醌还原酶2醌类化合物对偶氮染料脱色的作用
周觅,柳广飞,周集体,金若菲3
,陈明翔,王艳青
(大连理工大学环境与生命学院,工业生态与环境工程教育部重点实验室,大连 116024)
摘要:外加醌类化合物作介体,利用细菌胞内的醌还原酶考察基因工程菌E scherichia coli Y B 对偶氮染料的脱色能力,以及甲基氢醌预处理对E .coli JM109和厌氧污泥脱色的影响.结果表明,介体22羟基21,42萘醌(laws one ,LQ )的存在对胞内过量表达醌
还原酶AZR 的E .coli Y B 的脱色能力有显著的促进作用,012mm ol ?L -1LQ 存在下,苋菜红(1mm ol ?L -1)在2h 内可脱色75%.
LQ 存在时E .coli Y B 对高浓度的染料也有脱色效果,8h 可使苋菜红(5mm ol ?L
-1
)脱色50%左右.与LQ 相比,甲萘醌作为介
体对脱色的促进效果较差,215mm ol ?L -1甲萘醌存在下脱色70%需12h.LQ 存在时E .coli Y B 对苋菜红的重复脱色能力稳定,
12h 内能完成4次重复脱色.LQ 的存在对于结构较复杂的2种偶氮染料酸性大红G R 和活性艳红K 22BP 的脱色也有促进作
用,在最适LQ 浓度下,分别在9h 和30h 脱色70%.甲基氢醌预处理对E .coli JM109和厌氧污泥的脱色能力都有促进作用.
预处理后在LQ 存在下,E .coli JM109在5h 可脱色苋菜红(1mm ol ?L -1)80%左右,而污泥可在11h 脱色75%以上.
关键词:基因工程菌;醌还原酶;氧化还原介体;偶氮染料
中图分类号:X172 文献标识码:A 文章编号:025023301(2009)0621810208
收稿日期:2008209204;修订日期:2008210224基金项目:国家自然科学基金项目(50808029)
作者简介:周觅(1983～),女,硕士研究生,主要研究方向为环境微生
物,E 2mail :m izhou @https://www.doczj.com/doc/253484936.html,
3通讯联系人,E 2mail :jruofei @https://www.doczj.com/doc/253484936.html,
Decolorization of Azo Dyes Using Q uinone R eductase and Q uinoid Compounds
ZH OU Mi ,LI U G uang 2fei ,ZH OU Ji 2ti ,J I N Ruo 2fei ,CHE N Ming 2xiang ,W ANG Y an 2qing
(K ey Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering ,M inistry of Education ,School of Environmental and Biological Science and T echnology ,Dalian University of T echnology ,Dalian 116024,China )
Abstract :Using quinoid redox mediator and bacterial cellular quinone reductase ,we investigated the decolorization ability of gene 2engineered strain E scherichia coli Y B and the effects of methylhydroquinone (MH Q )pretreatement on decolorization per formance of E .coli JM109and anaerobic sludge.The results indicate that laws one is an effective accelerator for azo dye decolorization by E .coli Y B overexpressing cellular
quinone reductase AZR.In the presence of 012mm ol ?L -1laws one ,75%Amaranth (1mm ol ?L -1
)can be decolorized in 2h.E .coli Y B
can als o decolorize high concentration of azo dye in the presence of laws one.Around 50%Amaranth (5mm ol ?L -1
)is decolorized in 8h.C om pared to laws one ,menadione is a less effective mediator.E .coli Y B takes 12h to reach 70%decolorization in the presence of 215
mm ol ?L -1
menadione.Repeated decolorization studies showed that E .coli Y B had stable decolorizing ability in the presence of laws one.F our rounds of repeated decolorization can be com pleted in https://www.doczj.com/doc/253484936.html,ws one can als o accelerate the decolorization of azo dyes with com plex structures such as Acid Scarlet G R and Reactive Brilliant Red K 22BP.With the optimal LQ concentrations ,70%Acid Scarlet G R and Reactive Brilliant Red K 22BP are decolorized in 9h and 30h ,respectively.Decolorization per formances of E .coli JM109and anaerobic sludge pretreated with
MH Q are im proved.A fter MH Q pretreatment ,in the presence of laws one ,80%Amaranth (1mm ol ?L -1
)can be decolorized in 5h by E .coli JM109,while m ore than 75%Amaranth can be rem oved in 11h by sludge.
K ey w ords :genetically engineered bacteria ;quinone reductase ;redox mediator ;azo dyes
染料废水是较难处理的工业废水之一
[1,2]
,而偶
氮染料是使用最广泛的一类染料,占到染料使用总量的60%～70%[3]
.偶氮染料生物降解的第一步也是最关键的一步是由偶氮还原酶催化完成的偶氮键的断裂,生成相应的芳香胺.近年来,人们考察了多种不同来源的偶氮还原酶,并利用这些偶氮还原酶基因构建了基因工程菌
[4～12]
.但研究表明,这些胞内
过量表达了偶氮还原酶的基因工程菌并没有明显表现出较野生菌更强的脱色能力.Bl ümel 等[4]
比较了
Xenophilus azovorans K F46F 及携带有其偶氮还原酶
基因azoB 的重组大肠杆菌的细胞提取物的偶氮还原酶活性,发现后者的偶氮还原酶活性是前者的50倍;但重组大肠杆菌在完整细胞水平上却未检测到
偶氮还原活性.同样,携带有偶氮还原酶基因fre 的
重组Sphingomonas sp.strain BN6的细胞提取物的偶氮还原酶活性较野生菌提高了30倍,而其完整细胞对偶氮染料苋菜红和媒染黄3的还原速率却只比野
生菌提高了约3倍[12].Liu 等[13]
的研究也表明,胞内过量表达了偶氮还原酶AZR 的重组E scherichia coli Y B 的细胞提取物的偶氮还原酶活性是野生光合细菌Rhodobacter sphaeroides AS111737的10倍左右,但其完整细胞却没有表现出更强的脱色能力.由于偶
第30卷第6期2009年6月
环 境 科 学E NVIRONME NT A L SCIE NCE
V ol.30,N o.6Jun.,2009
氮染料通常分子结构复杂,含有高极性的取代基,其还原受到细胞膜通透性的限制[3],使得胞内过量表达的偶氮还原酶在细菌脱色偶氮染料过程中难以发挥作用.
近年来,有许多厌氧条件下细菌利用氧化还原介体如黄素类化合物FAD、FMN和核黄素,及醌类化合物蒽醌222磺酸(AQS)、蒽醌22,62二磺酸(AQDS)和22羟基21,42萘醌降解偶氮染料的报道[14～19].醌类化合物作为介体促进偶氮染料脱色依赖于细菌细胞膜上或细胞质内的醌还原酶,在醌还原酶的作用下,醌类化合物被还原为相应的氢醌,氢醌再通过纯化学的作用将偶氮染料还原使其脱色[20～22].此外,近来有报道认为与E.coli偶氮Π醌还原酶AzoR具有30%一致性的Bacillus subtilis偶氮还原酶AzoR1和AzoR2的表达受到甲基氢醌等亲电化合物的诱导[23,24].
此前研究发现偶氮还原酶AZR具有醌还原酶活性,22羟基21,42萘醌等醌类化合物为其更适合的底物[25].本实验利用AZR的醌还原酶活性,选用醌类化合物作为氧化还原介体,研究了基因工程菌E.coli Y B对偶氮染料的脱色,得到了目前已报道最快的细菌比脱色速率.此外,本研究还考察了甲基氢醌预处理对E.coli JM109和厌氧污泥脱色偶氮染料的影响.研究结果对于偶氮染料废水的污染整治有着非常重要的理论意义.
1 材料与方法
111 材料
11111 菌种及污泥来源
E.coli JM109为基因工程操作出发菌株.
E.coli Y B含有插入R.sphaeroides AS111737偶氮还原酶基因azr(G enBank登录号为AAN17400)的质粒p GEX2AZR,由本实验室前期工作构建[12].厌氧污泥取自大连市春柳河污水处理厂,经厌氧培养驯化. 11112 培养基
LB培养基:100m L培养基中含有015g酵母膏,1g蛋白胨,1g NaCl,调节pH=712,用于细菌的好氧增殖培养
脱色培养基:由无机盐培养基中加入葡萄糖(10 mm ol?L-1)制成.100m L无机盐培养基中含有011g NH4Cl,011g NaHC O3,0102g K2HPO4,0102g MgS O4?7H
2
O,0105～012g NaCl,生长因子1m L,微量元素1m L,蒸馏水97m L,调节pH=710,用于考察偶氮染料的脱色.
11113 偶氮染料
苋菜红为本研究的模式偶氮染料,与其它偶氮染料均由大连理工大学染料合成实验室合成,偶氮染料的化学结构及最大吸收波长如图1所示
.
图1 本研究中使用的偶氮染料
Fig.1 Az o dyes used in this study
11114 主要药品
甲萘醌(menadione)2羟基21,42萘醌(laws one,
LQ)、甲基氢醌(methylhydroquinone,MH Q和NADH
等购自Sigma公司;氨苄青霉素、牛血清白蛋白和考
马斯亮蓝G2250购自上海华美生物工程公司;IPTG
购自宝生物工程(大连)公司;其余药品均为国产分
析纯.
112 粗酶的提取及蛋白含量的测定
1181
6期周觅等:醌还原酶2醌类化合物对偶氮染料脱色的作用
T细胞
实验以细菌细胞提取物为粗酶液,提取方法如文献[11].简述如下:将培养后离心(8000r?min-1, 20min)收集的菌体先在低温冰箱(-20℃)中冷冻保存,取出后于室温融化,采用超声破碎器于冰浴中破碎细胞30min,脉冲110,然后离心(22000 r?min-1,20min)收集上清液,即得粗酶.采用Bradford法[26]测定酶液蛋白含量,以牛血清白蛋白作为标准蛋白.
113 酶活分析体系
反应体系的总体积为2m L,pH=7,30℃.此体系由20mm ol?L-1磷酸缓冲液配制,含有5～100μm ol?L-1甲基红或215～50μm ol?L-1LQ,一定量粗酶及011mm ol?L-1NADH.反应以加入NADH开始,混合均匀后迅速放入JASC O V2560型分光光度计中,以缓冲溶液为参比,在相应最大吸收波长下测定反应体系的吸光度随时间的变化情况,计算相应的酶活酶活力单位(U)定义为:在特定条件下(pH= 7,30℃),每min内转化1μm ol底物所需酶量.酶的比活力为单位蛋白的酶活力.
通过检测甲基红[λ
max
=430nm,ε=2314 L?(mm ol?cm)-1]最大吸收峰波长处吸光度的降低计算偶氮还原酶的酶活.
由于LQ在可见光区有吸收干扰,故通过检测NADH[λmax=340nm,ε=6122L?(mm ol?cm)-1]的氧化来计算醌还原酶的酶活[25].
114 脱色培养方法及脱色的测定
将培养后收集的菌体重悬于血清瓶中的脱色培养基,使菌体终浓度(干重)达到017g?L-1,加入一定量的醌类化合物,曝氮气15min,再加入偶氮染料(染料终浓度1mm ol?L-1,瓶内溶液总体积为50 m L),密封后放入30℃的培养箱内,观察其脱色情况.在选定时间间隔内,取样、将含染料以及菌体的培养液离心(8000r?min-1,10min)后,以未加染料的脱色培养基为参比,测量其最大吸收波长处的吸光度.并按下式计算其脱色率:
r=A0-A t
A0
×100%
式中,A
:初始时刻的吸光度;A t:培养时间t后的吸光度.
当染料达到70%左右的脱色率时重新补料加入,使培养基中染料浓度大致回复到初始值,考察细
.
115 偶氮染料还原电势的测定
,以玻碳电极(d=3mm)为工作电极,铂电极(2cm×2cm)为辅助电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极(100mg?L-1染料,011m ol?L-1Na2S O4溶液,pH6).实验中用PARST AT2273型电化学工作站测试并做循环伏安曲线.实验前经高纯氮气除氧15min,扫描速率为50 mV?s-1,在-800～500mV范围内循环扫描3次. 116 MH Q预处理对脱色的影响
在LB中培养E.coli JM109,待菌液D
600达到016左右时,将菌株收集洗净后,重悬于加入一定量MH Q的脱色培养基中,菌体终浓度(干重)为017 g?L-1,好氧培养10min;而后加入LQ(012 mm ol?L-1),曝氮气15min、加入染料苋菜红(1 mm ol?L-1)考察厌氧脱色.收集并洗净厌氧污泥(污泥终浓度M LSS=4g?L-1)取代E.coli JM109考察MH Q预处理对污泥脱色偶氮染料的影响.
2 结果与分析
211 粗酶液酶活及E.coli完整细胞脱色苋菜红的考察
分别以E.coli JM109和E.coli Y B的细胞提取物为粗酶,考察其还原甲基红及LQ的能力.由图2(a)可见,E.coli Y B的提取物具有比E.coli JM109更高的偶氮还原酶活性,当甲基红浓度为50μm ol?L-1时,前者的比活力为后者的5倍以上.而由图2(b)可知E.coli Y B提取物的醌还原酶活性也远远大于E.coli JM109,当LQ浓度为50μm ol?L-1时,前者的比活力是后者的17倍以上.
考察E.coli JM109和E.coli Y B完整细胞对苋菜红的脱色发现,48h后,两者对苋菜红的脱色率都仅为12%左右.尽管基因工程菌E.coli Y B在胞内表达了大量的偶氮还原酶AZR,且其提取物在体外考察中也表现出更高的酶活,但其在细菌细胞水平上的脱色效果却并不强于E.coli JM1091有报道认为,对于磺酸取代类偶氮染料的脱色,由于染料分子复杂的结构及其取代基的高极性使其很难进入胞内被还原[3,12],因此在胞内过量表达的偶氮还原酶难以发挥作用.
212 LQ对E.coli脱色苋菜红的影响
向脱色培养基中加入不同终浓度的LQ后,考察E.coli的脱色情况.如图3(a),无介体存在时E.coli JM109对苋菜红基本不脱色,012mm ol?L-1 LQ存在下对脱色的促进作用最为显著,6h可脱色75%.但随着介体浓度进一步提高,促进效果反而下降,可能是由于高浓度的LQ更多发挥与染料竞争
2181环 境 科 学30卷
图2 粗酶液的偶氮还原酶和醌还原酶活性
Fig.2 Az oreductase and quinone reductase activities of crude
enzymes
图3 la w sone 对E .coli JM109和E .coli YB 脱色苋菜红的影响
Fig.3 E ffects of laws one on decolorization of Amaranth by E .coli JM109and E .coli Y B
电子的作用而介体作用不明显,也可能由于高浓度
的LQ 给细胞带来毒性.如图3(b )可见,介体LQ 的存在也能促进E .coli Y B 的脱色能力,其最适介体
浓度也为012mm ol ?L -1
,2h 就可脱色75%.上述结果表明菌株E .coli Y B 胞内过量表达的醌还原酶AZR ,与介体共同参与脱色,提高了菌株的脱色能
力.LQ 存在时E .coli Y B 对高浓度的染料也有脱色
效果.012mm ol ?L -1
LQ 存在下,8h 可使苋菜红(5
mm ol ?L -1
)脱色50%.213 menadione 对E .coli Y B 脱色苋菜红的影响
前期实验工作发现,与LQ 相比,同为萘醌衍生物的menadione 是醌还原酶AZR 更为适合的底物[25]
.因此,考察menadione 对E .coli Y B 脱色苋菜红的影响.由图4可知,menadione 对脱色也有一定的促进作用,不存在menadione 的情况下24h 仅能
脱色10%,而215mm ol ?L -1
menadione 存在下12h 能脱色70%以上,促进作用最为显著.但与LQ
相
图4 menadione 对E .coli YB 脱色苋菜红的影响
Fig.4 E ffects of menadione on decolorization of Amaranth by E .coli Y B
比,促进效果较差.214 LQ 存在时E .coli Y B 对苋菜红的连续脱色
考察LQ 存在时E .coli Y B 重复脱色苋菜红能
3
1816期周觅等:醌还原酶2醌类化合物对偶氮染料脱色的作用
力的稳定性.LQ 存在时,E .coli JM109在12h 内仅
能完成2次脱色.而图5表明,12h 内E .coli Y B 能完成4次脱色,脱色能力稳定.第3、4次的脱色相对于前2次有所变慢,可能是由于电子供体葡萄糖被逐渐消耗浓度降低所致,也可能是降解代谢物毒性积累所致
.
图5 E .coli YB 重复脱色中的稳定性
Fig.5 S tability of repeated decolorization by E .coli Y B
215 LQ 对E .coli Y B 脱色其它染料的影响
向脱色培养基中加入不同终浓度的LQ 后,考察E .coli Y B 脱色酸性大红G R 和活性艳红K 22BP 的情况.由图6可知,LQ 的存在对E .coli Y B 脱色这2种染料也都有促进作用,无介体存在时染料基本不脱色.012mm ol ?L -1
LQ 存在下对酸性大红G R 脱色的促进作用最为显著,9h 脱色70%以上;而
018mm ol ?L -1
LQ 存在下对活性艳红K 22BP 脱色的促进作用最为显著,30h 脱色70%左右.216 MH Q 预处理对E .coli JM109和厌氧污泥脱色苋菜红的影响
考察外加MH Q 好氧预处理10min 对介体促进偶氮染料脱色的影响.由图7(a )可知,MH Q 预处理对E .coli JM109脱色苋菜红有促进作用.未经MH Q
预处理的control 5h 仅脱色60%,而经015mm ol ?L -1
MH Q 预处理后就可脱色80%.如图7(b )所知,LQ 的存在对污泥脱色苋菜红也有促进作用[16]
,无介体存在的control a 11h 基本不脱色,而LQ 存在下control b
11h 达到25%以上脱色率.015mm ol ?L -1
MH Q 预处理对脱色的促进作用较显著,11h 可脱色75%以上
.
图6 la w sone 对E .coli YB 脱色酸性大红GR 和活性艳红K 22BP 的影响
Fig.6 E ffects of laws one on decolorization of Acid Scarlet G R and Reactive Brilliant Red K 22BP by E .coli Y B
3 讨论
氧化还原介体是加速电子从最初电子供体传递到最终电子受体的化合物,它可以使反应速率增大
1至几个数量级[27]
.在有氧化还原介体存在时,偶氮染料的还原性脱色可分为不同的2步,第1步是非特异性的介体的酶还原,第2步是偶氮染料被介体
化学还原[28]
.近来研究发现醌类化合物可作为氧化还原介体,在厌氧条件下,通过细胞膜上或细胞质内的醌还原酶的还原,氢醌将细胞内的还原当量传递
给胞外的偶氮染料,实现偶氮类化合物的非酶降解[20～22].AZR 具有醌还原酶活性[25],因此研究者可以利用其醌还原酶活性,通过外加醌介体来加速基因工程菌脱色偶氮染料.
此前有研究报道了携带有偶氮还原酶基因fre 的重组Sphingomonas sp.strain BN6完整细胞对偶氮染料苋菜红的脱色情况,30h 后脱色率达75%左右[12].H ong 等[29]
利用AQS 和AQDS 作为氧化还原介体,考察了Shewanella decolorationis S12对苋菜红的脱色,介体的加入对脱色确实有促进作用,8h 后
4181环 境 科 学30卷
图7 MHQ预处理对E.coli JM109和厌氧污泥脱色苋菜红的影响
Fig.7 E ffects of MHQ pretreatment on decolorization of Amaranth by E.coli JM109and anaerobic sludge
脱色率达75%左右.而本实验中首次利用醌介体加速基因工程菌脱色偶氮染料,01035g细胞(干重)在LQ存在下仅2h脱色率就达到75%,为目前已报道最快的细菌比脱色速率.介体的加入使基因工程菌在脱色上的优势得到了充分的体现.
氧化还原电势是醌类化合物能否作为氧化还原介体的决定因素.近来研究表明,氧化还原电势大约在-320～-50mV之间的醌类氧化还原介体通常都能在细菌厌氧偶氮还原中发挥有效的功能.这一限度是由辅酶NAD(P)H的氧化还原电势和偶氮复合物的氧化还原电势共同决定的[15].LQ的氧化还原电势为-137mV,而menadione的氧化还原电势则高于-50mV[15],故menadione并不是一种理想的氧化还原介体.但本实验却发现menadione的存在对苋菜红的脱色有一定的促进作用,但其促进效果明显不如LQ.H ong等[30]对S.decolorationis S12偶氮呼吸的研究认为,醌类化合物和细胞膜上的醌还原酶是细菌细胞膜电子传递链的重要组分.因而menadione可能有利于细胞膜上的电子传递而对E.coli Y B脱色苋菜红发挥了促进作用.
根据Nernst方程,还原反应与氧化还原物质的电极电势及浓度有关.电极电势越高物质越易被还原本实验中3种偶氮染料还原电势由低到高的顺序为:酸性大红G R(E
r
=-684mV)<苋菜红(E r= -540mV)<活性艳红K22BP(E r=-176mV),而比脱色速率由小到大的顺序却是活性艳红K22BP<酸性大红G R<苋菜红.酸性大红G R的还原电势最低,因此较难得电子被还原;K22BP
原电势虽高,但其化学结构复杂,偶氮键邻位存在个磺酸基团还原.同时,活性艳红K22BP的最适介体浓度大于其他2种染料,也可能是其复杂的化学结构所决定的.
近来有报道表明,外加MH Q和儿茶酚等亲电醌类化合物经短时间的预处理,可显著提升偶氮Π醌还原酶基因的转录与表达[23,24].本研究发现MH Q预处理对E.coli JM109脱色偶氮染料有促进作用.即时定量反转录PCR实验表明,经015mm ol?L-1MH Q 预处理10min后,E.coli JM109染色体上偶氮Π醌还原酶的编码基因azoR的转录水平提升了近50倍(另文发表).因此,MH Q的预处理可诱导提升AzoR 等偶氮Π醌还原酶的转录表达,从而促进醌类介体存在下细菌对偶氮染料的脱色.研究表明在很多芳香化合物的代谢途径中都会生成具有与儿茶酚和氢醌类似结构的中间体[31].因此醌类化合物对偶氮、硝基和氯代等芳香化合物的降解的促进作用值得深入研究.随着基因组学的发展,许多细菌的全基因组序列被测序出来.研究发现与E.coli的azoR基因具有一定相似性的同源基因广泛分布于许多不同种类的细菌中[32],而污泥中存在着大量的细菌,数量可占污泥中微生物总量的90%～95%左右.本研究中MH Q预处理对厌氧污泥脱色偶氮染料有明显的促进作用.活性污泥法成本低廉、简单易行,是污水处理中常用的方法.但脱色偶氮染料对活性污泥来说是有难度的,通常需要较长的时间才能达到较好的处理效果.MH Q预处理能够改善污泥的脱色效果,加快脱色速率,该方法的实际应用有待于深入研究.
4 结论
(1)E.coli Y B细胞提取物的偶氮还原酶活性和醌还原酶活性都大大高于E.coli JM109,但由于
5181
6期周觅等:醌还原酶2醌类化合物对偶氮染料脱色的作用
染料分子复杂的结构及其取代基的高极性使其还原
受到细胞膜通透性的限制,因此对于磺酸取代类偶氮染料的脱色,胞内过量表达的偶氮还原酶难以发挥作用.
(2)介体LQ 的存在对E .coli Y B 的脱色能力有显著的促进作用,012mm ol ?L -1
LQ 存在下,E .coli JM109需要6h 才能脱色75%,而E .coli
Y B 2h 就可使苋菜红(1mm ol ?L -1
)脱色75%.介体将胞内的还原当量传递给了胞外的偶氮染料,其加入体现出了基因工程菌在脱色上的优势,该比脱色速率为目前已报道的最快的.介体LQ 存在时E .coli Y B 对高浓度的染料也有脱色效果.
(3)与LQ 相比,氧化还原电势过高的menadione 对脱色的促进效果较差,表明其并不是一种理想的氧化还原介体.
(4)LQ 存在时E .coli Y B 对苋菜红的重复脱色能力稳定,12h 内菌体能完成4次脱色,而E .coli JM109仅能完成2次.LQ 的存在对于结构较复杂的2种偶氮染料酸性大红G R 和活性艳红K 22BP 的脱色也有促进作用.
(5)MH Q 预处理对E .coli JM109和厌氧污泥的脱色能力都有促进作用.
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6期周觅等:醌还原酶2醌类化合物对偶氮染料脱色的作用
【实验目的】 了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。 【实验原理】 谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。 【器材与试剂】 1.实验仪器与用具 研钵、高速离心机、移液管、离心管、试管、分光光度计 2.实验试剂 还原型谷胱甘肽标准液；偏磷酸溶液；磷酸溶液缓冲液（pH7）；二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液；蒸馏水。 3.实验材料 小麦叶片 【实验步骤】 1.标准曲线制作 取7支试管，编号，按照下表加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。以1号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。 试管号 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 7 10μg/ml GSH标准液0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水 2.0 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 pH7磷酸缓冲液 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 DTNB试剂0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 GSH浓度μg/2ml 0 1 2 4 6 8 10 2.提取 取材后，称取0.2g样品置于研钵中，加入少量5%偏磷酸研磨成匀浆后，定容至6ml, 8000转离心10min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。 3.测定 取上清液2ml，显色，操作同标准曲线。重复3次。 显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度和空白对照管反应混合液的吸光度。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）。 4.计算 GSH含量（μmol/g）=（C x×V t）/ （FW×V S） 式中，C x为2ml样品中GSH的含量（μg）；V t为样品提取液总体积（ml）；V s为显色时样品液体积（ml）；FW为样品质量（g）。 【实验结果】 1.标准曲线 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 GSH浓度（μg/2ml）0 1 2 4 6 8 10 吸光度值A 0 0.067 0.134 0.314 0.452 0.579 0.723 以GSH浓度（μg/2ml）为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线。
醌氧化还原介质对厌氧氨氧化生物活性的影响 锦集 RMS 通过厌氧氨氧化生物抑制TN的去除性能 RMs 可以显著提高厌氧氨氧化菌关键酶的活性 RMs是推断发挥作用的Q/QH2在厌氧氨氧化过程 作为主要的原因，可能会阻止ladderane RMs 和关键酶之间的联系 文章信息 1.文章历史 2013年9月修订 2013年10月31日修订编版 2013年11月1日被接受 2013年11月10日在网上发布 2.关键词 厌氧氨氧化 氧化还原介质 肼脱氢酶 亚硝酸盐还原酶
硝酸还原酶 3.摘要 本研究首先探讨厌氧氨氧化生物/关键酶和醌的氧化还原介质之间的活动关系，其中蒽醌-2,6-二磺酸（AQDS），2-羟基-1,4- napthoqui-无（LAW）和蒽醌-2-羧酸（AQC）。实验结果表明，总脱氮性能随三种氧化还原介质（RMS）用量的增加而呈下降趋势。例如，当AQC增加到0.8毫米，TN的去除率急剧减少到17.2mg-N/gVSS/h，只能控制大约20%。这种现象可能是微生物中毒与细胞外的RM增加而引起的。然而，粗肼脱氢酶，亚硝酸盐还原酶，和硝酸还原酶的活性增强比没有RMS的对照实验约0.6-3倍。RMS被推断在厌氧氨氧化过程中发挥辅酶/泛醌（Q/QH2）作用。此外，具体ladderane 膜结构可以阻隔RMS和厌氧氨氧化膜内的关键酶。主要原因可能是RMS 对厌氧氨氧化生物和关键酶的反向影响。 1.简介 厌氧氨氧化（ANAMMOX）现在被确认为是一种新颖的重要的生物脱氮工艺。它可以在厌氧条件下将NH4与NO2直接转化成N2（Strouset等人，1999）。与传统工艺相比（硝化反硝化生物），厌氧氨氧化过程提供了显著的优点，如对氧气和有机碳，低污泥产量和减少CO2和NO2的排放（Opden Campet等人，2006）。近日，唐等人（2010）报告了一个高达74.3-76.7 kg-N/m3/d的脱氮率在一个实验室规模的厌氧氨氧化UASB反应器，在废水生物脱氮的厌氧氨氧化工艺的高电位。然而，如此高的脱氮率（NRR）是通过连续添加厌氧氨氧化污泥到目标反应器，其中生物量浓度的增加高达42-57.7VSS/L（唐等人，2010）。此外，厌氧氨氧化菌相对长的培养
谷胱甘肽还原酶检测试剂简介 谷胱甘肽还原酶的作用： 一、谷胱甘肽还原酶（GR）在人类细胞中具有极其重要的生理功能，广泛存在于人体肝、肾、心红细胞、单核巨噬细胞等组织细胞中。它可及时地清除人体代谢过程中产生的氧自由基（OFR），是维持细胞中还原型谷胱甘肽（GSH）含量的主要黄素酶。对保护肝细胞膜完整具有非常重要的作用意义。 在《临床肝病实验诊断学》和《临床检验诊断解析》中明确标示，血清谷胱甘肽还原酶活性测定可用于协助诊断肝脏疾病，血清谷胱甘肽还原酶活性上升可以辅助诊断肝炎、肝硬化、梗阻性黄疸及相当数量引发的肝肿瘤。原发性肝细胞癌和广泛转移性肝肿瘤时，血清谷胱甘肽还原酶活性明显升高，急性病毒性肝炎或中毒性肝炎中度升高，而肝硬化是血清GR轻度升高。 二：检测谷胱甘肽还原酶的临床意义 1、急性肝炎早期阶段，血清谷胱甘肽还原酶敏感性最高，可用于肝损的早期检测； 2、急性肝炎患者GR比转氨酶更早增加达到峰值，早早期肝脏损伤判断的首选指标； 3、GR有助于判断亚临床DILI，提高临床DILI的诊断率 4、不同于ALT和AST在肝细胞膜破裂和线粒体破裂时才能检测出来，GR填补肝细胞受损早期自我修复阶段至破裂进程中诊断的空白，将更有利于早期肝炎的诊断和治疗
三、临床解读： 谷胱甘肽和谷丙、谷草在化验单上的具体解读，谷胱甘肽的血清血浆正常值是33-73U/L，共有四种情况。 1、谷胱甘肽指标升高，谷丙和谷草指标正常，提示有肝损伤的风险，建议加强对肝脏的检测频率，有利于发现早期肝损伤。 2、谷胱与谷丙，谷草同时升高，提示进入肝损伤爆发期，建议临床治疗措施干预。 3、谷胱甘肽升高，谷丙、谷草下降，提示正在进行肝损伤修复，可以结合三者评估临床治疗情况。 4、当三者都出现下降，情况有两种极端提示：（1）是修复完成，临床好转。（2）是重型肝炎出现严重情况，出现胆酶分离现象。 另外一种是红细胞的检测，正常值4.7-13.2U/gHb 红细胞主要针对“蚕豆病”和遗传性伯氨喹溶血病人，谷胱甘肽还原酶降低，红细胞的细胞膜容易被氧化和分解，导致溶血性贫血和溶血性黄疸。
本科生毕业论文（设计）
题 姓 学 专 班 学
目: 名: 院: 业: 级: 号:
谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）对灵芝生长发育中 的活性氧物质（ROS）的改变及理化性的质影响 于南 生命科学学院 生物科学 生物科学 101 班 13210101 师亮 职称: 讲师
指导教师:
2013 年 5 月 20 日 南京农业大学教务处制
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目录
摘要 .......................................................................................................... 错误！未定义书签。 关键词 ...................................................................................................... 错误！未定义书签。 Abstract ................................................................................................... 错误！未定义书签。 Key words ................................................................................................ 错误！未定义书签。 引言 .......................................................................................................... 错误！未定义书签。 1 材料与方法 ........................................................................................ 错误！未定义书签。 1．1 材料 ....................................................................................... 错误！未定义书签。 1．1．1 菌种 .......................................................................... 错误！未定义书签。 1．1．2 CYM 培养基 ............................................................ 错误！未定义书签。 1．1．3 PDA 固体培养基 ..................................................... 错误！未定义书签。 1．1．4 试剂 .......................................................................... 错误！未定义书签。 1．1．5 主要仪器设备 .......................................................... 错误！未定义书签。 1．2 实验方法 ............................................................................... 错误！未定义书签。 1．2．1 ROS 的测定 ............................................................. 错误！未定义书签。 1．2．2 NBT 测定 ................................................................. 错误！未定义书签。 1．2．3 DAB 染色 ................................................................. 错误！未定义书签。 1．2．4 菌株对氧化物耐受性的检测 .................................. 错误！未定义书签。 1．2．5 胞内 Ca2+的荧光检测 .............................................. 错误！未定义书签。 1．2．6 三萜的测定 .............................................................. 错误！未定义书签。 1．2．7 菌丝分叉检测 .......................................................... 错误！未定义书签。 2 结果与分析 ........................................................................................ 错误！未定义书签。 2．1 GPX 沉默转化子胞内 ROS 含量上升 ......................... 错误！未定义书签。 2．2 NBT 染色显示 GPX 沉默转化子胞内超氧根离子含量上升错误！未定义书签。 2．3 DAB 染色显示 GPX 沉默转化子胞内 H2O2 含量下降...... 错误！未定义书签。 2．4 GPX 沉默转化子的菌株对氧化性物质的耐受力下降 ...... 错误！未定义书签。 2．5 GPX 沉默转化子胞内 Ca2+的含量下降 .............................. 错误！未定义书签。 2．6 GPX 沉默转化子菌株的三萜含量下降： .......................... 错误！未定义书签。 2．7 GPX 沉默转化子菌丝的分叉数减少 .................................. 错误！未定义书签。 3 讨论 .................................................................................................... 错误！未定义书签。 致谢 .......................................................................................................... 错误！未定义书签。 参考文献 .................................................................................................. 错误！未定义书签。
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货号：QS1111 规格：50管/48样 谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, GR）活性测定试剂盒说明书 紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。 测定原理： GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340 nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水 试剂组成和配置： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5.0 mL蒸馏水，混匀。 试剂三：液体×1支，4℃保存。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 操作步骤： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一置于25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）中预热30min。 3. 空白管：取1mL石英比色皿，加入850μL试剂一，100μL试剂二，50μL试剂三，充分混匀，于340nm 处测定10 s和190 s吸光度，记为A空1和A空2，△A空白管= A空1﹣A空2。 4. 测定管：取1mL石英比色皿，加入750μL试剂一，100μL试剂二，100μL上清液，50μL 试剂三，充分混匀，于340nm测定10 s和190 s吸光度，记为A测1和A测2，△A测定管= A 测1﹣A测2。 注意：空白管只需要测定一次。 计算公式： 第1页，共2页
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px/GPX）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号:BC1190规格:50T/24S 产品简介： 谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px/GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GPX 能够催化还原型谷胱甘肽（GSH）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物。 GPX 催化H 2O 2氧化GSH，产生GSSG，GSH 能与DTNB 生成在412nm 处有特征吸收峰的化合物，412nm 下吸光度的下降即可反应GPX 的活性。试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、天平、台式离心机、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管。产品内容： 提取液：液体40mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入5.5mL 蒸馏水溶解；试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入6.6mL 蒸馏水溶解备用； 试剂三：液体20μL×1支，临用前按1μL 试剂三：499μL 蒸馏水的比例稀释试剂三，4℃保存。现用现配； 试剂四：液体60mL×1瓶，4℃保存；瓶底若有结晶可50℃水浴溶解，此溶液为饱和溶液，若底部最终还有结晶，吸取上清使用即可； 试剂五：液体15mL×1瓶，4℃保存； 试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入15mL 蒸馏水溶解备用； 标准品：粉剂×1支，10mg 还原型谷胱甘肽，4℃保存。临用前加入1.62mL 蒸馏水溶解为20μmol/mL 的标准溶液备用。操作步骤：
一、粗酶液的提取： 1、组织：按照组织质量（g）:提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取0.05g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测(如上清不清澈，再离心3min)。 2、细菌、真菌：按照细胞数量104个：提取液体积（mL）500~1000:1的比例，建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min）然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置冰上待测(如上清不清澈，再离心3min)。 3、血清（浆）等液体：直接测定。 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。 2、将20μmol/mL标准液用提取液稀释为0.25μmol/mL的标准溶液。再吸取100μL标准溶液与400μL试 剂四混匀待用，此标准液混合物的浓度为0.05μmol/mL。标准液混合物现用现配。 3、将150μL样本与150μL试剂一混合后室温放置5min。 4、操作表：(在1.5mL离心管中依次加入下列试剂) 测定管对照管样品混合物（μL）100- 试剂二（μL）100100 37℃下预热5min 试剂三（μL）100100 37℃下反应5min 试剂四（mL）11 样品混合物（μL）-100 4000rpm常温离心5min，取上清。 试剂名称（μL）测定管对照管标准管空白管上清液500500--标准液混合物--500-试剂四---500 试剂五200200200200 试剂六200200200200 蒸馏水100100100100
生物氧化与氧化磷酸化 一、选择题 1．生物氧化的底物是： A、无机离子 B、蛋白质 C、核酸 D、小分子有机物 2．除了哪一种化合物外，下列化合物都含有高能键？ A、磷酸烯醇式丙酮酸 B、磷酸肌酸 C、ADP D、G-6-P E、1,3-二磷酸甘油酸 3．下列哪一种氧化还原体系的氧化还原电位最大？ A、延胡羧酸→丙酮酸 B、CoQ(氧化型) →CoQ(还原型) C、Cyta Fe2+→Cyta Fe3+ D、Cytb Fe3+→Cytb Fe2+ E、NAD+→NADH 4．呼吸链的电子传递体中，有一组分不是蛋白质而是脂质，这就是： A、NAD+ B、FMN C、FE、S D、CoQ E、Cyt 5．2,4－二硝基苯酚抑制细胞的功能,可能是由于阻断下列哪一种生化作用而引起? A、NADH脱氢酶的作用 B、电子传递过程 C、氧化磷酸化 D、三羧酸循环 E、以上都不是 6．当电子通过呼吸链传递给氧被CN-抑制后，这时偶联磷酸化： A、在部位1进行 B、在部位2 进行 C、部位1、2仍可进行 D、在部位1、2、3都可进行 E、在部位1、2、3都不能进行，呼吸链中断7．呼吸链的各细胞色素在电子传递中的排列顺序是： A、c1→b→c→aa3→O2 B、c→c1→b→aa3→O2 C、c1→c→b→aa3→O2 D、b→c1→c→aa3→O2 8．在呼吸链中，将复合物I、复合物II与细胞色素系统连接起来的物质是什么？ A、FMN B、Fe·S蛋白 C、CoQ D、Cytb 9．下述那种物质专一的抑制F0因子？ A、鱼藤酮 B、抗霉素A C、寡霉素 D、苍术苷 10．下列各种酶中，不属于植物线粒体电子传递系统的为： A、内膜外侧NADH：泛醌氧化还原酶 B、内膜内侧对鱼藤酮不敏感NADH脱氢酶 C、抗氰的末端氧化酶 D、a－磷酸甘油脱氢酶 11．下列呼吸链组分中，属于外周蛋白的是： A、NADH脱氢酶 B、辅酶Q C、细胞色素c D、细胞色素a- a3 12．下列哪种物质抑制呼吸链的电子由NADH向辅酶Q的传递： A、抗霉素A B、鱼藤酮 C、一氧化碳 D、硫化氢 13．下列哪个部位不是偶联部位： A、FMN→CoQ B、NADH→FMA C、b→c D、a1a3→O2 14．A TP的合成部位是： A、OSCP B、F1因子 C、F0因子 D、任意部位 15．目前公认的氧化磷酸化理论是： A、化学偶联假说 B、构象偶联假说 C、化学渗透假说 D、中间产物学说16．下列代谢物中氧化时脱下的电子进入FADH2电子传递链的是： A、丙酮酸 B、苹果酸 C、异柠檬酸 D、磷酸甘油 17．下列呼吸链组分中氧化还原电位最高的是： A、FMN B、Cytb C、Cytc D、Cytc1 18．A TP含有几个高能键：
植物生理学模块实验指导 玲主编 科学 还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法） 【实验目的】 了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。 【实验原理】 谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。 【器材与试剂】 1.实验仪器与用具 研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计 2.实验试剂 50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/L Na 2 -EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶 解稀释至100ml。再称取186mg Na 2-EDTA·2H 2 O，加入到100ml 50g/L三氯乙酸溶液中溶解。 0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制方法见附录。 0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录。 4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液：称取15.8mg DTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存。现用现配。
动物医学进展,2008,29(10):53-56 Pr ogress in Veterinary Medicine 文献综述 谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶研究进展* 马森 (武夷学院化学系福建省高校绿色化工技术重点实验室,福建武夷354300) 摘要:谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽转硫酶(GST)是一对抗氧化酶。GSH-Px为含硒半胱氨酸,至少有4种同工酶,催化还原H2O2和有机氢过氧化物。GST不含硒,有多种同工酶,不能分解H2O2,但具有清除过氧化物和解毒的双重功能。二者广泛存在于组织细胞、红细胞、血浆和乳中,与细胞损伤、缺氧、中毒、衰老、多种疾病的发生有关;GSH-Px活性也与机体硒水平密切相关。文章综述了GSH-Px 和GST的分类与结构、性质、作用、检测原理、动物临床方面的应用及研究进展。 关键词:谷胱甘肽过氧化物酶;谷胱甘肽转硫酶;研究进展 中图分类号:Q554.6文献标识码:A文章编号:1007-5038(2008)10-0053-04 谷胱甘肽过氧化物酶(g lutathione pero xidase, GSH-Px)于1957年由M ills从牛红细胞中发现,分子结构中含硒,故又名硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GSH-Px),是体内清除H2O2和许多有机氢过氧化物的重要酶。1976年,Law rence等发现组织中还存在一种不含硒的GSH-Px,命名为谷胱甘肽转硫酶或不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(g lutathio ne-S-tr ansferase,GST或on-Se-GSH-Px),在体内具有清除过氧化物及解毒的双重功能。文章对GSH-Px和GST的分类与结构、性质、作用、检测原理、动物临床方面的应用及研究进展进行了阐述。 1分类与结构 从人和动物组织或细胞中提纯的GSH-Px,分子质量为76ku~95ku,为水溶性四聚体蛋白,4个亚基相同或极为类似,每个亚基有1个硒原子。目前发现GSH-Px至少有4种同工酶,其在机体中的分布、亚基结构、一级序列和酶学特点上有显著不同。第1种为细胞谷胱甘肽过氧化物酶(cGPx),主要分布在组织细胞的细胞区、线粒体和红细胞中,催化还原H2O2和有机氢过氧化物,对各类氢过氧化物都有较好的催化作用。第2种为磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶(PH GPX),主要分布在各种组织细胞外的细胞液内,部分分布在细胞膜上,主要还原磷脂过氧化氢、脂肪酸过氧化氢和甾体过氧化氢, PH GPX是必需的生物膜组成成分,可阻止生物膜非专一性的磷脂过氧化。第3种为血浆谷胱甘肽过氧化物酶(pGPx),主要分布在血液中,既能还原磷脂氢过氧化物又能还原H2O2。第4种为消化系统谷胱甘肽过氧化物酶(GIGPX),高表达于胃肠道黏膜上皮细胞。牛红细胞GSH-Px有178个氨基酸,第35位是1个硒半胱氨酸。在其亚基结构中有4处A-螺旋和4处B-折叠。整个酶分子中,4个亚基处在一个平面,具有催化活性的硒半胱氨酸位于酶分子表面凹穴的活性部位,易于接触有机氢过氧化物等底物。后者虽然不溶于水,但由于活性基团周围存在一些疏水性芳香环氨基酸残基,形成脂溶性底物可进入的疏水区域,可以与硒半胱氨酸反应,从而使GSH-Px显示很高的反应性。GST是分子质量40ku~50ku的二聚体蛋白质,随着亚基的不同组合而有多种同工酶,如哺乳动物的GST分为A, L,P,H,R等5类水溶性GST,另外还有一类是脂溶性的微粒体同工酶。随着对GST的深入研究,新GST种类不断被发现。已确定了上述5种主要的酶家族中至少一个成员的三维结构,这些结构都具有包括两个结构域的基本蛋白质折叠。大鼠肝胞浆GST是由Ya、Yb、Yc3种不同亚基组合成的YaYa、YcYc、YaYc、YbYb等同工酶,亚基的分子质量为22.5ku~25ku;大鼠肝微粒体GST的亚基分子质量却为14ku;不同来源的GST中氨基酸组成可能有差异,分子质量常不一致[1-5]。 *收稿日期:2008-05-04 基金项目:福建省教育厅/乳谷胱甘肽过氧化物酶研究0项目(JB03266) 作者简介:马森(1947-),男,青海西宁人,教授,主要从事动物生理生化研究。
谷胱甘肽（glutathione） 谷胱甘肽(glfftathione)是由Hopkins发现并命名，1929年Hopkins及Kendall等各自独立的发现其为含有甘氨酸的三肽。谷胱甘肽化学名为：N-(N-L-r-Glutamyl-L-cysteninyl)glycine，即N(N-L-r-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸。谷胱甘肽可分为还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidizided glutathione，GSSG)。通常所说的谷胱甘肽是指还原型谷胱甘肽，是由r一谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的三肽。谷胱甘肽是机体内的重要活性物质，它具有清除自由基、解毒、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。 1 GSH的理化特性 谷胱甘肽分子量为307．33，熔点189～193℃(分解)，晶体是无色透明细长柱状(板状)，等电点(PI)为5.93，成品见光易分解，易氧化，谷胱甘肽分子中有一特殊的6-肽键，即由谷氨酸的6-COOH与半胱氨酸的a-NH：缩合而成，这样的肽键与蛋白质分子中的一个氨基酸中Q-COOH和另一个氨基酸中α-NH2失水缩合而成的肽键显然不同。由于谷胱甘肽中含有一个活泼的巯基极易被氧化，2分子还原型谷胱甘肽(简称GSH)，脱氢以二硫键-S-S-)相连便成为氧化型的谷胱甘肽(简称GSSG)，所以谷胱甘肽可分为氧化型和还原型两大类，在生物体中起重要功能作用的是还原型谷胱甘肽。 2 GSH在自然界中的分布 谷胱甘肽广泛分布于自然界的生物体中(Wierzbicka等，1989)，主要存在于酵母、动物肝脏、肌肉、血液中，许多植物，如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类及细菌中也含有一定量的谷胱甘肽。在动物细胞中还原型谷胱甘肽水平达5mmol／L，而氧化型仅为0．1mmol／L，细胞内高水平的GSH对动物机体维持正常机能是十分重要的。据测定，谷胱甘肽在未加工的肉中含量是50～200mg／kg，在新鲜水果和蔬菜中的含量是50～150mg／kg，干燥酵母中含有约．15％的谷胱甘肽，在乳制品、谷物和熟食品中含量较低。 3 GSH的代谢过程 谷胱甘肽在体内的代谢过程现已基本清楚。进入血液循环的GSH可被一些组织直接吸收入细胞，也可被组织细胞膜上的r-谷氨酰转肽酶(rGT)降解为r-谷氨酰氨基酸(氨基酸来自细胞外液中的游离氨基酸)和半胱氨酰甘氨酸，而后被二肽酶降解为半胱氨酸和甘氨酸或以二肽的形式转运到细胞内后再被降解为半胱氨酸和甘氨酸。大多数哺乳动物的肾、肝脏、小肠、肺组织中有较高的r-GT和二肽酶活性，它们是清除循环系统中GSH的主要器官。在细胞内，GSH的组成氨基酸在r-谷氨酰环化转移酶、r-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶催化下生成谷胱甘肽。GSH的合成通过其自身对r-谷氨酰半胱氨酸合成酶的反馈抑制来调控。肝脏是体内合成GSH的主要场所。细胞内的谷胱甘肽在谷胱甘肽硫转移酶(GST)的催化下，可与细胞内外产生的活性亲电子基、有机氢过氧化物(x)结合成GSH-S-复合物，经一系列反应生成N-乙酰-Cys-(x)后运出细胞而排出体外。GSH清除细胞内自由基、过氧化物、ROOH的同时，2分子的GSH转变为GSSG，GSSG在谷胱甘肽还原酶(GR)作用下由NADPH供氢还原为GSH。上述反应形成r-谷氨酰循环。由于猪肾脏中的r-GT与肝脏中的r_GT活力比较低，因此对于猪，肝脏和胆管分支在GSH周转中起重要作用。 4 GSH的生物学功能 谷胱甘肽的生理功能十分广泛，其主要功能有：(1)清除自由基、过氧化物、重金属及黄曲霉毒素等毒物；(2)参与氨基酸(谷氨酰氨、半胱氨酸及其它中性氨基酸)的转运；(3)利于铁的吸收、硒的吸收、钙的吸收，谷胱甘肽还可以使饲料中的过氧化脂肪酸在吸收时或吸收后恢复为正常的脂肪；(4)保护胃肠道黏膜上皮，防止因炎症、局部缺血、氧化物质等对肠黏膜的损伤；(5)贮存并提供其组成氨基酸(1尤其是半胱氧酸)；(6)参与蛋白质和DNA的合成;(7)作为还原物质，利于维生素E、维生素c的还原，维持巯基酶活性，并可作为甘油醛磷酸脱
谷胱甘肽过氧化物酶 开放分类：医学植物生理学 ?目录 ?图片 ?讨论 ?知识魔块 分享完善词条 谷胱甘肽过氧化物酶 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。硒是GSH-Px酶系的组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。NADPH的减少量则和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。GSH-Px主要包括4种：分别为胞浆GSH-Px、血浆GSH-Px、磷脂氢过氧化物GSH-Px及胃肠道专属性GSH-Px。 编辑摘要 谷胱甘肽过氧化物酶- 简介
谷胱甘肽过氧化物酶 GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2 O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。 谷胱甘肽过氧化物酶可以催化GSH产生GSSG，而谷胱甘肽还原酶可以利用NADPH催化GSSG产生GSH，通过检测NADPH的减少量就可以计算出谷胱甘肽过氧化物酶的活力水平。在上述反应中谷胱甘肽过氧化物酶是整个反应体系的限速步骤，因此NADPH的减少量和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。 谷胱甘肽过氧化物酶- GSH-Px酶系 主要包括4种不同的GSH-Px，分别为胞浆GSH-Px、血浆GSH-Px、 胞浆GSH-Px
由4个相同的分子量大小为22kDa的亚基构成四聚体，每个亚基含有1个分子硒半胱氨酸，广泛存在于机体内各个组织，以肝脏红细胞为最多。它的生理功能主要是催化GSH参与过氧化反应，清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用。 血浆GSH-Px 构成与胞浆GSH-Px相同，主要分布于血浆中，其功能目前还不是很清楚，但已经证实与清除细胞外的过氧化氢和参与GSH的运输有关。 磷脂过氧化氢GSH-Px 是分子量为20kDa的单体，含有1个分子硒半胱氨酸。最初从猪的心脏和肝脏中分离得到，主要存在于睾丸中，其它组织中也有少量分布。其生物学功能是可抑制膜磷脂过氧化。 胃肠道专属性GSH-Px 是由4个分子量为22kDa的亚基构成的四聚体，只存在于啮齿类动物的胃肠道中，其功能是保护动物免受摄入脂质过氧化物的损害。谷胱甘肽过氧化物酶- 正常值 (1)酶速率法(37℃)：2.96～83U/g?Hb
氧化还原酶的实验方法 1 （1）方法与原理 在空气存在的情况下，多酚氧化酶能酶促一元酚、二元酚或三元酚氧化成醌。以邻苯二 酚氧化成相应的二醌为例， CH(OH)+1/2O?CHO+HO 64226422 (2) 试剂配制 1%邻苯三酚溶液，乙醚，0.5N盐酸，重铬酸钾标准溶液（0.75gKCrO溶于 1L0.5N HCl），227pH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液 标准曲线绘制：取重铬酸钾标准溶液，用0.5N盐酸稀释成各种不同浓度。定容后，在 分光光度计上于430nm处比色测定。以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。 （3）操作步骤 取1g鲜土（过2mm筛），置于50ml三角瓶中，然后注入10ml1%邻苯三酚溶液，摇荡后放在30。C恒温箱中培养2h。(为了减少误差，建议以下操作在冰盘上进行)取出后加4mlpH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力振荡数次，萃取30min。最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。比色时用波长为430nm的滤光片，为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色液槽一次。 为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正没食子酚的纯度，需设无基
质的土壤和无土壤的基质作对照。在无基质的土壤对照中，用水代替基质进行培养。 （4）活性表示 紫色没食子素的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。 多酚氧化酶活性，以2h后1g土壤中紫色没食子素的毫克数表示。 2. （1）方法与原理 在空气存在的情况下，多酚氧化酶能酶促一元酚、二元酚或三元酚氧化成醌。以邻苯二 酚氧化成相应的二醌为例， CH(OH)+1/2O?CHO+HO 64226422 (2) 试剂配制 1%邻苯三酚溶液，乙醚，0.5N盐酸，重铬酸钾标准溶液（0.75gKCrO溶于 1L0.5N HCl），227pH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液 0.5%过氧化氢 标准曲线绘制：取重铬酸钾标准溶液，用0.5N盐酸稀释成各种不同浓度。定容后， 在分光光度计上于430nm处比色测定。以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。 （3）操作步骤。C恒温箱中培养2h。(为了减少误差，建议以下操作在冰盘上进 取1g鲜土（过2mm筛），置于50ml三角瓶中，然后注入10ml1%邻苯三酚溶液和2ml 0.5%行)取出后加4mlpH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力振荡数次，萃取30min。
第三节电子传递与氧化磷酸化 三羧酸循环等呼吸代谢过程中脱下的氢被NAD+或FAD所接受。细胞内的辅酶或辅基数量是有限的，它们必须将氢交给其它受体之后，才能再次接受氢。在需氧生物中，氧气便是这些氢的最终受体。这种有机物在生物活细胞中所进行的一系列传递氢和电子的氧化还原过程，称为生物氧化(biological oxidation)。生物氧化与非生物氧化的化学本质是相同的，都是脱氢、失去电子或与氧直接化合，并产生能量。然而生物氧化与非生物氧化不同，它是在生活细胞内，在常温、常压、接近中性的pH和有水的环境下，在一系列的酶以及中间传递体的共同作用下逐步地完成的，而且能量是逐步释放的。生物氧化过程中释放的能量可被偶联的磷酸化反应所利用，贮存在高能磷酸化合物（如ATP、GTP等）中，以满足需能生理过程的需要。 线粒体中氧化磷酸化反应的一般机理 一、呼吸链的概念和组成 所谓呼吸链(respiratory chain)即呼吸电子传递链(electron transport chain)，是线粒体内膜上由呼吸传递体组成的电子传递总轨道。呼吸链传递体能把代谢物脱下的电子有序地传递给氧，呼吸传递体有两大类：氢传递体与电子传递体。氢传递体包括一些脱氢酶的辅助因子，主要有NAD+、FMN、FAD、UQ等。它们既传递电子，也传递质子；电子传递体包括细胞色素系统和某些黄素蛋白、铁硫蛋白。呼吸
链传递体传递电子的顺序是：代谢物→NAD+→FAD→UQ→细胞色素系统→O2。 呼吸链中五种酶复合体(enzyme complex)的组成结构和功能简要介绍如下(图5-11，5-12)。 图 5-11 植物线粒体内膜上的复合体及其电子传递 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分别代表复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ； UQ库代表存在于线粒体中的泛醌库 1.复合体Ⅰ 又称NADH∶泛醌氧化还原酶(NADH∶ubiquinone oxidoreductase)。分子量700X103～900X103,含有25种不同的蛋白质,包括以黄素单核苷酸(flav in mononucleotide,FMN)为辅基的黄素蛋白和多种铁硫蛋白，如水溶性的铁硫蛋白(iron sulfur protein,IP)、铁硫黄素蛋白(iron sulfur flavoprotein，FP)、泛醌(ubiquinone,UQ)、磷脂(phospholipid)。复合体Ⅰ的功能在于催化位于线粒体基质中由TCA循环产生的NADH＋H+中的2个H+经FMN转运到膜间空间，同时再经过Fe-S将2个电子传递到UQ(又称辅酶Q,CoQ)；UQ再与基质中的H+结合，生成还原型泛醌(ubiquinol,UQH2)。该酶的作用可为鱼藤酮(rotenone)、杀粉蝶菌素A(piericidin A)、巴比妥酸(barbital acid)所抑制。它们都作用于同一区域，都能抑制Fe-S簇的氧化和泛醌的还原。
总谷胱甘肽(T-GSH)检测试剂盒(DTNB 速率比色法) 简介： 谷胱甘肽(glutathione ，GSH)存在于几乎身体的每一个细胞，参与细胞许多功能活动，是一种氧自由基消除剂。还原型谷胱甘肽(GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，能可逆的转变为氧化型谷胱甘肽(GSSG)，其存在形式会随着细胞内代谢的情况而发生相互转变。 总谷胱甘肽(T-GSH)检测试剂盒(DTNB 速率微板法)(T otal Glutathione Assay Kit)是一种简单易行的检测总谷胱甘肽(T-GSH)的试剂盒，其检测原理是谷胱甘肽还原酶把氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成还原型谷胱甘肽(GSH)，由GSSG 还原成的GSH 和样品本身含有的GSH 都与发色底物DTNB 反应，生成黄色的TNB 和GSSG 。该试剂盒可用于检测血浆、血清、组织、细胞等样品中总谷胱甘肽(T-GSH)含量。该试剂盒仅用于科研，不用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制GSH 标准储存液：取10mg 还原型谷胱甘肽(GSH)标准加入3.25ml ddH 2O ，溶 解并混匀，即为还原型GSH 标准储存液(10mM)。一部分立即使用，其余适当分装后-20℃保存。 2、 配制50×GSH 还原酶：按GSH 还原酶原液：GSH assay buffer =1:49的比例混合， 即为50×GSH 还原酶。-20℃保存，3个月有效。 3、 配制T-GSH 检测工作液：按下表配制T-GSH 检测工作液。 1个样品 10个样品 50个样品 GSH assay buffer 1.6ml 16ml 80ml DTNB 储存液 5μl 50μl 250μl 编号 名称 TO1049 100T Storage 试剂(A): 还原型谷胱甘肽(GSH)标准 10mg 4℃ 避光 试剂(B): GSH assay buffer 250ml RT 试剂(D): 蛋白沉淀剂 4g RT 避光 试剂(E): NADPH 10mg -20℃ 避光 试剂(F): DMSO 1.5ml RT 避光 试剂(G): ddH 2O 50ml RT 避光 使用说明书 1份