1.1 DNA重组技术的基本工具
（一）思考与探究（P7）
1．限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：（略）你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？
答： 2和7；4和8 ；3和6；1 和 5；
2.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？
提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
3.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？
提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒，即独立于细菌拟核DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点，还必需是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA 的复制而同步复制。（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
4.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
提示：迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。
（二）寻根问底
1.根据你所掌握的知识，你能推测出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？（P4）
提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病源物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，限制酶会将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
2.DNA连接酶与DNA聚会酶是一回事吗？为什么？（P6）
答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到的，称之为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚会酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚会酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA 连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA 双链上的两个缺口同时连接起来，因此它不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。
（三）模拟制作讨论题（P7）
1.你模拟插入的DNA片段能称得上一个基团吗？
提示：不能。因为一般基因有上千个碱基对。
2.如果你操作失误，碱基不能配对。可能是什么原因造成的？
提示：可能是剪切位点或连接位点选得不对（也可能是其他原因）。
（四）旁栏思考题（P6）
想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？
提示：能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因及对受体无害等。
分生—重组DNA技术试题 一、单选 1、在分子生物学领域，分子克隆主要是指（） A、DNA的大量复制 B、DNA的大量转录 C、DNA的大量剪切 D、RNA的大量反转录 E、RNA的大量剪切 2、在分子生物学领域，重组DNA又称（） A、酶工程 B、蛋白质工程 C、细胞工程 D、基因工程 E、DNA工程 3、在重组DNA技术中，不常用到的酶是（） A、限制性核酸内切酶 B、DNA聚合酶 C、DNA连接酶 D、反转录酶 E、DNA解链酶 4、多数限制性核酸内切酶切割后的DNA末端为（） A、平头末端 B、3突出末端 C、5突出末端 D、粘性末端 E、缺口末端 5、可识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类酶称为（） A、限制性外切核酸酶 B、限制性内切核酸酶 C、非限制性外切核酸酶 D、非限制性内切核酸酶 E、DNA内切酶 6、CDNA是指（） A、在体外经反转录合成的与RNA互补的DNA B、在体外经反转录合成的与DNA互补的DNA C、在体外经转录合成的与DNA2补的RNA D、在体内经反转录合成的与RNA互补的DNA E、在体内经转录合成的与DNA互补的RNA 7、基因组代表一个细胞或生物体的（） A、部分遗传信息 B、整套遗传信息 C、可转录基因 D、非转录基因 E、可表达基因 8、在基因工程中通常所使用的质粒存在于（） A、细菌染色体 B、酵母染色体 C、细菌染色体外 D、酵母染色体外 E、以上都不是 9、就分于结构而论，质粒是（）
A、环状双链DNA分子 B、环状单链DNA分于 C、环状单链RNA分子 D、线状双链DNA分子 E、线状单链DNA分子 10、聚合酶链反应可表示为（） A、PEC B、PER C、PDR D、BCR E、PCR 11、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是（） A、化学合成法 B、基因组文库法 C、CDNA文库法 D、聚合酶链反应 E、差异显示法 12、重组DNA的基本构建过程是将（） A、任意两段DNA搂在一起 B、外源DNA接入人体DNA C、目的基因接人适当载体 D、目的基因接入哺乳类DNA E、外源基因接人宿主基因 13、ECoRI切割DNA双链产生（） A、平端 B、5’突出粘端 C、3’突出粘端 D、钝性末端 E、配伍末端 14、催化聚合酶链反应的酶是（） A、DNA连接酶 B、反转录酶 C、末端转移酶 D、碱性磷酸酶 E、TaqDNA聚合酶 15、将PstI内切酶切割后的目的基因与用相同内切酶切割后的载体DNA连接属（） A、同聚物加尾连凑 B、人工接头连接 C、平端连接 D、粘性末端连接 E、非粘性末端连接 16、限制性核酸内切酶切割DNA后产生（） A、3磷酸基末端和5羟基末端 B、5磷酸基末端和3羟基末端 C、3磷酸基末端和5磷酸基末端 D、5羟基末端和3羟基末端 E、3羟基末端、5羟基末端和磷酸 17、重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶是（） A、DNA聚合酶 B、RNA聚合酶 C、DNA连接酶 D、RNA连接酶 E、限制性核酸内切酶 18、以质粒为载体。将外源基因导入受体菌的过程称（） A、转化 B、转染 C、感染 D、转导 E、转位 19、最常用的筛选转化细菌是否含质粒的方法是（）
同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在染色体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，同源重组需要一系列的酶催化。 !!!是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant) 拼接重组体(splice recombinant) 片段重组体： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) ：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 基因工程(genetic engineering) ：实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程。 工具酶功能 限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNA DNA连接酶催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键， 使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3′末端 Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5'→3'聚合、 3'→5'外切活性，而无5'→3'外切活性。常用于cDNA第二链合成， 双链DNA 3'末端标记等 反转录酶①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶切除末端磷酸基 基因载体：
分生—重组DNA 技术试题 一、单选 1、在分子生物学领域，分子克隆主要是指（） A DNA勺大量复制B、DNA勺大量转录C、DNA勺大量剪切 D RNA勺大量反转录E、RNA勺大量剪切 2、在分子生物学领域，重组DNA又称（） A、酶工程 B、蛋白质工程 C、细胞工程 D、基因工程 E、DNAT程 3、在重组DNA技术中，不常用到的酶是（） A、限制性核酸内切酶 B、DNA聚合酶 C、DNA连接酶 D、反转录酶 E、DNA军链酶 4、多数限制性核酸内切酶切割后的DNA末端为（） A、平头末端 B、3突出末端 C、5突出末端 D、粘性末端 E、缺口末端 5、可识别DNA勺特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA勺一类酶称为 （） A、限制性外切核酸酶 B、限制性内切核酸酶 C、非限制性外切核酸酶 D非限制性内切核酸酶E、DNA内切酶 6、CDNA1 指（） A、在体外经反转录合成的与RNA互补的DNA B在体外经反转录合成的与DNA互补的DNA C在体外经转录合成的与DNA2补的RNA D在体内经反转录合成的与RNA互补的DNA E、在体内经转录合成的与DNA互补的RNA 7、基因组代表一个细胞或生物体的（） A、部分遗传信息 B、整套遗传信息 C、可转录基因 D非转录基因E、可表达基因 8、在基因工程中通常所使用的质粒存在于（） A、细菌染色体 B、酵母染色体C细菌染色体外 D酵母染色体外E、以上都不是 9、就分于结构而论，质粒是（）
A、环状双链DNA分子 B、环状单链DNA分于 C、环状单链RNA分子 D线状双链DNA分子E、线状单链DNA分子 10、聚合酶链反应可表示为（） A、PEC B、PER C、PDR D、BCR E、PCR 11、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是（） A、化学合成法 B、基因组文库法 C、CDNAfc库法 D聚合酶链反应E、差异显示法 12、重组DNA勺基本构建过程是将（） A、任意两段DNA娄在一起 B、外源DNA接入人体DNA C、目的基因接人适当载体 D、目的基因接入哺乳类DNA E 、外源基因接人宿主基因 13、ECoRI切割DNA双链产生（） A、平端 B、5'突出粘端 C、3'突出粘端 D、钝性末端 E、配伍末端 14、催化聚合酶链反应的酶是（） A DNA连接酶B、反转录酶C末端转移酶D、碱性磷酸酶E TaqDNA聚合酶 15、将Pstl内切酶切割后的目的基因与用相同内切酶切割后的载体DNA连接属 （） A、同聚物加尾连凑 B、人工接头连接C平端连接D、粘性末端连接 E、非粘性末端连接 16、限制性核酸内切酶切割DNA后产生（） A、3 磷酸基末端和5 羟基末端B 、5 磷酸基末端和3 羟基末端 C、3 磷酸基末端和5 磷酸基末端D 、5 羟基末端和3 羟基末端 E、3 羟基末端、5 羟基末端和磷酸 17、重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶是（） A DNA R合酶B、RNA聚合酶C、DNA连接酶D、RNA连接酶 E、限制性核酸内切酶 18、以质粒为载体。将外源基因导入受体菌的过程称（） A、转化 B、转染 C、感染 D、转导 E、转位
重组表达质粒的构建——基因的克隆 长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。 选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。 原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种： 1）酶切连接 这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。 2）TA克隆 TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3′末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3′末端A正好匹配。这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3′末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。 3）TOPO克隆 TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。主要原理是在T载体的T碱基上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，其克隆效率提高数倍，并且操作极其简单，整个反应体系不需要在添加连接酶成分。如果在线性化平端载体上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，平端连接将不再是难题，如果再配合一个致死基因ccdB （Control of cell death）使用，凡是没有插入外源核酸序列的空载体自连，转入大肠杆菌可以正常表达ccdB蛋白，破坏细菌DNA gyrase(促旋酶)，造成细菌染色体降解而死亡；而插入外源核酸序列的会干扰ccdB蛋白的正常表达，细菌可以正常存活，平端克隆高背景问题这样得以完美解决。 4）Gateway技术 该技术所依赖的基础是lambda噬菌体的位点特异性重组反应。需要限制酶切回收、T4 Ligase连接；该方法一步就可以完成，只需要将基因克隆到入门载体（Entry Vector）,依赖载体上的特定的重组序列和重组酶，将外源基因克隆到具有相同重组序列的载体上；入门载体一般包含两个attL1和attL2,中间夹杂一个ccdB自杀基因，自连的空载体在转入大肠杆菌中都不会存活。入门载体构建成功之后，就可以轻松地将入门载体和目的载体质粒混合加入重组酶即可发生重组，生成所需要的融合质粒，当然还有一个副产品质粒。这种克隆方法适合于将一个基因批量化构建到不同载体系列中进行功能测试。这种技术也适合于大批量的文库构建，具体细节在此就不做赘述。 该技术主要的缺点是：该技术系统使用的酶非常昂贵，而且酶非常不稳定；其次，适合于gateway技术的载体非常少，只有一个厂家生产而且昂贵，来源受限；对于大片度（>10Kb）的效率很低，与传统的酶切-T4连接技术相比没有优势。 5）Infusion技术 这个是目前比较流行的克隆技术，可以任意载体任意基因片段快速实现多片段、长片段定点定向克隆，
第8章细胞重组与克隆技术 8.1细胞重组 8.1.1细胞重组定义 指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。 8.1.2细胞重组的特点与意义 8.1.3细胞重组方式 细胞重组的方式基本分为以下三种： （1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。 （2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。 （3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞。 8.1.4细胞重组材料的获得 8.1.4.1 胞质体（cytoplast)的获得 定义：是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 制备方法：用细胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发其排核。借助细胞松驰素的这种作用，结合高速离心可以得到胞质体。 制取容器及条件 结构特点：植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同，具有内质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等骨架系统，各细胞器仍占有固有的位置。 8.1.4.2 核体的获得 定义：与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。 制备方法： 8.1.4.3 微细胞(microcell)的获得 定义：又可被称为微核体，是只含有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。 制备方法：秋水仙素及其衍生物和长春花碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。 将从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞作为材料，通过显微操作技术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇（PEG）等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们重新装配成新的活细胞。 8.1.5 显微操作技术 借助显微操作仪进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位的变化等等操作。 8.2克隆技术 植物界——吊兰 动物界——孙悟空 8.2.1 克隆(clone)的定义 本意——是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。目前——指一种实现无性繁殖的操作，而不是一般意义上的无性繁殖（或无性繁殖操作）。关键技术——核移植。 克隆的三个层面 分子克隆：分子水平上的克隆。如基因克隆。 细胞克隆：细胞水平上的克隆。如制备单克隆抗体的杂交瘤细胞的克隆。 动物克隆或植物克隆：个体水平上的克隆。如利用营养繁殖和组织培养技术生产的植物。8.2.2 克隆的理论基础 细胞全能性。 细胞的分化。 植物界 *克隆现象在植物界普遍存在，既可以是自然的，也可以是人工的。
河南农业大学牧医工程学院 1 Gateway 基因克隆 Gateway 基因克隆是由Invitrogen 公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA 片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA 转移成为可能。 这一技术在插入的目的DNA 片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone ）。据Invitrogen 宣称Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA 保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA 片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology ）。 一、Gateway 基因克隆的原理及机制 Gateway 被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector ）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector ，目的载体）上。 Gateway 的原理是建立在噬菌体DNA 定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF 、Int ）的作用下，lambda 的attP 位点和大肠杆菌基因组的 attB 位点可以发生定点重组，lambda 噬菌体DNA 整合到大肠杆菌的基因组DNA 中，两侧产生两个新位点：attL 和attR 。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis 和IHF 、Int 的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB 和attP 位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
Gateway? 重组克隆技术 经典的克隆工作流程包括许多步骤，尤其是传统的限制性内切酶克隆方法。这种传统的方法限制了克隆的成功率。 例如，当其可能会在目的基因内部进行切割， 从而截短插入片段，并使得基因无法用于下游表达时，某些限制性内切酶是不能使用的。采用传统的克隆方法， 需要额外的片段回收步骤，而且在克隆大片段DNA 时，将会遇到重组效率降低， 从而需要浪费费很多时间以筛选到所需的克隆的问题- 所有这些步骤都会耗费大量的时间和精力，而且成功还无法得到保障。 而Gateway? 重组克隆技术则不存在这些问题。 极好的通用性 相反，Gateway? 重组克隆技术则规避了这些克隆限制，使您几乎能够使用任何表达系统。Gateway? 重组克隆采用了99% 有效且可逆的一小时重组反应， 并且不使用限制性内切酶、连接酶、亚克隆步骤，也不需要对不计其数的菌落进行筛选，从而节省您的时间、金钱和精力。Gateway? 技术自推出后便为研究界广泛采用， 仅参考文献便超过1500 篇。此技术使跨学科研究的合作变得简单方便，而且能从这些研究团体中获得众多载体用于真正的多学科科学研究。 最后，MultiSite Gateway? 技术等最新进展使得Invitrogen 的 Gateway? 克隆成为蛋白质表达和功能分析的理想克隆方法。 Gateway? 技术的优点 只需一小时，室温克隆反应便能快速产生您所需的克隆，效率高达99% 以上 无需使用限制性内切酶或连接酶便能保持片段正确的插入方向和阅读框，从而，获得可直接进行表达的克隆 从靶标鉴定到验证始终使用同一个克隆，无需重新测序，从而确保结果在整个实验过程中一致 使DNA 插入片段从一个表达载体穿梭到另一个表达载体，既提高了灵活性，同时还简化了克隆工作流程
原核生物的同源重组 在生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组（Homologous Recombination）。同源重组的频率与DNA 或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍。 3.1.1 原核细菌的基因转移程序 原核细菌的基因转移程序是基于物理学和生物学的原理建立起来的，将质粒或噬菌体DNA导入细菌受体细胞的方法主要有以下几种： 1．Ca2+诱导转化法 1970年，有人发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA，此后不久，对这种程序进一步的优化实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序如图3-1所示。将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+协助细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2和CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。1983年，有人除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。 2．原生质体转化法 在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子
第四章克隆策略与体外重组 一、填空题 1．克隆策略有三层涵义：(1)第一层是—--------------—； (2)第二层涵义是—----------------—； (3)第三层涵义就是-------------------- 。 2．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件： (1)—-----------------—(2)——------------------ (3)—------------------—。 3．现有的基因克隆策略大体上分为三类：—--------------—、—------------—、—--------------—。 4．受体细胞的感受态是—--------------—。 5． DNA重组连接的方法大致分为四种：(1)—---------------—(2)—------------— (3)————————————（4)—--------------------—。 6．平末端连接法(blunt end ligation)的连接效率比黏性末端连接的效率低得多，所以通常在连接反应体系中适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂，以提高平末端DNA连接的效率。常用的凝聚剂是--------------——。 7．一个细菌的表面大约有—-----------—个同DNA结合的位点。 8． 1984年,Hung和Wesink发现如果两个不同的5’黏性末端通过部分填补得到如下的单链突出末端，即可有效地相互连接：(1)—---------------—(2)—----------------— (3)——----------------。 9．将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个—-------------—，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个—---------------—。 10．将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个—----------—，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个—-------------------—。 11．在构建cDNA克隆之前，可以用—-----------—来富集一特殊的核苷酸序列。做法是用来自于能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞(不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切)的过量mRNA 分子杂交。 12．一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用——技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。 13．只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用—---------—可以将这段DNA进行百万倍的扩增。 14．SD序列是mRNA分子中同——结合的序列，其结构特征是—----------—的全部或一部分。
毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生 稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的， 也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有HIS4基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载 体经限制性内切线性化以后，可在AOX1或his4位点进行同源重组，从而产生HIS+重组子。单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的 1-10%。 1. 基因插入AOX1或aox1::AGR4位点 GS115 的AOX1或KM71 的aox1::AGR4 位点可以与载体上AOX1位点（AOX1 启动 子，AOX1 转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1 或 aox1::AGR4 基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。因为插入的表达盒没有破坏 原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115 中为HIS+ Mut+表型，在KM71 中为HIS+ Muts表型。 2. 基因替换AOX1位点
在his4 菌株如GS115 中，载体及基因组中AOX1启动子及3’AOX1 区的双交 换事件(取 代)，结果AOX1 编码区全部被取代，产生HIS＋Muts 表型。以AOX1 位点由基 因替 代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选出HIS＋转化子的Mut 表 型。基因取 代的结果是缺失了AOX1 位点（Muts），增加了含有pAOX1、目的基因、HIS4 的表达 盒。基因取代（双交换事件）不如基因插入（单交换事件）发生得多。 3. 基 因插入His4位点 GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，载体上HIS4 基因与染色体上his4 位点之 间发生 单交换事件，结果在his4位点插入一个或多个基因拷贝。由于基因组上AOX1 或 aox1::AGR4 位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株相同。 4. 多拷贝插入 尽管多拷贝事件自发发生的概率很低，但是通过在培养基中加入选择性标记， 还是很容 易在转化子中筛选到插入多拷贝的表达核的转化子。
中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy,2007,27(8):53～58 技术与方法 一种高效构建同源重组D NA 片段的方法 ———融合PCR 李 敏 杨 谦 3 (哈尔滨工业大学生命科学与工程系 哈尔滨 150001) 摘要 融合PCR 技术(fusi on PCR )采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR 产物,通过PCR 产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA 片段连接起来,此技术在不需要内切酶消 化和连接酶处理的条件下实现DNA 片段的体外连接,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。对原有的融合PCR 技术进行改进,以3个同源重组线性DNA 片段的构建为例,详细论述了改进的融合PCR 技术的反应过程及技术体系。结果表明,改进的融合PCR 技术可以同时进行3个片段及4个片段的融合反应,产物长度均在4.5kb 以上,各同源重组片段在扩增过程中均无 突变发生,获得的片段可以用于后续实验分析。关键词 融合PCR 重组片段 同源臂 抗性基因 中图分类号 Q784 收稿日期:2007204217 3通讯作者,电子信箱:yangq@hit .edu .cn 随着大规模的基因组测序计划的完成及大量表达序列标签数据库(dbEST )的建立,基因组研究已由结构基因组逐渐转向了功能基因组研究 [1] 。以同源重组技 术为基础,通过构建突变或缺失的同源媒介基因载体并取代基因组中野生型的等位基因,进而研究目的基因与表型性状间的关系,是研究动物、植物、微生物基因功能的一种非常有用的遗传操作方法 [2～4] 。 同源重组的发生依赖于载体与目的片段间存在一定的DNA 序列同源片段,同源片段越长越有利于同源重组事件的发生。传统的同源重组载体的构建以限制性内切酶和DNA 连接酶为基础,通过一系列的酶切连接反应将各片段逐步连接起来。这种方法费时费力,不但在连接过程中引入了不必要的酶切位点碱基序列,而且对于长片段的连接有时难以找到合适的酶切位点。为了克服传统的同源重组载体构建方法的缺陷,出现了以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术———融合PCR 技术(fusion PCR )。融合PCR 技术在 不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下,采用具有互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。现有的融合PCR 技术一般包括两步PCR 反应:(1)应用特异性引物,对各片段进行独立扩增,特异性引物的5′末端带有一段相邻片段的互补序列;(2)在同一反应体系中加入各片段的混合物,以一对外侧引物进行融合片段的全长扩增。由于融合PCR 技术正处于初步发展阶段,在应用过程中还存在很多方面的问题,如融合产物长度一般在4.0kb 以下、待融合片段的个数一般不超过3个、产物特异性差等。Robert 等 [5] 应用融合PCR 方法进行了3个片段的融合反应,获得了3个融合产物,融合产物长度最大为 4.2kb 。Majid 等 [6] 在进行4 个片段的连接时,首先将425bp 的alcA 启动子片段和 1.9kb 的pyr4基因片段连接到pUC19载体上,得到一 个2.1kb 的pyr4ΟalcA 表达盒,再通过两步PCR 将 2.1kb 的pyr4ΟalcA 表达盒与两个长度分别为410bp 和513bp 的片段进行了融合,最终才获得了一个由4个片 段组成的长3.0kb 的融合产物。
1.1.1Gibson assembly 简介（INTRODUCTION） 原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。 装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）, 高 保真DNA聚合酶。（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。下面是组装的示意图。 材料（MATERIALS） ?试剂（REAGENTS） NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH ，50% PEG-8000，mg/ mL Tag ligase，μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB 平板（相应抗性） ?实验前准备（SETUP） 于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。 4x isothermal assembly buffer NAD 20 mg
一步法构建同源重组载体 王海艳 （中国农业大学） 同源重组载体构建需要分别克隆目的片段两端的同源臂（长度~1kb），并与Marker基因进行连接。传统的构建方法是两段同源臂分别克隆构建到目的载体， 费时费力。在本例中，本人已经成功应用汉恒生物科技（上海）有限公司的 HB-Infusion TM无缝克隆试剂盒，将同源臂及Marker基因一步成功构建到载体上， 现将实验过程及结果分享如下： 1. 目的片段引物的设计 用NEB builder（https://https://www.doczj.com/doc/227521028.html,/watch?v=8_-t5xtJ3y8），或snapgene，genome compiler等软件，将三个目的片段的基因序列、线性化载体的基因序列按照软件使用说明依 次填入，将自动生成所需要的引物序列（如下表）。将引物提交华大基因进行合成。 引物序列列表 Primers Seq Tm GC(%) Len Fragment dDNA-P1 attgggtaccgggccctctagATATACTCGACAGGGCCCGC 73.5 61 41 3'-flank dDNA-P2 gtcactgtacGTGTGGCATTGCCCAGTCA 64.3 55 29 dDNA-P3 aatgccacacGTACAGTGACCGGTGACTCTTTCTG 66.8 51 35 5’-flank dDNA-P4 atcggtgcTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG 65.7 59 29 dDNA-P5 atctccactcgaGCACCGATGTCGCCACGC 68.5 63 30 Marker fragment dDNA-P6 aagggaacaaaagctggagctGTAGTAGAGAACTTGGACTTCGGCG 70.8 50 46 2. 目的片段的扩增 反应体系 DNA(248ng/μL) 1 μL
基因克隆 科技名词定义 基因克隆 经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。 从基因组或DNA中分离单个基因，并在细胞中复制拷贝的过程。 基因克隆(gene cloning) 是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具酶对DNA分子进行"外科手术"。 基因克隆-基因 基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。 基因克隆-基因克隆技术 基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA
DNA重组技术的基本工具 一、选择题 1．关于限制酶的说法中，正确的是( ) A．限制酶是一种酶，只识别GAA TTC碱基序列 B．EcoRI切割的是G—A之间的氢键 C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA D．限制酶只存在于原核生物中 2．限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的核苷酸碱基序列。下图为四种限制酶BamHI，EcoRI，HindⅢ以及BglⅡ的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列为何？( ) A．BamHI和EcoRI；末端互补序列—AA TT— B．BamHI和HindⅢ；末端互补序列—GA TC— C．EcoRI和HindⅢ；末端互补序列—AA TT— D．BamHI和BglII；末端互补序列—GATC— 3．下列关于DNA连接酶的叙述中，正确的是( ) A．DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键 B．DNA连接酶连接的是黏性末端两条链主链上的磷酸和脱氧核糖 C．DNA连接酶连接的是黏性末端两条链主链上的磷酸和核糖 D．同一种DNA连接酶可以切出不同的黏性末端 4．DNA连接酶催化的反应是( ) A．DNA复制时母链与子链之间形成氢键B．黏性末端碱基之间形成氢键C．两个DNA片段黏性末端之间的缝隙的连接D．A、B、C都不正确 5．在受体细胞中能检测出目的基因是因为( ) A．目的基因上有标记B．质粒具有某些标记基因 C．重组质粒能够复制D．以上都不正确 6．关于质粒的叙述正确的是( ) A．质粒是能够自我复制的环状DNA分子B．质粒是唯一的载体 C．重组质粒是目的基因 D．天然质粒可以直接作为载体 7．基因工程中可用作载体的是( ) ①质粒②噬菌体③病毒④动物细胞核 A．①②③B．①②④C．②③④D．①③④
重组dna技术名词解释 易患性：在多基因遗传病中，由遗传基础和环境因素共同作用，决定一个个体患病可能性的大小，称为易患性。易患性低，患病的可能性小；易患性高，患病的可能性大。在一定的环境条件下，易患性代表个体所积累致病基因数量的多少。 重组DNA技术：通过体外操作将不同来源的DNA重新组合以获得新功能分子的技术。就是将不同生物的DNA连在一起。 基因治疗：将缺陷基因的野生型拷贝引入患者细胞内以治疗疾病的方法。包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活、引入新基因等。就是基因水平上的治疗，将正常基因导入细胞达到治疗的目的。 同源染色体：一条来自父本，一条来自母本，且形态、大小相同，在减数分裂前期相互配对的染色体。上面有等位基因。人有46条染色体，有23对同源染色体。 表现度：具相同基因型的个体间基因表达的变化程度。表现型是由基因和环境共同决定的，基因相同的个体间表达程度可能不同。 癌基因：能诱导它所存在的细胞发生癌变的基因。就是说的原癌基因，原癌基因负责调节细胞周期，控制细胞生长和分裂的进程。它过度表达会使细胞不受控制地分裂，从而变成癌细胞。 RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）：RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。
定位克隆：分析遗传家系，获得与特定性状(疾病)紧密连锁的遗传标记，并定位于染色体特定区域，借此得到目的基因的方法。就是将致病基因定位，然后提取出来以便研究。 基因簇：基因家族中来源相同、结构相似和功能相关的在染色体上彼此紧密连锁的一组基因。某一祖先基因由于重复和变异产生的一系列基因称为一个基因家族，有的基因家族含有完全相同的成员，家族成员可以成簇存在或分布在不同的染色体中，基因簇少则是由重复产生的两个相邻相关的基因组成，多则几百个。当基因产物的需求量很大时，一个基因可以产生大量的连串重复，如rRNA基因和组蛋白基因。 同源染色体：形态、结构、遗传组成基本相同和在减数第一次分裂前期中彼此联会(配对),并且能够形成四分体,然后分裂到不同的生殖细胞的一对染色体，一个来自母方，另一个来自父方。一般在同源染色体上有相同的基因座位。 弱化子:是指原核生物的操纵子中可以明显衰减乃至终止转录作用的一段核苷酸序列，位于操纵子的上游。 假基因:是基因组中与编码基因序列非常相似的非功能性基因组 DNA 拷贝,一般情况都不被转录,且没有明确生理意义。 --根据其来源可分为:保留了间隔序列的复制假基因(如珠蛋白假基因家族)和缺少间隔序列的已加工假基因。 功能基因组学:是指基于基因组序列信息，利用各种组学技术，在系统水平上将基因组序列与基因功能(包括基因网络)以及表型有机联
目的基因的克隆、转化及重组子筛选 一．实验目的： (1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。 (2)学习DNA连接的有关技术。 (3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。 (4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 (5)掌握质粒提取的基本方法。 (6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。 二．实验原理： (1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。 (2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。 (3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。 三．实验材料： 大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2DNA割胶回收试剂盒，试管，Amp/IPTG/X-Gal，三角玻璃棒，玻璃珠，牙签，1μl pMD19-T Vector、质粒提取试剂盒。 四．实验步骤、现象、结果及分析： (1)cDNA电泳及胶回收 1. 提取总RNA，反转录cDNA，用设计好的引物扩增出不同的目的片段。取目的基因产物进行琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。 2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。 表一：cDNA琼脂糖凝胶重量 空管2管3管 重量（g）0.9045 1.2280 1.2961 净重（g）0.3235 0.3916 3.按1g/1ml 的量，大致各加入400μl Binding Buffer，65℃水浴7min；（每隔2－3 min，摇一下）； 4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液； 5.在柱子中加入300μl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液； 6.在柱子中加入700ul 的SPW 溶液，放置3min，10000g 离心1min ，去残液； 7.10000g 离心1min（去乙醇）； 8.把柱子放入干净的1.5ml EP 管。加Elution Buffer 20μl。室温放置1min，10000g 离心1min。