综述
摘要在临床病理诊断中，免疫组化技术是一项应用广泛的技术，可鉴定多方面的指标，通过免疫组化可以判断肿瘤和疾病的多方面指标。
关键词病理诊断免疫组化技术
前言
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术。在临床病理研究中免疫组化技术的应用很广泛，随着技术的发展免疫组化不仅在肿瘤的研究中具有重要意义，而且在疾病的确定等方面也表现出了良好的应用价值。
1 免疫组化技术
观察组织切片中抗原的数量及其在组织中的分布情况，对抗原进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。由于抗原与抗体特异性结合，因此通过免疫组化使标记抗体的显色剂( 酶、荧光素、同位素、金属离子等等) 显色来确定组织细胞内抗原( 多肽和蛋白质) 。IHC 所用标本主要为两大类: 组织标本和细胞标本，其中制作组织标本最常用、最基本的方法是石蜡切片。
2 免疫组化技术在临床诊断中的应用
2．1 肿瘤良恶性的判断
对于反应性增生还是肿瘤性增生，可用免疫球蛋白( Ig) 的轻链抗体检测B 淋巴细胞增生的单克隆或多克隆性来区别。在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达细胞凋亡蛋白( bcl-2) ，bcl-2 阴性; 而在滤泡性淋巴瘤中，由于90% 以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2 的高表达，bcl-2 阳性。而增殖细胞核抗原( PCNA) ，周期素( Cycling)，核抗原( Ki-67) 通过对肿瘤细胞增生的程度作出评价，从而提示增生细胞的良恶性。
2． 2 确定肿瘤分期
肿瘤分期是判断预后的一个指标，与是否浸润、有无淋巴管或血管侵袭密切相关，而通过免疫组化方法可以判断肿瘤是否浸润、有无淋巴管或血管侵袭。
2． 3 细胞属性的判定
通过特定抗体标记出细胞内相应的抗原成分，来判定细胞的属性，确定肿瘤的来源。如细胞角蛋白( CK) 是上皮性标记，CK 阳性提示肿瘤为上皮源性肿瘤; 降钙素抗体是甲状腺髓样癌特有的标记; 甲状腺球蛋白( Tg) 阳性提示是甲状腺滤泡性癌; 前列腺特异性抗原( PAS) 仅见于前列腺上皮; 胶质纤维酸性蛋白( GFAP) 阳性则提示胶质肿瘤; CD20 和CD79a 阳性则提示B 细胞淋巴瘤; 平滑肌肌动蛋白( Actin) 阳性提示肿瘤为平滑肌源性; 胃肠道间质瘤中原癌基因蛋白产物CD117 阳性; 血管源性肿瘤中内皮细胞标记物CD34 阳性等等。
2． 4 确定来源不明的转移瘤的原发部位
对于来源不明的转移瘤，用免疫组化技术有助于确定恶性肿瘤的组织学来源［5］，进一步确定原发部位。
2． 5 对“未分化”恶性肿瘤的分类
未分化恶性肿瘤包括癌或肉瘤，在HE 切片上由于肿瘤的“未分化”而缺少肿瘤细胞的起源特征不能分类，初步区分组织学类型用非特异性抗体，在其基础上再选用特异性抗体做进一步鉴定。
2． 6 进一步分类不同器官与组织交界处肿瘤
由于重叠的特征，在一些组织器官交界处的肿瘤，仅凭组织学基础对肿瘤进行分类很困难。如胃肠道梭形细胞肉瘤是肌肉起源的平滑肌肉瘤，是间质起源的胃肠道间质瘤( GIST) ，还是神经起源的神经鞘瘤; 同样发生于组织交界处的肿瘤有睾丸胚胎癌与精原细胞癌，两者较难区别，且治疗与预后显著不同，但用免疫组化检测角蛋白就较易于区别: 角蛋白阴性则为精原细胞癌，而角蛋白阳性则为胚胎癌。
2． 7 及时准确的发现微小转移灶
采用常规病理方法难以检出的实体瘤转移称为微小转移灶。在常规组织切片中，辨别单个或几个转移性肿瘤细胞很难，淋巴结内窦性组织细胞增生与某些癌的早期转移有时也不易区别，而采用免疫组化方法，有助于及时准确的发现微小( 癌) 转移灶。对乳腺癌而言主要是腋窝淋巴结的检测，淋巴结微转移患者预后差，这对进一步治疗和预后判断十分有意义。
2． 8 与治疗和预后有关的免疫组化标记物
与治疗及预后有关的标记物主要分以下为三类: ( 1) 肿瘤基因标记物, 2) 细胞增殖性标记物, ( 3) 类固醇激素受体.
2． 9 对感染性疾病诊断
应用抗病毒、细菌、真菌和寄生虫抗原的特异性抗体进行免疫组化染色，可以检测和诊断许多感染性疾病病原微生物，如乙型肝炎病毒( HBV) 、巨细胞病毒( CMV) 、人乳头状瘤病毒( HPV) 、疱疹病毒( HSV) 、丙型肝炎病毒( HVC) 、细小病毒B19、人禽流行性感冒病毒( AIV) 、严重急性呼吸综合征冠状病毒( SARS) 等等，由于免疫组化在感染性疾病诊断中具有及时性、低风险性、高敏感性、特异性、有效性等特点，可以用于( 1) 用于人类新病原微生物的识别;( 2) 提供快速的形态学诊断，使严重感染性疾病得以早期治疗; ( 3) 在无法取得新鲜组织或尚无培养方法的情况下，提供诊断并对发病机制进行研究和认识。
2． 10 药物靶点免疫组化
免疫组化及分子病理学方法在疾病诊断中仅仅起辅助治疗的作用，而药物病理学是用病理学的方法确定药物治疗的靶点、评价药物治疗的疗效、预测药物治疗的反应，因此药物靶点免疫组化属“独立诊断”。
3 免疫组化中应注意的问题
3.1 假阳性
由于免疫组化的步骤繁多，对每一步的操作要求规范准确，很多失误可能造成假阳性的结果，可能的原因有：（1）一抗的浓度及一抗是否失效;（2）试剂未充分覆盖组织;（3）抗体孵育时间过长;（4）操作过程中组织变干，造成组织边缘收缩或损坏形成伪影;(5)DAB显色时间太长；（6）由于胞浆里含有较多的蛋白质；（7）非特异性抗体吸附常见于坏死组织中，
使坏死组织呈较高的背景染色，在免疫组化中应避免选择坏死组织较多的蜡块。
3.2 假阴性
导致假阴性结果的原因有: ( 1) 抗原修复方法选择不当，根据不同的抗原特点采用不同的修复方法，大多数抗体要求热修复，热修复又包括高压修复、微波修复及煮沸热修复; 而对某些细胞内抗原和细胞间质抗原需要用酶消化，如表皮生长因子( EGFR) 要求胃蛋白酶( Pepsin) 消化，而Vimentin 则不用修复; ( 2) 一抗本身的问题: 一抗效价降低或失效。在免疫组化中染色结果的假阴性会导致错诊或漏诊，进而影响临床诊断及延误治疗。解决这一问题的可通过设立阳性对照，比较两者染色结果。若阳性对照有表达，表明试剂和染色体系及实验步骤均无问题; 若阳性对照无表达，则检测过程中某一试剂或某个步骤存在问题，应逐一查找原因。
4 总结
随着免疫组化技术的发展，在临床病理诊断研究中，免疫组化的作用显得越来越重要，但是免疫组化技术也有自身的缺陷和不足，免疫组化的步骤比较繁琐，而且每一步的操作要求比较精确，还需要有相应的对照，因此我们要恰当的运用免疫组化技术，要使免疫组化技术能在人类疾病的鉴定和治疗过程中起积极的作用。
免疫组化技术及其注意事项 一、免疫组化染色前处理技术操作规范 1、取材：理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm，大多数实验室都认为组织在加热抗原修复过程中造成脱片的主要原因是取材过厚或脱水浸蜡处理不当所致。良好的取材、固定、脱水过程是免疫组化质控的前提，如果H&E切片都做不出满意的染色结果，那么免疫组化染色也将无从谈起,根本无法保证染色质量。 2、固定：在众多的组织固定液中（如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛等），不同的实验方法在使用上各有千秋。但在保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上，福尔马林是最好、既经济又通用。而含酸或含汞的固定液对抗原保存均不理想。组织离体后固定一般不要超过30分钟，在常温条件下固定时间为8-24小时。同时还要注意避免福尔马林过度固定造成的组织抗原丢失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林一周固定后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检测，因为组织固定后会引起蛋白或蛋白分子之间形成交联，导致抗原位点遮盖，可以通过抗原修复方法来修正，若加抗体前不采用抗原修复，则免疫组化染色常不能到达理想结果或不成功。组织同样不能长时间放置在70%的乙醇中，酒精固定后的组织形态不如福尔马林固定的组织.脱钙液对抗原破坏较为严重，因此在组织脱钙前最好在福尔马林液中固定48小时，若组织没有固定透则酸会破坏抗原，脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在最低的限度。 3、浸蜡：我们认为浸蜡温度应控制在58~60℃左右，浸蜡用的石蜡应经常更换，以减少石蜡中二甲苯的含量。高温下的二甲苯容易使组织发脆，细胞收缩，更容易掉片。 4、切片厚度：用于免疫组织化学染色的切片厚度为3-4微米。为防止在染色过程中脱片，需要使用硅化玻片裱片。 5、硅化玻片的制备：载玻片经酸洗冲洗干净后烤干；2%APES丙酮或无水酒精中浸泡1~2min；丙酮或无水酒精洗1~2分钟；蒸馏水浸洗1~2min；烤干备用。 6、烤片：切片在60℃~65℃烤箱中烤片30-60分钟左右。有些实验室采用烤片过夜。有报导烤片温度超过60℃时，烤片时间超过18小时的切片，免疫组化染色强度比烤4小时的切片要略弱。温度过高或时间过长均会影响抗原的活性，原因是在高温干燥条件下可以加速组织切片中抗原的氧化。 7、切片保存：一些实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温
常用免疫组化标记物公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
常用免疫组化指标的意义 Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增埴细胞核抗原)。 多数腺癌表达CEA Rb (retinoblastoma视网膜母细胞瘤) 基因是肿瘤抑制基因，调节细胞周期。 P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。 E-Ca，E钙粘附蛋白，介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，其功能丧失引起细胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。 PS2（雌激素调节蛋白），其表达和ER表达有关，可作为内分泌治疗和预后判断的指标之一。 CK18，低分子量角蛋白，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，主要用于腺癌诊断。 CK19，分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应 Hep par 1,肝细胞抗原，正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性，低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。 CK20，用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。 CK7 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。 Villin 绒毛蛋白，正常组织中，villin通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾实质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有明显腺样结构的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的可能性极低。 乳腺癌也经常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别排除的一种疾病。因为在转移癌组织上观察到明显的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极
免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法
免疫组化技术 原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 分类（常用） 1、免疫荧光方法 最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。 2、免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。 3、免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法 标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
免疫组化常用标记物 免疫组化常用标记物 一、常用标志物 1. CD15(LeuM1)---（阳性部位：细胞膜）。是一种由半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原。免疫组织化学表达：成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等。 2. 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）(CD66e)---（阳性部位：细胞膜/浆）。癌胚抗原是表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，分子量为180kDa。存于某些恶性肿瘤组织尤其是内胚层来源发肿瘤中，大多数胃肠道（包括胰腺）和肺腺癌均有表达，少量成人上皮细胞和良性肿瘤亦可表达。CEA主要用于标记上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。 3.嗜铬素A（chromogranin A，CgA）---（阳性部位：细胞浆）。嗜铬素是位于神经分泌颗粒内的酸性糖蛋白家族，是一组可溶性酸性蛋白，分子量为76～1 20 kDa，分布广泛。含量最丰富的是嗜铬素A，另两个是嗜铬素B和嗜铬素C。几乎所有的神经内分泌肿瘤中均可检测到嗜铬素。嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞的分泌颗粒中，也广泛分布于所有含有颗粒的内分泌细胞和神经内分泌细胞来源的肿瘤细胞。此抗体可以识别嗜铬素A抗原羧基末端的片段，而不与氨基末端的片段反应，主要用于标记神经内分泌细胞及其来源的肿瘤。对小细胞癌进行抗原修复可提高检测的敏感性。 4.细胞角蛋白（cytokeratin pan，广谱CK）--- AE1/ AE3（阳性部位：细胞浆）。此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白（Ⅰ型/低分子量）和碱性细胞角蛋白（Ⅱ型/高分子量）。用于标记上皮及上皮来源的肿瘤，特别是对鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性具有一定的意义。 5.细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）---（阳性部位：细胞浆）。在正常组织中，鳞状上皮和导管上皮的基底细胞以及部分的鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞阳性，腺上皮细胞阴性。因此，可用于鳞癌和腺癌、间皮瘤和腺癌的鉴别诊断。支气管上皮基底细胞、间皮；鳞癌、大细胞癌、移行细胞癌、间皮瘤阳性。大多数腺癌为阴性。 6. 细胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）---（阳性部位：细胞浆）。CK7是分子量为54 kDa的一种碱性细胞角蛋白，存在于大多数正常组织的腺上皮和移行上皮细胞中，一般非上皮来源的细胞无表达。在卵巢、乳腺和肺的腺癌呈阳性反应，而胃肠道的腺癌阴性。 7. 细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）---（阳性部位：细胞浆）。CK20（46kDa）存在于正常的胃肠道上皮、移行上皮、Merkel细胞及其来源的肿瘤，而乳腺癌、肺癌和神经内分泌肿瘤不表达。CK7positive CK7 negative CK20 positive uninformative colorectum CK20 negative lunguninformative 8. 细胞角蛋白（高分子量）（cytokeratin，HMW）---（阳性部位：细胞浆）。高分子量细胞角蛋白抗体（34βE12）可以识别68kDa、58kDa、56.5kDa和50kD a的细胞角蛋白。 9.上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）(MUC1)---（阳性部位：细胞浆）。上皮膜抗原是一种高分子量（400 kDa）跨膜糖蛋白，广泛分布于各
免疫组化原理及步骤 免疫组化操作规程 一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。 二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。 三、试剂配制 1. 0.01 M PBS（pH 7.34 ）：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml ； 1000 ml 0.2M PB （pH 7.4）＝5.93 g NaH 2 PO 4 2·H 2 O ＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B （A. 0.2 M NaH 2 PO 4 2·H 2 O ：15.6 g in 500 ml ddH 2 O ； B. 0.2 M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O ：71.632 g in 1000 ml dH 2 O ）。 2. Citrate Buffered Saline （0.01 M 柠檬酸缓冲液， PH6.0 ）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O （A.Citrate acid
（柠檬酸）：10.5 g
加双蒸水至 1000 ml ； B.Citrate sodium （柠檬酸钠）： 29.41 g 加 双蒸水至 1000 ml ）。 3. 细胞通透液：由终浓度分别为 0.3% 双氧水和 0.5%Triton X-100 混合而成。配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS ，再接着 加 120 ul TritonX-100, 并加热一儿，冷却至临用前加 0.4 ml 30 ％ H 2 O 2 。 4. 5％羊血清或封闭血清，用 PBS 稀释。 5. 含 0.03 ％ H 2 O 2 的 0.05 ％DAB （避光） ：用 20×DAB （1％， 10 mg/ml ）5 ul ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS 。 6. 一抗、二抗均用 PBS 稀释。 7. Xylene 、梯度 Ethanol （100 ％×2、95％、80％、70％、50％）、 双蒸水、中性树胶（封裱剂）。 8. 苏木精染液： 四、操作步骤 1 、脱蜡、水化 60 ℃× 20 min →Xylene 2 × 10 minut ；es 80% ethanol 2 minutes ； 70% ethanol 2 minutes ； distilled water:5 min ； PBS 洗 3 次×3 min 。 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 100% absolute ethanol ：2 ×5 minutes ； 95% ethanol 2 minutes ；
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切 片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
常用免疫组化指标的意义 Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增埴细胞核抗原)。 多数腺癌表达CEA P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。 E-Ca，E钙粘附蛋白，介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，其功能丧失引起细胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。 PS2（雌激素调节蛋白），其表达和ER表达有关，可作为内分泌治疗和预后判断的指标之一。 CK18，低分子量角蛋白，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，主要用于腺癌诊断。 CK19，分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应 CK20，用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。 CK7 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。 Villin 绒毛蛋白，正常组织中，villin通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾实质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有明显腺样结构的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的可能性极低。 乳腺癌也经常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别排除的一种疾病。因为在转移癌组织上观察到明显的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极不可能为乳腺来源。其他villin 免疫组化染色通常为阴性表达的肿瘤还有：如卵巢浆液性癌、尿道移行细胞癌和前列腺癌。间皮瘤也经常为villin阴性表达，因此在一些情况下Villin还可以作为鉴别间皮瘤和腺癌使用抗体的一种。
免疫组化与免疫荧光 一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。 二、区别是： 1、概念和基本原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。 免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。 2、标本制作： 免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。 3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。 4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。 5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。 6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。 免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
免疫组化原理、步骤及要注意的事 项 免疫组化 ，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。 二，免疫组化技术的基本原理 免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等, 用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。 ，免疫组化步骤 1, 切片，烤片60C, 1h;
2, 脱蜡及复水 二甲苯10min，100%乙醇5min，95%乙醇5min，90%乙醇5min，85%乙醇5min，80%乙醇5min，75 %乙醇5min，60%乙醇5min，50%乙醇5min，30%乙醇5min，自来水1min，双氧水1min ； 3，1份30%H2O加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min; 4, 微波修复 将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98E -100C）加热至沸腾，冷却（约5-10min）,反复两次； 5, 将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min； 6, 封闭，5%BSA室温20min,甩去多余液体； 7, 滴加一抗，37C, 1h,或者4C过夜； 8, PBS洗涤3次，每次3min； 9, 滴加二抗，37°C, 15-30min ； 10, PBS洗涤3次，每次3min； 11, 滴加SABC 37C, 30min ； 12, PBS洗涤3次，每次5min； 13, 1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀； 14, DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）; 15, 自来水冲洗干净，过蒸馏水； 16, 苏木素复染2min,自来水冲洗； 17, 脱水 30%乙醇3min, 50%乙醇3min, 70%乙醇3min, 80%乙醇3min, 90%乙醇3min, 95%乙醇3min, 100%乙醇3min,二甲苯20min ； 18, 树胶封片，镜检。
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
免疫组化常用标记物 一、常用标志物 1. CD15(LeuM1)---（阳性部位：细胞膜）。是一种由半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原。免疫组织化学表达：成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等。 2. 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）(CD66e)---（阳性部位：细胞膜/浆）。癌胚抗原是表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，分子量为180kDa。存于某些恶性肿瘤组织尤其是内胚层来源发肿瘤中，大多数胃肠道（包括胰腺）和肺腺癌均有表达，少量成人上皮细胞和良性肿瘤亦可表达。CEA主要用于标记上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。 3.嗜铬素A（chromogranin A，CgA）---（阳性部位：细胞浆）。嗜铬素是位于神经分泌颗粒内的酸性糖蛋白家族，是一组可溶性酸性蛋白，分子量为76～120 kDa，分布广泛。含量最丰富的是嗜铬素A，另两个是嗜铬素B和嗜铬素C。几乎所有的神经内分泌肿瘤中均可检测到嗜铬素。嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞的分泌颗粒中，也广泛分布于所有含有颗粒的内分泌细胞和神经内分泌细胞来源的肿瘤细胞。此抗体可以识别嗜铬素A抗原羧基末端的片段，而不与氨基末端的片段反应，主要用于标记神经内分泌细胞及其来源的肿瘤。对小细胞癌进行抗原修复可提高检测的敏感性。 4.细胞角蛋白（cytokeratin pan，广谱 CK）--- AE1/ AE3（阳性部位：细胞浆）。此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白（Ⅰ型/低分子量）和碱性细胞角蛋白（Ⅱ型/高分子量）。用于标记上皮及上皮来源的肿瘤，特别是对鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性具有一定的意义。 5.细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）---（阳性部位：细胞浆）。在正常组织中，鳞状上皮和导管上皮的基底细胞以及部分的鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞阳性，腺上皮细胞阴性。因此，可用于鳞癌和腺癌、间皮瘤和腺癌的鉴别诊断。支气管上皮基底细胞、间皮；鳞癌、大细胞癌、移行细胞癌、间皮瘤阳性。大多数腺癌为阴性。 6. 细胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）---（阳性部位：细胞浆）。CK7是分子量为54 kDa的一种碱性细胞角蛋白，存在于大多数正常组织的腺上皮和移行上皮细胞中，一般非上皮来源的细胞无表达。在卵巢、乳腺和肺的腺癌呈阳性反应，而胃肠道的腺癌阴性。 7. 细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）---（阳性部位：细胞浆）。CK20（46kDa）存在于正常的胃肠道上皮、移行上皮、Merkel细胞及其来源的肿瘤，而乳腺癌、肺癌和神经内分泌肿瘤不表达。 CK7 positive CK7 negative CK20 positive uninformative colorectum CK20 negative lung uninformative 8. 细胞角蛋白（高分子量）（cytokeratin，HMW）---（阳性部位：细胞浆）。高分子量细胞角蛋白抗体（34βE12）可以识别68kDa、58kDa、56.5kDa和50kDa的细胞角蛋白。 9.上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）(MUC1)---（阳性部位：细胞浆）。上皮膜抗原是一种高分子量（400 kDa）跨膜糖蛋白，广泛分布于各种上皮细胞及其来源的肿瘤。癌细胞过表达MUC1与肿瘤侵袭有关，有意义的免疫反应性为膜阳性，如为纯粹的胞浆着色则为假阳性。此抗体可以用于标记上皮及上皮源性肿瘤，EMA阳性表达的肿瘤包括大多数的癌、间皮瘤、滑膜肉瘤和上皮样肉瘤等，淋巴瘤、黑色素瘤和软组织肿瘤阴性表达。 10.HBME1---（阳性部位：细胞膜）。该抗体与间皮细胞表面的抗原反应，染色方式呈现一种特殊的“厚膜”方式，在鉴别间皮瘤与腺癌时有一定的参考价值：间皮瘤为厚膜型，腺癌为薄膜型或胞浆着色。 11.突触素（synaptophysin，Syn）---（阳性部位：细胞浆）。突触素是分子量为38kDa的糖蛋白，主要存在于神经元突触前囊泡膜，是神经性和上皮性神经内分泌肿瘤的特异性标志之一，用于标记神经内分泌肿瘤。 12.甲状腺转录因子1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）---（阳性部位：细胞核）。TTF-1表达于甲状腺腺上皮和肺的上皮细胞中。大多数肺的小细胞癌、腺癌、少部分大细胞癌、大多数非典型神经内分泌肿瘤免疫组化结果显示TTF-1阳性，而肺鳞癌及绝大多数典型类癌TTF-1阴性。
免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
---------------------------------------------------------------------------------华中科技大学同济医学院
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免疫组化 一，免疫组织化学简介 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 二，免疫组化技术的基本原理 免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。 三，免疫组化步骤 1，切片，烤片60℃，1h； 2，脱蜡及复水 二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min； 3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min； 4，微波修复 将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次； 5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；