富的氨基酸，可以作为药材很好的开发利用。毛泉明等纠对黄芪经适当提取分离后，用6300氨基酸自动分析仪测定游离氨基酸含量，检测波长k l=570nm，X2=440nm；柱温50～77℃。游离氨基酸总含量：云南栽培黄芪为1．7343％，梭果黄芪为0．5608％，金翼黄芪为0．3741％。结果得出游离氨基酸含量云南栽培黄芪最高，金翼黄芪最低。
1.2.5其他
黄芪中还含有微量元素、甾醇类物质、叶酸、亚麻酸、亚油酸、甜菜碱、胆碱、咖啡酸、香豆素、尼克酸、核黄素、维生素P、淀粉E等。
1.3.异黄酮简介
1.3.1异黄酮基本介绍
异黄酮，是植物苯丙氨酸代谢过程中，由肉桂酰辅酶A侧链延长后环化形成以苯色酮环为基础的酚类化合物，其3-苯基衍生物即为异黄酮，属植物次生代谢产物。
┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊装┊┊┊┊┊订┊┊┊┊┊线┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊类黄酮属，是一种芳香族含氧杂环化合物，黄酮的异构体【13】。精制的异黄酮呈片状或针状结晶。一般无色，但随着羟基的增加，可呈黄至深黄色。为广泛分布于高等植物的色素。有些异黄酮是植保素，有些可用于心血管病的治疗。
图1 异黄酮的结构式
1.3.2理化性质
黄酮类化合物多为结晶性固体，少数为无定型粉末。黄酮类化合物的颜色与分子中存在的交叉共轭体系及助色团（-OH、-CH3）等的类型、数目及取代位置有关。一般来说，黄酮、黄酮醇及其苷类多呈灰黄至黄色，查尔酮为黄色至橙黄色，而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类等因不存在共轭体系或共轭很少，故不显色。花色素及其苷元的颜色，因pH的不同而变，一般呈红（pH<7）、紫（7<8.5）、蓝（PH>8.5）等颜色。黄酮苷元一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，易溶于稀碱液。黄酮类化合物的羟基糖苷化后，水溶性相应加大，而在有机溶剂中的溶解度相应减少。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶等溶剂，难溶于乙醚、三氯甲烷、苯等有机溶剂。黄酮类化合物因分子中多有酚羟基而呈酸性，故可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。有些黄酮类化合物在紫外光（254nm或365nm）下呈不同颜色的荧光，氨蒸汽或碳酸钠溶液处理后荧光更为明显。多数黄酮类化合物可与铝盐、镁盐、铅盐或锆盐生成有色的络合物。
1.3.3鉴别反应
（1）盐酸-镁粉还原反应
取药材粉末少许与试管中，用乙醇或甲醇数毫升温浸提取，取提取液加镁粉少许振摇，滴加几滴浓盐酸，1-2min内即出现颜色。多少黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类显红-紫红色，黄酮类显橙色，异黄酮及查尔酮类无变化。其他还原反应还有：
┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊装┊┊┊┊┊订┊┊┊┊┊线┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊盐酸-锌粉反应，黄酮、黄酮醇类常不显色，只有二氢黄酮醇类可被锌粉还原呈深红色；钠-汞齐反应，黄酮类成分可产生黄、橙、红等色；四氢硼钠（钾）反应，仅二氢黄酮醇类可被四氢硼钠还原呈红色，其他黄酮类不反应。
（2）金属盐类试剂络合反应
黄酮类成分和铝盐、镁盐、铅盐、锆盐等试剂反应，生成有色的络合物，可供某些类型黄酮的鉴别。产生络合作用的条件是黄酮类成分必须具备下列条件之一，如5-羟基、3-羟基或邻二羟基。根据有色络合物的最大吸收波长，可进行定量测定。常用的试剂有三氯化铝、醋酸铅、醋酸镁与二氯氧化锆等试剂。
1.3.4分布特点
黄酮类化合物在植物体内的形成，是由葡萄糖分布经过莽草酸途径和乙酸-丙二酸途径生成羟基桂皮酸和三个分子的乙酸，然后合成查尔酮，再衍变为各类黄酮类化合物。
（1）黄酮类及二氢黄酮类
黄酮类广泛分布于被子植物中，以芸香科、菊科、玄参科、伞形科、苦苣苔科及豆科植物中存在较多；二氢黄酮类分布较普遍，尤其在被子植物的蔷薇科、芸香科、姜科、菊科、杜鹃花科和豆科中分布较多【14】。
（2）黄酮醇类及二氢黄酮醇类
黄酮醇类较广泛地分布于双子叶植物，特别是一些木本植物的花和叶中，以山柰酚和槲皮素最为常见；二氢黄酮醇类存在于裸子植物、单子叶植物姜科的少数植物中，双子叶植物中分布较普遍，在豆科、蔷薇科植物中也较多。
（3）查尔酮类
大多分布在菊科、豆科、苦苣苔科植物中，在玄参科、败酱科植物中也有发现。
（4）异黄酮类和二氢异黄酮类
异黄酮类主要分布在被子植物中，豆科中占到70%左右，其余分布在桑科、鸢尾科中。
（5）花色素类
花色素类是使植物的花、果、叶、茎等呈现蓝、紫、红等颜色的化学成分，广泛
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（6）黄烷类
黄烷-3-醇的衍生物称为儿茶素类，在植物中分布较广，主要存在于含鞣质的木本植物中。黄烷-3，4-二醇衍生物被称为无色花色素类，在植物界的分布也很广，其中在含鞣质的木本植物和蕨类植物中存在较多。该类化合物常因分子聚合而具有鞣质的性质。
（7）橙酮类
橙酮类定位与其它黄酮类化合物不同，在中药中比较少见，多存在于玄参科、菊科。
（8）双黄酮类
双黄酮类较集中地分布于除松科以外的裸子植物中，如银杏科、松科、杉科；蕨类植物中的卷柏属植物中也有分布。
（9）其他黄酮类
苯骈色原酮为一种特殊类型的黄酮类化合物，常存在于龙胆科、藤黄科植物中，在百合科植物中也有分布【15】。呋喃色原酮类和苯色原酮类在植物界中分布较少，如凯刺种子和果实中得到的凯林（khellin）属于呋喃色原酮类化合物。
1.4酶简介
酶水解法条件温和, 大豆异黄酮苷元不易变性, 目前已有研究报道。陈莲等采用β- 葡萄糖苷酶(β- glucosidase,Sigma- Aldrich Corporate), 水解脱脂黄芪片中的异黄酮, 从而增加了豆粕中染料木素含量。
1.4.1酶的基本介绍
酶（enzyme），早期是指in yeast 在酵母中的意思，指由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成（少数为RNA）。能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。
1.4.2酶的特性
（1）高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快。
┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊装┊┊┊┊┊订┊┊┊┊┊线┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊（2）专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽。
（4）多样性：酶的种类很多，大约有4000多种。
（5）温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的。
（6）活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。
（7）有些酶的催化性与辅因子有关。
（8）易变性：由于大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏。
（9）一般来说，动物体内的酶最适温度在35到40℃之间，植物体内的酶最适温度在40-50℃之间；细菌和真菌体内的酶最适温度差别较大，有的酶最适温度可高达70℃。动物体内的酶最适PH大多在6.5-8.0之间，但也有例外，如胃蛋白酶的最适PH为1.5，植物体内的酶最适PH大多在4.5-6.5之间。
1.4.3酶促反应
酶促反应（Enzyme catalysis）又称酶催化或酵素催化作用，指的是由酶作为催化剂进行催化的化学反应。生物体内的化学反应绝大多数属于酶促反应【16】。酶作为一种生物催化剂在催化一个化学反应时，即具有一般的催化剂的特征，又具有不同于一般催化剂的特殊性。酶与一般催化剂一样，只催化热力学允许的化学反应；可以加快化学反应的速度，而不改变反应的平衡点，既不改变反应的平衡常数；作用机理都是降低反应的活化能；在反应前后，酶没有质和量的改变，且微量的酶便可发挥巨大的催化作用。但是酶也具有不同于其他催化剂的特殊性。
在酶促反应中，酶作为高效催化剂，使得反应以极快的速度或在一般情况无法反应的条件下进行。酶是生物体内进行各种化学反应最重要的物质。影响酶催化速度有以下因素：温度、酸碱度、酶的浓度、被催化物质的浓度。
1.5纤维素酶简介
1.5.1纤维素酶基本介绍
纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。纤维素酶（英文：cellulase）是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中【15】。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一
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1.5.2纤维素酶的组成与功能
纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或
图2.纤维素和几丁质分子结构图
endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen、外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex) 和β-葡聚糖苷酶（β-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区,产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端,释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。真菌纤维素酶产量高、活性大，在畜牧业和饲料工作中主要应用真菌来源的纤维素酶。
1.5.3纤维素酶降解纤维素的机理研究
纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。
1950年，Reese等提出了C1-Cx假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖。协同作用一般认为是内切葡聚糖酶(C1酶)首先进攻纤维素的非结晶区，形成Cx所需的新的游离末端，然后由CX酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由β-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖。不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，C1-Cx和β-葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。若先用C1酶作
┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊装┊┊┊┊┊订┊┊┊┊┊线┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊用结晶纤维素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此顺序作用却不能将结晶纤维素水解。
1.6大孔吸附树脂分离原理
大孔吸附树脂一般为白色球形颗粒状，粒度多为20~60目，通常分为非极性和中极性两类。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶媒。对有机物选择性较好，不受无机盐类及强离子低分子化台物存在的影响。大孔吸附树脂为吸附性和筛选性原理相结合的分离材料，与以往使用的离子交换树脂分离原理不同。它本身具有的吸附性，是由于范德华引力或产生氢键的结果【17】。筛性原理是由于其本身多孔性结构所决定。正因为有这些特性，使得有机化台物尤其是水溶性化合物的提纯得以大大简化。从显微形状上看，大孔吸附树脂包含有许多具有微观小球组成的网状孔穴结构，这些球体的构成，多为苯乙烯型和2一甲基丙烯酸酯型，前者非极性树脂，后者为中极性树脂。大孔吸附树脂的“孔径”是指微观小球之间的平均距离(A )。其“比表两积”是指微观小球表面积的总和(Ell ／g) 由于吸附性和筛性原理，有机化台物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而分开。大孔吸附树脂根据孔径、比表面积及构成类型被分为许多型号，在应用中，可根据实际要求及化合物特性加以选择。国内外常用的一些不同型号大孔吸附树脂的型号及性能。
1.7抗氧化性的作用
生物的抗氧化能力与其抗病性、抗逆性及延缓衰老密切相关。因而从天然植物中寻找有效的抗氧化剂应用于医药、食品、保健品、饮料、化妆品等之中，或从氧化与抗氧化代谢的平衡来探讨生物对变化环境条件的适应性机理，都是当前研究的热点之一。适当补充外源抗氧化剂或给予能够促使机体内源性抗氧化物质恢复到一定水平的药物，可以改善衰老以及疾病的情况。抗氧化剂还是一种重要的食品添加剂"它主要用于阻止或延缓油脂的自动氧化"可以用于防止食品因氧化而使营养损坏、褐变、褪色等。抗氧化剂广泛应用于食品工业，需求量逐年增加，其中天然抗氧化剂的应用越来越广泛。
广义的抗氧化剂是指自由基及活性氧的清除剂、阻断剂及修复剂等物质的总称。通过测定植物提取物清除自由基的能力也能表明其抗氧化能力的强弱，研究自由基的检测方法并探讨物质对自由基的清除作用也有重要意义。迄今用于评价植物抗氧化能力的方法虽已有诸如硫氰酸盐法、硫代巴比妥酸法(ORAC)法等、但是这些方法或者所需试剂或大型仪器的费用昂贵,尚缺乏一种灵敏、简单易行的有效方法。
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第二章实验
2.1实验材料与设备
2.1.1 材料
黄芪, 购自吉林长春中药材有限公司。纤维素酶( 酶活力为: 1.5 wU/g) , 购自江苏省无锡市雪梅酶制剂科技有限公司;染料木苷(genistin) 标准品和 ( 2,2- Diphenyl- 1- picrylhydrazyl) 购自美国密苏里州圣路易斯Sigma- Aldrich 公司; 甲醇为Fisher 色谱纯试剂, 购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆热电飞世尔科学有限公司; 二次蒸馏水为自制; 其他均为国产分析纯试剂。DPPH 自由基为自制，方法如下：0.0039432g三羟甲基氨定容于50ml无水乙醇中。
2.1.2设备
FA2004电子天平；FW110 型高速粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；UV - 2550 紫外分光光度计(日本岛津)；电子天平（北京赛多利斯仪器系统）；KQ—VDE型三频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；台式高速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；恒温循环水槽（北京长流科学仪器公司）；隔膜真空泵（天津市腾达过滤器件厂）；循环水空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；旋转蒸发仪(RE- 52A 型, 亚荣生化仪器厂, 上海)。
2.2实验方法
2.2.1工艺流程
原料→浸提→抽滤→浓缩→纯化→浓缩→DPPH测定→数据记录→绘图→总结
2.2.2实验过程
（1）粉碎
将片状黄芪根放入粉碎机中进行粉碎，然后将其装入小塑料袋中，用电子天平进行称量。
粉碎后黄芪的重量（g）+袋的重量（g）=47.73g
袋的重量（g）：1.0g
所以粉碎后黄芪的净重量为：46.73g
┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊装┊┊┊┊┊订┊┊┊┊┊线┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊（2）浸提
将70%的乙醇倒入锥形瓶中，并将粉碎好的黄芪倒入锥形瓶中，将清洗好的转子放入，用保鲜膜将瓶口盖住，放在磁力搅拌器上，搅拌一夜。
（3）抽滤
将搅拌好的浸提液用隔膜真空抽滤泵进行抽滤，将滤渣扔掉，将滤液用锥形瓶保存起来。
（4）浓缩
将滤液倒入圆底烧瓶中，在40℃的水温下用旋转蒸发仪进行浓缩。
（5）纯化
先将大孔吸附树脂用工业乙醇浸泡一夜，然后将乙醇放出，再用500ml的乙醇清洗一遍，然后用蒸馏水进行清洗，直至大孔吸附树脂中完全无乙醇的残留。将浓缩后的液体慢慢倒入大孔吸附树脂中，进行吸附，用500ml的蒸馏水进行清洗，再用500ml70%的乙醇进行解吸。
（6）浓缩
降解吸下来的液体分别倒入圆底烧瓶中，在50℃的水温下用旋转蒸发仪进行浓缩，然后将浓缩后的液体放入试管中，将试管放入冰箱中冷藏备用。
2.3黄芪提取物DPPH自由基的清除
2.3.1自由基的作用
自由基与人体一些重大疾病有一定的相关性, Harman提出的自由基学说认为: 自由基攻击生命大分子造成的损伤是引起机体衰老的根本原因, 也是诱发肿瘤等疾病的重大原因, 这一学说已被越来越多的人所接受。近年来, 对自由基及其清除剂的研究成为热点, 寻找、筛选具有阻断自由基形成或抑制细胞膜过氧化活性的药物研究越来越受到人们的关注, 其中对黄酮类化合物的研究是自由基清除剂研究中的热门领域之一, 到目前为止已发现的黄酮类化合物已超过5000多种。
自由基过量产生或人体自身清除自由基能力下降会导致多种疾病的产生与恶化。自由基对人体的损害主要有三个方面：一、使细胞膜被破坏；二、使血清抗蛋白酶失去活性；三、损伤基因导致细胞变异的出现和蓄积。自由基对人体的攻击首先是细胞膜开始的。细胞膜极富弹性和柔韧性，这是由它松散的化学结构决定的，正因为如此，它的电子很容易丢失，因此细胞膜极易遭受自由基的攻
┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊装┊┊┊┊┊订┊┊┊┊┊线┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊击。一旦被自由基夺走电子，细胞膜就会失去弹性并丧失一切功能，从而导致心血系统疾病。更为严重的是自由基对基因的攻击，可以使基因的分子结构被破坏，导致基因突变，从而引起整个生命发生系统性的混乱。大量资料已经证明，炎症，肿瘤、衰老、血液病、以及心、肝、肺、皮肤等各方面疑难疾病的发生机理与体内自由基产生过多或清除自由基能力下降有着密切的关系。炎症和药物中毒与自由基产生过多有关；克山病－－硒缺乏和范可尼贫血等疾病与清除自由基能力下降有关；而动脉粥样硬化和心肌缺血再灌注损伤与自由基产生过多和清除自由基能力下降两者都有关系。自由基是人类健康最隐避、最具攻击力的敌人。
自由基是指具有未配对价电子的原子、原子团或分子。大多数自由基化学性质极为活泼，寿命极短。然而也有少数的自由基的化学性质十分稳定"即便在室温溶液中也很稳定。二苯代苦味肼基自由基就是其中的一个例子。它的稳定性主要来自共振稳定作用及三个苯环的空间障碍,而使夹在其中间氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用，由于DPPH给我们提供了一个试样与稳定自由基反应的信息,故可将此法用于自由基清除剂的筛选研究工作。DPPH分光测定法的测定原理是依据DPPH 在517nm处有一强吸收，其乙醇溶液呈深紫色。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系。因而可用分光法进行定量分析。国外已有很多的学者用此法研究了物质清除自由基的性质。
2.3.2清除DPPH 自由基能力的测定原理
检测抗氧化剂清除自由基方法中以清除DPPH(1,1-diphenyl-2-PicrylhydRazyl)自由基最为常见。该方法的基本原理是DPPH 在溶液中生成一个稳定的含氮自由基且该溶液呈典型的紫色在紫外- 可见(UV-Vis)光区具有较强的吸收光谱。当DPPH 溶液中加入抗氧化剂时，由于其自由基清除作用使DPPH 紫色消退导致吸收光谱强度随加入的抗氧化剂的量的增加而减小，通过加入抗氧化剂前后吸光度的线性变化计算自由基清除率。通常抗坏血酸等具有递电子和递质子能力的抗氧化剂对DPPH 自由基的清除作用是通过抗氧化剂把电子和质子传递给DPPH 自由基，从而生成稳定的分子态的DPPH2的结果，见下图。
一般而言，对于Fenton试剂与有机化合物氧化能力的影响因素大致上可分为： A.亚铁离子浓度。 B.过氧化氢浓度。 C.溶液于反应时的反应温度。 D.溶液中的pH值。 以下将对此四项变因做详细的探讨： A.亚铁离子浓度的影响 在Fenton试剂的反应中，亚铁离子主要是扮演着催化过氧化氢的角色。因此，若溶液中没有亚铁离子当触媒，则其溶液可能就没有氢氧自由基的生成。所以，大致上分解反应会随亚铁离子的浓度增加而加快，亚铁添加量会影响脱色效率，亚铁剂量愈高效果愈佳，此原因为增加亚铁剂量将使氧化反应更加完全并且可产生混凝机制而进行脱色(26)。但亚铁离子本身会与有机物形成竞争，亚铁离子浓度过高会增加氢氧自由基的消耗，反而造成处理效果的下降，反应式如下： Fe2+ + ·OH Fe3+ + OH- 故当浓度到达某一定值时，则其分解速率便不会在随着亚铁离子浓度的增加而持续加快，且亚铁离子浓度和生成物的比值也将可能会影响生成物的分布。一般而言，亚铁离子浓度皆维持在亚铁离子与其反应物之浓度比值为1：10-50(wt/wt)。 此外，亚铁在Fenton程序中除了扮演催化过氧化氢的角色外，亦具有混凝的功能，因此过量的铁离子加入将会造成过度的混凝，降低Fenton程序处理的效果，其可能的反应如下所示: B.过氧化氢浓度的影响 反应过程中，过氧化氢的浓度会直接影响氧化有机物的效果。一般而言，随着过氧化氢添加量的增加，有机物的氧化效果亦将随之提升，并且过氧化氢的添加浓度不同，则分解反应生成的产物将会有所差异。大致而言，在过氧化氢浓度越高的情况下，则其氧化反应产物，将会更趋近于最终产物。但是，当溶液中的过氧化氢浓度过高时，反而会使过氧化氢与有机物竞争氢氧自由基，而造成反应速率的结果可能不如预期一般增加。此外，当Fenton试剂系统中过氧化氢浓度远高于亚铁离子浓度时，Fenton法所产生的氢氧自由基会与过氧化氢反应产生perhydroxyl radical (HO2．)及一系列反应，且三价铁离子会与HO2．进行氧化还原反应生成superoxide radical anion (O2．)，造成过氧化氢消耗量的增加，过量的过氧化氢加药量并不必然增加氢氧自由基的浓度，氢氧自由基达到稳定浓度所需反应时间随加药量增加而增加(27)。因此，若以连续之方式加入低浓度之过氧化氢，减少因为过氧化氢初始浓度过高所导致的抑制效应，亦可得到较好的氧化效果。 C.温度的影响 根据Arrhennius' Law：k=k0exp(-Ea/RT)可得知温度的改变会影响活化能及反应速率常数，进而影响反应速率。 对于Fenton试剂反应而言，一般若选用的反应温度条件是在小于20℃以下时，其对有机物的氧化速率将会随温度升高而加快。但是，倘若将其反应的温度升高至40-50℃时，其Fenton反应将会可能因为温度过高，进而使过氧化氢自行分解成水与氧(2H2O2 → 2H2O + O2 )，造成Fenton试剂对氧化有机物之反应速率减慢。 因此，当过氧化氢浓度超过10-20 g/L时，在其经济与安全的考量下，应谨慎选择适当的温度。在一般商业应用上，通常皆将其反应的温度设定在20-40℃之间。 D. pH值的影响 于Fenton试剂反应中，其反应溶液之pH值对Fenton法之影响，关系到铁离子错合效应、铁
超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧 化法） （适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式
DPPH自由基清除法 李熙灿/Xican Li （广州中医药大学） [文献] Xican Li, Jing Lin, Yaoxiang Gao, Weijuang Han, Dongfeng Chen. Antioxidant activity and mechanism of Rhizoma Cimicifugae. Chemistry Central Journal. 2012; 6(1):140. [原理] DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。 N 2 2 当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH测试液的配制 取DPPH 1mg溶于约20mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A＝1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。 1.3 预试 取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。 【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。 1.4测量 A0值的测量：取DPPH溶液2 mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加95乙醇（或无水乙醇）1mL，充分混合，测A值（519nm），此A值为A0（A0多在0.7-0.9之间）。 A值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液xμL （x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 95乙醇（或无水乙醇），混合，静置30分钟后，测A值（519nm）。如：某样品的用量梯度为40、80、120 、160、200μL，则加样表如下： 表1 加样表 1.5 正式测量
·O2ˉ自由基清除实验 (1) 实验原理 黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2ˉ 即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2ˉ)。·O2ˉ与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2ˉ越少，溶液的颜色越浅。 (2)试剂 Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l) 实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用 Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！) 0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解) NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65, 黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l) 实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用 PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g, 800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。 实际配制500mL。高压灭菌，室温保存。 PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上 Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度 实际配制见记录本！ HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml) 实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。 NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱 (3) 测定方法 超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。样品溶液1-5mg/ml 起始浓度，用于水或50%乙醇溶液。 Bae, S.W., Suh, H.J., 2007. Antioxidant activities of ve different mulberry cultivars in Korea.
清除自由基能力的研究概况 陶涛 （西南林业大学林学院农学（药用植物）昆明 650224） 摘要：自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、一心血管疾病等的重要因素。乳酸茵作为一种高效、低毒的生物源天然抗氧化荆，正逐步受到食品、制药、化工等领域的广泛关注。就目前国内外常用的乳酸茵抗氧化活性的筛选方法、乳酸茵抗氧化机理的国内外研究进展及未来的发展趋势作一综述。 关键词：自由基；乳酸茵；抗氧化． Study on the scavenging ability of lactic acid bacteria on free radical bstract：Free radical and its inducing oxiditative reaction may CaUSe biological doat and certain diseases such as Cancers，diabetes and the cat- diovascular．The lactic acid baaeria as one ofbiological SOUrCeS oxidation inhibitor is becoming more and more popular in the fields offood．，drug manufacture and chemical industry．This article mainly reviews the screening methods for antioxidative of lactic add bacteria among domestic and foreign countries，the advance of the research progress in lactic add bacteria antioxidative and r∞earch trends in future． 引言 氧化过程可以提供能量．对大多数生物体来说，是维持生命必不可少的一个能量转化过程。但过多的氧化过程会对生物大分子引起损伤．氧化损伤主要是由于自由基和过氧化产物作用于人体而产生的。 自由基(free radicals)27．．称游离基．为人体氧化代谢过程中形成含有一个不成对电子的原子或原子团。人体的自由基主要包括超氧阴离子自由基(o2)、
氧自由基与氧自由基清除剂依达拉奉 山东大学齐鲁医院麻醉科（250012）于金贵 一、氧自由基 （一）自由基的概念 自由基（free radical，FR）是指外层轨道上有未配对电子的原子、原子团、分子或离子的总称。因其含有未配对的电子，故化学性质非常活泼，极易与其生成部位的其他物质发生反应，而这种反应的最大特点是以连锁反应的形式进行。氧原子上有未配对电子的自由基称为氧自由基。人体吸入的分子氧，在正常状态下绝大多数（98%）都连接4个电子，它们最终与H+结合，代谢还原为H2O。但有极少数氧（1~2%）在代谢过程中被夺去或接受一个电子而形成活性氧，即氧自由基。 （二）氧自由基的生理作用 氧自由基在生理上是必需的物质，如合成ATP 和前列腺素、中性粒细胞杀灭细菌、酸性粒细胞杀灭寄生虫等过程都必须有氧自由基参与。氧自由基在体内的生成与清除保持动态平衡，且在体内存在时间甚短。由于其化学性极强，反应剧烈，过量产生会对机体造成极大危害。 （三）氧自由基的种类及其作用
1. 超氧化物阴离子：氧自由基连锁反应的启动者，使生物膜、激素和脂肪酸过氧化。 2. 羟自由基（OH∙）：作用最强的自由基，可破坏氨基酸、蛋白质、核酸和糖类。 3. 过氧化氢（H2O2）：过渡型氧化剂，主要使巯基氧化，可氧化不饱和脂肪酸。 4. 单线态分子氧（1O2）：氧分子的激发状态，亲电子性强，在光作用下可由O2直接产生，对细胞有杀伤作用。 5. 其他含氧的自由基如脂质过氧化物（ROOH）：易于分解再产生自由基，腐化脂肪，破坏DNA，可与蛋白质交联使之形成变性交聚物。 （四）机体抗氧化机制 机制一：直接提供电子，以确保氧自由基还原；机制二：增强抗氧化酶的活性，以有效地消除或抵御氧自由基的破坏作用如酶类抗氧化剂超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）；非酶类抗氧化剂如维生素E、维生素C、辅酶Q、还原型谷胱甘肽（GSH）、葡萄糖、含硫氨基酸和不饱和脂肪酸等。 SOD多存在于细胞的线粒体内，作用是将氧自由基歧化，将其一半转变成H2O，另一半转变成O2，从而清除氧自由基。CAT是血红蛋白酶类之一，作用是分解H2O2，并将其清除之。
第五章自由基清除剂 本章要点 1.自由基理论的产生机理及来源 2.自由基对机体活动的影响 3.自由基清除剂的基本概念 随着生命科学的飞速发展，英国人Harman于1956年提出了自由基学说。该学说认为，自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因，其中的观点被越来越多的实验所证明。 自由基（Free radical）是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的化学活性，是机体有效的防御系统，若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动。但自由基产生过多而不能及时地清除，它就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。 近年来，国内外对自由基及自由基清除剂的研究十分活跃，在各类食品科学、生命科学及医学书籍上都有许多关于自由基及其清除剂的研究报道，自由基清除剂作为功能性食品的重要原料成分之一，通过人们日常消费的食品来调节人体内自由基的平衡，已受到食品营养学家的广泛重视。 第一节自由基理论 一、自由基的产生机理及来源 自由基又叫游离基，它是由单质或化合物的均裂（Homdytic Fission）而产生的带有未成对电子的原子或基团。它的单电子有强烈的配对倾向，倾向于以各种方式与其他原子基团结合，形成更稳定的结构，因而自由基非常活泼，成为许多反应的活性中间体。 人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位，大约占自由基总量的95%。氧自由基包括超氧阴离子（O2－·）、过氧化氢分子（H2O2）、羟自由基（OH·）、氢过氧基（HO2－·）、烷过氧基（ROO·）、烷氧基（RO·）、氮氧自由基（NO·）、过氧亚硝酸盐（ONOO－）、氢过氧化物（ROOH）和单线态氧（1O2）等，它们又统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS），都是人体内最为重要的自由基。非氧自由基主要有氢自由基（H·）和有机自由基（R·）等。 （一）自由基的产生 人体细胞在正常的代谢过程中，或者受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用），都会刺激机体产生活性氧自由基。 人体内酶催化反应是活性氧自由基产生的重要途径。人体细胞内的黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和NADPH氧化酶等在进行酶促催化反应时，会诱导产生大量的自由基中间产物。除酶促反应外，生物体内的非酶氧化还原反应，如核黄素、氢醌、亚铁血红素和铁硫蛋白等单电子氧化反应也会产生自由基。外界环境，如电离辐射和光分解等也能刺激机体产生自由基反应，如分子中的共价键均裂后即形成自由基。 自由基反应包含3个阶段，即引发、增长和终止阶段。反应之初，引发阶段占主导地位，反应体系中的新生自由基形成许多链的开端，反应物浓度高。引发后的扩展阶段为反应的主体，若起始有几个引发自
DPPH?和ABTS+?自由基清除实验（含PTIO?自由基清除实验)：详细说明与疑难解答 李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.7） （以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH?) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-Oxid e (PTIO?) Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297 【概述】DPPH?、ABTS+?、PTIO?自由基三者，都是常用的自由基。概述如下表： 1
紫色墨绿色蓝紫色 2
3
DPPH.法测定绿原酸清除自由基能力 2.1 待测液的制备 将绿原酸(纯度56%)、维生素C 和没食子酸分别配制成体积分数为0.1mg/mL 的无水乙醇溶液。 2.1.1 绿原酸母液的配制 称取 9.0 mg 绿原酸，定容到50ml ，即可得到绿原酸的母液0.1mg/mL 。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.2 Vc 母液的配制 称取 mg VC ，定容到100ml ，即可得到VC 的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.3 没食子酸母液的配制 称取 mg 没食子酸，定容到100ml ，即可得到没食子酸的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.4 DPPH 母液的配制 称取 mg DPPH ，用无水乙醇定容到100ml ，即可得到DPPH 的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成至一定浓度的溶液。C DPPH = mg/ml 。（建议用0.025mg/mL ） 2.2 DPPH.溶液的可见光谱 以无水乙醇为对照，在分光光度计上对DPPH.溶液进行在440～600nm 下扫描。A max = nm 2.3 抗氧化活性测定 DPPH.是一种稳定的自由基，它的乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为 nm 。当DPPH.溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm 处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此，可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力，其能力用清除率(Scavenging Rate,SR)来表示，清除率越大，抗氧化能力越强 [4.5]。 具体实验步骤及方法： 精确吸取的DPPH.溶液2mL 与2ml 无水乙醇混合均匀后，以相对应的溶剂(4mL 无水乙醇)为对照，用分光光度计测定上述溶液在 nm 处的吸光度值(A 0)。 A 0= 2.3.1 绿原酸样品溶液的抗氧化能力测定 精确吸取上述不同浓度的绿原酸溶液2mL ，分别与浓度 mg/ml 的DPPH.溶液2mL 混合，摇匀后放置30min 。以相对应的溶剂(无水乙醇)为对照调零，用分光光度计分别测定上述溶液在 nm 处的吸光度值(A i )，分别测得A i 值。 A 1 ；A 2 ；A 3 ；A 4 ；A 5 ；A 6 ；A 7 。 精确吸取上述不同浓度的绿原酸溶液2mL ，分别与2mL 无水乙醇混合均匀后，以无水乙醇为对照，用分光光度计分别测定各混合液在波长 nm 处的吸光度值(A j )，分别测得A j 值。 A 1 ；A 2 ；A 3 ；A 4 ；A 5 ；A 6 ；A 7 。 将以上数据代入下列公式计算其清除率。 清除率SR(％)=%100A A A 10j i ???? ? ?? -- 其中， A i ：为2mL 绿原酸、维生素C 和没食子酸与 2mL 的DPPH.溶液混合后在波长 nm 处的吸光度值； A j ：为2mL 绿原酸、维生素C 和没食子酸分别与2mL 无水乙醇溶剂混合后在波长 nm 处的光值； A 0：2mLDPPH.溶液与2mL 无水乙醇溶剂混合后在波长 nm 处的吸光度值。
1、超氧负离子 黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统产生超氧负离子产生超氧负离子 黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、 清除超氧自由基负离子O2- 徐艳,曲婷婷. 甘草消除氧自由基的体外研究[J]. 食品研究与开发,2006,(8). 2、1.2.2NBT 光还原反应中主要试剂的配制 1.2.2.1 测试缓冲液: 0.026 mol/LMet- 磷酸钠缓冲液具体配制方法: 首先配制0.1 mol/LpH7.8Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液 a 称取Na2HPO4·12H2O( MW=358.14) 3.581 4 g 于100 mL 小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 b 称取NaH2PO4·2H2O(MW=156.01)0.780 g 于50 mL小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 c 量取91.5 mL a 液与8.5 mL b 液混合后, 该液即为0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液。 d 称取L- Met( MW=149.2) 0.194 1 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液定容至刻度。 1.2.2.2 NBT( 氯化硝基四氮唑蓝) 的配制(7.5×10-4mol/L) 称取NBT( MW=817.7) 0.061 3 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 1.2.2.3 核黄素溶液(2×10-5 mol/L) a.称取EDTA( MW=292) 0.002 92 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。 b.称取核黄素( MW=376.36) 0.073 5 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。合并 a 液和 b 液, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度( EDTA0.1 mmol,核黄素2 mmol)。贮于冰箱中, 避光保存, 用时稀释100 倍。 1.2.3 甘草提取物溶液的配制 1.2.3.1 甘草酸溶液的配制 称取甘草酸0.05 g 用少量稀醇(10 %乙醇溶液)溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用稀乙醇定容至刻度, 即为 1 g/ mL 的甘草酸溶液。 1.2.3.2 甘草次酸溶液的配制 称取甘草次酸0.05 g 用少量稀醇(10 %乙醇溶液)溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用稀乙醇定容至刻度,即为 1 g/mL 的甘草次酸溶液。 1.2.3.3 甘草总黄酮组溶液的配制
如何清除体内自由基 消除体内自由基，应该要了解自由基的来源，从外界到身体内部的代谢一起中和性的描叙不要单方面的讲叙体内各种酶与自由基之间的关系 人体内的自由基有两个来源：其一是来自环境，如环境污染、食品污染、过度的紫外线照射和各种辐射、杀虫剂、室内外废气、吸烟、二手烟、酗酒、工作压力、生活不规律等等，都会直接导致人体内产生过多的自由基（活性氧）；食品添加剂、食用脂肪和熏炸烤肉、某些抗癌药物、安眠药、抗生素、有机物腐烂物、塑料用品制造过程、油漆干燥挥发、石棉粉尘、空气污染、化学致癌物、大气中的臭氧等也都能诱发人体内产生自由基。 其二是来自体内，人体内组织细胞的新陈代谢也会产生自由基，这是人体代谢过程的正常产物，十分活跃又极不稳定，它们会附着于健康细胞之上，再慢慢瓦解健康细胞，而被破坏的细胞则又再转而侵害更多健康的细胞，如此恶性循环从而导致人体的衰老和疾病的发生。另外，组织器官损伤后的缺血一段时间后又突然恢复供血(即重灌流)，如心肌梗塞、脑血栓、外伤、外科手术后，自由基会大量生成。正常人体有一套清除自由基的系统，但这个系统的力量会因人的年龄增长及体质改变而减弱，致使自由基的负面效应大大增强，引起多种疾病发病率的提高。活性氧自由基对人体的损害实际上是一种氧化过程。因此，要降低自由基的损害，就要从抗氧化做起。 听说过抗氧化剂吗？它对人体的健康可是有着密切的关系。既然自由基不仅存在于人体内，也来自于人体外，那么，降低自由基危害的途径也有两条：一是，利用内源性自由基清除系统清除体内多余自由基；二是发掘外源性抗氧化剂——自由基清除剂，阻断自由基对人体的入侵。 大量研究已经证实，人体内本身就具有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统，它包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等一些酶和维生素C、维生素E、还原型谷胱甘肽、β-胡萝卜素和硒等一些抗氧化剂。酶类物质可以使体内的活性氧自由基变为活性较低的物质，从而削弱它们对肌体的攻击力。酶的防御作用仅限于细胞内，而抗氧化剂有些作用于细胞膜，有些则是在细胞外就可起到防御作用。这些物质就深藏于我们体内，只要保持它们的量和活力它们就会发挥清除多余自由基的能力，使我们体内的自由基保持平衡。 要降低自由基对人体的危害，除了依靠体内自由基清除系统外，还要寻找和发掘外源性自由基清除剂，利用这些物质作为替身，让它们在自由基进入人体之前就先与自由基结合，以阻断外界是自由基的攻击，使人体免受伤害。在自然界中，可以作用于自由基的抗氧化剂范围很广，种类极多。目前，国内外已陆续发现许多有价值的天然抗氧化剂。如β－胡萝卜素（维生素A）、维生素C、维生素E、番茄红素、辅酶q10、等等。此外，我国很多中草药植物中的有效成分都是天然抗氧化剂，例如，银杏黄酮、甘草黄酮等，另外还有巴西菇、灰树花、茯苓、黄芪、丹参、银杏、枸杞、灵芝、人参......。 吃什么可以减少体内自由基 在正常的生命过程中，自由基为维持生命所必需。体内自由基不断产生，也不断地被清除，两者 处于动态平衡之中，使之维持在一个正常的生理水平上。自由基在生物体内具有参与吞噬病原体，参 与前列腺素和凝血酶原的合成、解毒，参与体内部分生化反应和胶原蛋白的合成，调节细胞增殖与分化，参与机体免疫和环核苷酸的生物合成，以及生殖和胚胎发育等重要的生理功能。但是当自由基过 量时，自由基在机体内损伤蛋白质、核酸和生物膜，导致细胞凋亡，并参与许多疾病的发病过程。 由基清除剂即抗氧化剂清除机体自由基，保护机体免受氧化损害中起重要作用。因此，近年来对 自由基清除剂的研究备受关注。多吃点抗氧化剂食物有利于减少体内多余自由基。 方法/步骤 1.全面复方自由基清除剂：葡茶多酚胶囊。适当吃葡茶多酚可以全面清除体内多余自由
主要目的： ——为了测定样品清除DPPH自由基的能力。 主要原理： ——自由基清除剂与DPPH单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用酶标仪进行快速的定量分析。 实验室签章
一、试剂 ——1 ,1-二苯基-1-苦味肼基自由基（DPPH）——甲醇（分析纯） 二、仪器设备 ——96孔酶标板 ——UV-Vis可见多功能酶标仪 ——移液枪 ——200 μL量程枪头
三、实验方法 ◆前期准备 配置2 g/L 的DPPH甲醇标准溶液。 ◆DPPH自由基清除能力 参照Brand-Williams (1995)[1]报道的方法，将其稍加改动后应用在96孔酶标板中[2]。在酶标板的每孔中，依次加入不同体积（10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 μL）的样品溶液和200 μL的DPPH标准溶液（2 g/L），最后用甲醇溶液补齐至总体积300 μL。 室温反应30 min后，于515 nm下用UV-Vis可见多功能酶标仪测定其吸光度（EL 340, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA）。番茄样品消除自由基的能力表示为EC50（清除1 μg DDPH至50 %所需的样品用量（μg干重））。 EC50越小，表示抗氧化活性越高。平行测定三次，取平均值计算。 清除DPPH自由基能力用如下公式计算： 清除率%=（1- Ac Aj Ai ）×100% 其中：Ai为样品溶液加DPPH试剂混合液的吸光度，Aj为样品溶液加甲醇的吸光度，Ac为DPPH溶液加样品溶剂的吸光度。 [1] Brand-Williams W, Cuvelier M E. Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity [J]. LWT - Food Science and Technology, 1995, 28(1): 25-30. [2] Verma A R, Vijayakumar M, Rao C V. Mathela C S. In vitro and in vivo antioxidant properties and DNA damage protective activity of green fruit of Ficus glomerata [J]. Food and Chemical Toxicology, 2010, 48(2): 704-709.
电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法 自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。 其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。 原理部分： 1.DPPH·法测试机理 DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。 2. 羟基自由基（·OH） 1）邻二氮菲法[70]
实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。 2）水杨酸法[71] 实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。 3）甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系 测定原理：在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下： Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH 甲基紫在酸性溶液中呈现紫色[9],在578nm 处有强吸收。反应产生的·OH 具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在578nm 处吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量。当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与·OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。
羟基自由基(·OH)清除能力测定法的简易操作图解 （适用于各种抗氧化剂） 文献来源 [1] Xican Li. Solvent effects and improvements in the deoxyribose degradation assay for hydroxyl radical-scavenging. Food Chemistry, 2013, 141(3):2082-2088. 操作图解 图1 羟基自由基(·OH)清除能力测定法（脱氧核糖降解法）的实验操作图 具体方法 1 溶液配制 0.2 MKH2PO4溶液: 100mL蒸馏水+2.7218g KH2PO4。 0.2 M Na2HPO4溶液: 500mL蒸馏水+35.814g Na2HPO4·12H2O。 磷酸盐KH2PO4－Na2HPO4缓冲液phosphate buffer（0.2M, pH7.4, 100mL）：19mL0.2 MKH2PO4+ 81mL 0.2 MNa2HPO4. （注意：19：81是大概的体积比，具体的比例以pH=7.4为准）。 Na2EDTA溶液：（1mM, 25mL）：8.4 mg+25mL蒸馏水。 FeCl3溶液：（3.2mM, 5mL）：4.2 mg+5mL蒸馏水。 抗坏血酸溶液：（1.8mM, 50mL）：15 mg+50mL蒸馏水。 H2O2溶液：（50 mM,5mL）：30 mg 30% H2O2+5mL蒸馏水。 脱氧核糖溶液：（50 mM, 2 mL）：15 mg脱氧核糖+2 mL蒸馏水(该用量约可做40个数据) 。 三氯乙酸溶液TCA（10%, 10 mL）：1 g + 10 mL蒸馏水。 硫代巴比妥酸溶液TBA：（5%, W/V, 20mL）:取1gTBA+20mL蒸馏水+20mgNaOH (临用时配，超声溶解. 该用量可做40个数据) 。 样品溶液：选合适的溶剂（如甲醇、无水乙醇等），先配成1mg/mL的溶液试试。 2 操作方法与注意事项 2.1 操作方法（见图1） 2.2 注意事项 1 测试前，一定要检查试管是否干净，不净的试管不能用。正式测试前,盛装样品的容器(小瓶或试管) 必须用铬酸洗液洗净。 2 样品溶液加入到试管后，先彻底挥干溶剂，再用样品的残渣，进行实验检测（见：操作图解）。这一步至关重要，因为有机溶剂都会产生数十倍的干扰。其原因中文献[1]已做详细说明。 3 最后显色时，如颜色太淡，可能是加热温度不够高； 4 加样：在10μL以下最好用进样针，插到瓶底；取样：力保均匀。 5 如平行样之间差别太大，系混合不均所致。两次水浴前，都要充分振荡。振荡时，用保鲜膜盖住管 口上下剧烈振荡。
一、试验方法 1、DPPH自由基清除率的测定 本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。 1.1实验原理 1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。 1.2溶液的配制 0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。 1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。 DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100% 公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值 A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值 A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值
将实验重复三次，求得清除率的平均值。 2、总的抗氧化活性的测定 总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。 2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。 2.2溶液的配制 样品液:同上 磷钼试剂:0.6mol/L浓硫酸溶液、28mmol/L磷酸钠溶液和4mmol/L钼酸胺溶液混匀，即得。 2.3实验步骤 分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml 离心管中，加入3.0ml试剂溶液（试剂溶液中包括0.6mol/L的硫酸、28mmol/L 的磷酸钠、4mmol/L的钼酸铵）。混合液于95℃水浴锅中分别水浴30min，60min、90 min、120 min、150 min。 放冷至室温，695nm处测吸光度值。以蒸馏水为空白，吸光度值越大，表明抗氧化能力越强。BHT做为阳性对照。将实验重复三次，求平均值。 三、还原力的测定 3.1 实验原理 以普鲁士蓝[Fe4(Fe(CN)6)3] 之生成量作为指标，将六氰合铁酸钾[K3 Fe(CN)6] 还原成K4Fe(CN)6，再利用Fe3+形成Fe4(Fe(CN)6)3，由700nm处吸光
一．实验原理： 该方法利用NADH-PMS-NBT为超氧阴离子(O2·-)生成系统，超氧阴离子清除剂能减少NBT 的蓝色。通过检测560nm处吸光值可判断体系中还原物质的还原能力。 二．实验仪器：分光光度计 三．实验试剂： 一：液体40mL×1瓶； 二：液体1mL一瓶； 三：粉剂一支； 四：粉剂一支； 五：1mg/mL芦丁标准品，1mL 四．溶液配制： 一工作液：用时加双蒸水360mL，也就是10倍稀释，得到400mL试剂一工作液； 二工作液：用赠送的棕色瓶配制。试剂二工作液由试剂二加上100mL试剂一工作液配得，现配现用，注意避光； 三工作液：试剂三工作液由试剂三溶解于100mL试剂一工作液配得，现配现用； 四工作液：粉剂一支。用50mL双蒸水溶解，摇匀后，取10mL，加入90mL试剂一，配成试剂四工作液，现配现用，用赠送的棕色瓶盛装。注意避光，配好的试剂请于2小时内用完。五工作液：阳性对照，按需配制，-20℃保存。 五．实验步骤： 测定吸光值。
六．清除能力计算： 超氧阴离子自由基清除（%）=[空白孔吸光值-（测定孔吸光值-对照孔吸光值）]/空白孔吸光值*100 注： 1 如未做对照孔，可以将其视作为0； 2 阳性对照求值时将其视作测定孔进行计算即可。 七．注意事项： 1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔； 2. 如不确定样品的超氧阴离子自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。 3. 试剂三建议全程冰上操作。试剂四切记避光保存，特别是配制后，且应尽快用完。建议在做好一切其它准备工作后再配制试剂四应用液。试剂四正常颜色为黄色，强光照射下，5-10分钟内会变为绿色，随后变为蓝色，变色后试剂不可再用！ 4. 试剂二、三应用液和样品混匀后再加入试剂四，次序颠倒会导致不显色。 5. 部分物质会导致显色加深，导致求得的抑制率是负值，如遇到此类现象请先确定该物质是否具有超氧阴离子清除能力，再考虑更换方法，如邻苯三酚自氧化法等进行测试。
1、DPPH 自由基清除实验 取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL 乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度A b。4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。 2、ABTS 自由基清除实验 20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。ABTS 溶液作空白吸光度为Ar，样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。 ABTS＋自由基清除率(%)＝[1-(At-A0)/Ar]×100 式中：At 为样品的吸光值；Ar 为空白的吸光值。 3、超氧阴离子清除实验 采用邻苯三酚自氧化法，取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL，混匀后在25 ℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液2 mL，取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制，空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液)，摇匀后倒入比色皿，325 nm下每隔30 s 测定吸光度，连续测定4 min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。 抑制率(%)=(△A0-△A)/△A0×100 式中：△A0 为邻苯三酚的自氧化速率；△A 为加入样品溶液后邻苯三酚的自氧化速率。