蛋白质相互作用的概述
一、为什么要研究蛋白质相互作用
二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB]
三、蛋白质相互作用的应用
A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库
B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合，
C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组
四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。
五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能
I、一些常用蛋白质相互作用技术
?Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation)
?Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag
?(co-)Immunoprecipitation
?Western和Far-Western blot
Surface Plasmon Resonance
Two-Hybrid System
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
（实验过程及原理，注意事项，优缺点）
III、研究实例讨论
一、酵母双杂交系统
作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团
具体过程：见书本
优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到
缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame
蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性
酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂
交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
（1）原理：
将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。
(2)应用范围
1）已知蛋白之间相互作用的检测：
2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；
3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。
1）二、噬茵体展示技术
2）
3）在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。
4）
5）三、等离子共振技术
6）
7）表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
8）
9）四、荧光能量转移技术
10）（fluorescence resonance energy transfer，FRET）FRET：
优点：体内测定两个蛋白质之间的相互作用；敏感度高；溶解度好；大分子的主要构象变化能测定；定量和定性测定相互作用。
缺点：只能测定荧光基团大小为（20-100?）的分子；仪器设备很贵；需要荧光标记
FRET可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。
基本原理：在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体Donor）的发射光谱与另一个基团（受体Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于100 ?），就可观察到荧光能量由供体向受体共振转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。其中以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)及其突变体的应用最为广泛。
特点：a 反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程;b 两个荧光集团间的合适距离为20－100 ?（2－10nm）;c 需用荧光或GFP标记测试蛋白。
荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。
FRET就是采用非放射方法，在供体和受体相互靠得很近（1-10 nm）时，将光子能从一个受激发的荧光团（供体）转移到另一个荧光团（受体）。当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP
的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。例如要研究两种蛋白质a和b间的相互作用，可以根据FRET原理构建一融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白质b、YFP(yellow fluorescent protein)。用CFP吸收波长433nm作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋白质a与b没有发生相互作用时，CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFP的发射波长为476nm的荧光；但当蛋白质a与b发生相互作用时，由于蛋白质b受蛋白质a作用而发生构象变化，使CFP与YFP充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的就是YFP的发射波长为527nm的荧光(图1)。将编码这种融合蛋白的基因通过转基因技术使其在细胞内表达，这样就可以在活细胞生理条件下研究蛋白质－蛋白质间的相互作用。
五、抗体与蛋白质阵列技术
蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。
六、免疫共沉淀技术
免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加
入与抗体特异结合的结合于 Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。
（1）原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档
缺点：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性,三是可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用
七、pull-down技术
蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀（Co- IP）、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或 GST-），从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
1）原理
细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。
两种应用：
1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用
2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用
生物学意义是一切：
1）通过改变蛋白质的相互作用，分析由蛋白质相互作用改变而产生的生物学现象。如通过酵母双杂交或蛋白质组分析，发现相互作用蛋白质，再分析这些作用的生物学意义。人们容易犯的错误是：研究一大堆的蛋白相互作用，却不知道这些相互作用有什么生物学意义。2）通过改变生物学现象，分析其中相关的蛋白质以及相互作用。如小分子化合物抑制了某一生物学活动，发现相应变化的蛋白质，再分析蛋白质的功能和作用。人们容易犯的错误是：找到了平行变化的不相关蛋白质。
蛋白质相互作用的亲和力是技术的基础。
Kd=[A][B]/[AB]。Kd越小，亲和力越好。抗体的亲和力为10-8 -10-10 M是好,10-6M是弱
蛋白质相互作用的应用：发现新的相互作用和相互作用蛋白
利用抗原和抗体的相互作用的技术：
1）Westrern blot：变性抗原，主要用于检测蛋白的存在与否
2）免疫共沉淀：非变性抗原，用于鉴定不同蛋白质间的相互作用
Ab－Pr1－Pr2：免疫共沉淀。
Pr1－Ab－Pr2：非特异性结合
3）染色质沉淀：用抗体沉淀抗原得到与抗原结合的DNA，用PCR鉴定DNA，从而证明蛋白质和特定DNA间的相互作用。
4）过时的抗体筛选：cDNA表达库，抗体结合表达的蛋白质，从而得到基因。有了质谱和PCR后过时。
利用已知的相互作用建立tag：
1）GST pull down ：已知蛋白质和GST融合，与细胞或组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分离和已知蛋白质结合的新蛋白质。GST tag
2）Biotin-Avidin结合：生物素标记已知蛋白质，通过Avidin结合生物素标记的蛋白质，从而得到与生物素标记蛋白结合的新蛋白质。优点是biotin－avidin的结合是最牢靠的；缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很多。
3）其它各种tag。例子
生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，结合二者即可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。自20世纪70年代，BAS开始应用于免疫化学领域以来，利用BAS可被荧光索、酶、放射性核素等材料标记的特点而发展和建立了许多新的检测方法和技术，尤其是与免疫标记技术的有机结合，极大地提高了测定的灵敏度。
直接利用蛋白质的相互作用：
1）蛋白质亲和层析：用蛋白质当亲和层析的亲和基团。要有大量的蛋白质
2）酵母双杂交：优点是简单；缺点是不能得到修饰调控型的相互作用蛋白质。还有衍生的酵母三杂交以及单杂交。
3）噬菌体展示：Physically固定蛋白质，结合phage，洗脱，扩增phage，再结合；循环
4）快成化石的Bait蛋白质筛表达库：bait蛋白质用同位素、GST、等标记，再筛库。
5）一网打尽的蛋白质组：这是检测和鉴定蛋白质的方法。由于检测和鉴定方法上的提高，使得许多蛋白质间的相互作用都可以被用于发现新的蛋白质和新的相互作用。缺点是发现的相互作用蛋白质太多常常超出人们的辨别能力和研究能力。
技术成果的鉴定：蛋白质相互作用的生物学功能是蛋白质相互作用的意义
1）相互作用的证实：不同的发现互相作用的技术都可以用来被验证相互作用的蛋白质。如GST pull down 发现的蛋白质，用免疫共沉淀或酵母双杂交验证。越接近生理状态的证实越好。验证方法和发现方法的差别越大验证结果也越可靠。采用的方法多，结果也越可靠。
2）相互作用的生物学功能：有重要生物学功能的相互作用、一般功能的相互作用、还是没有功能的相互作用。有运气的成分。如果从重要功能蛋白质出发，从重要生物学现象出发，“运气”会越好。
生物学功能的研究：技术成果的大小
相互作用的生物学功能研究基本上可以归为两类：获得功能或失去功能。
获得功能：转基因表达，使得原本不表达该蛋白质的细胞表达了蛋白质，从而和已有的蛋白质发生相互作用，细胞有新的功能。常用的方法有细胞内转基因过表达蛋白质、转基因老鼠。
失去功能：抑制蛋白质的表达或用dominant negative突变体，使原有的蛋白质缺失或失活，细胞功能的丧失。常用的方法有：RNA干扰使蛋白质不表达、蛋白质部分功能片断的影响、基因敲除的细胞、基因敲除的老鼠。
一、一些常用蛋白质相互作用技术：
蛋白质相互作用的亲和力是技术的基础。
Kd=[A][B]/[AB]。Kd越小，亲和力越好。抗体的亲和力为10-8 -10-10 M是好,10-6M是弱。
1、蛋白质相互作用的目的是发现蛋白质与蛋白质的相互作用：
生化方法（co-purification提纯，亲和色谱法，GST pull down ,IP，WB, Far-Western）
Surface plasmon resonance表面等离子体谐振、遗传分析、
酵母双杂交、Fluorescence resonance energy transfer：FRET荧光共振能量转移、
2、注释：表面等离子体谐振(Surface Plasmon Resonance, SPR) 生化分析仪，是基于物理光学现象和生物传感技术的新型生化分析系统。荧光共振能量转移（FPET）：当生色团被光照时，被照射激发的分子可以通过散发能量来返回到基态1-3。光能可被生色团在10-15秒内吸收而在10-9秒内在发射出来。然而，也有可能被激发分子并不发光而将能量传递给别的生色团或是另外的荧光素，这些荧光素可以在相同的时间量级内发荧光，这后一种现象称为FPET.
应用：是比较分子间距离与分子直径的有效工具，广泛用于研究各种涉及分子间距离变化的生物现象，可以定量测量两个发光基团之间的距离，在蛋白质空间构象、蛋白与蛋白间相互作用、核酸与蛋白间相互作用得到广泛应用。
3、生化方法的具体实验：
1）GST pull down ,见ppt25
2）IP和CoIP：上网查
3）Far-Western:
a.不是用抗体直接与膜上的蛋白质结合，而是用另一个蛋白质通过相互作用与膜上蛋白质作用。
b.直接标记另一个蛋白质或用抗另一个蛋白质的抗体做Western blot。
c.因为是蛋白质相互作用，Far-Western常常会包含一步蛋白质复性的过程。
4）SPR：用来监控生物特定表面在金属层的相互作用，通过测量这个相互作用引起的溶液浓度的变化。具体过程
BLAcore SPR的优点：不用标记；实时测量
4、遗传方法：
例子：有A：小量表达；有B：无表达；有C：无表达
有A和B：表达增加；有A和C：小量表达；有B和C：无表达
有A、B、C：高表达
结论：在A、B和C的蛋白质复合体中，A是和基因调控区结合并有小的转录活性；B可以和A结合促进A的转录活性；C本身不能直接促进A的活性，所以不大可能和A有直接相互作用，但能通过B的介导进一步促进转录。
。
二、研究实例讨论：
1、G2/M期阻断的实验测定方法：根据DNA的含量变化
2、亲和层吸：对磷酸化蛋白质有特异性的结合（PY蛋白）
3、质谱鉴定蛋白
4、磷酸化蛋白质的验证
5、蛋白质生物学功能的验证：Loss of function and gain of function
6、进一步寻找相互作用蛋白质
7、细胞内的定位和细胞器，与细胞器的动态相互作用
8、根据已知的蛋白质结构和功能的特点，提出功能模型
9、模型的验证
10、得到研究结论
1．
2．生化方法（Biochemical approaches）
1.1共纯化、共沉淀Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation)在不同基质上进行色谱层析
1.2蛋白质亲和层析（Affinity chromatography）将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过改基质时，可与改固
定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。
GST pull down：为了更有效的利用蛋白质亲和色谱，可以将待纯话的蛋白以融合蛋白的形式表达，即将”诱饵“蛋白与一种易于纯化的配体蛋白融合。例如与GST融合的蛋白再经过GSH的色谱柱时，就可以通过GST和GSH的相互作用而被吸附。当载有细胞抽提物经过柱时，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的目标蛋白了。
Epitope-tag：表位附加标记技术就是将附加的抗原融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达，同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白。缺点：表位附加标记可能会使融合蛋白不稳定，改变或使融合蛋白功能丧失。
以上两种方法都要共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能时由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白
的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作为中介的；有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。因此实验结果还应经其他方法验证。
1.3免疫共沉淀（Immunoprecipitation）
免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。
缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。
1.4Far-Western
又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。
缺点是转膜前需要将蛋白复性。
3．表面等离子共振（Surface plasmon resonance）
该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射绿上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。
缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。芯片比较昂贵，如果重复使用可能导致结果不好。
4．遗传学方法（Genetic approaches）
基因外抑制子
基因外抑制子是通过一个基因的突变来弥补原有基因的突变。比如相互作用的蛋白A和B，如果A发生了突变使两者不再相互作用，此时B如果再发生弥补性突变就可以使两者的相互作用恢复，那么B就是A的基因外抑制子。缺点：需要知道基因，要有表型，筛选抑
制子比较费时。
合成致死筛选
指两个基因同时发生突变会产生致死效应，而当每个基因单独发生突变时则无致死效应。用于分析两个具有相同重要蛋白之间的相互作用。
5．酵母双杂交（Two-hybrid）
原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。优点是是酵母细胞内的in vivo相互作用，只需要cDNA，简单，弱的相互作用也能检测到。
缺点：自身有转录功能的蛋白或者有其他蛋白插足介导或者自身激活报告基因会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能；不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。另外还有酵母的翻译后修饰不尽相同。尤其是蛋白质的调控性修饰；对基因库的要求比较高，单向1/3是in frame；蛋白质毒性等。
6．荧光共振能量转移技术（Fluorescence resonance energy transfer）
指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。
缺点：此项技术要求发色基团的距离<100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。
此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。
酵母双杂交
2.2.1 构建pBD-A与pAD-I两种重组表达质粒，这样使得待研究蛋白可融合表达GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激活结构域；
2.2.2 pBD-A与pAD-I两种质粒共转化
酵母细胞。
分别设置如下对照组：
pBD / pAD；
pBD-A / pAD；
pBD / pAD-I；
2.2.3 蓝白斑法验证LacZ基因的表达情况。
说明: 如果蛋白A和蛋白I能够相互作用，那么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激活结构域就会相互作用，从而激活lacZ报道基因的表达。如果设置的实验组长出蓝色克隆而对照组没有的话基本上可证明蛋白A和蛋白I有相互作用。
概述
3）研究蛋白质相互作用的意义：细胞生命活动的基础
稳定相互作用--protein complex
瞬时相互作用--enzyme-substrate
蛋白质相互作用如无相应功能是没有研究意义的！
蛋白质相互作用
4）蛋白质相互作用的亲和力---一切蛋白质相互作用的基础
AB ＝A＋B Kd=[A][B]/[AB]（Kd: dissociation constant ）
5）蛋白质相互作用的应用
1、利用抗原和抗体的相互作用
Western blot：变性抗原，主要用于检测蛋白质的存在与否。
免疫共沉淀：非变性抗原，用于鉴定不同蛋白质间的相互作用。
Ab－Pr1－Pr2：免疫共沉淀Pr1－Ab－Pr2：非特异性结合
染色质沉淀：用抗体沉淀抗原得到与抗原结合的DNA，用PCR鉴定DNA，从而证明蛋白质和特定DNA间的相互作用
2、利用已知的相互作用建立tag
GST pull down：已知蛋白质和GST融合，与细胞或组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分离和已知蛋白质结合的新蛋白质，即GST tag。
Biotin－Avidin结合：Biotin标记已知蛋白质，通过Avidin结合biotin标记的蛋白质，从而得到与biotin 标记蛋白结合的新蛋白质。优点是biotin－avidin的结合是最牢靠的；缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很多。
3、直接利用蛋白质的相互作用
蛋白质亲和层析：用蛋白质当亲和层析的亲和基团。要有大量的蛋白质。
酵母双杂交：优点是简单；缺点是不能得到修饰调控型的相互作用蛋白质。还有衍生的酵母三杂交以及单杂交。
phage display：Physically固定蛋白质，结合phage，洗脱，扩增phage，再结合；这样做好几轮。
Bait蛋白质筛表达库：bait蛋白质用同位素、GST、等标记，再筛库。
蛋白质组：这是检测和鉴定蛋白质的方法。不管用什么方法，只要你能得到结合的蛋白质，理论上蛋白质组都可以分析。但由于检测和鉴定方法上的提高，使得许多蛋白质间的相互作用都可以被用于发现新的蛋白质和新的相互作用。缺点是发现的相互作用蛋白质太多常常超出人们的辨别能力和研究能力。
11）发现相互作用的生物学意义
相互作用的证实：不同的发现相互作用的技术都可以被用来验证相互作用的蛋白质。
相互作用的生物学功能：有重要生物学功能的相互作用、一般功能的相互作用、还是没有功能的相互作用。
12）生物学功能的研究
功能的获得：转基因表达，使得原本不表达该蛋白质的细胞表达了蛋白质，从而和已有的蛋白质发生相互作用，细胞有了新的功能。常用技术：细胞内转基因过表达蛋白质、转基因老鼠
功能的失去：抑制蛋白质的表达或用dominant negative突变体，使原有的蛋白质缺失或失活，细胞功能的丧失。
常用技术：RNA干扰使蛋白质不表达、蛋白质部分功能片断的影响、基因敲除的细胞、基因敲除的老鼠
一些常用蛋白质相互作用技术
5）生化方法
Traditional co-purification
Affinity chromatography(GST pull down)
Immunoprecipitation
Western and Far-Western blot
a.GST pull down
已知蛋白质和GST融合，与细胞或组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分离和已知蛋白质结合的新蛋白质。GST tag。
GST 的结合较弱！
b. 免疫共沉淀
免疫沉淀：通过抗原与抗体的结合得到所要的蛋白质 免疫共沉淀：通过抗原与抗体的结合，得到与该已知蛋白有相互作用的蛋白质
优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；
（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；
（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；
(2) 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；
已知蛋白
GST （谷胱甘肽 S 转移酶）
GST fusion protein
谷胱甘肽 对照
有相互作用的蛋白
(3) 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具
有冒险性。
c.蛋白质分析技术：
SDS－PAGE：蛋白质按分子大小分离。
Western Blot：显示特异蛋白质的技术。
基本原理：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（PVDF膜全面优于nitrocellulose膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
决定因素：SDS－PAGE acrylamide的浓度
蛋白质上样的量
相邻泳道的蛋白质量、离子强度和样品体积
转移膜
转移电流
抗体
注意点：
1、电转移效率
2、PVDF膜的充分浸润
3、转移液中有太多的SDS
4、膜的损坏
5、转移时胶和膜没有完全接触
6、抗体的问题
7、抗体的浓度太高或太低
8、还原性物质的存在
9、封闭不充分
等电聚焦：蛋白质按PI值分离。
非变性电泳：蛋白质按分子量和电荷的比值分离。可用来分离具有生物活性的蛋白质。
d.Far western
不是用抗体直接与膜上的蛋白质结合，而是用另一个蛋白质通过相互作用与膜上蛋白质作用。
直接标记另一个蛋白质或用抗另一个蛋白质的抗体做Western blot。
因为是蛋白质相互作用，Far－Western常常会包含一步蛋白质复性的过程。
e.Surface plasmon resonance
原理：表面等离子体谐振（SPR）利用SPR传感器通过检测共振角或共振波长的变化来检测待测分子的成分，浓度及参与化学反应的特性。生物检测上，主要用于检测生物分子的结合作用或者通过生物分子结合作用的检测来完成特定生物分子的识别及其浓度的测定。
优点：lable-free detection
Real time measurement
特点：SPR技术因其高效灵敏无需额外标记等优势，广泛应用与蛋白质检测和蛋白-蛋白相互作用等蛋白质组学研究，它能在保持蛋白质天然状态的情况下实时提供靶蛋白的细胞器分布，结合动力学及浓度变化等功能信息，为蛋白质组研究开辟了全新模式。
f.Two-hybrid system(酵母双杂交)
典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)(BD)和转录激活结构域(transcription-activating domain)(AD)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。因此当在DB上连接X蛋白，AD上连接Y蛋白时，若X与Y有相互作用，则同样可以激活lacZ的表达。因此，通过酵母双杂交可以发现新的相互作用的蛋白质，如X，Y。lacZ 作为reporter gene，用蓝白筛选的方法检测。
Two-Hybrid的优点：
是酵母细胞内的in vivo相互作用。
只需要cDNA，简单。
弱的相互作用也能检测到。
Two-Hybrid的缺点：
都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用。
酵母的翻译后修饰不尽相同。尤其是蛋白质的调控性修饰。自身激活报告基因。
都基因库的要求比较高，单向1/3是in frame
蛋白质毒性。
第三者Z插足介导的相互作用。
假阳性。
举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物－蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控，介导细胞的许多生物学活性。 虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。 一、生物物理学方法 1. 融合蛋白pull-down实验 融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。 被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－转移酶（glutathione-S-transferase ，GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。 GST融合蛋白在经过固定有GST（glutathione）的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说，GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。 该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。 2. 亲和印迹 亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了的“诱饵”蛋白发生作用。此方法所要考虑的是如何保持膜上蛋白的生物活性，如何得到纯化的“诱饵”蛋白等。 3. 免疫共沉淀
检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较 1、生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法.改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。另外灵敏度不如亲与色谱高。 ●Fａr—Ｗestｅrｎ 又叫做亲与印记。将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点就是转膜前需要将蛋白复性。2?、等离子表面共振技术（Surfacｅｐｌasmoｎｒｅsoｎance)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升，从而导致共振角度得改变。而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。该技术不需要标记物与染料，安全灵敏快速,还可定量分析。缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。 ３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成．分别使结合
域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因．缺点：自身有转录功能得蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。不利于核外蛋白研究,会导致假隐性. 5、荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（〈100埃)时，它们之间可发生能量转移得现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。另外设备昂贵,还需要融合ＧFP给蛋白标记。?此外还有交联技术(ｃrｏsｓ－ｌｉnＫing)，蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Pｈａgｅ dｉsｐｌaｙ）以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵 体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统 酵母双杂交得原理就是,把报告基因HIS３与l a c Z 整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较 1. 生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。 ●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。 3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和
激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。 5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。 此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域基因和转录激活因子（如GAL4等）激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统
DNA-蛋白质相互作用的研究方法2008-02-21 12:21一、凝胶阻滞试验 1.试验原理 又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 2.主要步骤及内容 首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段(亦称探针DNA)，然后同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离。应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部，反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。 凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性。 其办法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争DNA(competitor DNA)。如果它与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA 相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。相反地，如果反应中加入的竞争DNA并不能够同探针DNA竞争结合同一种蛋白质，于是探针DNA便仍然与特定蛋白质结合形成复合物，结果在电泳凝胶的放射自显影图片上就会呈现阻滞的条带。 在凝胶阻滞试验中使用竞争DNA，可以间接地阐明在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用。例如，使用一种具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，我们就可以判断通过特定的凝胶阻滞试验所检测到的蛋白质，是否就是属于此类转录因子，抑或是与之相关的其它因子。同样地，假如我们在竞争DNA上已知的转录因子结合位点处，事先引入一个或少数几个碱基突变，通过凝胶阻滞试验亦可有效地评估出这些突变对竞争DNA的性能及其与转录因子结合作用的影响。 二、DNaseI足迹试验(DNaseI footFIrinting assay) DNaseI足迹试验是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术。 首先是对包含一定顺式作用元件的双链DNA进行单链标记，然后用DNaseI水解单链标记的双链DNA，产生不同长度的片断，DNA结合蛋白与其特异序列结合处由于空间位阻，DNaseI对这部分DNA不能切割，即被DNaseI保护。DNaseI水解产物经尿素变性，PAGE 分离及放射性显影后，形成以相差一个核苷酸为梯度的一系列DNA条带，在此显影图中相
蛋白质相互作用的概述 一、为什么要研究蛋白质相互作用 二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB] 三、蛋白质相互作用的应用 A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库 B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合， C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组 四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能 I、一些常用蛋白质相互作用技术 ?Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation) ?Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag ?(co-)Immunoprecipitation ?Western和Far-Western blot Surface Plasmon Resonance Two-Hybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) （实验过程及原理，注意事项，优缺点） III、研究实例讨论 一、酵母双杂交系统 作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团 具体过程：见书本 优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到 缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂
蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗体的使用有助于避免污染的产生。（2）要确保抗体的特异性。即在不表达抗原
Thermo Scientific Pierce Th S i tifi Pi
蛋 蛋白相互作用的研究方法和实践 实
罗 莎 Rosa Luo Ph.D. Application Scientist Biosciences Division Thermo Fisher Scientific China
酵母蛋白质相互作用图谱
Thick blue lines represent literature-derived interactions from PreBIND+MIPS in the HMS-PCI dataset. Thin orange lines represent potential novel interactions. Courtesy MDS Proteomics
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蛋白质相互作用技术
Genetic Two Hybrid Phage Display Mutational analysis M t ti l l i Biochemical Immunoprecipitation (IP) Co-Immunoprecipitation (C IP) C I i it ti (Co-IP) Pull-Down Assays Far Western FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Chemical Crosslinking Label-transfer FeBABE F BABE mapping i Fluorescent Immunofluorescence colocalization
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蛋白质相互作用数据库和分析方法 1. 蛋白质相互作用的数据库 蛋白质相互作用数据库见下表所示： 数据库名 说明 网址 BIND 生物分子相互作用数据库 http://bind.ca/ DIP 蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/2311367154.html,/ IntAct 蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/2311367154.html,/intact/index.html InterDom 结构域相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/2311367154.html,.sg/ MINT 生物分子相互作用数据库 http://mint.bio.uniroma2.it/mint/ STRING 蛋白质相互作用网络数据库 http://string.embl.de/ HPRD 人类蛋白质参考数据库 https://www.doczj.com/doc/2311367154.html,/ HPID 人类蛋白质相互作用数据库 http://wilab.inha.ac.kr/hpid/ MPPI 脯乳动物相互作用数据库 http://fantom21.gsc.riken.go.jp/PPI/ biogrid 蛋白和遗传相互作用数据，主要来自于酵母、线虫、果蝇和人 https://www.doczj.com/doc/2311367154.html,/ PDZbase 包含PDZ 结构域的蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/2311367154.html,/services/pdz/start Reactome 生物学通路的辅助知识库 https://www.doczj.com/doc/2311367154.html,/ 2. 蛋白质相互作用的预测方法 蛋白质相互作用的预测方法很非常多，以下作了简单的介绍 1) 系统发生谱 这个方法基于如下假定：功能相关的(functionally related)基因，在一组完全测序的基因组中预期同时存在或不存在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相似．可以推断它们在功能上是相关的。
?技术与方法? 生物技术通报 B I O TECHNOLO G Y BULL ET I N 2006年增刊 蛋白质相互作用研究方法及其应用 王海波 安学丽 张艳贞 王爱丽 李巧云 晏月明 (首都师范大学生命科学学院,北京 100037) 摘 要: 过去10年来,蛋白质组学得到迅速发展,蛋白质间的相互作用作为蛋白质组学的重要内容,更是成为国内外竞相研究的重点,研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。着重就经典的噬菌体展示、酵母双杂交以及新近发展起来的串联亲和纯化、荧光共振能量转移技术和表面等离子共振等蛋白质相互作用研究方法的原理及应用作一综述并展望其发展前景。 关键词: P DT Y2H T AP FPET SPR Approaches and Appli cati ons of Protei n 2Protei n I nteracti on Studi es W ang Haibo An Xueli Zhang Yanzhen W ang A ili L i Q iaoyun Yan Yue m ing (College of L ife Science,Capital N or m al U niversity,B eijing 100037) Ab s tra c t: W ith the fulfill of HGP (Hu man genom ic p r oject ),the study t op r otein is s p ring up.Pr otein -p r otein in 2 teracti on is one of i m portant subjects of Pr oteom ic,it is i m p licated in every cellular p r ocesses .Now many methods have de 2vel oped t o identify and characterize p r otein 2p r otein interacti ons .The main content of this paper is describe both classical and es pecially recent methods t o study p r otein 2p r otein interacti ons such as Yeast t w o 2hybrid syste m (Y2H ),Tande m affinity pur 2ificati on (T AP ),Fluorescence res onance energy transfer (FRET )and Surface p las mon res onance (SPR ),fr om the p rinci p le t o p r ocess of these technol ogies,s ome ne w achieve ment obtained by these methods als o intr oduced . Key wo rd s: P DT Y2H T AP FPET SPR 作者简介:王海波,硕士研究生,首都师范大学生命科学学院608实验室 通讯作者:晏月明,Tel:010*********;E 2mail:yany m2004@https://www.doczj.com/doc/2311367154.html, 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科———蛋白质组学应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一,迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法,为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。 1 噬菌体展示技术(P DT ) 大肠杆菌丝状噬菌体包括f1、fd 和M13,它们只感染含F 因子的大肠杆菌。1985年,美国M iss ouri 大学S m ith 博士等人 [1] 将R I 核酸内切酶基因片段 连接到丝状噬菌体fd 编码次要外壳蛋白的基因Ⅲ中,成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。后经验证,该噬菌体能被Eco R Ⅰ核酸内切酶抗体有效中和,说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性,这一试验的成功标志着噬菌体展示技术(Phage dis p lay techniques,P DT )的诞生。 噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。1990年Scott 等人 [2] 利用噬菌体展示技术构建了随机多
蛋白质-蛋白质相互作用 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之 间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂 交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间 的相互作用。 四、荧光能量转移技术
研究蛋白质的相互作用的方法 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附 上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET 效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术
一、检测蛋白质与蛋白质相互作用 ① FRET技术（in vivo） FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示： 以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。 ②酵母双、三杂交技术（in vivo） 酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。 一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：
由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示： 如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。 将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。 酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下图所示： 如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达；当加入第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。 ③ Pulldown技术（in vitro） Pulldown，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用。
一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术 蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。 六、免疫共沉淀技术 免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用[/url]的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三
研究蛋白质与DNA相互作用的主要方法 一、引言 在许多的细胞生命活动中，例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。 重组DNA技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性。为此需要： a、鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件； b、分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子； 这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用。 研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括： a、凝胶阻滞实验； b、DNase 1 足迹实验； c、甲基化干扰实验； d、体内足迹实验；f、拉下实验。 二、凝胶阻滞实验 1、概念： 凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），要叫做DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（Band retardation assay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 2、原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质，那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基本原理。 3、过程: 首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子） 用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点） 这种被标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育，于是产生DNA-蛋白质复合物 在控制使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 最后进行放射自显影，分析电泳结果 4、实验结果的分析： a、如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部，这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针DNA相互结合的转录因子蛋白质；
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术
蛋白质相互作用的主要研究方法
蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A 或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆