血清药理学方法观察复方斑蝥胶囊对人肝癌细胞ＳＭＭＣ一７７２１增殖的影响
杨军”，丁敏”，张太君２，郭渝３，宋自阆３，曹永艳１（１．重庆市临床检验诊断学重点实验室，重庆市４０００１６；２．重庆希尔安药业有限公司，重庆市４０１５２０；３．四川省自贡市第四人民医院，自贡市６４３０００）
中图分类号
Ｒ９６５
文献标识码
Ａ
文章编号１００１—０４０８（２００５）０４
０２６２０３
摘要ｇｌ的：研究复方宽蝥胶囊含药动物血清对人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１增殖的影响。方法：采用血清药理学方法，对兔灌胃
给予不同剂量（临床等效剂量、２倍临床等效剂量和３倍临床等效剂量）的复方斑蝥胶囊混悬液，应用ＭＴＴ比色法观察含药血清对
人肝癌细胞ｓＭＭｃ７７２１增殖的抑制作用，同时观察临床等效剂量组各采血时间点的抑制作用。结果：３个剂量组的含药血清对
ＳＭＭＣ
７７２１细胞增殖均有抑制作用（Ｐ＜００１），其中以３倍临床等效剂量组含药血清的抑制率最高；临床等效剂量组各采血时
间点的含药血清对ＳＭＭＣ
７７２１细胞增殖均有抑制作用（Ｐ＜０．０５），其中３ｈ时舍药血清的抑制率最高。结论：复方斑蝥胶囊含药
动物血清对人肝癌细胞ｓＭＭＣ
７７２１增殖具有一定的抑制作用，并具有剂量依赖性。
关键词复方斑蝥胶囊；人肝癌细胞ｓＭＭＣ一７７２１；血清药理学
Ｓｅｒｕｍ—?ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＳｔｕｄｙｏｆＣｏｍｐｏｕｎｄＢａｎｍａｏＣａｐｓｕｌｅ
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Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ
ＳＭＭＣ—。７７２１ｉｎＨｕｍａｎ
ＨｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒＣａｒｃｉｎｏｍａＣｅｌｌｓ
ＹＡＮＧＪｕｎ，ＤＩＮＧＭｉｎ，ＣＡＯＹ。ｎｇｙａｎ（ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＤｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００１６，
Ｃｈｉｎａ）
ＺＨＡＮＧ
Ｔａ巧ｕｎ（Ｃｈ。ｎｇｑｉｎｇＨｉｌ’ＡｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣＯ．Ｌｔｄ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０１５２０，Ｃｈｉｎａ）
ＧＵＯＹｕ．ＳＯＮＧＺｉｌａｎｇ（Ｎｏ．４Ｐｅｏｐｌｅ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＺｉｇｏｎｇ，Ｚｉｇｏｎｇ６４３０００，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｓｅｒｕｍｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆＣｏｍｐｏｕｎｄＢａｎｍａｏＣａｐｓｕｌｅ（ＦＢＣ）ｏｎｐｒｏｌｉｆ－
ｅｒａｔｉｏｎｏｆＳＭＭＣ７７２１ｃｅｌｌｓｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＭＥＴＨｏＤＳ：ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＦＢＣｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｉｎｖｉｔｒｏｕｓｉｎｇ
ｓｅｒｕｍｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｓｅｓ（ｃｌｉｎｉｃｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｄｏｓａｇｅ，ｄｕｐｌａｔｉｏｎａｎｄｔｒｉｐｌｉｃｉｔｙ）ｏｆＦＢＣｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
ｗｅｒｅｉｒｒｉｇａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｒａｂｂｉｔｓｔｏｍａｅｈｓ．ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｖｅｆｆｅｃｔｓｏｆＦＢＣｓｅｒｕｍｏｎＳＭＭＣ
７７２１ｃｅｌｌｓｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙ．Ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｖｅｆｆｅｃｔｓ
ａｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇｈｏｕｒｓｉｎｔｈｅｃｌｉｎｉｅａＩｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｇｒｏｕｐｗｅｒｅａｌｓｏｏｂｓｅｒｖｅｄＲＥＳＵＬ』、ＳＡｌｌｏｆ
ｔｈｅｄｒｕｇｓｅｒｕｍｓｉｎｔｈｅｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｓｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＳＭＭＣ一７７２１ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０１）．ｗｉｔｈｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｒａｔｅｉｎｔｒｉｐｌｅｄｏｓａｇｅｇｒｏｕｐ；ａｌｌｏｆｔｈｅｄｒｕｇｓｅｒｕｍｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｉｎｃｌｉｎｉｃｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｄｏｓａｇｅｇｒｏｕｐｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒ－
ａｔｉｏｎ
ｏｆＳＮＭＣ７７２１
ａｌｌｓ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｒａｔｅｗａｓａｔ３ｒｄｈｏｕｒ．ＣＯＮＣＬＵＳＩｏＮ：Ｔｈｅｄｒｕｇｓｅｒｕｍｃｏｕｌｄ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＳＭＭＣ一７７２１ｃｅｌｌｓｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ．ＫＥＹＷｏＲＤＳＣｏｍｐｏｕｎｄＢａｎｍａｏＣａｐｓｕｌｅ：ＳＭＭＣ一７７２１ｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ；Ｓｅｒｕｍ
ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＾，?“ｐ?＾?＾?＾?，日，?¨＿■－＾?日，?Ｈ，＿ｕ－～ｖ＾●＾，＿ｖｕ＿、－＾●‘，●…
的脂质体小球。这在其他文献中也有记载“】。在操作中，笔者还发现，旋转蒸发温度在４６℃耗时较长。综合以上因素，最后确
定工艺条件为ｄｌｃ。ｂ…ａ即氯仿量２０ｍｌ、旋转蒸发温度４８Ｃ、超
声时间１０ｒａｉｎ、进行二次超声。
按优选工艺制备脂质体，同法检测包封率结果为４７．２５％，脂质体数量多，粒度分布均匀，粒径范围为２５０ｎｍ－－７５０ｎｍ。证明优选工艺稳定可行，条件易控制，操作简便。
３讨论
苦参碱易溶于水，而逆相蒸发法适用于水溶性药物且对水溶性药物包封率较高，故笔者确定采用逆相蒸发法制备脂质体。试验中选用氯仿作为溶剂，但因其密度较大，与水相超声混匀后在旋转蒸发的过程中脂质体不能很好地分散于水相中。为了解决这个问题．笔者在试验最后再进行短时超声，发现可将脂质体很好地分散于水相之中。因此，脂质体的制备采用二次
★主管药师。研究方向：生化检验。电话：０８１３
２２１１８６７
＃通讯作者。副教授。研究方向：生物分析化学。电话：０２３
６８４８５６８８
２６２‘
ＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｙ
２００５Ｖｏｌ１６Ｎｏ４
超声。
由于大部分生物碱在碱性条件下不稳定６１，故笔者选择弱
酸性和中性磷酸盐缓冲液作为水相，即ｐＨ分别为６．５、６．８和７．０，以提高苦参碱的稳定性。
参考文献
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（收稿日期：２００４０９
１５修回日期：２００４—１０—２５）
中国药房２００５年第１６卷第４期
万方数据
复方斑蝥胶囊（ＦＢＣ）的主要成分有斑蝥、熊胆粉、人参等，临床上主要用于治疗癌症，尤其是对原发性肝癌，显示了较好的疗效“】。该药杀灭肝癌细胞的机制在国内、外还未见相关报道，为此，笔者采用血清药理学方法观察家兔灌胃给予复方斑蝥胶囊后其含药血清对人肝癌细胞ＳＭＭＣ一７７２１增殖的影响，以为复方斑蝥胶囊治疗肝癌提供实验依据。
１材料与方法
１．１动物与试药
新西兰大耳白兔１５只，体重（２５±０．２）ｋｇ，旱含不限，由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：ＳＣＸＫ（渝）２００２０００１。
噻唑蓝（ＭＴＴ）、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）（美国Ａｍｒｅｓｃｏ公司）；ＲＰＭｌｌ６４０培养基、胰蛋白酶（美国Ｇ１ＢＣＯ公司）；ＦＢＣ（重庆希尔安药业有限公司提供，批号：０３０４０１０５４０８）。
１．２细胞
人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１由重庆医科大学基础医学院病理生理教研室惠赠。处理方法：将细胞株培养于含１０％胎牛血清的ＲＰＭｌｌ６４０培养液中，置于３７℃培养箱中，在５％ＣＯｚ、饱和湿度条件下培养，２ｄ－－３ｄ后以０．１％胰酶消化传代。
１．３最佳采血时间点的确定
取兔３只，体重（２．５±０．１）ｋｇ，旱舍不限。以ＦＢＣ内容物临床等效剂量加入磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）制成混悬液后灌胃给药，１次／ｄ，连续３ｄ，末次给药后１、２、３、４、５ｈ自耳缘静脉采血，分离血清，５６℃灭活３０ｍｉｎ，０．２２“ｍ滤膜过滤，除菌，２０Ｅ保存，备用。对照血清于给药前采血制备，方法同含药血清。将各兔相应时间点含药血清等量混合。以各采血时间点的含药血清进行ＭＴＴ试验，以确定最佳采血时间点。
１．４分组及中药悬液制备
将兔分为临床等效剂量组（ｎ一６）、２倍临床等效剂量组（ｎ＝３）和３倍临床等效剂量组（ｎ一３）。临床等效剂量组的给药剂量＝临床用量×等效剂量系数（按体表面积计算）×培养体系血清稀释度”１。动物体表面积和体重之间的关系通用公式：ｌｇＳ一０．８７６２＋０．６９８ｌｇＷ，式中Ｓ为体表面积（ｃｍ），Ｗ为体重（ｇ），人标准体重按７０ｋｇ计算。１。复方斑蝥胶囊的临床用量为１５００ｍｇ／ｄ，等效剂量系数＝Ｓ∥ｓ＾，培养体系血清稀释度为１０。以适量ＰＢＳ将ＦＢＣ内容物制成混悬液。其它剂量组按相应倍数加倍。
将上述３组兔灌胃给予相应药物后（１次／ｄ，连续３ｄ），于末次给药后３ｈ自耳静脉取血，分离血清，制作含药兔血清；将给药前的兔（ｎ一３）以同样方法分离血清作为对照兔血清组。另制备空白对照组（不加细胞，只加培养液）和细胞对照组（不加兔血清，作为各处理组各浓度水平的共同对照）。
１．５ＭＴＴ试验
取对数生长期人肝癌细胞ＳＭＭＣ一７７２１，消化，以ＰＢＳ洗涤２次，离心，弃去上清液，用含１０％胎牛血清的ＲＰＭｌｌ６４０培养液配成浓度为１．５×１０４个／ｍｌ的细胞悬液。将此细胞悬液接种于９６孔板，每孔接种１８０ｕｔ，培养２４ｈ后加入相应对照兔血清或含药兔血清２吼ｌ，细胞对照组加入２０９１ＰＢＳ，每孔设８个复孔。继续培养４８ｈ后小心吸出培养液，换以１８雌ｌ不含胎牛血清的ＲＰＭｌｌ６４０培养液和２０ｐ．ＩＭＴＴ，置于５％Ｃ０２、３７℃培养箱中继续培养４ｈ，吸去培养液，加入２０阻ｌＤＭＳＯ，振荡１０ｍｉｎ，使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定吸光度值
中国药房２００５年第１６卷第４期
（Ａ），测定波长为５７０ｎｍ。
抑制率＝（对照血清组Ａ值一实验血清组Ａ值）／对照血清组Ａ值。
１．６剂量一反应曲线
取兔１２只，体重（２．５±０．１）ｋｇ，旱舌不限，分为临床等效剂量组、２倍临床等效剂量组、３倍临床等效剂量组和对照组，每组３只。各组以相应剂量ＦＢＣ内容物悬液对兔灌胃给药，１次／ｄ，连续３ｄ，于末次给药后最佳采血时间点采血，分离血清，５６℃灭活３０ｍｉｎ，０２２“ｍ滤膜过滤，除菌，－－２０℃保存，备用。对照组除以等体积ＰＢＳ灌胃外，其余操作均同含药组。将各组内３只兔的血清等量混合，进行ＭＴＴ试验，绘制剂量一反应曲线。
１．７统计学方法
结果以ｉ±ｓ表示，并进行方差分析和ＳＮＫ（Ｓｔｕｄｅｎｔ—ＮｅｗｍａｎＫｅｕｌｓ）检验。
２结果
２．１不同采血时间点血清ＭＴＴ试验结果
以临床等效剂量组不同采血时间点含药血清进行ＭＴＴ试验，结果洋见表１和图１。
表１不同采血时间点ＭＴＴ试验结果（Ａ，ｉ±ｓ）
Ｔａｂ１ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＭＴＴａｓｓａｙｗｉｔｈｄｒｕｇｓｅｒａｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｏｕｒｓ（Ａ。ｉ±ｓ）
自ｎ≈月‰目月ｍ镕ｍ———ｉ——————ｉ———！１８１｝８２２４——ｉｉ————丁
Ｉ１３Ｌ＋（Ｉ魄１１３５±００８６‘０．９５０＿＋０１硝０，９１５ｉ０。９５‘０８２０±０１００“０晰±００７２＊Ｉ１０９±００９８’与细胞对照组比较：Ａｐ＞００５；与对照血清组比较：女Ｐ＜０Ｏｌ，＃Ｐ＜０．０５；与５ｈ时间点比较：ＡＰ＜００５
Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ：Ａｐ＞０．０５；ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒａｂｂｉｔｓｅｒｕｍｇｒｏｕｐ：－ｈ－Ｐ＜００１，＃Ｐ＜００５；ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｅｒｕｍａｔ５ｈｒ：ＡＰ＜００５
抑制率（％）
１２３４５ｈ
图１不同采血时间点对人肝癌ＳＭＭＣ一７７２１细胞增殖的抑
制率曲线
Ｆｉｇ１Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｒａｔｅｃｕｒｖｅｓｏｎ
ＳＭＭＣ一７７２１ｃｅｌｌｓｐｒｏ－ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｄｒｕｇｓｓｅｒａｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｏｕｒｓｉｎ
ｃｌｉｎｉｃａｌｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｄｏｓｅｇｒｏｕｐ
由表１可见，对照血清组与细胞对照组比较，吸光度无显著性差异（Ｐ＞Ｏ．０５），说明未含药的对照血清对人肝癌ＳＭＭＣ
７７２１细胞增殖无抑制作用。
由图１可见，各取血时间点的含药血清对ＳＭＭＣ７７２１细胞增殖均有抑制作用。５ｈ时吸光度与对照组吸光度比较具有显著性差异（Ｐ＜００５），其余各时间点吸光度与对照组吸光度比较具有极显著性差异（Ｐ＜００１）；３ｈ时间点的吸光度与５ｈ时间点的吸光度比较具有显著性差异（Ｐ＜００５）；其它各时间点之间两两比较无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。ｌｈ－－５ｈ时间点含药血清对ＳＭＭＣ７７２１细胞增殖抑制率由低到高再到低，在３ｈ处达到峰值，因此最佳采血时间点确定为给药后３ｈ。
ＣｈｉｎａＰｈａｍｌａｃｙ２００５Ｖｏｌ１６Ｎｏ４。２６３
万方数据
２．２不同剂量组血清ＭＴＴ试验结果
以各剂量组含药血清进行ＭＴＴ试验，结果详见表２和图２。
表２不同剂量组ＭＴＴ试验结果（Ａ。ｉ±ｓ）
Ｔａｂ２ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＭＴＴａｓｓａｙｗｉｔｈｄｒｕｇｓｅｒａｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｄｏｓｅｇｒｏｕｐｓ（Ａ．Ｆ±ｓ】
细胞对照组对照血清组ＦＢｃ等效剂量组ＦＢＣ２倍等效剂量组ＦＥ描等效剂量组１１１６±００８２１１３２±００６８‘０８００±００８０’０７３５±００５矿０６５８±０１３５Ⅵ
与细胞对照组比较：Ａｐ＞００５；与对照血清组比较：★Ｐ＜０．０１；与等效剂量组比较：ＡＰ＜０．０１
ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ：▲Ｐ＞０．０５；ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒａｂｂｉｔｓｅｒｕｍｇｒｏｕｐ：女Ｐ＜０．０１：ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｇｒｏｕｐ：ＡＰ＜０．０ｌ
抑制率ｒ％）
ｌ２３ｈ
图２不同剂量组对人肝癌ＳＭＭＣ一７７２１细胞增殖的抑制率
曲线
Ｆｉｇ２ＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙｒａｔｅｃｕｒｖｅｓｏｎＳＭＭＣ一７７２１ｃｅｌｌｓ
ｐｒｏ－
ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｄｒｕｇｓｅｒａｃｏｌｌｅｃｔｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｓｅｇｒｏｕｐｓ由表２和图２可见，对照血清组与细胞对照组比较，吸光度无显著性差异（Ｐ＞０．０５），说明对照血清对ＳＭＭＣ７７２１细胞增殖无抑制作用。ＦＢＣ各剂量组血清对ＳＭＭＣ～７７２１细胞增殖均有抑制作用，吸光度与对照组比较有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。其中，３倍等效剂量组与等效剂量组比较，吸光度具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。提示含药血清对ＳＭＭＣ７７２１细胞增殖存在着剂量依赖性抑制作用。
３讨论
传统的中药药理体外实验是将未精制提取的中药或中药复方粗制剂直接加入离体反应体系（细胞培养、酶反应）中进行的，难以获得与体内药物作用相同的结果。日本学者“在２０世纪８０年代提出血清药理学的概念，即给动物灌服受试药物，在一定的时间里，取其血清进行实验。已有众多研究５。６裴明，采用血清药理学方法研究复方中药的药理作用具有一定的科学性和合理性。
血清药理学理想的采血时间应为血药浓度达到峰值左右的时间，这样能够避免因有效物质尚未吸收或代谢完全而造成
的假阴性结果。多数学者认为，不同研究中的最佳采血时间应
当通过实验来确定”１。笔者通过比较不同时间点的含药血清对ＳＭＭＣ一７７２１细胞抑制率的结果，确定以末次给药后３ｈ为最
佳采血时间点。
在应用血清药理学研究复方中药的药理作用过程中，由于
加入反应系统的血清需经稀释后使用，故应尽可能增大给药剂量。但给药剂量加倍后，血药浓度却不可能也增加相应倍数，因
为血药浓度与给药剂量并不成等比增加，同时还要受到灌胃药
物浓度和体积的限制剐。鉴于此，笔者在本研究中采用王力倩
等引提出的参考公式确定了给药剂量，并且在此基础上增加了
２个剂量组。结果表明，复方斑蝥胶囊含药血清对ＳＭＭＣ
７７２１细胞增殖存在剂量依赖性抑制作用。
通过实验，笔者确定了制备复方斑蝥胶囊含药血清的最佳
采血时间和给药剂量，为以后应用血清药理学的方法研究复方
斑蝥胶囊的分子药理学作用机制奠定了基础。
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药学进展，２０００，２４（２）：８９．
（收稿日期：２００４０７０９修回日期：２００４０９１７）
雾ｉ焦算药品市场监管工作重点敲定
本刊讯２００５年１月３１日，在昆明召开的２００５年全国药品市场监管工作会议传来消息，２００５年我国要针对药品流通中的薄弱环节、薄弱地区、薄弱领域，推动７个方面的工作，以促进全国药品市场的进一步规范。
这７个方面的工作包括：进一步推进和深化ＧＳＰ认证工作，探索和建立企业认证后的日常监管体系，促进流通领域改革和发展，推动集中配送、连锁经营；进一步开展农村药品“两网”建设工作，在巩固现阶段成果的基础上，狠抓“两网”的运行质量；避一步做好药品、医疗器械和保健食品广告审查监管工
２６４?ＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｙ２００５Ｖｏｌ１６Ｎｏ．４作，进一步规范广告审查行为，加强部门联动，建立治理违法广告的协作机制；进一步开展专项整治工作，与公安部等相关部门联合打击制售假劣药品、医疗器械违法犯罪活动，继续整顿和规范中药材专业市场，开展饮片生产经营秩序的专项整治，开展各类药品、医疗器械展示活动的专项整治工作；进一步推动药品安全信用分类管理工作，在实践中建立起省、市、县的三级信用运行体系；进一步推进流通领域药品分类管理工作；进一步加强市、县市场监管队伍建设，全面提高各级药品、医疗器械稽查人员的执法水平。
中国药房２００５年第１６卷第４期
万方数据
HuH-7 人肝癌细胞 Catalogue No.: C165 Product Format: a T25 flask Culture Properties：贴壁 Complete Growth Medium:89%H-DMEM+10%FBS+1%双抗 Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5% Application:Cells and cancer research NOTE: FOR RESEARCH USE ONLY. Components Operation steps for cell culture 1.吸走用于培养基，加入3-5mL PBS后轻轻晃动培养瓶润洗细胞； 2.吸干净PBS后加入1mL 0.25%胰酶-0.53mM EDTA，轻轻摇晃培养皿使胰酶 浸没细胞表面，培养瓶放37度培养箱消化； （细胞对于消化比较敏感，消化过度会严重影响细胞状态，导致细胞传代死亡漂浮或者传代后不长。细胞消化到细胞间隙变大但未脱落，可以轻轻吹下时即可终止，禁止消化到细胞完全漂浮。混匀细胞时尽量轻柔，不要吹出大量气泡。） 3.加入6-8ml完全培养基终止消化，轻轻吹下细胞混匀； 4.将混匀的细胞1000rpm（约150g）离心3min，弃上清，再用新鲜培养基 重悬37度培养箱继续培养； 传代比例: 不同细胞生长速度不一，具体传代比例视细胞生长速度而定，大部分细胞适用1:3-1:4传代，生长较慢的细胞可以1:2传代。 Cell cryopreservation 1.冻存液：92%完全培养基+8%DMSO（可以根据实验室条件自行选择） 2.降温步骤：4度10min，-20度2h，-80过夜后液氮保存。
［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０４３８－ ０５［收稿日期］ ２０１１－０４－ １６［基金项目］ 国家自然科学基金面上项目资助课题（ＮＳＦＣ ３０９７２９１４）；广东省科技计划项目资助课题（２００９Ｂ０６０７０００２４）；广东省自然科学基金面上项目资助课题（１０１５１００８９０１０００２０８ ）；中山大学高校基本科研业务费重大项目培育基金资助课题（１０ｙｋｊ ｃ０３）［作者简介］ 汪田甜（１９８３－） ，女，安徽省明光市人，医师，医学硕士，主要从事肝脏恶性肿瘤方面的研究。［通信作者］ 吴祥元（Ｔｅｌ：０２０－８５２５２２１７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｘｙ３０７＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ）肝癌相关成纤维细胞的培养和鉴定及其对肝癌细胞增殖的影响 汪田甜１，贾昌昌２，张 琪２，董 敏１，李 星１，陈冠中２，吴祥元１ （１．中山大学附属第三医院肿瘤内科，广东广州５１０６３０；２．中山大学附属第三医院肝移植中心，广东广州５１０６３０）［摘 要］ 目的：分离、培养及鉴定原代肝癌相关成纤维细胞（ ｈＣＡＦ），阐明其在肝癌发生发展中的作用。方法：采用酶消化法分离、纯化人ｈＣＡＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法鉴定其相关蛋白标记物的表达，流式细胞术检测肝癌细胞Ｈｅｐ ３Ｂ经ｈＣＡＦ上清处理后的增殖速度及细胞周期的变化，建立裸鼠移植瘤模型，观察ｈＣＡＦ对肝癌细胞生长的影响。结果：在肝癌组织标本中成功分离出ｈＣＡＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示ｈ ＣＡＦ特异性地高表达α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）。ＣＣＫ８细胞增殖检测试剂盒检测证实，经ｈＣＡＦ上清处理后的Ｈｅｐ ３Ｂ细胞增殖量为完全培养基处理４８ｈ细胞增殖量的１２６．０％、１２５．０％及１２０．５％，细胞增殖量差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５） 。流式细胞术结果显示，经ｈＣＡＦ上清处理后的Ｈｅｐ ３Ｂ细胞增殖速度及细胞周期中处于Ｓ期的细胞数目均高于完全培养基处理的Ｈｅｐ３Ｂ细胞（Ｐ＜０．０５）。ｈＣＡＦ与Ｈｅｐ ３Ｂ共同接种至裸鼠皮下的成瘤体积［（１．３４±０．５２）ｃｍ３］明显大于单独接种Ｈｅｐ ３Ｂ组［（０．５１±０．０９）ｃｍ３］，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论：ｈＣＡＦ可以明显促进肝癌细胞系Ｈｅｐ ３Ｂ的生长，其可能在肝癌生长过程中发挥重要作用。［关键词］ 癌相关成纤维细胞；肝细胞肿瘤；增殖；肿瘤微环境 ［中图分类号］ Ｒ３２２．４７ ［文献标志码］ Ａ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐ ａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐ ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ ｈｅｐ ａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓＷＡＮＧ Ｔｉａｎ－ｔｉａｎ１，ＪＩＡ Ｃｈａｎｇ－ｃｈａｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｑｉ ２，ＤＯＮＧ Ｍｉｎ１，ＬＩ Ｘｉｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｇｕａｎ－ｚｈｏｎｇ２，ＷＵ Ｘｉａｎｇ －ｙｕａｎ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇ ｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ，Ｇｕａｎｇ ｚｈｏｕ ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ，ｃｕｌｔｉｖａｔｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ｈＣＡＦ）ａｎｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｐ ｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙ ｈＣＡＦ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈＣＡＦ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ Ｈｅｐ３Ｂｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒｈＣＡＦ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈＣＡＦ ｏｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈｏｕｇｈ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｈＣＡＦ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄα－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（α－ＳＭＡ）ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｐ３Ｂｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈＣＡＦ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ．Ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｅｐ３Ｂｗｅｒｅ １２６．０％，１２５．０％ａｎｄ １２０．５％ｏｆ ｔｈｏｓｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐ ｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍｆｏｒ ４８ｈ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｓ ｐｈａｓｅ ｗｅｒｅ ｈｉｇ ｈｅｒ８３４第３８卷 第３期２０１２年５月吉 林 大 学 学 报 （医 学 版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３ Ｍａｙ ２０１２
2018年重庆市第一次感染性疾病血清学标志物 系列B室间质评活动小结 2018年重庆市第一次感染性疾病血清学标志物系列B室间质评活动共有219家实验室参加，本次有216家参评实验室按时回报了结果。请各实验室注意回报时间，不要迟报和漏报。 表1. 样本的预期结果 项目编号201811 201812 201813 201814 201815 抗HCV R(约2 NCU/ml) R (1 NCU/ml) N N R (约1 NCU/ml) 抗HIV R (约>4 NCU/ml) N R (约>4 NCU/ml) N R (约2 NCU/ml) 梅毒（非特异）N R(1:1/1:2/1:4) N N N 梅毒（特异）N R (约>24 mIU/ml) R (4 mIU/ml) R (12 mIU/ml) N 表2. 各项目的检测情况 项目样本编号总实验室数正确实验室数错误实验室数正确率% 错误率% 抗HCV 201811 213 212 1 99.5 0.5 201812 213 210 3 98.6 1.4 201813 213 211 2 99.1 0.9 201814 213 213 0 100 0 201815 212 207 5 97.6 2.4 抗HIV 201811 209 208 1 99.5 0.5 201812 209207 2 99 1 201813 209206 3 98.6 1.4 201814 209208 1 99.5 0.5 201815 209202 7 96.7 3.3 梅毒（非特异）201811 169 169 0 100 0 201812 173 170 3 98.3 1.7 201813 173171 2 98.8 1.2 201814 173 167 6 96.5 3.5 201815 169 169 0 100 0 梅毒 （非特异凝 集效价） 201812 162 151 11 93.2 6.8 梅毒（特异）201811 208 208 0 100 0 201812 208 208 0 100 0 201813 208 200 8 96.2 3.8
MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验 1.实验步骤： 1.1.调整淋巴细胞浓度： a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min； b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将 脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研 钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料 离心管； c)离心1500rpm, 5min； d)用Hank’s液洗2次； e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀 后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡； f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。（假定4个大方格内总数为N，则 该细胞悬液的浓度为n=105*N） 1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。以 100μl/孔加入96孔细胞培养板中。（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。不同品种的动物也有一定的不同。 1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防 止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。 1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。每过24小时需取 出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。 1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。 1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去 细胞培养液，纸巾吸干。加入DMSO，150ul/孔。充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解） 1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。
现代生物医学进展https://www.doczj.com/doc/283456171.html, Progress in Modern Biomedicine Vol.12NO.1JAN.2012 白藜芦醇对肝癌细胞增殖和凋亡影响及其机制* 戴维奇徐凌王锋卫巍沈杰黄银实杨丽娟何姗姗郭传勇△ （同济大学附属第十人民医院消化内科上海200072） 摘要目的：研究白藜芦醇（resveratrol ，Res ）对肝癌细胞LM3周期及凋亡的影响并探讨其可能的分子机制。方法：分别用50、 100、150、200μmol/L 浓度的Res 作用LM3肝癌细胞24、48和72h ，CCK-8测定Res 对细胞的增殖作用；分别以相同剂量的DMSO 及 无处理的LM3细胞为随机和空白对照，观察150μmol/L Res 作用72小时后对肿瘤细胞周期及凋亡的影响； Real time-PCR 及Western blot 分析Res 对LM3细胞中Bak 和Bcl-2mRNA 及蛋白表达的影响。结果： Res 体外能明显抑制肝癌细胞LM3的生长增殖，在一定范围内呈现作用浓度（F=101.183，P ＜0.001）和时间依赖性（F=192.371，P ＜0.001）； 150μmol/L Res 作用72小时后能显著减缓肝癌细胞LM3的周期转换（P ＜0.001），并诱导明显的细胞凋亡效应（P ＜0.001）；进一步的检测发现Res 作用LM3细胞后，Bak mRNA （P=0.002，0.007）及蛋白（P =0.004，0.01）表达增强，而Bcl-2mRNA （P=0.027，0.007）及蛋白（P =0.001，0.001）表达 出现显著下降。结论：Res 可能通过对Bak 及Bcl-2表达的调节来抑制肝癌细胞LM3的增殖，并诱导其细胞凋亡。 关键词：肿瘤；周期； Bcl-2；Bak 中图分类号：R735.7，R285.6文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2012） 01-16-04Effects of Resveratrol on Cell Cycle and Apoptosis of Hepatocellular Carcinoma Cells and its Possible Mechanism* DAI Wei-qi,XU Ling,WANG Feng,WEI Wei,SHEN Jie,HUANG Yin-shi,YANG Li-juan,HE Shan-shan,GUO Chuan-yong △ （Tong Ji University,Department of Gastroenterology,Tenth People's Hospital,Shanghai,200072） ABSTRACT Objective:To investigate the effect of resveratrol (Res)on cell cycle and apoptosis of hepatocellular carcinoma LM3cells and the possible molecular mechanisms.Methods:Cell counting kit-8(CCK-8)assay was used to examine the effect on cell prolifer-ation of hepatocellular carcinoma LM3cells treated by Res with the concentration of 50μmol/L for 24and 72hours;LM3cells were treated by DMSO or no treatment as randomized and blank control,and then were detected.The expression of Bak and Bcl-2mRNA and protein in LM3cells treated by Res were evaluated by Real-time PCR and western blot,respectively.Results:Res inhibited the prolifera-tion of LM3cells in time-dependent manner （F=101.183，P ＜0.001）and concentration-dependent manner （F=192.371，P ＜0.001）in vit-ro.It was found that Res could accelerate cells cycle transition and induce apoptosis after treatment by Res at 150μmol/L for 72hours.The expression of Bak mRNA (P=0.002，0.007)and protein （P =0.004，0.01） were obviously up-regulated on treated LM3cells,while the expression of Bcl-2mRNA （P=0.027，0.007）and protein （P =0.001，0.001） decreased remarkably.Conclusion:Res can not only in-hibit proliferation of LM3cells but also induce cellular apoptosis through accommodating the expression of Bak and Bcl-2. Key words:Carcinoma;cycle;Bcl-2;Bak Chinese Library Classification(CLC):R735.7,R285.6Document code:A Article ID:1673-6273(2012)01-16-04 *基金项目：国家自然科学基金(81072005)。上海市科委基金(0941*******) 作者简介：戴维奇(1985-)，男，硕士生； E-mail ：dai_yue@https://www.doczj.com/doc/283456171.html, △通讯作者：郭传勇， E-mail ：guochuanyong@https://www.doczj.com/doc/283456171.html, （收稿日期：2011-07-12接受日期：2011-08-06）前言 原发性肝癌（primary liver cancer,PLC ）包括肝细胞癌（hep- atocellular carcinoma,HCC ）、肝胆管细胞癌（cholangiocarcino- ma ）、肝细胞及胆管混合癌等几种类型， PLC 是我国高发肿瘤，位于恶性肿瘤病死率第二位，这其中又以乙型肝炎病毒感染后 的肝细胞癌为主[1]。因此， 针对能够明显抑制原发性肝细胞肿瘤的药物研究就显得十分重要。 白藜芦醇（Resveratrol,Res ）是1940年首次从毛叶黎芦的 根部分离得到的非黄酮类多酚化合物。Res 在新鲜葡萄皮中含 量较高，在中药植物虎杖中含量最为丰富。因Res 具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、保护心血管、鳌合自由基等作用，长期以来一直广泛用于心血管病的防治中。最近研究表明Res 可显著抑制多种人类肿瘤细胞的生长增殖[2-6]，本研究主要通过白藜芦醇处理肝癌细胞株LM3，观察白藜芦醇对肝癌细胞增殖及凋亡的影响，检测相关基因及蛋白的变化情况，以期阐明白藜芦醇抗肿瘤的可能机制。1材料与方法1.1细胞和主要试剂人肝细胞癌细胞株LM3(购自美国ATCC 公司)；Res(纯度>99.9％)(Sigma)用二甲基亚(DMSO)溶解后配成100mmol ／L 16··
综述：肝细胞性肝癌 原发性肝癌以肝细胞性肝癌（HCC）为主。在全球范围内，肝癌是导致癌症相关死亡的第四大常见原因，在发病率方面排名第六。根据世界卫生组织的年度预测，估计2030年将有100多万患者死于肝癌。 在美国，从2000年到2016年，肝癌的死亡率增加了43%（从7.2人/10万人上升到10.3人/10万人），而5年生存率为18%，肝癌已成为仅次于胰腺癌的第二大致死性肿瘤。大部分的HCC发生在有基础肝脏疾病的患者当中，主要是HBV或HCV感染或酒精滥用。 普遍接种HBV疫苗和广泛应用针对HCV的直接作用抗病毒药物可能将改变HCC的病因谱。而非酒精性脂肪肝（NAFLD）、代谢综合征和肥胖患者的增加放大了肝癌的发生风险，在西方国家，NAFLD将很快成为肝癌的主要病因。 针对晚期肝癌患者的系统疗法发展迅速，在过去2年，有4种新药在3期临床试验中显示出了临床疗效。本文将主要论述HCC的主要遗传学改变、风险因素、监测和诊断，以及循证治疗方法。 一、发病机制 慢性肝病患者存在持续性肝脏炎症、肝纤维化和肝细胞异常再生。这些异常的生理过程可导致肝硬化，并导致一系列遗传学和表观遗传学事件，最终导致异常增生结节（真正的肿瘤癌前病变）的形成。额外的分子改变能使异常增生细胞获得增殖、侵袭性和生存优势，并完成到成熟HCC的转变（图1）。HCC也可发生于不存在肝硬化或明显炎症的慢性肝病患者（如HBV感染患者）。 图1HCC的主要遗传学改变及分子分型 图中描述了人HCC发生过程中关键的分子和组织学改变，以及HCC两个分子亚型的主要遗
传和临床特征。*表示高水平的DNA扩增。在非增生型中，CTNNB1突变增强了免疫排斥。 二、风险因素 没有基础肝病的患者很少罹患HCC，男性的HCC发病率是女性的两倍。任何原因的肝硬化都会增加HCC的发生风险。 这种风险因病因、地理区域、性别、年龄和肝损伤程度而异。 在世界范围内，HBV感染是HCC的主要病因。尽管乙肝疫苗的广泛接种降低了HCC的发病率，但仍有许多未接种疫苗的人感染HBV（2015年为2.57亿人），有罹患HCC的风险。饮食中接触黄曲霉毒素B1可导致249位TP53的特异性突变（R→S），增加HBV感染患者发生HCC的风险。在西方国家和日本，HCC的主要病因是HCV感染。无论潜在的肝纤维化程度如何，HBV感染都有直接的致癌作用，但在HCV感染者中，若不伴有重度肝纤维化，则HCC很少发生。 全世界范围内，NAFLD相关HCC的发病率呈上升趋势。在美国，从2016年到2030年，该发病率预计将增加122%（从5510例增加到12240例）。 酒精性肝硬化是HCC的另一常见病因。 吸烟合并HIV感染也可能导致HCC的发生。抗病毒治疗在降低HCC的发生率方面是有效的，但不能根除这种风险。 与无应答的患者相比，在对干扰素治疗方案有持续病毒学应答的HCV感染患者中，HCC 的风险从6.2%降低到了1.5%。据报道，使用直接作用抗病毒药物治疗的HCV感染患者发生HCC的风险也会降低。 除了肝病的病因治疗外，尚无任何药物可以降低HCC的发生率。 三、HCC的监测 癌症监测旨在早期发现肿瘤，增加治疗机会，提高生存率。然而，尚无高质量的随机对照试验评估HCC监测对肝硬化患者的临床价值。不过，数学模型、低质量的临床试验（在方法学上有局限性）以及meta分析都显示了监测对患者的生存益处。 HCC监测的目标人群是肝硬化患者，且不考虑肝硬化的病因。 由于重度肝功能不全的肝硬化患者不适合接受根治性治疗，所以没有癌症监测的必要。但因肝功能障碍而等待肝移植的患者则需要进行监测，目的是确保肿瘤不会发展到按照既定标准无法进行移植的程度。 一些没有肝硬化的肝病患者也应该被纳为癌症监测目标。慢乙肝患者发生HCC的风险存在地区差异（非洲和亚洲地区的发生风险高于其他地区），且老年、男性、肝纤维化、病毒复制水平高、基因C型以及HCC家族史都提示着更高的HCC发生风险。 虽然无肝硬化的非酒精性肝病患者可能会发生HCC，但实际风险是未知的，且可能非常低。除非有方法可以识别出风险较高的患者，否则不建议对无肝硬化的NAFLD患者进行癌症监测。 HCC的推荐监测方法为：每6个月进行一次腹部超声检查，联合/不联合血清甲胎蛋白水平检测。结果对操作者的依赖性较高，敏感度为47%-84%，特异度＞90%。对肥胖患者，超声检测的实用性会降低。 四、HCC的诊断 在肝硬化患者中，利用影像学技术就可以诊断HCC（图2）。由于肝细胞在恶性转变期间会发生血管转变：良性病灶（如增生性结节）由门静脉系统分支供血，而恶性病灶由肝动脉分支供血。这种转变转化为一种独特的模式：对比增强CT或MRI可显示动脉后期明显强
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
细胞集落形成实验方法介绍 非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。 集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100% （一）原理 细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。 （二）实验用品 1.材料：Hela细胞。 2.器材：（直径60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。 3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。 （三）方法 1.平板克隆形成试验 本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。 (1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。 (2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。 (3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。 (4)培养皿置37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。 (5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。 2.软琼脂集落形成试验
目录 中文摘要 (Ⅰ) Abstract (Ⅲ) 缩略语 (Ⅶ) 前言 (1) 研究现状、成果 (1) 研究目的、方法 (4) 一、对象和方法 (5) 1.1材料和仪器 (5) 1.2试剂配制 (6) 1.3实验方法步骤 (7) 1.3.1细胞培养 (7) 1.3.2Western blot检测GDF11蛋白表达 (10) 1.3.3CCK-8法检测SMMC-7721细胞体外增殖能力 (14) 1.3.4平板克隆形成实验 (14) 1.3.5CCK-8检测SMMC-7721细胞顺铂敏感性 (15) 1.3.6流式细胞术检测细胞周期分布 (15) 1.3.7裸鼠皮下移植瘤增殖实验 (16) 1.3.8免疫组化法检测GDF11、Ki-67蛋白表达及肿瘤微血管密度 (17) 1.3.9免疫组化结果判定 (18) 1.3.10统计学方法 (18) 二、结果 (20) 2.1GDF11在肝细胞癌SMMC-7721细胞中表达水平检测 (20) 2.2 GDF11过表达明显降低肝细胞癌SMMC-7721细胞体外增殖能力 (20) V
2.3 GDF11过表达明显降低SMMC-7721细胞的克隆形成能力 (21) 2.4 GDF11过表达增加肝细胞癌SMMC-7721细胞对顺铂的敏感性 (22) 2.5 GDF11过表达将肝细胞癌SMMC-7721细胞阻滞在G1期 (23) 2.6 GDF11过表达抑制SMMC-7721细胞裸鼠皮下移植瘤的增殖能力 (24) 2.7 GDF11、Ki-67、及CD34蛋白在裸鼠皮下移植瘤组织中的表达 (25) 2.8 GDF11蛋白、Ki-67蛋白、MVD的相关性分析 (27) 讨论 (28) 结论 (33) 参考文献 (34) 发表论文和参加科研情况说明 (40) 综述 (41) GDF11蛋白研究进展 (41) 综述参考文献 (46) 致谢 (49) 个人简历 (50) VI
一、原发性肝癌 【病理与临床】 原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在消化系统恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食管而居第三位，在部分地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%。由于依靠血清甲胎蛋白（AFP）检测结合超声成像对高危人群的监测，使肝癌在亚临床阶段即可作出诊断，早期切除的远期效果尤为显著。加之积极综合治=治疗，使肝癌的五年生存率有了显著提高。原发性肝癌发病年龄多在中年以上，男多于女。原发性肝癌发病隐匿，早期无临床症状，有症状时多已属中晚期，表现为中上腹不适、腹胀、疼痛、食欲缺乏、乏力、消瘦等，其他可有发热、腹泻、黄疸、腹水、出血倾向以及转移至其他脏器而引起的相应症状。 原发性肝癌按组织学类型分为肝细胞、胆管细胞和肝细胞与胆管细胞混合型肝癌三类，其中肝细胞肝癌最多见，占90%以上。按病理形态来分肝癌分为三型： 1、块状型癌结节直径>5cm，其中>10cm者为巨块型，块状型肝癌有膨胀性生长的特点，邻近肝组织和较大的血管、胆管被推移或受压变窄形成假包膜，巨块型肝癌内部多伴出血、坏死。 2、结节型癌结节直径<5cm，可单发或多个，多伴有肝硬化。 3、弥漫型癌结节小，呈弥漫性分布，该型肝癌多伴有明显肝硬化，癌结节与周围肝组织境界不清，易与肝硬化混淆。 另外，将肝内出现单个癌结节且直径<3cm者，或肝内癌结节不超过2个且2个癌结节直径之和<3cm者称作小肝癌。近年来提出将单个肿瘤直径≤2cm肝癌定为微小肝癌。原发性肝癌极易侵犯门静脉分支，癌栓可经门静脉系统形成肝内播散，甚至阻塞门静脉主干引起门静脉高压的表现；经淋巴转移可出现肝门淋巴结肿大，其次为胰周、腹膜后、主动脉旁及锁骨上淋巴结。此外，还可出现膈肌及附近脏器直接蔓延和腹腔种植性转移。 【超声表现】 1、二维超声肝癌结节形态多呈圆形或类圆形，结节内部回声较复杂、大致可分为低回声型、等回声型、混合型，而以低回声型和混合回声型较多见。癌结节内部回声多不均匀，部分肝癌具有周围暗环，有较高的诊断特异性。癌结节后方回声常可呈轻度增强变化，尤其是小肝癌。此外，大部分肝癌具肝硬化背景。不同病理类型肝癌的超声表现也不尽相同，具有各自的特征。
EFTUD2维持肝癌细胞生存并促进其增殖、侵袭转移的相关研究研究背景肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。最新的全球癌症数据显示,肝癌全球发病率位列第八,死亡率位列第四,其中男性中肝癌死亡率位居前三。 而全球每年一半以上的肝癌新发及死亡病例均发生在中国。在我国,肝癌患者能够早期诊断并接受手术治疗的比例仅有10%-20%,大多数患者在诊断为肝癌时己是晚期或终末期,治疗手段非常局限且预后较差。 多病灶的发展、肝内或远处转移是肝癌患者手术切除后,预后差和高复发率的主要原因。然而,目前关于肝癌术后复发和转移的机制以及有效的控制手段仍未明确。 因此,新的预测指标亟待发现以提高肝癌的早期诊断,进而降低肝癌致死率。延长因子结合蛋白(elongation factor Tu GTP binding domain-containing protein,EFTUD2)是U5小核核糖核蛋白(U5 snRNP)的核心组件,是一种高度保守的GTP酶,参与催化RNA的剪接以及剪接复合体剪接后的解离。 文献报道eftud2基因突变可引起的下颌骨发育不全、头小畸形、唇裂等头面部发育畸形,提示EFTUD2可能是生长发育所必需。此外,研究发现EFTUD2能够介导乳腺癌细胞及神经前体细胞的凋亡。 而EFTUD2在肝癌发生发展中的作用尚无相关报道。本研究通过检测EFTUD2在肝癌组织及其匹配的癌旁组织和正常肝组织中的表达及分布情况,分析EFTUD2对肝癌术后患者生存预后的影响,并进一步探索EFTUD2在肝癌发展过程中发挥的作用及其相关的分子机制。 研究结果1.通过TCGA数据库及疫组织化学染色(IHC)检测组织芯片及126例肝癌及其对应的癌旁组织中EFTUD2的表达情况,结果表明肝癌内EFTUD2高表
原发性肝癌与炎症关系的研究进展 摘要原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，与炎症密切相关。在我国，肝癌患者中约大多数有慢性乙型病毒性肝炎感染病史；在欧美及日本，肝癌与丙型病毒性肝炎有关。本文总结原发性肝癌与炎症关系的最新研究进展，探讨多种炎症介质对肝癌发生、转移的促进机制，通过阻断相关炎症介质作用，探索出抑制原发性肝癌的发生、发展，减少复发、转移的新治疗途径。 原发性肝癌（primary hepatic carcinoma PHC）是世界卫生组织公布的十大恶性肿瘤之一，全世界每年新发及死亡病例约占所有恶性肿瘤的5.4%。最新的流行病学调查结果显示，其发病率及死亡率均有上升趋势。原发性肝癌是一种与炎症密切相关的恶性肿瘤，炎症在肝癌的发生和转移过程中具有促进作用[1][2]。本文就原发性肝癌与炎症关系的研究作一综述。 概述 Rudolph Virchow[3]第一次提出炎症在恶性肿瘤进展中起一定的作用，认为慢性炎症可促进肿瘤的生长；随后Wiemann B[4]证明：通过给患者注射化脓性链球菌和粘质沙雷菌引起的急性炎症可使部分患者的恶性肿瘤退化。目前炎症与肿瘤关系的研究成为热点。 大量流行病学调查提示：炎症是导致肿瘤发生或促进肿瘤发展的最主要因素之一，约20%的恶性肿瘤由炎症诱发或促进[1] [2] [5]。炎症与肿瘤发展的多个环节相关，包括肿瘤细胞形成、进展、逃逸、增生、浸润、血管生成、转移。炎症引起恶性肿瘤的分子和细胞机制尚未完全明确，有研究认为：炎症发生后，炎性细胞在迁入炎症部位的过程中产生大量的活性氧、活性氮物质，而且在慢性炎症过程中，内生抗氧化机制的抑制作用也可以产生超负荷的活性物质，这些活性物质诱导DNA损伤，破坏增生细胞的基因稳定性，最终在炎症和活性物质的反复破坏下，细胞基因改变，包括点突变、基因缺失、基因重组[6]。 在我国，原发性肝癌患者中约1/3有明确的乙型病毒性肝炎病史，欧美及日本，肝癌主要与丙型肝炎病毒感染及酒精性肝病有关。肝癌与肝炎病毒、酒精性肝病的关系，国内外已有大量研究，部分机制已经阐明。研究证实：乙型肝炎病毒（HBV）是一种DNA病毒，它可以整合插入宿主基因组，改变宿主体细胞基因的表达，导致宿主细胞基因组的不稳定，易发生基因改变，从而转化为肝癌细胞[7]；丙型肝炎病毒（HCV）为单链RNA病毒，可以和多种细胞蛋白作用，促进肝细胞向肝癌细胞转化[8]；酒精性肝病诱导肝癌形成过程中，酒精产物乙醛可直接损伤肝细胞或乙醇代谢产生的反应性氧化剂和脂质过氧化物直接造成DNA损伤[9]。原发性肝癌通常发生在慢性肝损伤的基础上，包括慢性肝炎、肝硬化，这些被认为是癌前病变。慢性肝损伤引起的炎症反应促进肝硬化的发展，并且激活了肝细胞的再生能力[10]。肝脏的修复机制若被短暂的激活，肝脏的结构和功能可迅速恢复，修复机制的持续激活可促进肝癌的形成和发展，肝炎病毒感染和长期饮酒可激活先天性免疫功能，维持持久的炎症反应，从而促进肝癌的形成和发展[11]。 目前研究已证明，在炎症与癌症的关系中，许多炎症介质具有重要作用。炎症介质产生于炎症反应过程中，也可以由肿瘤细胞产生，其中起关键作用的炎症介质包括环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）、核转录因子—kappaB（NF-kB）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、补体系统。. 原发性肝癌与Cox-2 环氧化酶（cyclooxygenase，Cox）是花生四烯酸转变为前列腺素的限速酶，又称前列腺素内过氧化物合成酶，是一种完整的膜结合蛋白，至少有三种形式：Cox-1位于内质网，属于结构型基因，多种正常组织
实验室用肝癌细胞株 细胞英文名称Hep G2 [HepG2]细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性该细胞来源于一名15岁的白人少年的肝癌组织。该细胞表达甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体C4、C3激活物、纤维蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、视黄醇结合蛋白；表达胰岛素受体和胰岛素样生长因子IGFⅡ的受体；该细胞具有3-羟基-3-甲酰辅酶A还原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未证明该细胞中有HBV基因组。 培养基MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清10%FBS其它因子1%NEAA 传代方法1:4~1：6传代；每周2次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 细胞英文名称SMMC-7721 [SMMC7721]细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性取人肝癌组织，采用静置和旋转管法培养11天细胞开始生长，首次传代23天。AFP阳性。用Northern blot方法，未能检测到细胞中1.3kb LFIRE-1/HFREP-1 mRNA的表达，免疫缺陷小鼠体内可成瘤。 培养基RPMI 1640 (w/o Hepes) 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:3传代；3~4天1次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 细胞英文名称Hep3b 细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮细胞样生长特性贴壁生长。 特征特性该细胞源自一位患有肝癌的7岁黑人男童，HBV阳性。 培养基MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清10%FBS 其它因子无 传代方法1:4～1:6传代，每周换液2次传代情况C2 冻存条件基础培养基+8%DMSO+20%FBS 支原体检测培养法（-） 国内还有，： 小鼠肝癌细胞Hepa 1-6 [Hepa1-6] 人胆管细胞型肝癌细胞HCCC-9810 小鼠肝癌瘤株H22 人肝癌细胞HHCC 人肝癌细胞PLC/PRF/5 人肝癌细胞HB611 人肝癌细胞BEL-7402 人肝癌细胞QGY-7701 （有疑问细胞待定） 人肝癌细胞QGY-7703 （有疑问细胞待定） 人肝癌细胞BEL-7404 人肝癌细胞BEL-7405
一、淋巴细胞转化试验（MTT） （一）原理： 四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。 （二）材料： MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原 （三）方法： 1、脾细胞制备： （1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上； （2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏； （3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks液的培养皿中； （4）制备脾细胞悬液 ①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。调整细胞浓度为 5 105/ml。 ②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入