研究基因功能的“四大绝招”（初步总结版）
生命科学的研究有很大一部分集中于研究基因及其产物的功能。到底有哪些方法可以用来研究基因功能呢？本文初步总结为“四大绝招”。
第一招：患得患失
得，指的是基因的过表达（Overexpression）；失，指的是基因敲除（Knockout）或者低表达（Under-expression）。例如研究的假说是基因A与记忆力呈正相关，那么可以这样设计实验：先过表达基因A，预期结果是记忆力增强，再降低基因A的表达水平，或者完全敲除（如果不是lethal的话），预期结果是记忆力减弱。一个高质量的实验设计，一般应该“患得患失”，两方面的实验都要做。
我们不仅要“患得患失”，还要“斤斤计较”。因为过表达或低表达的水平不同，表型改变可能也不同，甚至看不到表型改变。例如，用RNAi Knockdown一个基因的表达水平的70%也许看不到任何变化，但是Knockdown 90%就能观察到表型改变了。所以，当过表达或者低表达研究基因却没有得到预期结果的时候，就需要考虑基因表达水平的变化是否不足。
有时即使完全敲除一个基因也看不到任何表型的改变，此时也不能下“研究基因与研究表型无关”的结论。这就好比一个桥有十个桥墩，如果只去除掉桥墩4，在非过负荷的情况下，桥可能不会倒塌，可以正常通车。可是，如果先去除掉桥墩5，再去除桥墩4，桥就会倒塌了。我们能够认为桥墩4是无用的吗？当然不能。桥墩在这里好比处于同一个通路具有相似功能的基因，桥是否可以通车好比基因的表型是否正常。所以，在敲除一个基因A看不到表型改变的情况下，可以在基因B（与A的功能具有相似性，或者是上下游的基因）敲除的动物模型上敲除基因A，观察敲除后是否有变化。
有时候，全身性的过表达、低表达或者基因敲除会出现我们不想要的结果。例如，全身性的基因敲除会致命。为了解决这个问题，现已开发出许多种组织特异性和时间特异性的过表达、低表达和基因敲除技术，使得基因调控更加准确。
第二招：上下求索
基因需要经过转录为RNA、翻译为蛋白质至少两步才能发挥功能。所以，研究一个基因的功能，就可以在DNA、RNA和蛋白质的水平分别进行研究。DNA 的水平相同，不代表RNA的水平相同；同样，RNA的水平相同，不代表在蛋白质的水平相同。哪怕就是在RNA水平，还有不同的剪切的可能。
一个基因翻译成蛋白质之后，常常需要同其它的基因及其产物相互作用才能发
挥功能。例如基因S，翻译成蛋白质S，如果它是配体，就需要和受体结合，然后受体激活信号通路。如果S鉴定出来了而其余的通路基因没有鉴定出来，那就可以研究上游的配体和下游的信号通路基因分别是什么。一个转录因子，常常可以激活或抑制一系列基因的表达，究竟可以控制哪些下游基因，也值得研究。蛋白质发挥功能，常常会有正性调控和负性调控因子。从上游来看，哪些基因及其产物可以促进或抑制研究基因的表达水平？具体机制是怎样的？从下游来看，哪些基因及其产物可以增强或者减弱研究基因的功能？具体机制是怎样的？这些都可以研究。
所以，研究一个基因，就可以在不同的表达水平和不同的作用水平上“上下求索”。
第三招：背井离乡
背井离乡，指的是misexpression，就是在非正常时间、非正常位置、非正常物种（时间、地点、人物）表达一个基因。如果在正常情况下，研究基因具有特定功能，而且在非正常时间、非正常位置和非正常物种间表达的时候同样导致该功能，则我们下“该基因具有该特定功能”的结论就更有把握。
值得注意的是，misexpression不产生预期表型，并不能认为研究基因与该表型无关。因为一个基因发挥作用，需要很多其它基因的帮助。如果misexpression的部位、时间、物种缺乏该基因发挥功能需要的辅助基因，或者多了可以抑制该基因功能的其它基因的表达，则可以导致预期表型无法产生。如果misexpression产生了某一表型，不代表该表型是该基因的正常功能，原因同上。所以，misexpression告诉我们：该基因“可以”做什么，不代表该基因实际上做了什么。打个比方，我们把一个教授放到农村去，他没法接触到做科研需要的设备、文献等，而且迫于生计，他不得不自己种田维持生存。我们能够下结论说：教授的社会职能是种田吗？当然不可以。但是我们可以说：教授是“可以”种田的。
第四招：一网打尽
如上所述，每一个基因都有作用于它的上游基因，也有受它作用的下游基因。每一个上游基因和下游基因又分别有自己的上下游基因。除了上下游基因及其产物，细胞内、机体内的其它物质例如离子等也都会作用于基因自身。用马哲的观点来说就是联系无处不在，无时不有。这些联系构成了一个复杂的网络。目前生命科学的一个发展趋势就是研究基因网络。所以，研究一个基因的功能，还可以构建出它所处的网络。
一切道理都是相通的。上面提到的“四大绝招”也适用于研究日常生活和人类社
会中遇到的问题。我们可以把基因替换为人，例如想要研究某一总裁的功能，就可以：将他撤职，看看公司有何变化；看看公司里面哪些人与总裁发生了联系，联系是怎样的，总裁与外界发生了哪些联系，哪些人可以领导总裁，总裁又可以领导哪些人；把他调换到另一家公司任职，看看那家公司有何变化；总裁与公司及外界事物形成了怎样一个网络等。
植物基因功能诠释研究方法的新进展 (东北农业大学，150030) 摘要：本文通过阅读大量的文献，总结了植物基因功能注释研究方法的最新进展。对每种方法的原理及优缺点做了综述，拟供初学者和作相关研究者参考。 关键词：基因功能；研究方法；新进展 基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(struc tural genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组(functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征。功能基因组学(functional genomics)又往往被称为后基因组学(postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。[1,2]这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析。新的技术应运而生，包括基因表达的系统分析，cDNA微阵列，DNA芯片等。鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异，因此需要建立模式生物体。 自华大基因启动“千种动植物基因组参考序列谱构建计划”和“千种植物转录组研究”以来，已完成水稻、黄瓜、马铃薯、白菜等植物的基因组序列图谱绘制，并通过对大豆的重测序研究建立了高密度分子标记图谱。这将是21世纪生命科学研究的重要领域。[3]本文将对研究基因功能的新技术及其新进展作一综述。 1 利用生物信息学方法分析基因的功能 生物信息学是利用生物信息学和电子技术(互联网技术)寻找并克隆新的未知功能的基因,着重于技术和操作层面,利用生物信息学对新基因进行电子克隆,及克隆该新基因的序列后对其进行简单的功能分析,如基因的编码区、启动子区、内含子/外显子、翻译启始位点和翻译终止信号预测,基因的同源比对,编码的氨基酸辨识蛋白质,蛋白质的物理性质,蛋白质的二级/三级结构、特殊局部结构以及功能预测等[4]。 1.1 通过序列比对预测基因功能
基因功能的研究思路主要包括: 1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度, 不同组织/器官)表达谱; 2.基因在转录水平的调控(可以通过genome walking PCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域, 通过单杂交或ChIP等技术, 寻找该基因的转录调控蛋白) 3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交, GST pulldown, co-IP, BRET, FRET, BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位) 4.gain-of-function & loss-of-function: 也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout), 从表型分析该基因的功能. 功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究, 综合分析. 关于基因的表达和定位，可以这样去做： 1. mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或real time RT-PCR，检测基因的表达情况/变化。 （或者以northern blot、Rnase protection assay方法，检测基因的mRNA表达情况/变化。）2. 蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Western blot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。 3. 检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。 1 首先应当表达该基因，原核基因最好原核表达，真核基因最好真核表达。 2 蛋白质的功能首先观察这种蛋白是膜蛋白还是分泌型蛋白，通过软件分析都可以预测。 3 功能分析可以通过基因树，探究此基因与其他基因的同源性，然后用表达的蛋白进行分析。 4 再有考虑到蛋白相互作用往往介导了蛋白的功能，可以应用酵母双杂交技术和噬菌体展示技术筛选能与此基因表达的蛋白相互作用的蛋白。 5 发现与其相互作用的蛋白后可以通过与其相互作用蛋白的功能推测。 6 可以通过体外过表达此基因观察各种信号通路的改变从而推测其功能
·综述· 基因功能研究的方法 李新枝,蔡佩玲,牟林春 (成都医学院基础医学院人体解剖学与组织胚胎学教研室,四川成都 610083) 【中图分类号】 Q78 【文献标识码】 A 1985年在加利福尼亚大学Santa Cruz分校举行的一次会议上,有人第一次提出了共同努力测出人类基因组序列的可能性,虽然这个主意引起了许多人的兴趣,但几乎没有强的支持者[1]。1986年,诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco于《Science》上率先提出人类基因组计划(human geno me project,H GP),旨在阐明人类基因组的3×109个碱基对的序列,发现人类所有基因并阐明其在染色体上的位置,破译人类的全部遗传信息,使人类第一次在分子水平上全面认识自我[2]。自1990年正式启动以来,随着人类基因组计划和其它模式生物基因组研究的顺利进行,生命科学研究已进入后基因组时代。基因组学的研究也从结构基因组学转向功能基因组学的研究。基因组序列测定的完成仅仅是基因组计划的第一步,更大的挑战在于如何确定基因的功能和弄清全部的遗传信息。因而基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题,它将是21世纪生命科学研究的重要领域。经典的扣除杂交(subtractive hybridization)、差示筛选(diferential screening)、cDNA替代差异分析(repre-sentative dife rential analy sis,RDA)以及m RNA差异显示(diferential display)等技术已广泛应用于差异表达基因的鉴定和克隆,但这些技术和策略对于从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究来说是远远不够的[3]。于是,随着后基因组时代的到来,一些能够对大量基因进行全面、系统分析的新技术应运而生。本文主要介绍近年来用于基因功能研究的较新方法。 1 微阵列分析[1] 微阵列(micro array)是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项研究基因功能的新技术。它包括cDNA微阵列(cD-NA microarray)和DNA芯片。 其基本原理是:将成千上万条DNA片段(cD-NA、表达序列标签(ex pressed sequence tag,EST)或特异的寡核苷酸片段)按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微阵列就称为DNA芯片。检测时,首先用来自不同生理状态和发育阶段的m RN A作为模板,以放射性同位素或荧光标记的dN TP为底物反转录合成cDNA,再用所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交,然后通过计算机对结果进行判读和处理,这样就可以知道芯片中哪些基因在细胞里表达,哪些基因不表达;同样也可以测知哪些基因的表达水平高,哪些基因的表达水平低[3]。 2基因转导技术 基因转导是将目的基因转入某一细胞中,然后观察该细胞生物学行为的变化,从而了解该基因的功能。这是目前应用最多、技术最成熟的研究基因功能的方法之一。但因基因的表达受转导效率和是否持续稳定表达两方面因素的影响,故要慎重选择转导系统[4]。常用的基因转导系统有非病毒性和病毒性两种。 (1)非病毒性表达载体:通过DNA直接注射或与多聚赖氨酸、阳离子脂类混合,使目的基因穿过细胞膜。由于转录效率、m RN A的加工、m RNA的稳定性及翻译效率、目的基因的拷贝数以及目的蛋白翻译后加工等因素影响目的基因的表达,因此在选择表达载体时应注意:内含子序列、内部核糖体进入位点(Internal ribo some entry site,IRES)、选择强启动子和增强子及选择高效的多聚腺苷酸加尾信号(Poly A)。 (2)病毒表达载体:以病毒为载体介导的基因转移技术因其转染效率高、目的基因可稳定表达等优势被广泛应用。目前已构建的多种病毒载体各有特点:逆转录病毒载体可携带外源基因并整合到靶细胞的基因组中,从而实现目的基因的稳定持久表达,某些亚型几乎能稳定转导100%靶细胞,但缺点是只能感染正在分裂的细胞,且有插入突变和激活癌基因的危险;人腺病毒载体具宿主范围广、装载量大(重组腺病毒最大包装容量为野生型的105%)等优点,是对分 · 57 · 四川解剖学杂志2007年 第15卷 第1期
研究基因功能的“七大绝招”与“三板斧” 2011.12.6-12.8 （说明：本文是对大约一年前的博文《研究基因功能的“四大绝招”（初步总结版）》的修改和补充，仍存在继续修改的可能。本文可能适合的读者是生物医学的科研新手和非生物医学领域的人。） 生命科学的研究有很大一部分集中于研究基因及其产物的功能。到底有哪些方法可以用来研究基因功能呢？本文初步总结为“七大绝招”和“三板斧”。掌握了这“七大绝招”和“三板斧”，设计实验更容易，看文献听学术报告也更轻松。 第一招：天地人合 无论是学习还是研究，必须遵循的一个原则是“从生活中来，到生活中去”。学习的时候，如果与日常生活中熟悉的、简单的事情结合起来理解，就可以化繁为简，化难为易。学习的目的是为了应用，学到的东西，必须应用到日常生活中去。 怎样研究基因的功能？要回答这个问题，我们先看怎样研究人的功能。假如你是男生，喜欢上了一个“女生”，可是这个“女生”长得扑朔迷离，帅气中带着妩媚，羞涩中透出豪爽。所以，你面临的第一个问题就是：TA到底是男还是女？第二个问题是：TA是不是学生？如果是的话，是本校的吗？你不认识TA的任何朋友，所以也没法打听。为了回答这几个问题，你决定翘课跟踪TA。你发现，白天的大多数时间，TA去了本校教学楼的教室。你守在教室的洗手间旁边，观察TA下课的时候上洗手间，去的是男洗手间还是女洗手间。高兴的是，你发现 TA去了女洗手间（终于松了一口气）。不过你比较小心，为防万一，你又跟 踪她，看她晚上回宿舍去的是男生宿舍还是女生宿舍。不出所料，她去了本校的女生宿舍。这下你终于放心了：她是本校的一个女生。
因为她去女洗手间和女生宿舍，提示她是女的。因为她白天去本校教室，晚上去本校女生宿舍，提示她是本校女生。上述事例告诉我们：一个人什么时候，在哪里活动可以提示其身份。同样，基因表达的时间和部位，常常可以提示其功能。例如，如果基因A在胚胎发育过程中表达，成年后不表达，则提示该基因与发育有关。基因B在在大脑的海马中表达，而海马与记忆有关，那么这个基因可能与记忆有关。 接下来的问题就是：她是哪个系的？她有什么兴趣爱好？你发现，她有两个个形影不离的好朋友。你恰好有同学认识她的这两个朋友。同学告诉你：她两个好朋友都是中文系的，都喜欢打羽毛球。这时，你基本上就可以认为这个女生是中文系的，爱好之一是羽毛球了。 以上所述可以归纳为三点：天时，地利，人和。“天时”指基因及其产物什么时候表达，“地利”指的是基因及其产物表达于哪个部位。“人和”可以进一步引申为两点：1. 近朱者赤，近墨者黑。就是说一个人会与他经常接近的人相似。基因也是如此，相互作用的一些基因常常具有类似的功能，它们为了完成同一个功能而通力合作。例如，如果实验发现蛋白C与蛋白D相互结合，而基因D是某一信号通路的受体，则基因C可能也是该信号通路的成员。2. 近猪者吃，近墨者喝。就是说一个人不仅会经常接触与自己类似的人，还经常接触自己的工作对象。例如，一个经常与学生接触的人，既可能是学生（近朱者赤），也可能是老师（近猪者吃）。同理，与一个基因接触的其它基因或者物质，也可能是其作用的对象。例如，如果蛋白质F与DNA结合在一起，则提示其对DNA发挥作用，可能参与DNA复制、转录等。 “合”指的是合理。亿万年的进化使不合理的基因基本上都被淘汰了，所以存在的基因其功能必定是合理的，至少具有合理性的一面。合理的表现就是能够促进个体的生存和繁衍。合理遵循两个原则：一，经济原则。生物不会浪费物质和能量在一个无用或者冗余的基因上。凡是一个基因可以实现的功能，没有必要用两个基因。二，有效原则。基因的功能应该促进而不是损害生物的生存和繁衍。根据合理性原则，无需任何实验证据，我们不难想到非编码DNA序列是有用的，不是无用的垃圾。 第二招：患得患失
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新基因功能研究的整体策略 张岚,李庆章 (东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030) 摘要:随着生命科学的发展及研究领域的不断开拓,越来越多的未知新基因和基因的新功能被发现,这些基因功能的研究成为了后基因组时代的首要任务。作者对新基因的研究策略作了一个较为系统全面的综述。 关键词:新基因功能研究;功能预测;基因转导;蛋白质相互作用 中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(2011)05 0109 05 随着人类基因组计划(H GP)和其它模式生物基因组计划的相继完成,生命科学已经进入了后基因组学时代(post geno mics)。在对基因组结构进一步了解的同时,功能基因组学逐渐成为核心内容(徐子勤,2007)。基因组序列测定的完成仅仅是基因组计划的第一步,更大的挑战在于如何确定基因的功能和阐述其调控的机制与表达规律。因而,基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题,它将是21世纪生命科学研究的重要领域(李新枝等, 2007)。那么,对于一个未知的新基因,如何对它制定基因功能的研究方案从而进行全面、系统的研究是每个基因功能研究者面临的首要问题。目前基因功能的基本策略包括:通过生物信息学的方法对新基因进行结构和功能的预测;通过试验方法进行基因功能的验证,包括功能获得策略和功能失活策略;基因编码产物相互作用蛋白的研究。作者结合国内外基因功能研究方法的新进展,对基因功能研究的策略进行了一个系统的综述。 1 新基因全长cDNA的克隆策略 在研究新基因的功能之前,首先要通过基因克隆试验得到新基因全长cDNA序列。所有的基因克隆都包括4个步骤,依次为产生DNA片段、连接至载体、转化到受体细胞中扩增和目的序列的筛选鉴别。如果一个基因的完整序列已经被报道,可以 收稿日期:2010 10 18 作者简介:张岚(1980-),女,黑龙江人,硕士,研究方向:乳腺发育功能基因功能。 通信作者:李庆章(1953-),男,河北人,教授,博士生导师,研究方向:泌乳生物学与乳腺功能调控。E mail:qing zhangLi@h https://www.doczj.com/doc/2011387256.html,;T el:0451 ********基金项目:国家重点基础研究发展(973)计划(2011CB100800); 东北农业大学创新团队项目(CXT005 1 1/CXT005 1 2)。根据已知序列设计特异引物,通过PCR技术获得目标DNA片段。如果一个或多个物种的某种基因已经被分离,可以根据同源性比对找到的保守性序列合成探针或简并引物,通过文库筛选或PCR反应从另一个新物种中分离功能相似的基因。如果只知道某个基因的一段碱基序列,可以采用RA CE(cDNA 末端快速扩增)或反向PCR和锚定PCR方法克隆该基因的cDNA全长序列;也可以将已知序列制备成探针对cDNA文库进行筛选,获得cDNA克隆后利用载体上的引物进行序列分析。此外,转座子示踪技术可用于酵母和植物的克隆;基于图谱的基因克隆方法(m ap based clo ning)依赖于遗传图谱和物理图谱,可用来分离与已知分子标记紧密连锁的基因,包括染色体跳查和染色体歩查;硅片克隆(silico cloning),即不经过实验室工作,将网络中的数据资料进行整理分析和拼接,得到新基因的全长序列(樊红等,2002)。基因的克隆有多种不同策略,研究者应根据自己的实际情况,采取适合的方法。 2 通过生物信息学预测新基因的功能 目前,生物信息学分析已成为新基因功能研究的首选和必用方法,具有方便、快捷、经济等优点。研究者往往可以从中得到与新基因功能有关的重要信息,初步推测基因的可能功能,进而制定出进一步的实验室研究方案(Kim,2004;Mo unt,2004)。 2.1 编码产物预测分析 研究者往往最开始得到有价值的EST序列,进而通过电子延伸或和相关试验方法获取其全长cDNA。在这种情况下,首先要进行全长cDNA序列的开放阅读框查找,推导其编码蛋白质的氨基酸序列。然后,进行信号肽序列预测分析(http://genome.cbs.dtu.dk/services/ Sing nalP/),初步判定其亚细胞定位(Bendtsen等, 2004)。再进行蛋白质的基本理化性质分析,包括氨基酸组成、分子质量、等电点、亲/疏水性等。最后,