实验六、基因克隆及序列分析 1.目的片段回收 取5 μl PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上检测，如果扩增产物大小与原来一致，在紫外灯管下用刀片切下目标带，然后用UNIQ-10 Column DNA Collection Kit 试剂盒（上海生工）进行回收。具体回收过程如下：从琼脂糖凝胶中精确切下包含有目标片段的胶块，放入到1.5 ml离心管中，加入500 μl Binding Buffer II，50℃~60℃水浴锅中放置10 min，使胶彻底熔化，然后将熔化的胶溶液转移到套放于2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min，8000 r/min离心1 min，倒去收集管中的废液，在UNIQ-10柱中加入500 μl Washing Solution，室温8000 r/min离心1 min，加入新鲜的Washing Solution重复一次，倒去收集管中的废液，室温12000 r/min离心15 s。在UNIQ-10柱中加入Elution Buffer 30 μl（直接滴到过滤膜上），37℃放置2 min，放到一个新的1.5 ml离心管后离心收集（12000 r/min，1 min），所得溶液用于连接反应。 2 片段连接反应 采用pGEM? -T Easy Vector试剂盒（Promega，A1360）进行目标片段的克隆。取1.5 μl PCR产物，加入0.5 μl T4 DNA ligase，0.5μl T Easy Vector，2.5 μl ligation buffer，短暂离心收集，轻轻混匀，置于室温连接1-2 h后，放于4?C冰箱过夜。 3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 取保存于-70℃的大肠杆菌菌株DH5α菌液，首先在LB固体培养基上分离单克隆，然后挑一个单克隆进行液体培养过夜。从中取1.0 ml菌液转接于装有100 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，于摇床培养1.5~2 h（37℃，240 r/min），后转移至预冷的50 ml离心管中，冰浴10 min，低温离心10 min（4℃，4000 r/min）收集菌体，加入25 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬培养物，冰浴20-30 min，4℃4000r/min离心10 min，去上清液，倒立晾干，再加2 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%的甘油）重悬细胞，分装于冰浴的0.5 ml无菌离心管中，放入-70℃冰箱保存。 取2 μl连接反应物转到1.5 ml离心管中，冰上保存待用。从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上，待其刚好融化时（约5 min）小心吸取30-50 μl转入到离心管中，冰上静置20 min。42℃水浴中热激90 s（不要摇动）。迅速放回冰上2 min，然后加入LB培养基（室温）400 μl，37℃摇床培养1.5 h（150 r/min）。
（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多
控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸
T载体克隆连接原理、制备及载体序列 T载体的定义： T载体（T-Vector）是一种高效克隆 PCR 产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。 T载体的作用原理： 大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性（下图红色框内所示位置）。因此，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提高了PCR产物连接和克隆的效率。 T载体进行TA克隆的优势： 相对于另一种非定向克隆——平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快速、高效、一步到位的非定向克隆法。有研究曾证明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率高。 T载体的制备： ： 1 商业化T载体： 一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72～75℃反应，进行末端的加T。 2 自制T载体： 一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI，其识别和切割特点如下：其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG，而切割序列则为中间三角箭头所指的N（N代表任意碱基）。由于N可以是任意碱基，所以如果将切割位置的N设置为T，那么在该酶的切割下，就可以产生一个3’ T末端。相似的，在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点（保证切割位点为T即可）就可以产生另一个T末端。一般可以在商业化的T载体基础上进行改造，通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存，使用时用XcmI进行完全酶切（这里的酶切必须保证完全，否则载体易自连，所以XcmI酶最好过量，或者适当延长消化时间），就可以制备得到T载体。[3] 常见T载体及序列： 虽然上面提到可以自制T-Vector，但实际上现在的商业化载体已经做到比较便宜，而且批次间稳定性保持的不错。最常见的T-Vector要属Takara公司的pMD系列（pMD18-T、pMD19-T、pMD20-T以及对应的去除多克隆酶切位点的Simple载体，如pMD19-T-Simple[4]）和Promega公司的pGEM系列（pGEM-T和pGEM-T Easy）[5]。 以下分别是两种T载体的序列：（序列已经经过调整，直接将需要插入的片段粘贴到序列的头端或者尾端即可得到最终的质粒序列）
第9卷第1期2011年3月生物信息学 China Journal of Bioinformatics Vol．9No．1Mar．，2011 收稿日期：2010－04－29；修回日期：2010－09－06．基金项目：国家948项目（2010－C21）。 作者简介：李国印，男，山东菏泽，硕士研究生E －mail ：lyion029@163．com． *通讯作者：许莉萍，女，福建莆田，博士，博导、研究员，E －mail ：xlpmail@yahoo．com．cn． doi ：10.3969/j．issn．1672－5565．2011．01．006 甘蔗MYB2转录因子的电子克隆和生物信息学分析 李国印，阙友雄，许莉萍* ，郭晋隆，闫学兵，陈如凯 （福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福建福州350002） 摘要：用电子克隆方法获得甘蔗MYB2基因，采用生物信息学方法，对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构 域、 疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明：甘蔗MYB2基因全长991bp ，包含570bp 的ORF ，编码189个氨基酸。甘蔗MYB2基因包含有MYB 功能域，在序列组成、高级结构及活性位点等方面，与玉米等其它植物的MYB2基因具有高度的相似性。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。关键词：甘蔗；MYB2基因；电子克隆；生物信息学中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1672－5565（2011）－01－024－04 Electronic cloning and characterization of MYB 2gene from Saccharum officinarum using bioinformatics tools LI Guo-yin ，QUE You-xiong ，XU Li-ping *，GUO Jin-long ，YAN Xue-bing ，CHEN Ru-kai （Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement ，Ministry of Agriculture ，Fujian Agriculture＆Forestry University ，Fuzhou 350002，China ） Abstract ：An novel MYB2gene from Saccharum officinarum was cloned in silico based on the EST seqences from Unigene of NCBI．Some characters of the MYB2encodes amino acid were analyzed and predicted by the tools of bioinformatics in the following aspects ，including the compositon of amino acid sequence ，hydrophobicity or hydro-philicity ，secondary and tertiary structure of protein and funcion．Bioinformatical analysis showed that the full －length of MYB2gene from S．officinarum was 991bp and it contained a complete ORF which encoded 189amino acid．The MYB2gene contained an typical MYB domain and was highly conservative compared with MYB2from several different plant species in sequence compositon ，advanced structure and activity sites．The results will pro-vide the basis for MYB2gene cloning in experiment． Key words ：Saccharum officinarum ，MYB2gene ，In silico cloning ，Bioinformatics 在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB 结构 域的转录因子C1基因［1］ ， 此后在植物中发现的MYB 相关基因的数量迅速增加。对其功能的研究表明，植物MYB 转录因子具有广泛的生理功能，几乎参与植物发育和代谢的各个方面，重点是调控环境胁迫，如干旱和病害逆境胁迫、次生代谢调节、激素调控应答及控制细胞分化等。 植物MYB2转录因子是MYB 大家族中一个小的亚族，虽然不同植物的MYB2基因具有不同的生物学功能 ［2，3］ ，但它们都是在转录水平上调控植物 各个阶段的生长发育。通过突变体及基因敲除技 术，已克隆了很多植物MYB 类基因，但在甘蔗MYB 方面研究甚少。 以NCBI 数据库为基础，电子克隆得到甘蔗中编码MYB2的cDNA 序列，利用生物信息学方法，对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、疏水性、亚细胞定位及结构功能等方面进行预测和分析，为后续通过实验手段克隆甘蔗MYB2基因和基因功能研究奠定基础。
热和酸应力条件下脂环酸芽孢杆菌Dnak基因克隆和序列分析 DNA基因克隆及序列分析。通过兼并PCR基因组扩增获得了大约1300bp的基因片段，然后子克隆到PMD-18T载体上测序。BLAST基因组数据库搜索表明，此PCR产物的序列共享原核热休克蛋白70 DNAK基因，与来自脂环酸芽孢杆菌LAA1伴侣蛋白的DNAK基因的同源性是最高的（92%）。通过基因组步移技术测定DNAK 基因（基因组数据库登录号HQ893543），包含1854bp完整的开放阅读对话框（ORF），编码617个氨基酸。推知的氨基酸序列与来自A. acidocaldarius LAA1 (86%)的DNAK基因表达的伴侣蛋白的相似性最高，与来自Bacillus tusciae,Paenibacillus sp.Y412MC10,Thermosinus carboxydivorans, Brevibacillus brevis 的 A. acidocaldarius 的相似性分别为83%, 77%, 76%,75%。没有检测到信号肽。预测分子量是(Mw)是66.2KDa，等电点（pI）是4.82. 氨基酸序列比对和主题搜索结果显示，在这个基因中有3个域：N末端核苷酸结合域(NBD, aa 1–360)类似于肌动蛋白ATP酶结构域，它包括三个保存位点(-I-D-L-G-T-T-N-S-, -V-F-D-L-G-G-G-T-F-D-V-S-I-L-,和V-I-L-V-G-G-S-T-R-I-P-A-V-Q-E) ，它可能与ATP绑定和激活有关；aa 360–517组成C-末端底物结合域(SBD);aa- 484–617组成的C-末端子域，它可能和底物的结合和释放有关。 脂环酸芽孢杆菌在不同的培养温度下DNAK基因的表达。脂环酸芽孢杆菌生长的温度范围从20°C - 60°C，最适生长温度为45-50°C。在这项研究中，脂环酸芽孢杆菌DSM 3922T在45°C中活跃培养16小时，分别在20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C和60°C繁殖生长。根据观察脂环酸芽孢杆菌在温度为30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C和55°C正常生长。在55°C和30°C生长时，分别繁殖8小时和10小时时达到对数生长期。然而，在培养温度为20°C，25°C或者60°C时，芽孢生长及其缓慢，与其他处理组像比较很难进入指数生长期。值的注意的是，在繁殖温度为20°C，25°C和60°C 时没法收集到足够的细菌ＲＮＡ用于分离和表达分析。 如图２所示，ＤｎａＫ在培养温度为30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C 和55°C的基本表达情况。在脂环酸芽孢杆菌最适生长温度(40–55°C),其表达水平相对稳定。在较低的温度下，30°C和35°C,Ｄｎａｋ的表达大幅升高。这表明Ｄｎａｋ可能参与脂环酸芽孢杆菌对不良环境的适应。 在热应力条件下脂环酸芽孢杆菌DNAK的表达。在实验中，热应力加在45°C 繁殖生长到指数生长期摇瓶菌悬液内的细菌上，然后置于温度分别为70°C, 80°C, 90°C的恒温浴内。在80°C和 90°C时，开始10分钟内，细菌正常生长，15分钟后细胞开始破裂。随着热应力的继续，有明显的细胞裂解和细胞凋亡的进一步加剧。在80°C,和90°C时仅仅热应力持续5分钟和10分钟，提取的RNA适合做进一步分析，热冲击15分钟或更长时间，提取的RNA严重退化，不能用于ＲＴ－ＰＣＲ分析。当孵育温度70°C热冲击，所有的时间范围内细菌维持正常生长，全部的RNA被分离用于ＲＴ－ＰＣＲ检测。 正如图３所示，以70°C的热冲击温度，与对照在不孵育的脂环酸芽孢杆菌相比，ＤＮＡＫ的表达水平在孵育５分钟增加了４０％，长时间的热冲击，表达水平下降，与对照的相比２５分钟孵育的细菌ＤＮＡＫ表达水平提高了３０％，当热休克在80°C和90°C时，与对照相比，在5分钟内细菌的DNAK表
全长CDNA克隆方法 以MITF基因为例,简述全长CDNA克隆的方法. 方法分三步: 1.克隆中间片段 2.克隆3’片段 3. 克隆5’片段,然后再将3者重复序列删除,拼接起来. 1.中间序列克隆 提取锦鲤的皮肤组织的mRNA,然后跑胶检测。如果有2根带,则显示mRNA 提取成功. 然后反转录成CDNA，检测B-actin。 首先在NCBI上查找mitf基因,获取该基因的序列,CDS区,基因编号.并且保存,以备以后比对序列用.选取斑马鱼的mitf a 为模板. 引物合成:用Primer 5设计 a.引物长度:长度一般在18-30个碱基。一般都是18-24个左右。 b.GC含量：一般引物GC含量为40%-60%，一对引物的GC含量和TM值要协调。 如果引物存在严重的GC或者AT倾向，可以在引物最后加适当A.T.C.G尾巴c.退火温度：退火温度需要比解链温度低5度。适当提高引物退火温度可以使 PCR的特异性增加。一般设计一对引物的TM值应该要比较接近，一般在0-4度以内，不会影响PCR的产率。温度在55-75度之间。 d.避免扩增模板的二级结构区域，一对引物之间不应该存在4个连续碱基的同 源性或者互补性。选取时尽量选取分高的组合。 设计引物时，尽量增加克隆的中间片段长度，为避免5‘和3’克隆出现长片段。 引物设计好以后，根据引物的TM值，首先设计温度，做梯度PCR. 比如TM为65度，设计梯度时可以设计63,64,65,66. 4个梯度。然后根据跑胶结果确定大体系的TM值，如有目的带，直接胶回收。然后进行链接，转化。送公司测序。 测序结果出来后，用Chmas软件打开，并将其转化为TXT格式的碱基序列。 用Jellyfish里面，找特异性的正向，反向引物。找完正向后，将序列反过来再找反向引物。只有都能找到2个引物的序列才能算测序成功。将特异性引物两端的序列全部删除，（那是对应载体的序列）。保存克隆的中间序列，然后跟斑马鱼的序列对比，一般重复性在90%以上。若有几组序列满足要求，用着几组进行对比突变的地方按照重复多的碱基最为标准。尽量选2组以上序列。 2. 3‘克隆 克隆3‘的时候要重新用mRNA做反转录，在做反转录的时候要加上3‘接头。（接头由自己合成）。 设计引物：正向的外侧引物和内侧引物 反向的UPM和NUP 一般设计特异性引物的TM值为接近60度，最后60度以上。 首先用外侧引物和UPM做10ul体系的下体系。然后用其PCR产物模板稀释10-40倍。用作内侧引物+NUP的PCR反应模板。做大系统检测最适合TM值。找到以后直接进行胶回收，链接转化，测序。 第一轮的TM值需要摸索，第一轮以后通常是弥散的条带。如果多次尝试还是不
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
第14卷第2期2004年4月 江苏大学学报(医学版) Journal of Jiangsu University(medicine) Vol.14No.2 Apr.2004 小鼠GITRL基因的克隆和序列分析 王胜军1,2,马 斌1,仝 佳1,许化溪1,杨胜利2 (1.江苏大学医学技术学院免疫学研究室;2.江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212001) [摘 要] 目的:克隆小鼠GITRL基因全长编码区的cDNA,同时对其序列分析。方法:采用RT PCR方法,从小鼠树突状细胞获得GITRL基因的cDNA,克隆至pMD18 T载体,选择阳性克隆并进行序列测定。结果:扩增得到的GITRL基因编码区cDNA的全长519bp,编码173个氨基酸残基,与GeneBank中发表的序列完全一致。结论:获得小鼠GITRL基因的克隆,为进一步研究其生物学功能提供基础。 [关键词] GITRL基因;cDNA克隆;RT PCR;调节性T细胞;小鼠 [中图分类号] R394 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7783(2004)02-0097-04 Cloning and Sequence Analysis of Mouse Glucocorticoid induced Tumor Necrosis Factor Receptor Ligand Gene WANG Sheng jun1,2,MA Bin1,TONG Jia1,XU Hua xi1,Y ANG Sheng li2 (1.Department of Immunol ogy,School of Medical Technology,Jiangsu Universi ty,Zhenjiang Jiangs u212001,China; 2.Li fe Science Institute,Jiangs u University,Zhenjiang Jiangs u212013,China) [Abstract] Objective:To clone and analyze the cDNA enc oding mouse glucoc orticoid induced tumor necrosis fac tor receptor ligand(G ITRL)gene,a type transmembrance protein of the tumor necrosis factor(TNF)su perfamily.Methods:The c DNA of GITR L was amplified from total RNA e xtracted from mouse dendritic cells (DC)by RT PC R and inserted into pMD18 T vector,and the sequence of the DNA was analyzed.Results:The c DNA of GITRL has the length of519bp with an complete open reading frame,which encodes a product of173 a mino acid and shares100%homology with the sequence of mRNA for mouse G ITRL in GeneBank.Conclu sion:The cDNA of G ITRL was successfully cloned,which brought a founda tion for further researching on its bio logical function. [Key words] Glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor ligand;cDNA cloning;RT PCR;Dendrit ic cell;Mouse 小鼠GI TR(glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor)最初是1997年Nocentini等人[1]在地塞米松诱导T细胞杂交瘤细胞中发现的膜蛋白受体,由228个氨基酸组成,富含半胱氨酸的重复结构域,但不含DD结构域(death domain),具有许多TNF 受体超家族的特征,被命名为TNFRSF18,随后人类对应的蛋白也被发现[2]。2003年12月Tone[3]和Kime[4]等人同时发现其配体G ITRL,初步研究结果表明GI TRL具有阻断C D4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)免疫抑制功能的作用。本研究从小鼠树突状细胞(dendritic cells,DCs)中通过RT PCR扩增出G ITRL的cDNA,并进行序列分析。 1 材料和方法 1 1 材料 RPMI1640及胎牛血清为Gibc o公司产品,小鼠GM CSF、TNF 为Peprotech公司产品,PE标记抗小鼠H 2Kd单克隆抗体及FI TC标记抗小鼠CD11c单克隆抗体为BD Pharmingen公司产品,Trizol及逆转 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30300169)和江苏省社会发展资助项目(BS2000026) [作者简介]王胜军(1969-),男,江苏镇江人,副教授,主要从事免疫调节研究。
目的基因序列克隆的筛选与鉴定 目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体（recombinant）。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选(dcreening)是基因克隆的重要步骤。在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。以下就常用技术的基本原理加以介绍。 一、根据重组载体的标志作筛选 最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)、G418等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。 载体含有lacZ’的蓝白筛选法，近年更被广泛应用。例如将目的序列插入前面述及的质粒pUC19的多克隆位点，转化大肠杆菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养，凡能生长并呈白色的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒，这样就很容易获得目的序列的克隆。 根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步细致的筛选。 二、核酸杂交法 利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影（auroradiography）法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。 三、PCR法
乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析 【摘要】目的：克隆并分析保加利亚德氏乳杆菌中的乳糖酶基因。方法：利用PCR技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出乳糖酶基因、测序并生物信息学分析。结果：成功的从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3 024 bp的乳糖酶基因，利用生物软件分析，推测乳糖酶基因共编码1 008个氨基酸，蛋白分子量为114 KDa，等电点为4.9，氨基酸序列中共有9处潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。结论：成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征，为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。 【关键词】乳糖酶基因；克隆；生物信息学分析 Clone and bioinformatics analysis of lactase gene WANG Zheng1, 2, MA Wen li1, ZHENG Wen ling1 (1.Institute of Gene Project, South Medical University Guangzhou 510510, China; 2.Key Laboratory of Molecular Biology, Hainan Medical College Haikou 571101, China ) ［ABSTRACT］Objective: To clone and analyze lactase gene from Lactobacillus delbrueckii bulgaricus. Methods: Cloned lactase gene from Lactobacillus delbrueckii bulgaricus with PCR, made sequencing and bioinformatics analysis. Results: Cloned lactase gene (3 024 bp) successfully. It was presumed that the lactase gene encode 1 008 amino acids, with protein molecule 114 KDa, isoelectric point 4.9, 9 potential glycosylation sites in amino acid sequence. Made homology comparison with other lacteses. Conclusion: The lactase gene is cloned successfully and the bioinformatics analysis is made by biological analysis software to investigate its character. It provides foundation for further study and colonization at low cost. ［KEY WORDS］Lactase gene; Clone; Bioinformatics analysis 乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，还含有免疫球蛋白等抗病因子，易被人体消化吸收，是人类改善营养、增强体质的理想食品［1］。除此之外，在牛乳等制品当中还含有5%左右的乳糖,它是牛奶中主要的碳水化合物，对人体有着重要的作用。主要表现在于乳糖能促进钙质吸收及整理肠道的功效，特别是乳糖被分解后的半乳糖是婴儿脑发育的必需物质，与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。然而，人体却不能直接利用乳糖，它必须被乳糖酶分解为单糖的葡萄糖及半乳糖后才能被吸收和利用。据研究发现，世界各国人口都有不同程度的乳糖酶缺乏，东方人乳糖酶缺乏高达85%［2］，从而导致“乳糖不耐症”的发生。 乳糖酶(EC3．2．1．23，又名β 半乳糖苷酶)能将牛乳中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，并具有半乳糖苷的转移作用［3］。利用该酶生产低乳糖制品或口服酶制剂，能够有效解决“乳糖不耐症”问题。乳糖酶广泛存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡豆等植物中，大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉菌等微生物中，以及有效哺乳动物的小肠等器官和皮肤组织中。然而，
多克隆位点序列：AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA TATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAA MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHisMetAlaSerMetThrGlyGlyGlnGln ATGGGTCGCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC pET-28a(+) MetGlyArgGlySerGluPheGluLeuArgArgGlnAlaCysGlyArgThrArgAlaProProProProProLeuArgSerGlyCysEnd ...GGTCGGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC pET-28b(+) ...GlyArgAspProAsnSerSerSerValAspLysLeuAlaAlaAlaLeuGluHisHisHisHisHisHisEnd ...GGTCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC pET-28c(+) ...GlyArgIleArgIleArgAlaProSerThrSerLeuArgProHisSerSerThrThrThrThrThrThrGluIleArgLeuLeuThrLysPro... GAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG 0票
pcDNA3.1载体序列：5428bp GACGGA TCGGGAGA TCTCCCGA TCCCCTA TGGTGCACTCTCAGTACAA TCTGCTCTGA TGCCGCA TAGTTAAGCCAGTA TCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAG CAAAA TTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAA TTGCA TGAAGAA TCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGA TGTACGGGCCAGA TA TACGCGTTGACA TTGA TTA TTG ACTAGTTA TTAA TAGTAA TCAA TTACGGGGTCA TTAGTTCA TAGCCCA TA TA TGGAGTTCCGCGTTACA TAACTTACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCA TTGACG TCAA TAA TGACGTA TGTTCCCA TAGTAACGCCAA TAGGGACTTTCCA TTGACGTCAA TGGGTGGAGTA TTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACA TCAAGTGTA TCA TA TGCCAAGTACGCC CCCTA TTGACGTCAA TGACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCA TTA TGCCCAGTACA TGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACA TCTACGTA TTAGTCA TCGCTA TTACCA TGGTGA TGCGGTT TTGGCAGTACA TCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTGACTCACGGGGA TTTCCAAGTCTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAA TCAACGGGACTTTCCAAAA TGTCG TAACAACTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTA TA TAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTA TCGAAA TTAA TACGACT CACTA 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