离子色谱法与高效液相色谱法对丙酸钙检测的比较研究
杨芳
（淮安市产品质量技术监督所，淮安，223001，YangFang072@https://www.doczj.com/doc/2c2016380.html,）
摘要：本文分别利用离子色谱法（IC）与高效液相色谱法（HPLC）对食品中丙酸钙的检测进行比较研究。离子色谱法（IC）的样品平均加标回收率达到98.98%，方法最低检出限为5mg/L；而高效液相色谱法（HPLC）中样品平均加标回收率为96.85%，方法检出限为30mg/L。因此离子色谱法方法具有更低的检出限，更高的加标回收率，其对食品中丙酸钙的检测具有明显的优势。
关键词：离子色谱法；高效液相色谱法；丙酸钙；检测；比较
1 前言
丙酸钙，白色结晶性粉末，熔点400℃以上（分解），无臭或具轻微特臭。可制成一水物或三水物，为单斜板状结晶，可溶于水，微溶于甲醇、乙醇，不溶于苯及丙酮。在酸性条件下，产生游离丙酸，具抗菌作用，比山梨酸弱，比乙酸强，是近年发展起来的新型食品防腐剂，它的防腐保鲜奇效使它广泛应用于面包、西点、饼干、酱油、水果等的防腐保鲜，其中丙酸钙不仅可以延长食品的保质期,而且还可以通过代谢作用被人体吸收，供给人体必须的钙，这是其它防腐剂无法比拟的［1,2,3］。国家标准方法针对食品中丙酸钙的测定是高效液相色谱法［4］，而本文利用离子色谱法对丙酸钙进行检测，并与高效液相色谱法进行比较研究。https://www.doczj.com/doc/2c2016380.html,/Shop/Product/Product_680423.shtml
2试验
2.1试验仪器与试剂
2.1.1试验仪器
CIC-100型离子色谱仪系统（配有电导检测器，色谱工作站，SHODEX IC SI-52 4E离子色谱柱）（青岛盛翰）瓦里安ProStar液相色谱仪（配有二极管阵列检测器，色谱工作站，C18柱）（美国瓦里安）https://www.doczj.com/doc/2c2016380.html,/Shop/product.asp?id=105119
2.1.2 试验试剂
丙酸标准溶液：购于国医集团试剂有限公司，纯度99.89%。标准使用液，将标准储备液逐级稀释即可。实验用水为Millpore纯水系统处理的高纯水。其他所用试剂为分析纯。
2.2仪器分析条件
2.2.1离子色谱仪条件
淋洗液：A 20mmol/LNaOH B H2O
抑制器电流：64mA
淋洗液流速：1.5mL/min
进样量：20μL
梯度淋洗条件：
2.2.2高效液相色谱仪条件[4]
色谱柱：Ultimate AQ-C18 5μm 250×4.6mm
流动相：1.5g/L磷酸氢二铵溶液（用磷酸溶液调pH至2.7-3.5）
流速：1.0mL/min
柱温：25℃
进样量：20μL
波长：214nm
3 试验谱图分析
3.1离子色谱法（IC）中丙酸根标准物质图谱
图1 IC中丙酸根标准物质图谱（16.084’-F-，18.961’-乙酸，19.969’-丙酸，21.420’-甲酸）
3.2高效液相色谱法（HPLC）中丙酸根标准物质图谱
3.3 标准曲线与最低检出限
离子色谱法中做出丙酸离子线性曲线，得到丙酸根离子线性相关性为99.97%。按信噪比S/N=3计，本方法中丙酸根离子最低检出限为5mg/L。而GB/T 23382-2009《食品中丙酸钠、丙酸钙的测定高效液相色谱法》[4]中的方法检出限为30 mg/L。
3.4 样品加标回收率
样品溶液中均加入400mg/L丙酸根离子标准溶液做加标回收率试验。IC法中样品平均加标回收率为98.98%。HPLC法中样品平均加标回收率为96.85%。
3.5 精密度
在相同试验条件下，对400mg/L丙酸根离子标准溶液进样6次，两种仪器的相对标准值偏差均小于1%。https://www.doczj.com/doc/2c2016380.html,/Shop/Product/Product_269868.shtml
4 结论
本文利用离子色谱仪（IC）和高效液相色谱仪（HPLC）对食品中丙酸钙的测定进行比较研究，得出结论如下：
（1）IC方法中丙酸根离子最低检出限为5mg/L，HPLC方法检出限为30 mg/L。
IC方法具有更低的检出限；
（2）IC法中样品平均加标回收率为98.98%，HPLC法中样品平均加标回收率为96.85%。
IC方法具有更高的加标回收率。
故离子色谱法对食品中丙酸钙的检测具有更好的优势，必将成为食品检验史上的潮流。
参考文献
[1] 吴翠红,王喜正等.丙酸盐类的生产工艺及市场前景[J]齐鲁石油化工,2003,31(2): 131-135.
[2] 罗欣,朱燕等.丙酸钙在真空包装鲜牛肉保鲜中的应用[J].研究肉类研究,1998,02.
[3] 王娟等.离子色谱法对食品中丙酸钙的测定[J].第十一届全国离子色谱学术报告会论文集,2006,11:28-30.
[4] 中华人民共和国国家标准GB/T 23382-2009 食品中丙酸钠、丙酸钙的测定高效液相色谱法.
仪器分析练习题（二）——高效液相色谱法部分 一、选择题 1. 分离一组高聚物（分子量>2000）时最宜采用的色谱方法是（D ） A. 气固色谱 B. 反相键合相色谱 C. 离子交换色谱 D. 凝胶色谱 2. Si-O-Si-C型的18烷基固定相可用于（ B ） A. 正相色谱 B. 反相色谱 C．离子交换色谱 D. 空间排阻色谱 3. 反相离子对色谱法分离试样组分时，随着对离子浓度的增大，组分的保留时间（A ）。 A. 增大 B. 减小 C. 不变 D. 不能确定 4. 下列试剂中可作为正相色谱流动相的是（C D ）。 A. 水 B. 甲醇 C．乙腈 D. 正已烷 5. 在惰性担体表面健合上基团－SO3ˉ后的离子交换树脂称为（ B ）。 A．强碱性阳离子交换树脂 B. 强酸性阳离子交换树脂 C．强碱性阴离子交换树脂 D. 强酸性阴离子交换树脂 6. 分离一组高沸点的物质时最宜而是采用的色谱方法是（D ）。 A. 气液色谱 B. 气固色谱 C. 毛细管气相色谱 D. 液相色谱 7. 应用正相色谱法分析一组组分时，组分的出峰顺序为（A ）。 A. 极性小的组分先出峰 B. 极性大的组分先出峰 C. 分子量小的先出峰 D. 分子量大的先出峰 8. 火焰光度检测器是（ C ）检测器。 A. 通用型、质量型 B. 通用型、浓度型 C. 选择型、质量型 D. 选择型、浓度型 9. 梯度洗脱适用于下列哪种色谱分析方法是（ C ）。 A. 气液色谱 B. 液液分配色谱 C. 凝胶色谱 D. 反相键合相色谱 10. 下列试剂中最适宜作为反相色谱流动相的是（ A ）。 A. 甲醇水 B. 环已烷 C．四氯化碳 D. 正已烷 11. 在惰性担体表面健合上基团－NR3＋后的离子交换树脂称为（ C ）。 A．强碱性阳离子交换树脂 B. 强酸性阳离子交换树脂 C．强碱性阴离子交换树脂 D. 强酸性阴离子交换树脂 12. 分离一组难挥性、可离解的物质时最宜而是采用的色谱方法是（ C ）。 A. 气液色谱 B. 正相色谱 C. 离子交换色谱 D. 气固色谱 13. 应用反相键合相色谱分离R-CH3、R-COOH及R-COCH3（R为一长碳链）时出峰顺序为（ A ）。 A. R-COOH、R-COCH3 、R-CH3 B. R-CH3 、R-COCH3 、R-COOH、 C. R-COCH3 、R-COOH、R-CH3 D. R-CH3 、R-COOH、R-COCH3
高效液相色谱法在水质检测中的应用 摘要：液相色谱仪已广泛应用于水环境监测中，逐步成为常规检测方法，其适用于分子量大、挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析，具有准确、快速等特点。 关键词：液相色谱仪；水环境监测；有机污染物 1、引言 高效液相色谱法 ( high performance liquid chro-matography，简称 HPLC)，具有下列主要优点：固定相颗粒细且规则均匀，传质阻抗小，组分间分离效率高；利用高压泵输送流动相，大大缩短分析时间；使用高灵敏检测器，提高了检测灵敏度，在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面，达到了和气相色谱法相媲美的程度，气相色谱法仅适于分析蒸汽压低、挥发性高、沸点低、热稳定性好的样品。在全部已知的有机化合物中仅有20%的样品符合这些条件，近80%的有机化合物属于挥发性低、易受热分解或者大分子化合物，适合于高效液相色谱分析，因此，HPLC 应用前景更为广阔。 在环境监测中，高翔液相色谱法已逐步上升为常用的监测方法，如检测多环芳烃类、酚类、多氯联苯、苯胺类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药除草剂等。随着经济的快速发展，人们在获取大量化学物质以满足经济、生产和生活需要的同时，也将一些典型的有毒有害的有机污染物带入环境，其中部分有机污染物已经直接或间接被证明具有致癌、致畸和致突变的作用，给人类健康和自然生态环境带来了严重、持久、潜在的危害。根据发达国家的经验和我国经济发展
伴随的污染现状，有毒有机污染物也必将成为我国环境监测的重要目标。 2、实验部分 2.1主要仪器 岛津公司生产的高效液相色谱仪（LC-20A），包括： (1)CBM-20A—系统控制器； (2)CTO-20A—色谱柱柱温箱； (3)LC-20A—溶液传输单元； (4)SPD-20A—紫外可见光检测器； (5)RF-20A—荧光检测器； (6)SIL-20A—自动进样器； (7)DGU-20A3R—在线脱气机 (8)数据处理：LC-LabSolutions工作站软件。 (9)色谱柱：Shim-pack column size serial NO.VP-ODS。 2.2液相色谱原理简介 液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的 一种连续多次交换的过程，它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 2.3建立实验方法 研究液相色谱测定苯系物的实验方法，结合查找的资料及实验验证，确定检测苯系物的实验方法如下： (1) 进样量：10微升；色谱柱：Shim-pack column size serial NO.VP-ODS 柱。
高效液相色谱仪（HPLC）校正方法 0.1输液系统： 0.1.1梯度误差G C不超过±3% 0.1.2泵流量设定值误差 S s＜±2% 0.1.3流量稳定性误差 S R＜±2% 0.2紫外检测器性能 0.2.1基线噪声不超过5×10-4AU，基线漂移不超过5×10-3AU 0.2.2定量测量重复性误差（6次进样）RSD≤1.5% 0.2.3最小检测浓度不超过1×10-7g/ml萘/甲醇溶液 0.2.4可调波长紫外可见光检测器波长示值不超过±2nm(HP1100高效液相色谱仪可由仪器自身完成) 1校正条件 1.1环境温度10-30℃，相对湿度低于65% 1.2校正设备 1.2.1秒表分度值小于0.1 s 1.2.2分析天平最大称量200g,最小分度值0.1mg 1.2.3容量瓶 1.2.4微量注射器 1.3标准物质和试剂 1.3.1HPLC用甲醇、纯水，分析纯的丙酮 1.3.21×10-4g/ml，1×10-7g/ml的萘甲醇溶液 1.3.3紫外波长标准溶液 2校正方法 2.1梯度误差G C的校正 2.1.1进行梯度洗脱程序，A溶剂为水，B溶剂为0.1%丙酮的水溶液，B经5个阶段从0变到100%， 20%—40%—60%—80%—100%，重复测量两次，取平均值，求各段梯度误差Gci，取最大作为仪器梯度误差，公式：Gci=（Li—Lm）/Lm×100% Li：第i段信号值的平均值； Lm ：各段输出信号平均值的平均值 可接受标准： -3%≤Gci≤3% 2.2泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S R的校正 2.2.1将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，按表一设定流量，待 流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确的收集10-25
乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱检测法 三聚氰胺（Melamine）是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料，主要用于生产三 聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革等行业，为白色晶体。三鹿奶粉事件引发了对三聚氰胺检测的广泛关注，国家质量监督检验检疫总局和国家标 准化管理委员会相继发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T22388-2008）和《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T22400-2008）的国家标准。本文参考了 以上标准并进行配制条件优化，建立了液相色谱检测法，前处理简单，检测限、精密度、重 现性以及回收率均符合国家标准。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 LC1620高效液相色谱仪（含UV1620紫外-可见检测器1台，P1620高压恒流泵1台，上海 舜宇恒平科学仪器有限公司）；AT-330色谱柱温箱（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；FA2004 分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TGL-16G-A离心机（上海安亭科学仪器厂）； 三聚氰胺标准品(>99%，上海安谱)；辛烷磺酸钠(色谱纯，北京百灵威)；磷酸(分析纯)、乙 腈(色谱纯，美国Tedia)、纯净水(杭州娃哈哈)。 1.2 标准品溶液配制 精密称取三聚氰胺标准品，溶于50％的甲醇水溶液，配制称1.422mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。根据实验需要，用流动相逐级稀释成适当浓度的标准工作液。 1.3 样品前处理 称取2g酸奶样品与50ml具塞离心管中，加入乙腈：水＝50：50混合溶液15ml，充分混匀 后超声提取15min。取提取液250ul，加入0.1mol/l盐酸750ul，混匀，以12000r/min离心 5min，取上清液，0.22um滤膜过滤，作为HPLC测定溶液。 1.4 色谱条件： 色谱柱：Globalsil C18 5μm(ID4.6mm×250mm) 流动相：乙腈/缓冲盐=15/85（缓冲盐：10mM辛烷磺酸钠水溶液，含0.1％磷酸） 流速：1.0ml/min 波长：240nm 温度：40℃ 进样量：20μl 2 实验结果 2.1 精密度实验 取浓度为0.569μg/ml三聚氰胺标准工作液，按上述色谱条件，连续进样5次，以各成分峰 面积计算RSD(%)，所得结果如表1所示：保留时间相对标准偏差（RSD）为0.23％，峰面 积RSD为0.57％。 表1 精密度实验 time（min）Peak High Peak Area NO. Retention 1 11.933 289 4216.8 2 11.990 290 4264.2 3 11.928 287 4246.0 4 11.927 287 4242.8 5 11.923 284 4218.6 RSD(%) 0.23 0.82 0.57
高效液相色谱法 思考题和习题 1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。 相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测 不同点： 2．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别？ 离子色谱法(Ion Chromatography) ：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法，也可用于阳离子分析。 反相离子对色谱法(IPC或PIC) ：反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和t R，以改善分离。适用于较强的有机酸、碱。 反相离子抑制色谱：在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和t R，以达到改善分离的目的。适用于极弱酸碱物质（pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物） 3．速率理论方程式在HPLC中与在GC中有何异同？如何指导HPLC实验条件的选择？ 解:液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相传质以及柱外效应。 在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质及柱外效应。 在高效液相色谱中，对液液分配色谱，Van Deemter方程的完整表达形式为 由此，HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜过快；③柱温适当。 4．试讨论影响HPLC分离度的各种因素，如何提高分离度？ (1) 色谱填充性能 液相色谱柱分离性能的优劣，是由固定相粒度、柱长、由柱内径和填充状况决定的柱压降这三个参数度决定的。这三个参数度也决定了样品组分的保留时间，保留时间不仅与色谱过程的热力学因素k有关，还直接与决定柱效与分离度的柱性能参数及流动相的黏度有关，这些参数都是影响色谱分离过程动力学的重要因素。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般都是购买商品柱，很少自行制备。 (2) 流动相及流动相的极性 液相色谱中，改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接因素。液相色谱不可能通过增加柱温来改善传质。因此大多是恒温分析。流动相选择在液相色谱中显得特别重要，流动相可显著改变组分分离状况。 (3) 流速 流速大于0.5 cm/s时， H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。 5．指出苯、萘、蒽在反相色谱中的洗脱顺序并说明原因。 三者极性顺序从大到小是苯、萘、蒽，因此在反相色谱中的洗脱顺序为苯、萘、蒽，苯最先出峰。 6．宜用何种HPLC方法分离下列物质？ （1）乙醇和丁醇；（2）Ba2+和Sr2+；（3）正戊酸和正丁酸；（4）相对分子质量的的葡糖苷。 1
2015 年版药典高效液相色谱法、质谱法
2015 版药典 --- 高效液相色谱法、质谱法 0512 高效液相色谱法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处 理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为 3.9 ～ 4.6mm，填充剂粒径为 3～lOμm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约 2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 （1）色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物 等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰 基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残 留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当 提高色谱柱的温度，但一般不宜超过 60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相 pH 值一般应在 2～8 之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚 合物色谱柱可耐受更广泛 pH值的流动相，适合于 pH 值小于 2 或大于 8 的流动相。 （2）检测器最常用的检测器为紫外 - 可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、 蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外- 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与 其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射 检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外 - 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈 线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外 - 可见分光检测器所用流动相应符合紫外 - 可见分光光度法（通则 0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测 器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 （3）流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇 - 水系统和乙腈 - 水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈 - 水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动 相中有机溶剂一般不低于 5%，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。
高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性
准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值
精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查
第二十章高效液相色谱法 思考题和习题 1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。 相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测不同点： 分析对象及范围流动相的选择操作条件 GC 能气化、热稳定性好、且沸 点较低的样品，占有机物的20% 流动相为有限的几种“惰 性”气体，只起运载作用，对 组分作用小 加温常压操作 HPLC 溶解后能制成溶液的样品， 高沸点、高分子量、难气化、离 子型的稳定或不稳定化合物，占 有机物的80% 流动相为液体或各种液 体的混合。它除了起运载作用 外，还可通过溶剂来控制和改 进分离。 室温、高压下进行 2．何谓化学键合相常用的化学键合相有哪几种类型分别用于哪些液相色谱法中 采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。 目前常用的Si-O-Si-C型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。①非极性键合相：常见如ODS键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。 3．什么叫正相色谱什么叫反相色谱各适用于分离哪些化合物 正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。 反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。4．简述反相键合相色谱法的分离机制。 典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。 反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。对于反相色谱的分离机制目前，保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制可用疏溶剂理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的"分子毛"，这种"分子毛'有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂作用，将会从水中被＂挤＂出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用，其结果使组分分子在固定相得到保留。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减小保留值，此即解缔过程，显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般说来，固定相上的烷基配合基或被分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比k'也越大，保留值越大。不难理解，在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。 5．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别
高效液相色谱 高效液相色谱仪 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。 目录 化学信息 基本信息 性状描述 物理说明 药理作用 危险说明 历史 特点 主要类型 结构组成 综述 高压输液泵 色谱柱 进样器 检测器 馏分收集器 数据获取和处理系统 分离原理 液—固色谱法 离子交换色谱法 离子对色谱法
离子色谱法 空间排阻色谱法 流程 使用方法 综述 色谱柱的理论板数分离度 拖尾因子 测定方法 综述 面积归一化法 主成分自身对照法内标法 外标法 设备选型 综述 相对分子质量 溶解度 化学结构 仪器设备 综述 高压泵 梯度洗提 进样装置 色谱柱 检测器 应用实例 化学信息 基本信息 性状描述 物理说明 药理作用 危险说明 历史 特点 主要类型 结构组成 综述 高压输液泵 色谱柱 进样器 检测器 馏分收集器 数据获取和处理系统
分离原理 液—固色谱法 离子交换色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 空间排阻色谱法 流程 使用方法 综述 色谱柱的理论板数 分离度 拖尾因子 测定方法 综述 面积归一化法 主成分自身对照法 内标法 外标法 设备选型 综述 相对分子质量 溶解度 化学结构 仪器设备 综述 高压泵 梯度洗提 进样装置 色谱柱 检测器 应用实例 展开 化学信息 基本信息 中文名称：葛根素(HPLC),98% 中文别名：葛根黄酮，8-beta-D-葡萄吡喃糖-4',7-二羟基异黄酮 英文名称：Puerarin 英文别名：8-(β-D-Glucopyranosyl-7-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one 纯度：98% CAS号：3681-99-0 分子式：C21H20O9 分子量：416.38
高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
离子类高效液相色谱法 1308102-19 彭陈 摘要：离子色谱是高效液相色谱的一种，是分析阴离子和阳离子的一种液相色谱方法。 离子色谱的分离机理主要是离子交换。分离方式有3种：离子交换色谱，离子排斥色谱和离子对色谱。其中离子交换色谱用低容量的离子交换树脂，分离机理主要是离子交换;离子排斥色谱用高容量的树脂，分离机理主要是离子排斥；离子对色谱用不含离子交换基团的多孔树脂，分离机理主要是基于吸附和离子对的形成。 一，离子对色谱 离子对色谱法是将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。 在色谱分离过程中，流动相中待分离的有机离子A+（也可以是带负电子的离子）与固定相或流动相中带相反电荷的对离子B-结合，形成离子对化合物A+B-，然后在两相间进行分配： 若固定相为有机相，流动相为水溶液，就构成反相离子对色谱，此时A= 的分布系数B-为： 当流动相的pH值、离子强度、有机改性剂的类型、浓度及温度保持恒定时，k'与对离子的浓度［B- ］w成正比。因此通过调节对离子的浓度，就可改变被分离样品离子的保留时间Tr。
离子对色谱法，特别是反相离子对色谱法解决了以往难以分离混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子的混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱以及药物等的分离。另外，还可以借助离子对的生成给试样引入紫外吸收或发荧光的基团，以提高检测的灵敏度。 二，离子交换色谱法以及离子色谱法 （1）离子交换色谱法 离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配，固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。 离子交换色谱的固定相是交换剂，根据交换剂性质可分为： 阳离子交换剂和阴离子交换剂。 交换剂由固定的离子基团和可交换的平衡离子组成。当流动相带着组分离子通过离子交换柱时，组分离子与交换剂上可交换的平衡离子进行可逆交换，最后达到交换平衡，阴阳离子的交换平衡可表示为： 阳离子交换：R+Y-+ X-= R+X-+ Y- 阴离子交换：R-Y++ X+= R-X++ Y+ R+、R-—为交换剂上的固定离子基团，如RSO3-或RNH3+； Y+、Y-—为可交换的平衡离子，可以是H+、Na+或OH-、Cl-等 X+、X-—为组分离子。 组分离子对固定离子基团的亲和力强，分配系数大，其保留时间长；反之，分配系数小，其保留时间短；因此：离子交换色谱：是根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的。
实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置 待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 （1）样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。 （2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为：50%的甲醇。
实验二 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因 一、目的要求 1、学习高效液相色谱仪的操作。 2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。 3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。 二、基本原理 咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为： N N CH 3 H 3C O O N N CH 3 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。 三、仪器和试剂 1、Agilent 1100高效液相色谱仪。 2、色谱柱：Kromasil C18，5μ 150×4.6mm 。 3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气10min 。 4、 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110℃下烘干1h 。准确称取0.1000g 咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度1000μg·mL -1。 5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
高效液相色谱仪常用的检测器及其性能 (1)紫外吸收(UV)检测器 UV检测器是目前HPLC应用最广泛的检测器。它是依据光吸收原理，以适当的光路和电路，输出一个与试样组分浓度成正比的紫外一可见光吸收信号，其结构与一般光度计相似。其流通池是组分流过的光学通道，池体积一般为8μl，内径小于lmm，长度10mm左右。这种检测器灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱分离。紫外吸收检测要求被检测样品组分有紫外一可见光吸收，而使用的流动相无吸收，或在被测组分吸收波长处无吸收。一般选择在欲分析物有最大吸收的波长处进行检测，以获得最大灵敏度和抗干扰能力。在没有最大吸收时，可采用末端吸收。检测波长的选择除取决于待测物质的成分和分子结构外，还必须考虑流动相组成、共存组分干扰等因素。特别是各种溶剂都有一定的透过波长下限值，超过这个波长，溶剂的吸收会变得很强，以至于不能很好地测出待测物质的吸收强度。表1列出了HPLC中一些常用的溶剂透过波长的下限。 (2)光电二极管阵列(IJDA)检测器 PDA检测器又称为二极管阵列检测器(diode array UV detector，DAD)，这种检测器以光电二极管阵列作为检测元件，可进行多通道并行检测，在一次色谱测量中，可同时获得时间、波长、吸光度三者的关系，通过计算机处理，在荧光屏上显示出三维图谱，也可作出任意波长的吸光度一时问曲线和任意时间的吸光度一波长曲线。DAD的光路与紫外检测器不同，光源发出的光聚焦后先通过检测池，通过检测池的透射光由全息光栅色散成多色光，不同波长的色散光按波长顺序聚焦在阵列元件上，每个元件对应一定的纳米数。当光照射到光电二极管时，光电二极管产生讯号。由于色散过程及透射光的检测是全波长范围的，可在瞬间检测流经检测池的全吸收光谱，得到三维色谱一光谱图。计算机化的数据处理，还可进行色谱峰光谱相似性比较、峰纯度检测及利用谱图库对掣定样品进行检索等，为定性、定量分析提供更丰富的信息。 ①多通道多波长检测可以同时得到多个波长的色谱图，每个成分均可在最佳波长下检测定量。 ②光谱相似性比较在HPLC中，两个物质出峰时间一致并不能完全说明为同一物质，通过色谱峰紫外光谱一致性比较，可提高测定的可靠性。 ③峰纯度检测对色谱峰峰顶、上、下3个点的光谱进行比较，完全吻合意味这是1个单组分峰，不吻合则表示为未分离峰。并可计算出纯度系数PI，PI值在0~1之问，越接近1，表示峰纯度越好，PI可由计算机自动计算。 ④光谱检索与比较二极管阵列检测器得到的光谱图可分类存储到光谱库中，当测定类似成分时，可调出相关谱图，进行检索和比较，也可通过比较光谱相似系数比较相似性。
标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分
离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括： 1.高效液相色谱法（HPLC）的概述 2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼） 3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类 4. 液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法（HPLC）的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相
的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（L OAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅
高效液相色谱法的分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制 吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。 流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应： X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相） 其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。 吸附反应的平衡常数K为： K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。 K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。 发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。 ②液-固色谱法的吸附剂和流动相 常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。 对流动相的基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样的检测 常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用 常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法（液-液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。 液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。