河南农业大学
硕士学位论文
灰枣离体叶片高效再生体系建立的研究
姓名：喻晓敏
申请学位级别：硕士
专业：森林培育
指导教师：冯建灿
20090601
烟草植物组织培养实验 一实验目的学习和掌握植物组织培养技术。深刻理解植物细胞的全能性。 二实验原理 植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。由于其拥有占地少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。 在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。①起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有生长素（2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、萘乙酰胺NAD和吲哚乙酸IAA、吲哚丙酸IPA和吲哚丁酸IBA）细胞分裂素（6-苄氨基嘌呤6-BA、6-糠氨基嘌呤（KT）氯吡苯脲（KT-30，CPPU））等。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2～4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的形态发生方式经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式（器官发生型）和胚状体方式两种。不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。在植物组织培养中，不定芽方式和胚状体方式是愈伤组织形态发生的两种最常见和最重要的方式。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。 培养基的主要指标为营养的组分，植物生长物质的浓度，特别是后者对外植体的分化起着极其重要的作用。培养基的组织成分主要包括：1. 矿质营养。矿质营养又叫无机营养，
t-DNA插入突变体的鉴定 实验时间：2012年5月18日 摘要T i质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。本实验即检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。 1.引言 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。若将Ti质粒进行改造，把感兴趣的基因放进T-DNA序列中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。 本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA 扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确东样品是否为T-DNA 插入突变纯和体。 PCR（Polymerase Chain Reaction）， 即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术， 具有特异、敏感、产率高、快速、简便、 重复性好、易自动化等突出优点；能在一 个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万 倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本 原理如右图） DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer （本实验中为TAE）中带负电, 在电场中
烟草叶片的组织培养 一、实验原理与实验步骤 在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 植物材料：烟草植株 药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞 仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0) 、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、 1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子 二、实验方法与步骤
注意： 1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。 2、微量元素母液的配制 按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签 3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。 4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。（1）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。 （2）称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。 生长调节剂母液配制： 为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。 不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。 称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。 三、培养基配制和灭菌 本次实验使用 （1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L； （3）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。 注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述
植物叶色突变体的研究进展 植物叶色的表现受叶绿体中各种色素的综合影响, 正常情况下,由于叶绿素在植物色素总量中占优势而表现为绿色.叶色突变体是植物中突变率较高且易于鉴定的突变性状,往往直接或间接影响叶绿素的合成与降解,导致植株的叶片颜色较正常的绿色发生变化.目前几乎所有的高等植物中都发现了叶色突变体.(陈艳丽)在本世纪三十年代就有关于叶绿素突变体的报道,但叶色变异通常伴随着植株矮小,并影响植株的光合作用造成减产,甚至在生长过程中出现死亡现象,因此叶色突变体常被认为是无意义的突变.直到1949年,Granick对失绿的小球藻突变体的研究并通过此突变解释了叶绿素合成过程[1]，人们才认识到叶色突变体对理论研究具有重要的作用。并且最近几年，叶色突变体的研究越来越深入，也受到广泛的关注，已经被用于基础研究和生产实践，也取得了一定的成果。[2] 叶色突变体的来源 除自然突变可产生叶色突变体外，利用人工诱变，插入突变和基因沉默等均可得到叶色突变，其中人工诱变和插入突变的突变频率较高。 自然突变就是在自然条件不经过人工处理情况下发生的突变，比如自然辐射，环境污染等。但是自然突变的频率极低，一般不超过1%（郭龙彪，2006），因此可供直接利用的突变很少。我国著名水稻良种矮脚南特就是在高杆品种南特号稻田里发现的自然突变，水稻的叶色突变体chl1和chl9（zhang et al .2006），棉花中的芽黄突变体（蒋博2012），荠菜型油菜黄化突变体都是自发突变体。 人工诱变 人工诱变导致植物基因产生突变，是选育新品种、创造新种质的有效途径。根据产生诱变的来源，人工诱变分为物理、化学诱变及基因工程引起的突变，物理和化学诱变是主要的诱变方法。 诱发植物发生突变的因素有诱变剂，物理诱变是通过各种射线（紫外线、X射线、、丫射线、p射线、中子等）来处理植物某个器官（如种子、子房、愈伤组织等），诱发植物发生基因突变。种子是最常用的处理材料，其对环境适应能力很强，可以在极度干燥、低温、高温、真空等条件下进行处理，并且操作方便，便于运输和储藏。1934年日本首次利用X射线处理水稻种子，成功得到水稻早熟突变体（阳惠琴，1995）我国于1987年开始航天搭载育种利用空间环境（微重力、高真空、微磁场等）进行诱变，通过地面选育得到有益变异创造出新种质、培育出新品种，已经成功在水稻种选出紫色、红色、茶色等叶色突变体（萨如拉，2009）。 化学诱变是通过烷化剂、叠氮化钠、碱基类似物等对植物进行诱变，其中烷化剂是诱变效率最高和最常用的化学诱变剂。常用的烷化剂又包括甲基黄酸乙酯（EMS）、磺酸二乙酯、乙烯亚铵和亚硝基乙基脲。EMS诱变得到的突变体大多数为点突变，诱变机理：EMS带有1个或多个活性烷基，该基团能够转移到其他电子密度高的分子上去，使碱基许多位置上增加了烷基,可以改变氢键的能力,从而DNA在复制时导致碱基配对错误而引起突变。EMS将鸟嘌呤的O6位置烷基化，在DNA复制过程中由于烷基化的鸟嘌呤与正常的胸腺嘧啶配对，使得碱基发生替换（赵用亮，1996）。EMS诱发的另外一个鸟嘌呤位点是N7位点，该位点是最易起反应的位点几乎可以与所有烷化剂起烷化作用，鸟嘌呤N7位点烷基化后，使核苷键发生水解导致断裂，鸟嘌呤从DNA链上脱落，造成DNA链碱基缺缺失，在复制的时候游离的碱基可能发生错配，以致发生碱基颠换即G：C—A：T，G：C—C：G，G：C—T：A；另外烷基化的鸟嘌呤易离子化，使稳定的酮式变为不稳定的烯醇式，不与胞嘧啶配对而与胸腺嘧啶配对，从而发生G：C—A：T转换。除此之外，EMS还可能使两个鸟嘌呤N7
最近要购买一批拟南芥突变体，想请教有经验的虫友购买拟南芥突变体的具体流程，例如我需要一个APETALA1的突变体，应到哪个网站进行搜索，怎样进行选择订购，越具体越好，有截图就更好了，谢谢大家了！ Step 1. 打开NCBI主页：https://www.doczj.com/doc/21941047.html,/ 打开的页面如下： 如下 得到如下页面：
进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图： 记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：https://www.doczj.com/doc/21941047.html,/ 点击T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：
显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：
植物遗传资源学报2018,19(6):1205?1209Journal of Plant Genetic Resources DOI:10.13430/https://www.doczj.com/doc/21941047.html,ki.jpgr.20180326001 玉米叶色突变体遗传分析及基因定位 王 飞,段世名,李 彤,王荣纳,陶勇生 (河北农业大学农学院/国家玉米改良中心河北分中心/华北作物种质资源教育部重点实验室,保定071001) 收稿日期:2016?03?26 修回日期:2018?04?09 网络出版日期:2018?09?20URL :http ://https://www.doczj.com/doc/21941047.html, /kcms /detail /11.4996.S.20180920.1435.001.html 基金项目:河北农业大学创新创业项目(2017096);国家粮食丰收增收科技创新专项(2017YFD0300901?04) 第一作者研究方向为玉米遗传育种三E?mail :462188997@https://www.doczj.com/doc/21941047.html, 通信作者:陶勇生,研究方向为玉米遗传育种三E?mail :yshtao2016@https://www.doczj.com/doc/21941047.html, 摘要:玉米叶色与叶绿体及结构相关,调控光合产量,因而对调控叶色基因的遗传研究或克隆将有助于玉米光合产量的 遗传改良和植物光合作用理论机制的解析三本研究以玉米W22::Mu 介导的综31为遗传背景的导入系群体为材料,获得了 细胞核单隐性基因控制二叶绿体结构和数目异常二色素缺失和PSII 显著降低的叶色突变体三使用覆盖B73基因组的SSR 标记将突变位点定位于约2.95Mb 区间(bnlg1863~umc2075)三基于区段标记开发和1200单株分离群体将突变位点精细定位于约900kb 区间(B73RefGen_V4;S1~S7区间),经区段内基因表达和功能分析获得了候选基因Zm00001d010000,该基因编码硫氧还蛋白,与突变体表型形成相关三该研究将为光合产量的遗传改良和植物光合作用理论机制解析提供重要的基因或标记资源三 关键词:玉米;叶色;突变体;基因定位 Fine Mapping and Candidate Gene Analysis of Leaf Color Mutant in Maize WANG Fei,DUAN Shi?ming,LI Tong,WANG Rong?na,TAO Yong?sheng (College of Agronomy ,Hebei Agricultural University /Hebei Sub?center of National Maize Improvement Center / North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Education Ministry ,Baoding 071001) Abstract :The leaf color of maize is associated to the content and structure of chloroplast,which is the com? partment and of importance in photosynthesis.Genetic analysis and isolation of genes that control the leaf color will provide insights in the genetic improvement for photosynthetic yield and exploration of the theoretical mechanism.In this study,by screening for maize mutants generated by W22::Mu in introgression lines with genetic back?ground of Z31,we obtained a leaf color mutant with the abnormal chloroplast,lack of pigment and the reduction of PSII,which was controlled by a single recessive locus.By the low?resolution genetic mapping using the SSR mark?ers,this mutation locus was mapped to a 2.95Mb interval(B73RefGen_V4;bnlg1863?umc2075).Furthermore, this locus was finely mapped to a ~900kb interval(B73RefGen_V4;S1?S7)by 1200individuals plants from BC 6F 2and developed SSR.Taking advantage of gene annotation and expression analysis,we identified a strong candidate gene Zm00001d010000that encodes for thioredoxin.Thus,the study could provide genetic material and the selection markers that become valuable in theoretical and applied research for increasing photosynthetic yield. Key words :maize;leaf color;mutant;fine mapping 玉米是重要的粮食和饲料作物,也是遗传学和育种学理论与实践应用的模式作物,因而对玉米叶 色突变体进行遗传研究或基因克隆将为禾谷类作物光合产量的提高和遗传改良提供有益信息三叶色变
实验二愈伤组织诱导及观察 一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照
水稻苗期叶片白化转绿性状研究进展 摘要：白化转绿突变体在基础理论研究和实际应用研究方面均具有重要意义。介绍了国内外在水稻白化转绿突变体材料的发掘、生理生化特性、性状遗传、基因定位及克隆、分子作用机理和作为标记性状基因应用等方面的研究进展。 关键词：水稻（oryza sativa）；突变体；白化转绿；基因；标 记性状 中图分类号：s511；q343.1 文献标识码：a 文 章编号：0439-8114（2012）23-5241-07 research advances on green revertible albino mutants of rice leaves in seeding stage dong hua-lin，fei zhen-jiang，wei lei，wu xiao-zhi，zhou peng （institute of food crop research of hubei academy of agriculture sciences / hubei key laboratory of food crop germplasm and genetic improvement， wuhan 430064，china）abstract： the gra（green revertible albino） mutant is very important in theoretical research and practical applications. the research advances both at home and abroad in aspects of mutant’s discovering， characters of physiology and biochemistry， hereditary of trait， gene mapping and cloning，
烟草叶片愈伤组织诱导 摘要用不同成分培养基，附加0.8%琼脂，3%蔗糖，调pH5.8—6.0，取烟草叶片 作为外植体进行愈伤组织诱导培养，计算污染率、诱导率以及诱导情况，观察愈伤 组织的发生情况。实验表明，养分较高的培养基，外植体生长情况较好。当细胞分 裂素高于生长素的浓度时，有利于分化出芽；细胞分裂素低于生长素的浓度时，有 利于分化出根；当细胞分裂素及生长素的浓度适合时，愈伤组织不分化，但是生长 旺盛。 关键词：烟草叶片愈伤组织诱导 前言 烟草（Nicotiana tabacum）又名草烟，属茄科烟草属的一年生草本植物，本属约有60种，原产于美洲和大洋洲[1]。烟草是重要的经济作物和工业原料作物，其体内所含的烟碱等生物碱是非常宝贵的医药及化工原料[2]。有报道烟草细胞悬浮培养物获得细胞分裂素类物质，因此很有必要对烟草的组培快繁进行研究，以获得更有效的方法提高产率和产量。柯善强综述植物细胞的遗传全能性与组织培养形态发生控制[3]，戴冕进行了烟草叶肉原生质体再生植株的研究[4] ,徐瑞娟等通过烟草花序苞叶的离体培养分化出花芽[5],战淑敏用烟草叶组织培养直接获得再生植株[6]。本实验以烟草叶片组织为外植体进行组织培养，诱导愈伤组织，观察愈伤组织诱导情况。 1.材料与方法 1.1 配置培养基母液，每2人为一个小组，配置以下培养基，并分装，灭菌，然后室温下放置一周。 1.2 取烟草叶片取烟草的嫩叶片作外植体。先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水洗2次后，置于超净台上，于无菌条件下先用75%的酒精浸泡30秒，然后置于无菌瓶中用10%次氯酸钠溶
液浸泡20分钟至30分钟，再用无菌水冲洗4次，最后在无菌培养皿中将嫩叶片切成1cm见方小块，接种在培养基中。 1.3.1 观察污染情况：观察是否有细菌性污染（菌斑呈粘液状,接种后1-2天出现）和真菌性污染（出现不同颜色霉菌,接种后3-10天出现），并计数。计算污染率。 污染率(%)=污染的材料数/总接种材料数×100%[7] 1.3.2 观察各培养基中的外植体产生愈伤组织的情况，愈伤组织出现时间和愈伤组织形态特征（颜色和质地等），计数形成愈伤组织的材料数，并计算诱导率。 诱导率(%)=形成愈伤组织的材料数/总接种材料数×100%[7] 2.结果及分析 2.1愈伤组织诱导情况 三天后发现部分组有细菌性污染（如图1），7天后发现部分有真菌性污染。计算出污染率和如表1所示： 表1. 愈伤组织诱导的污染情况 造成污染的可能原因有：叶片消毒灭菌不彻底，接种室超净工作台消毒不彻底，接种操作时操作不规范等等。 叶片在第4天后边缘慢慢上卷，外植体开始膨胀，于接种后第7 天膨大成圆拱型，愈伤首先发生在叶片边缘, 为黄绿色颗粒状，有些呈现半透明。随着进一步培养, 10天愈伤组织不断加大。 排除褐变及感染的外植体后，诱导情况如表2所示： 表2.愈伤组织诱导情况
中国农业科学 2010,43(2):223-229 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.02.001 两个新的水稻叶色突变体形态结构与遗传定位研究 张力科1，李志彬2，刘海燕1，李如海2，陈满元1，陈爱国2，钱益亮1，华泽田2， 高用明1， 朱苓华1，黎志康1,3 （1中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；2辽宁省稻作研究所，沈阳 110101；3 International Rice Research Institute, DAPO Box7777, Metro Manila, Philippines） 摘要：【目的】对2个新的水稻叶色突变体进行形态结构与遗传分析，并且初步定位这2个突变基因。【方法】在水稻育种材料中分别发现了一株白色条纹叶突变体和一株黄叶突变体，经多代自交已形成稳定的突变系。对突变体的主要形态特征与叶绿素组分等进行分析，观察叶绿体的超微结构，并以这2个突变系杂交产生的F2群体作为定位群体，应用SSR标记对突变基因进行初定位。【结果】与其野生型相比，白色条纹叶突变体的单株穗数减少 12.86%，生育期延长11.27%，黄色叶突变体的株高降低31.08%，千粒重减少14.55%，生育期延长17.86%，并且 2种突变体的叶绿素含量都显著低于其野生型。电镜观察结果表明：2种突变体的类囊体结构异常，与野生型水稻相比，黄色叶突变体的类囊体片层数变少，白色条纹叶中条纹部分的类囊体片层结构几乎消失，正常绿色部分的类囊体结构没有变化。遗传分析表明：这2种突变性状均受1对隐性核基因控制，位于不同染色体上，将突变基因暂时命名为st9(t)(stripe)、chl12(t) (chlorophyll-deficit)。将st9(t)定位到第一染色体短臂最末端，与分子标记RM1331相距9.6 cM，且与标记RM3252等共分离；将chl12(t)定位到第三染色体短臂，与分子标记RM411、RM8208之间的遗传距离分别是1.2、5.1 cM。【结论】发现了2个叶色突变新基因，为下一步的基因克隆与功能分析奠定了基础。 关键词：水稻；白条叶突变体；黄色叶突变体；遗传分析；基因定位 Study on Morphological Structure and Genetic Mapping of Two Novel Leaf Color Mutants in Rice ZHANG Li-ke1, LI Zhi-bin2, LIU Hai-yan1, LI Ru-hai2, CHEN Man-yuan1, CHEN Ai-guo2, QIAN Yi-liang1, HUA Ze-tian2, GAO Yong-ming1, ZHU Ling-hua1, LI Zhi-kang1,3 (1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2Liaoning Rice Research Institute, Shenyang 110101; 3International Rice Research Institute, DAPO Box7777, Metro Manila, Philippines) Abstract: 【Objective】 The objective of this study is to analyze the morphological structure, chlorophyll components, chloroplast ultrastruture and map genes underlying the two novel leaf color mutants in rice. 【Method】A white stripe leaf mutant and a yellow leaf mutant were found in rice breeding materials. The main agronomic character and chloroplast ultrastructure of the mutants were observed. The mutant genes was mapped with SSR markers and F2 mapping population of the cross between the two mutant lines. 【Result】Compared to their wild-type, the panicles per plant of the white stripe leaf mutant decreased by 12.86%, and the growth duration increased by 11.27%; the plant height of yellow leaf mutant decreased by 31.08% and the growth duration increased by 17.86%, and the photosynthetic pigment contents of both mutants were significantly lower than their wild-type. The result of electron microscope observation showed that the grana structures were unnormal in both mutants. The genetic analysis indicated that the white stripe leaf mutant was controlled by a recessive nuclear gene located on the tip of the short arm of rice 收稿日期：2009-05-15；接受日期：2009-06-12 基金项目：国际先进农业科学技术计划（“948”计划）项目（2006-G1(A)） 作者简介：张力科，硕士研究生。共同第一作者李志彬，硕士研究生。通信作者高用明，研究员，博士。E-mail：irriygao@https://www.doczj.com/doc/21941047.html,。华泽田，研究员，博士。E-mail：hzetian@https://www.doczj.com/doc/21941047.html,
实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等 放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入 150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。 4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养 基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标， 绘制鲜重增长曲线。 烟草遗传转化实验 实验目的
烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。实验要求： 掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。 实验原理 根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。 p BI121载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素（kan）抗性选择标记基因，含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因。β－葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因，转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。 实验器材 摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。 实验材料 植物材料：烟草无菌苗 农杆菌与载体：农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5 g/L)、pH 7.0 烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA 烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA 卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 头孢霉素（cef）母液：300mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 利福平(rif): 50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 实验步骤 1. 农杆菌感受态的制备： 1)接菌于5 ml YEB液体培养基(Rif 50 mg/L)中，28℃，200转/分钟，培养1～2天； 2)取1mL活化的菌液接种于50mlYEB液体培养基中，同样条件下培养至OD600值为
0引言 植物叶色突变是植物在生长过程中叶色发生变化的现象，由叶绿素合成受阻或降解加快所引起。植物叶色突变的种类较多，性状较明显，通过观察叶片颜色即可鉴别。根据叶色表型可将其分为白化、条纹、黄化、淡黄绿、淡绿、常绿、斑叶、紫叶、类病 斑、白黄和白绿等类型（Manjaya ，2009；Vairam et al.，2014）。1933年，Killough 和Horlacher 发现了陆地棉（Gossypium hirsutum ）芽黄突变体，但由于叶色突 变会造成作物减产甚至死亡，故被认为是有害突变，在当时未引起重视。自1948年Granick 利用小球藻（Chlorella vulgaris ）失绿突变体W 5验证原卟啉9是叶 收稿日期：2017-03-27 基金项目：国家重点研发计划项目（2016YFD0600605）；江西省林业科技创新专项项目（201406）；广西农业科学院基本科研业务 专项项目（2017YT47）。 作者简介：*为通讯作者，章挺（1981-），副研究员，主要从事林木栽培及育种研究工作，E-mail ：zhangtycx@https://www.doczj.com/doc/21941047.html, 。刘新亮 （1986-），博士，主要从事观赏植物选育及栽培研究工作，E-mail ：liuxinliang1988@https://www.doczj.com/doc/21941047.html, 植物叶色黄化突变分子机理的研究进展 刘新亮1，李先民2，何小三1，邱凤英1，章挺1* （1江西省林业科学院，南昌 330032；2广西农业科学院花卉研究所，南宁 530007） 摘要：植物叶色黄化突变具有突变频率高、易鉴别等特点，不仅是基础研究的理想材料，在品种选育和改良中也有重要的利用价值。文章从叶绿素生物合成、血红素代谢、叶绿体发育及叶绿体蛋白代谢等方面，对植物叶色突变相关基因的功能和作用机理进行综述，发现目前对叶色突变分子机理的研究主要集中在叶色突变相关基因功能方面，针对质核信号转导、转录因子及调控元件的研究较少，因此，今后在相关研究中可利用叶色突变体这一理想材料分析鉴定相关基因功能及其互作关系，从对单一基因的研究转向对多个基因甚至功能基因组的系统研究，尤其加强对质核信号转导、转录因子及调控元件的研究；叶色突变体作为作物品种改良的一类特殊种质资源，可通过人工诱导方式增加植物突变频率，在较短时间内获得大量叶色突变体，应用于基因功能及基因间的互作关系等研究，为黄叶植株的选育和遗传改良提供参考。 关键词：叶色黄化突变；叶绿素合成；叶绿体发育；叶绿体蛋白代谢中图分类号：S311 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）08-1358-09 A review:Molecular mechanism of plant yellow leaf mutation LIU Xin-liang 1，LI Xian-min 2，HE Xiao-san 1，QIU Feng-ying 1，ZHANG Ting 1* (1Jiangxi Academy of Forestry ，Nanchang 330032，China ；2 Flowers Research Institute ，Guangxi Academy of Agricultural Sciences ，Nanning 530007，China) Abstract ：Yellow leaf mutation are ideal materials for basic research with high mutation frequency and easily identi-fied in nature.They also have important value in variety breeding and improvement.Functions and mechanisms of genes related to leaf color mutation were reviewed from perspectives of chlorophyll synthesis ，heme metabolism ，chloroplast development and chloroplast protein metabolism.The current researches on mechanism of leaf mutants focused on the functions of genes related to leaf color mutation ，but nucleoplasm signal transduction ，transcription factor and regulatory element were only studied by a few.Therefore ，in the future ，leaf mutants ，which is ideal materials ，can be used to study the function of the related genes and their interactions ，and switch the research from single gene to multiple genes or even functional genomes ，especially strengthen the study in nucleoplasm signal transduction ，transcription factor and regulato-ry element.As a special germplasm resource ，leaf mutants can increase plant mutation frequency through artificial induc-tion ，obtain large amount of leaf mutants within short period of time and apply them into the study in interactions between gene functions and genes ，and proude reference for yellow leaf plants breeding and gentic improvement. Key words ：yellow leaf mutation ；chlorophyll synthesis ；chloroplast development ；chloroplast protein metabolism