第三篇发酵工程产物的提取
第十一章发酵工程下游技术发展及发酵液的预处理
第一节：发酵工程下游技术发展
一、下游技术领域及发酵产物分类(5-8min)
1.引入概念
在前11周，我们学习了菌种选育、种子培养、发酵过程控制等内容，以上为发酵的上游部分，区分上游和下游的关键是判断“发酵结束”，标准为产品质量和经济效益。
2.定义：下游技术（工程）（downstream processing）：对于由生物界自然产生的或由微生
物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取
分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。（重点）
3.从工业发酵范畴来看，从发酵液中获得的发酵产物大致可分为三类：菌体、酶、代谢产物。发酵液中的杂质：菌体、蛋白、有机酸
4.举例：酶的分离纯化；葡萄酒的纯化
二、下游加工过程在生物技术中的地位（3min）
1.组成：下游加工过程是生物技术的重要组成部分，发酵液或反应液需要经过下游加工过程才
能成为成品；
2.费用：传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的６０％，而对重组ＤＮＡ生产
蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的８０％－９０％；
3.关注程度：英国政府工业部于１９８３年发起生物分离计划（ＢＩＯＳＥＰ），专门研究下
游加工过程；１９８７年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议；我国也于１９
８９年在济南召开了一次专门会议；近十年来国内外有关生物分离或蛋白质纯化的专著陆续出版。
三、下游加工技术的特点（3min）
1.目的产物在初始原料中的含量较低;
2.含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外，还有大量的细胞、代谢、残留培养基、
无机等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；
3.目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、
表面张力等十分敏感，容易是其失活、变性；
4.种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异
的生物活性物质；
5.应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。
四、生物工业下游技术的发展历程（3min）
1.古代酿造业
古代酿造业包括酿酒、制酱（油）、醋、酸奶和干酪等。技术原始、家庭式作坊、产物基本不经过
后处理而直接使用，无下游技术。
2. 第一代生物技术
主要指19世纪60年代---20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握了纯种培养技术，生物技术进入近代酿造产业的发展阶段。到20世纪上半叶，逐渐开发形成了发酵法生产酒精、丙酮、丁醇等微生物发酵工业（厌氧发酵），其产品相对简单，基本上是无活性的小分子。此时开始引入过滤、蒸馏、精馏等近代分离技术。
3. 第二代生物技术
以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。
无菌空气制备技术、大型好氧发酵装置开发，一大批通风发酵技术产品相继投入了工业生产，如抗生素（链霉素）、氨基酸（谷氨酸）、有机酸（核酸、柠檬酸）、酶制剂（淀粉酶）、微生物多糖和单细胞蛋白等。产品多样性决定了分离方法的多样性。借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的分离技术，如沉淀、离子交换、萃取、结晶等。
4.近期的生物技术
20世纪80年代以来，生物工业下游技术进步很快，出现了很多新概念、新技术、新产品和新装备。大致可分为以下几大类
（1）固液分离技术
近20年来，将在污水处理、化学工程和选矿工程上广泛使用的絮凝技术引入到发酵液的预处理上，研究开发了菌体及悬浮物絮凝技术，改善了发酵液的分离性能，加之纤维素助滤剂的开发，大大提高了发酵液的固液分离效率。在固液分离机械方面，也出现了一些性能优良的新型机械，如带式过滤机、连续半连续板框过滤机、螺旋沉降式离心机等。微滤膜可高效分离细微的悬浮粒子。
（2）细胞破碎技术
已开发出珠磨破碎、压力释放破碎、冷冻加压释放破碎和化学破碎等技术。该技术的成熟使得胞内生物物质的大规模工业化生产成为可能。
（3）初步分离纯化技术主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。较早出现的是酶及蛋白质的盐析法；有机溶剂沉淀法；双水相萃取技术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的分离，为进一步纯化精制创造了前提；超滤技术解决了生物大分子对pH、热、有机溶剂、金属离子敏感等难题，在生物大分子的分级、浓缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。
（4）高度分离纯化技术
小分子物质一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方法获得纯度很高的产品。生物大分子的纯化一直是个难题。20世纪70年代以来，逐渐开发出各种色谱（层析）技术，如亲和色谱、疏水色谱、聚焦色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等，后两种技术已开始用于批量生产。
（5）其他新型分离技术
超临界CO2萃取技术在获得天然生物物质方面有着独特的优势。20世纪80年代以来，已经在许多领域中迅速实现了工业化。如啤酒花中有效成分和咖啡豆中咖啡因的萃取分离。介于反渗透和超滤之间的纳米滤技术，由于其能使水和大部分无机盐通过而截留分子量300-1000的小分子有机物，且操作压力低，在生物工业和水处理中具有广阔的应用前景。渗透蒸发技术、液膜技术及反胶团技术的研究和应用开发等也相继取得了很大的进展。
第二节发酵工业下游技术的一般工艺过程（5min）
成熟的化工单元：蒸馏、萃取、结晶、吸附、蒸发和干燥等属传统的单元操作；
新近发展起来的单元操作：如细胞破碎、膜过程和色谱分离等，缺乏完整的理论；
介于两者之间的有离子交换过程等。
1、一般工艺过程
一般说来，下游加工过程可分为4个阶段：培养液(发酵液)的预处理和固液分离；初步纯化(提取)；高度纯化(精制)；产品的最后加工。
预处理和固液分离：目的是除去发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质（离心和过滤）。
初步分离：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件（萃取、吸附、沉淀、蒸发）
高度纯化：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质（层析、膜分离、离子交换、沉淀、电泳）。
产品的最后加工：成品形式由产品的最终用途决定（结晶、干燥、蒸馏）。
2.如何着手对一种未知的发酵产品进行提取
（1）分离过程的控制参数
（2）设计中应考虑下列问题
What is the value of the product? （产品价值）
What is an acceptable product quality? (产品质量）
Where is the product in each process stream?
（产物在生产过程中出现的位置）
Where are the impurities in each process stream?（杂质在生产过程中出现的位置）
What are the unusual physicochemical properties of the product and the principal impurities?
（主要杂质独特的物化性质是什么？）
What are the economics of various alternative separations?
（不同分离方法的技术经济比较）
第三节发酵液预处理
引言：
从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个重要步骤，就是预处理和固液分离。其目的不仅在于分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒，还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后续的各步操作。
一、发酵液预处理工艺
各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。大多
数发酵产物存在于发酵液中，但也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有，但无
论产物是在胞内，还是在胞外或者是菌体本身，首先都要对发酵液进行过滤和预处理，将固、
液分开，然后才能从澄清的滤液中采用物理、化学的方法提取代谢产物，或从细胞出发进行细
胞破碎、碎片的分离和提取胞内产物。
预处理的方法完全取决于可分离物质的性质，如对PH和热的稳定性、是蛋白质还是非蛋
白质、分子的质量和大小等等。具体方法主要有以下几种：
1、加热法
加热法是最简单和价廉的预处理方法，即把悬浮液加热到所需温度并保温适当时间。加热
可降低液体的黏度，根据流体力学的原理，滤液通过滤饼的速率与液体的黏度成反比，可见降
低液体黏度可有效提高过滤速率；同时，在适当温度和受热时间下可使蛋白质凝聚，形成较大
颗粒的凝聚物，进一步改善了发酵液的过滤特性。例如，链霉素发酵液，调酸至PH3.0后，加
热至70℃，维持半小时，其黏度下降至原来的1/6，过滤速率可增大10～100倍。
使用加热法时必须严格控制加热温度和时间。首先，加热的温度必须控制在不影响目的产
物活性的范围内；其次，温度过高或时间过长，会使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液的
复杂性，影响产物后续的分离与纯化。因此，加热法的关键取决于产品的热稳定性。
2、调节悬浮液的PH值
PH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，因此适当调节发酵液的PH值可改
善其过滤特性。此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一。对于Aa、Pro等两性物质，在等电点时，其溶解度最小，这就是等电沉淀法。例如，在味精生产中，利用等电点（PH3.22）沉淀法提取谷氨酸；在膜过滤中，发酵液中的大分子物质容易与膜发生吸附，通过调整PH值
改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。
3、凝聚和絮凝
凝聚和絮凝都是悬浮液预处理的重要方法，其处理过程就是将化学药剂预先加入到悬浮液中，改变细胞、细胞碎片、菌体和Pro等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其凝结成较大的颗粒，便于提高过滤速率，而且能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。但凝聚和絮凝是两种不同方法，其具体处理过程还是有差别的，应该明确区分开来，不可混淆。
（1）凝聚
凝聚是指向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质异电离子作用下，胶体粒子的双电层电位降低，从而使胶体失去稳定性并使粒子相互凝聚成1mm左右大小的块状凝聚体的过程。
发酵液中的细胞、菌体或Pro等胶体粒子的表面，一般都带有电荷，由于静电引力的作用，使溶液中带相反电荷的离子被吸附在其周围，这样在界面上就形成双电层。这种双电层的结构使胶体粒子之间不易凝聚而保持稳定的分散状态，其电位越高，电排斥作用越强，胶体粒子的分散程度也就越大，发酵液过滤就越困难。
电解质的凝聚能力可用凝聚值来表示，使胶体粒子发生凝聚作用的最小电解质浓度（mmol / L）称为凝聚值。根据Schuze－Hardy法则，反离子的价数越高，其凝聚值就越小，即凝聚能力越强。所以，阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子的凝聚能力依次为：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。
常用的凝聚剂有Al2(SO4)3·18H2O、 AlCl3·6H2O、 ZnSO4 、FeCl3 、FeSO4·7H2O、
H2SO4、HCl、 NaOH 、Na2CO3、 Al(OH)3等。
（2）絮凝
絮凝是指使用絮凝剂将胶体粒子交联成网，形成10mm左右大小的絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。
采用凝聚方法得到的凝聚体，其颗粒常常只有1mm左右，比较细小，有时还不能有效地进行分离。而采用絮凝方法则常可形成粗大的絮凝体（10mm左右），使发酵液较容易分离。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，具有长链状结构，其链节上带有许多活性官能团，包括带电荷的阳离子或阴离子基团以及不带电荷的非离子型基团，这些基团能强烈地吸附在胶体粒子的表面，使其形成较大的絮凝团。根据其来源不同，工业上使用的絮凝剂可分为如下3类：①有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物和聚苯乙烯类衍生物等；②无机高分子聚合物，如聚合铝盐和聚合铁盐等；③天然有机高分子絮凝剂，如海藻酸钠、明胶、骨胶、壳聚糖等。
目前最常用的絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺类衍生物，其优点是用量少（一般以mg/L 计），絮凝速度快，分离效果好，应用广泛；缺点是具有一定毒性。
4、添加助滤剂
助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。这是因为使用助滤剂后，悬浮液中大量的细微粒子被吸附到助滤剂的表面上，从而改变了滤饼结构，使滤饼的可压缩性
下降，过滤阻力降低。
常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒和淀粉等。其中最常用的是硅藻土，它具有极大的吸附和渗透能力，能滤除0.1～1.0μm的粒子，而且化学性能稳定，既是优良的过滤介质，同时也是优良的助滤剂。
5、添加反应剂
在某些情况下，通过添加一些不影响目的产物的反应剂，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速率。
加入的反应剂与某些可溶性盐类发生反应，生成不溶性沉淀，如CaSO4、 AlPO4等。生成的沉淀物能防止菌体粘结，使菌丝具有块状结构，另外沉淀物本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。若能正确选择反应剂和反应条件，则可使过滤速率提高3～10倍。
如果发酵液中含有不溶性的多糖物质，则最好先用酶将它转化为单糖，以提高过滤速率。例如，万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土作助滤剂，可使过滤速率提高5倍。
6、其他方法
发酵液中杂质很多，其中有些杂质不仅直接影响产品质量和得率，同时对后续的提取和精制有很大影响，因此，在预处理时，必须采用适当方法使这些杂质沉淀，在固液分离时除去，以利于后面的提取和精制过程能顺利进行。
(1) 添加草酸盐除去高价无机离子（主要是Ca2+、Mg2+和Fe2+等）
(2) 去除杂蛋白的主要方法
①沉淀法：Pro是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等形成沉淀，在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀；②变性法：其中最常用的是加热法，还有大幅度调节PH，加酒精、丙酮等有机溶剂或一些表面活性剂等方法；③吸附法：加入某些吸附剂吸附杂蛋白而将其除去。
二、固液分离理论基础
1．离心力场中固相粒子在液相连续介质中的自由沉降速度
固相粒子在粘性液体中运动时要受到阻力。在重力场沉降时，最初处于加速阶段，但由于阻力随速度的增加而增大，当阻力与重力相等达到恒速时，这时称重力沉降的最终速度。在离心力场中，粒子的沉降速度也是不断增大的，这是因为粒子的沉降，回转半径增大，作用在粒子上的离心力也随之增大的缘故。但对于整个过程而言，也是一个极短暂的作用力大于阻力的初始阶段，随后是作用力与阻力相等阶段，与重力沉降不同的是这后阶段的作用力与阻力处于变化的随遇平衡过程。
球形粒子在离心场中所受的作用力与慢性离心力与浮力之差：
Fc=∏/6*d3*△ρ*ω2*r
其所受到的阻力为Fa=C*ρ1ν2*d2粒子沉降的运动方程：
Mdv/dt= ∏/6*d3*△ρ*ω2*r- C*ρ1ν2*d2 (1) 式中
M——粒子的质量
ν——粒子的沉降速度
d——粒子的直径
△ρ——固液相的密度差
ρ1ρ2——分别为固相液相的密度
ω——液相的回转角速度
r——粒子所处的回转半径
C——阻力系数，是雷诺准数Re的函数，C=f(Re)=f(ρvd/υ)
由上式可以看出来粒子的沉降速度v与d，△ρ，ρ1，υ，j=ω*ωr 有关，即νv=f(d. △ρ. ρ1. υ.j)由于变数较多，为了便于进行实验研究，利用因次分析找出如下的准数方程：
dνρ/μ=A(△ρ/ρ1)b(d3ρ12j/μ2)e
其中雷诺准数Re=dνρ1/μ，加里列准数 Ga=d3ρ12j/μ，阿基米德准数SA=△ρ/ρ1
计算粒子的沉降速度，首先判明粒子所在的区域，可以根据以下公式判断Ar
Re3=CAr(m+1)
层流区 Ar<28.8
过渡区 28.8< Ar<57600
湍流区 Ar>57600
由区域判断球形粒子的沉降速度
层流区ν=d2 △ρj/18μ（2）
过渡区ν=0.1355 d1.2(△ρj)0.733/ρ10.267μ0.467
湍流区ν=1.75(d △ρj/ρ1)0.5
式中 j=rω2
2．粒子形状与悬浮液的浓度对沉降速度的影响
非球形粒子的形状对沉降速度的影响
粒子在液体中的运动阻力与其横截面积及表面积有关。对于同体积的粒子而言，球形粒子的表面和横截面积最小，在液体中运动阻力尽然最小，非球形粒子的阻力较大，因而沉降速度也较之球形粒子慢，一般是将非球形粒子尺寸换算成当量直径代入上式中进行计算。
de=(6Vp/(∏A)0.5)0.5 （3）
式中 de——非球形粒子的当量直径
Vp——粒子的体积
A——粒子的表面积
3.悬浮液固相浓度对沉降速度的影响
悬浮液固相浓度达到一定的值后，出现阻滞沉降现象，粒子沉降速度较自由沉降计算值小，并随浓度的增加而迅速降低。许多的学者对阻滞沉降现象进行研究，并提出了浓度对自由沉降速度影响的修正系数的经验公式：
（1）卡明斯基公式η1=（1-x0）3
(2) 斯太诺公式η1=(1-x0)210-Ax0
(3) 哈克斯利公式η1=(1-x0)2exp(-5.53x0/(1.64- x0))
(4) 理查逊公式η1=（1-x0）n
式中η1——沉降速度的修正公式
x0——悬浮液中固相粒子的容积浓度，按分数表示
A n——无因次指数
对于工程计算，一般用理查逊公式，取n=5.5
η1=（1-x0）5.5 （4）
考虑了粒子形状和回相浓度对沉降速度的影响后，离心场中悬浮液固相粒子的沉降速度按下公式计算
层流区ν=η1de2 △ρj/18μ= η1ν0Fr
过渡区ν=η10.1355 de1.2(△ρj)0.733/ρ10.267μ0.467 =η1ν0Fr0.733
湍流区ν=1.75η1(de△ρj/ρ1)= η1ν0Fr0.5
式中η1——阻滞沉降系数，按（4）式计算
de——当量直径，按（3）计算
j——离心加速度，j= rω2
Fr——分离因数， Fr= rω2/g
ν——重力沉降速度
离心场中沉降分离的极限
已知在扩散过程中，粒子在t内的平均距离和扩散系数D之间的关系为h2=tD，而扩散系数D=kT/3∏μd。设在时间t内，粒子以沉降速度所沉降的距离为h=νt，由于粒子的尺寸很小，沉降处于层流区域，由（2）式计算得
h=6kT/∏d3*△ρ*ω2*r
式中 k——波茨曼常数，k=1.3805*10-16 达因厘米/。K
T——绝对温度（。K）
d ——粒子直径（厘米）
△ρ——固液相的密度差（克/厘米3）
ω——转鼓回转角速度
r——回转半径（厘米）
由一般临界条件可得极限粒子直径的计算公式
dl=1.6(KT/△ρω2r)1/4
将k值代入上式得： dl =1.734(T/△ρω2r) 1/4
在生产实行中，根据待分离的最小粒子直径来确定所必须的最小分离因素，
Fr=ω2*r/g=1.7344T/△ρd4g=9T/d4△γ
式中 T——绝对温度
d——待分离的最小粒子直径
△γ——待分离的最小粒子直径
4．分离因素
被分离的物料在离心场中所受的离心力与它在重力场中所受到的重力的比值，称为分离因素Fr
Fr=Fc/G=mω2r/mg=ω2r/g
分离因素实际上是离心加速度与重力加速度之比
分离因素一般以转鼓的转速来表示
Fr=(2n∏/60)2r/g
分离因素是离心机分离能力的主要指标，是离心机性能的重要标志之一。Fr越大物料受到的离心力就越大，分离效果也就越好。因此，对钻井液这类含有极小固相颗粒，粘度又较大的固相液，要采用分离因数较大的离心机，钻井液离心机的分离因数一般在500-1000左右。
由上式可以看出分离因素与转鼓半径成正比，与转鼓的转速成平方关系。增大转鼓半径，Fr增长平缓，但转鼓的受力状态受到了影响。转数与维修成本在三次方关系。因此，离心机的结构特点是转数高，直径小，他离因素大。
5.分离因素与分离点的关系
由斯托克斯计算得：
D50=(18μQR㏑(R/r1)/ ∏d2Fr(ρ2-ρ1)gL△H(2R-△H))0.5
H——离心机中钻井液自由液面到转鼓内壁的半径差
从上式可以看出分离中点受到离心机结构（L r1 R），钻井液性质（ρ1ρ2μ）和进浆量Q和Fr的影响。现假设其它参数一定来分析分离因数与分离中点的关系
D50=C Fr-0.5
当 Fr<=1200时提高分离因数可以显著降低离心机的分离中点，当Fr>1200时，Fr增大离心机的分离中点变化不大，。因此，分离因数达到一定程度后，增大Fr对离心机分离效果的影响变小。
三、固液分离工艺
固液分离是生物产品生产中经常遇到的重要单元操作。培养基、发酵液、某些中间产品和半成品等都需要进行固液分离，其方法很多，生物工业中常规的方法有分离筛、重力沉降，浮选分离、离心分离和过滤等，其中用于发酵液固液分离的主要是离心分离和过滤。
1、发酵液的粗过滤
过滤是发酵液处理中常用的单元操作，通过过滤可获得20%～30%（W/V）细胞浓度的淤浆，或40%（W/V）以上浓度的细胞固体。
（1）澄清过滤
在澄清过滤中，所用的过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠和塑料颗粒等，填充于过滤器内部即构成过滤层；也有用烧结陶瓷、烧结金属、粘合塑料及用金属丝绕成的管子等组成的成型颗粒滤层。当悬浮液通过过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，所以这种方法叫澄清过滤。该法适合于固体含量少于0.1g/100mL、颗粒直径在5～100μm的悬浮液的过滤分离，如麦芽汁、酒类和饮料等的澄清。
（2）滤饼过滤
在滤饼过滤中，过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维布、金属织布、石棉板、玻璃纤维纸等。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（或称滤渣）。当滤饼达到一定厚度时即起过滤作用，此时即可获得澄清的滤液，故这种方法叫做滤饼过滤或滤渣过滤。该法适合于固体含量大于0.1g/100mL的悬浮液的分离。
滤饼过滤按推动力的不同可分为4种：重力过滤、加压过滤、真空过滤和离心过滤。
（3）错流过滤
在一般过滤中，滤液的流动方向与滤饼基本垂直，采用这种方法时，随着过滤过程的进行，所积累形成的滤渣阻力很大，过滤速率迅速下降。为了维持较高的过滤速率，有效的方法是设法阻止滤渣的加厚，或者当滤渣达到一定厚度时采用反洗除去滤渣。
错流过滤，又称切向流过滤或十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的滤渣移走。
2、发酵液的离心分离
利用离心机高速旋转产生的离心力来实现分离，具有分离速度快、分离效率高，液相澄清度好等优点；缺点是设备投资高、能耗大，此外，连续排料时，固相干度不如过滤设备。
滤饼过滤
错流过滤