无患子毒性实验
无患子皮
2011-10-22 15:18 【大中小】【我要纠错】
无患子皮为无患子科植物无患子SapindusmukorossiGaertn.的果皮。
【出处】出自《日华子本草》
【拼音名】WúHuànZǐPí
【英文名】Root-barkofChineseSoapberry
【别名】槵子肉皮、无患子荚、槵子皮。
【来源】药材基源：为无患子科植物无患子SapindusmukorossiGaertn.的果皮。
拉丁植物动物矿物名：SapindusmukorossiGaertn.采收和储藏：秋季果实成熟时，
剥取果肉，晒干。
【原形态】无患子落叶大乔木，高可达20多米。嫩枝绿色，无毛。偶数羽状复叶，互生；叶连柄长25-45cm或更长，叶轴上面两侧有直槽；小叶5-8对，通常近对生，小叶柄长约0.5cm；叶片薄纸质，长椭圆状披针形或稍呈镰形，长7-15cm或更长，宽2-5cm，先端短尖，基部楔形，腹面有光泽，两面无毛或背面被微柔毛。花序顶生，圆锥形；花小，辐射对称；萼片卵形或长圆状卵形，大的长约0.2cm，外面基部被疏柔毛；花瓣5，披针形，有长爪，长约0.25cm，外面基部被长柔毛或近无毛，鳞片2个，小耳状；花盘碟状，无毛；雄蕊8，伸出，花丝中部以下密被长柔毛；子房无毛。核果肉质，果的发育分果爿近球形，直径2-2.5cm，橙黄色，干时变黑。种子球形，黑色，坚硬。花期春季，果期夏秋。
【生境分布】分布于华东、中南至西南地区。各地寺庙、庭园和树边常见栽培。
【性状】性状鉴别果皮不规则团块状，展开后有不发育果爿脱落的疤痕。
疤痕近圆形，淡棕色，中央有一纵棱，边缘稍突起，纵棱与边缘连接的一端有一极短的果柄残基。外果皮黄棕色或淡褐色，具蜡样光泽，皱缩；中果皮肉质柔韧，粘似胶质；内果皮膜质，半透明，内面种子着生处有白色绒毛。质软韧。气微，味苦。
【化学成份】果皮含皂贰约24.2%，无患子倍半萜甙（mukurozioside）Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb，姜香甙（rutin），抗坏血酸（ascorbicacid），糖类（sugar），类黄酮（flavonoid）及鞣质（tannin，约含4%）等。其中皂甙有无患子属皂甙（sapindosides）A，B，C及E，无患子皂甙（mukurozisaponin）E1、G、X、Y1及Y2等，上述皂甙的甙元均为无患子皂甙元（mukurosigenin）亦即常春藤皂甙元（hederagenin）。
【药理作用】1.降压及降血脂：本品总皂甙0.44mg/kg皮下注射，能使正常兔血压下降25%，对实验性动脉粥样硬化的兔每日以0.04mg/kg灌胃，连续30-50天，从第40天开始，血胆甾醇含量自248-292mg/100ml降至50-110mg/100ml，同时血中卵磷脂升高，血压降低36.7%.2.抗菌：常春藤皂甙元有较强的抗菌作用。
3.溶血：本品总皂甙有溶血作用，溶血指数为7000.
4.其他：果壳煎剂0.02%-0.03%
浓度在1小时内能杀死蝌蚪。
【毒性】毒性：本品总皂甙对小鼠的半数致死量，灌胃为1625mg/kg.
【性味】苦；平；有小毒
【归经】心；肝；脾经
【功能主治】清热化痰；止痛；消积。主治喉痹肿痛；心胃气痛；疝气疼痛；风湿痛；
虫积；食滞；肿毒。
【用法用量】内服：煎汤，6-9g；捣汁或研末。外用：捣涂或煎水洗。
【各家论述】1.《本草拾遗》：主喉闭。
2.《陆川本草》：行气止痛，消胀去郁。治腹泻，腹痛，喉痛。
3.《南宁市药物志》：化热痰。
4.《中国药植图鉴》：为祛痰剂，并能解河豚中毒，止疝痛、风湿痛。
5.《广西实用中草药新选》：无患子果含有无患子皂甙，有强烈的溶血作用。但通常将
果焙成炭，剂量可达五钱，未见溶血症状，此可能与炮制有关。
【摘录】《中华本草》
无患子果实的化学成份、作用、副作用及毒性
化学成份
无患子果实含无患子皂甙（Sapindoside A, B, C, D,
E），其甙元为常青藤甙元（hederagenin），尚含芸香甘及大量维生素C、酪氨 （tyrosine）、甘氨 （Glycine）、丙氨 （alanine）、果糖、葡萄糖、戊糖、甲基戊糖、阿拉伯糖及鼠李糖等。
无患子果实中最重要的成份是皂甙。很多植物都会产生皂甙，但各种植物所生皂甙各有不同，例如人参会产生人参皂甙，茶有茶皂甙，茶及人参皂甙都被认为有防癌作用。
作用
1.改变水的表面张力，作用类似肥皂，因此农业上也被用为展著剂。
2.分解油脂：取一滴动物或植物油在盘飧上，再加上一滴无患子皂乳，以手指搓匀，就可发现两者作用变成不透明的乳化物，而使油脂失去油腻性。
3.促进其他药物的吸收：动物试验证明，将无患子皂乳与某种抗生素混合灌入动物大肠，动物对此抗生素的吸收率要比单纯灌入抗生素者的吸收率要高上许多，这可能是因为Saponin改变了细胞的可渗透性，使他种化学物质更易穿透。由此推论，无患子皂乳有成为皮肤用“药引”的潜力，能促使各种皮肤用药或美容保养品，更有效的渗透至皮肤深层，进而发挥更大疗效。
副作用
无患子汁液若接触到眼睛，会有不适感，必须用水冲洗眼睛，不适感在1￣2小时後才消失。
毒性
医书形容无患子有“小毒”。无患子正是因为有这些“小毒”的存在，才能表现出其疗效。若无此小毒，恐怕与一般食用水果无异。
野外求生者，可经由野生动物采食与否来判断该水果是否有毒，可否食用。在自然界，无患子正是松鼠、飞鼠及猴子所爱吃的水果，可见其毒性之“小”，无患子也是一种人兽通用的肠道驱虫剂（见附录2）。嗜食无患子果实的野生动物在岛上历经数万年（或更久）仍繁衍不绝，这也足以佐证无患子对於同为哺乳动物的人类之安全性，藉著一年一度的无患子排虫大餐把体内寄生虫扫除，更有益其健康。近年无患树在有人烟之地几近绝灭，少了无患子这种药膳食物，说不定野生动物们正在为肠内寄生虫所苦呢！
药物的作用与毒性往往只是一物的两面，与剂量、给予方式、物种差异、生物体大小、过敏性、可逆性有关：
1.剂量：疗效强的中药植物，不宜超量使用或食用。若适量使用是药，超量则是毒，一般人都有这种普通常识。
2.给予方式：各种药物都有其特定的正确投与路径，非遵循不可。无患子只能外用及口服，而绝不可以用来作静脉注射，若静脉注射会导致溶血。
3.物种的差异性：无患子对冷血脊椎动物（如鱼）有毒，但对同样是水中生物的虾子却很安全。这就是不同种生物间的差异性，但是由於无患子皂乳这种果汁的成份可迅速被细菌分解，因此即使大量使用无患子皂乳，经污水处理池作分解後，也不致对鱼群产生影响。
4.生物体大小之差别：体型小的昆虫对无患子毫无防御能力，例如飞行中的蚊子若碰到可消除表面张力的无患子喷雾，其体表的防湿装置失效，以致全身湿透，就像一架失去动力的飞机垂直坠落，小蚂蚁也会因呼吸气孔进水而在一瞬间完全静止，蜘蛛对无患子更是毫无抵抗力。
5.过敏性：人类特异体质者可对任何物质过敏，尘及花粉的过敏体质虽较常见，但也有人对鸡蛋、面粉过敏。有人因体质关系不可接触无患子，易起过敏反应，但极少见。
6.可逆性：把无患子皂乳滴在舌尖，舌尖会有厚重麻木感，维持4￣5小时，过後就恢复正常，可以百分之百恢复原来的功能，是为可逆。
注：无患子虽然尚未被西方医学界深入研究及使用，但是在中国及印度却已临床使用了两千年以上且有文字记录，可以说已经做过无数的人体试验，只要使用方法、对象、适应症及剂量正确，其安全性应是可被接受的。
(3)无患子去皮肤金属毒物沾染洗涤剂研究获得成功
长期以来,接触金属毒物的工人班后皮肤清洁多用肥.皂或洗衣粉清除,但效果不理想,手
及皮肤仍不同程度地残留金属毒物的成分。为了及时有效地清除体表沽染的金属毒物,防止金属中毒,广西职业病防治研究所科研人员,在广泛药物筛选的基础上,以中草药无患子(SaPindaceae)为主要原料,经过毒性试验,洗脱效果试验,剂型配比,现场使用试验,开发价值论证等综合研究,研制出一种新型高效的去皮肤金属沽染洗涤剂。该洗涤剂对皮肤无损害、无刺激,对机体无毒,对铅、锰、铬、镯、砷、汞等金属沽染皮肤的洗脱率分别达96.6%、99.6%、94.8%、91。1%、90.6%和99.3%,均显著优于肥皂,经6个工厂铅作业工人班后洗手试验,对其中76例抽样检查的洗脱率平均达95.4%,洗后双手残留铅量0.59毫克而普通肥皂为了3.1%和3。53毫克,两者差异非常显著,工人普遍反映该洗涤剂去污效果比肥皂好,不失为一种较理想的金属作业工人的劳动保护用品。自古以来,我国民间用无患子桌皮洗手洗衣物就颇受赞誉,《山海经
广西壮族自治区职业病防治研究所以中草药无患子(Sapindaceae)为主要原料,经过毒性试验,洗脱效果试验,剂型配比,现场使用试验,开发价值论证等综合研究,研制出一种新型高效的去皮[
(4)无患子皂苷对肾性高血压大鼠血压及左心室血流动力学的影响
无患子皂苷是从无患子科植物无患子(Sapin-dus mukorossi Gaertn)的果实中提取的有效部位-皂苷成份。本实验旨在观察无患子皂苷对实验肾性高血压大鼠降压作用以及对大鼠心脏血流动力学的的影响,旨在阐明其药理作用的基础。1实验材料1.1主要药品及仪器无患子皂苷,由合肥新新石化有限公司提供;卡托普利,25 mg/片,上海普康药业有限公司产品,批号:051102;Bp-6无创血压测试仪,成都泰盟科技有限公司生产;Medlab U/4C501生物信号采集处理系统,由南京美易科技有限公司生产。1.2实验动物SD大鼠120只,雌雄兼用,体重180~220 g,扬州大学比较医学中心提供,生产许可证号:SCXK(苏)2002-0009。2实验方法2.1动物模型的复制及造模标准参照文献[1]的方法,加以改进,取健康SD大鼠120只,适应性喂养1W,以Bp-6无创血压测试仪测基础血压。手术前禁食12h,以3.5%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉下于腹部正中偏左约0.5 cm处打开腹腔,经腹膜后近主动脉侧分离左肾动脉,用小圆针带3/0线从肾动脉下穿...
(5)无患子籽油脂肪酸成分分析
生物柴油由各种动物及植物油脂经酯化工艺取得,主要成分是长链脂肪酸甲酯.开拓新油脂资源是未来生物柴油产业发展的关键因素.依据国家政策,要大规模生产不与民争油的生物柴油只能是野生植物.我国野生产油植物有400多种,主要有油茶、小桐子、光皮树、无患子、油棕榈[1]等.无患子(Sapin-dus mulorossiGaertn)是一种优良能源林树种,种仁含油率高达40%,盛果期平均每株产果实20 kg,产油4 kg以上,全果压榨出的油脂油酸和亚油酸高达63%以上.在
目前新能源日显重要的背景下,很多企业都看好无患子的市场前景.但是,国内对无患子籽油成分分析和加工方法研究甚少,本研究旨在对无患子籽油成分及提取工艺进行研究.1无患子籽油成分分析1.1材料与方法原料与试剂.无患子种子:漳州鼎能生物科技有限公司种植基地生产.试验用试剂均为分析纯,色谱用试剂均为色谱纯.试验仪器.高速万能粉碎机:FW-00上海金鹏仪器分析有限公司生产.气相色谱仪为GC5890HZ.索氏提取器为瑞士BUCHI B-811.旋转蒸... 无患子种仁含油量为42.7%,无患子籽油不饱和脂肪酸含量高达86.63%,其中油酸含量为55.68%;无患子籽油的酸值(KOH)为4.33 mg/g,碘值(I)为102.22 g/100 g,是很有开发前景的生物柴油的原料
(5)确立无患子皂苷提取的最佳工艺。[方法]通过单因素试验和正交试验,研究各种提取条件(提取溶剂、提取温度、
目的]确立无患子皂苷提取的最佳工艺。[方法]通过单因素试验和正交试验,研究各种提取条件(提取溶剂、提取温度、提取时间、提取次数、料液比)对无患子皂苷得率的影响,优化其提取工艺。[结果]无患子皂苷的最佳提取工艺为:提取溶剂为乙醇,提取温度为60℃时,料液比为1∶9,提取时间为3 h,提取为3次。在该条件下,无患子皂苷得率为9.32%。[结论]该工艺操作简单、提取效率高、对环境友好,适合于无患子皂苷的工厂化生产.
采用酶法提取无患子皂苷,研究了酶的类型对无患子皂苷提取的影响,并通过正交实验优化酶法提取工艺。结果表明,纤维素酶有助于无患子皂苷的提取,酶提法的较优工艺条件为:纤维素酶用量为无患子粉末质量的0.1%,酶提时间2.5 h,酶提温度50℃,pH值4.7。此时,无患子皂苷的提取率达到86.59%,比未加酶处理时提高了19.63%。...[详细]
急 性 毒 性 试 验 方 法 ――改良寇氏法 K?rber 法由K?rber 于1931提出，后经Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD 50及全部有关参数与正规概率单位法相近。 改良寇氏法（K?ber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～100%之间，最好出现0 %和100 %的剂量组。 一、剂量选择及分组 1、剂量选择 剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。 探求外源化学物的急性毒性，测定其LD 50或LC 50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD 50的计算方法，然后设计剂量。 2、预试验： 总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b ）和全部不致死的最大剂量（a ），即求出待测化学物0 %~100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组，组间剂量呈等比级数（r ），其比值为1.2~1.5。进行正式实验。 用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g ，小鼠18~22g ，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg ，犬10~12 kg 。用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD 50。 通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。 按下式设计剂量组： 1n a b r -= 式中：r —相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5， b —最低全致死剂量量， a —最高不致死剂量， n —设计的组数。 分组恰当与否也是确保实验结果准确的条件之一。因为组数过多，需要消耗较多的动物，还可能出现较大剂量组动物死亡率低于较小剂量组；组数过少，不能较精确求出LD 50。 3、根据公比(r)计算各组剂量 各组剂量分别为： 第一组：a 第二组：a r
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖) 胰酶双抗(青霉素/链霉素）DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛指甲油 6孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45μm滤膜 灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 （SiO 2 -SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时 夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化 硅（SiO 2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、SiO 2 -SS-HA、DOX， 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维 细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、 SiO 2 -SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO 2-SS-HA/DOX、SiO 2 、HA、DOX药物载 体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。 ②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口
长期毒性试验 药物毒性是否产生，取决于： a药物本身的理化特性b给药情况c如何被机体代谢 对一特定药物而言，最重要的影响毒性的因素： a给药途径b体内停留时间c给药频率 （影响靶组织的药物浓度） 1.半数有效量（ED50）：能引起50%的动物或实验标本产生反应的浓度或剂量。 2.半数致死量（LD50 ）：能引起50%的动物死亡的浓度或剂量。 3.治疗指数：TI= LD50/ ED50 药物实验动物的LD50和ED50的比值称为治疗指数（TI），用以表示药物的安全性。 4.安全范围：ED99~LD1（或ED95~LD5）之间的距离。值越大越安全。 ?有效量曲线和致死量曲线的斜率不一样时，以TI评价药物的安全性并不可靠。（原因？）六、药物毒性作用类别 药物不良反应（adverse reaction)：凡是不符合用药目的并为病人带来不适或痛苦的有害反应统称为药物不良反应。 包括：副反应、后遗效应、停药反应、毒性反应、变态反应、特异质反应、致癌性、致畸性、致突变性； （三)药物毒性临床前评价程序（三水平） 第一水平，急性毒性试验： 第二水平，长期毒性试验（第一阶段） 第三水平，长期毒性试验（第二阶段） （四）药物毒理学研究在新药临床试验各阶段的任务 第一期临床研究→探索安全的人用剂量 第二期临床研究→安全性{疗效（有效性）不良反应（安全性） 第三期临床研究→大范围的社会考察 不良反应监测→提高疗效，降低不良反应 多数毒物发挥其毒性作用至少经历四个过程： a毒物吸收后经过多种屏障转运到一个或多个靶部位； b进入靶部位的终毒物与内源靶分子发生交互作用； c毒物引起机体分子、细胞和组织水平功能和结构紊乱； d机体启动不同水平的修复机制。当此机制低下或功能和结构紊乱超过机体修复能力时，机体即出现组织坏死、癌症、纤维化等毒性损害。 长期毒性试验的意义 a判断受试药物能否进行临床试验； b预测人类临床用药时可能毒性和安全范围； c制定临床试验中的防治措施； d确定应该着重评价的生理生化指标； e选择I期临床试验时的初试剂量，等。 一、一般原则 1动物选择： a.敏感动物，年轻动物，雌雄各半 b.2种（啮齿—大鼠6w、非啮齿—比格犬4-6m） c.体重差异不大于平均体重的20% d..单笼饲养、定量喂食
化学品分类、警示标签和警示性说明安全规范急性毒性 GB20592-2006 化学品分类、警示标签和警示性说明安全规范急性毒性Safety rules for classification，precautionary labeling and precautionary statements of chemicals-Acute toxicity 前言 本标准第4章、第6章、第7章、第8章为强制性的，其余为推荐性的。 本标准与联合国《化学品分类及标记全球协调制度》(GHS)的一致性程度为非等效，其有关技术内容与GHS中一致，在标准文本格式上按GB／T 1.1—2000做了编辑性修改。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC／TC251)提出并归口。 本标准负责起草单位：天津出入境检验检疫局。 本标准参加起草单位：中国疾病预防控制中心、中化化工标准化研究所、浙江出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：王利兵、李宁涛、尚为、冯智颉、刘绍从、张园、陈文。 本标准自2008年1月1日起在生产领域实施；自2008年12
月31日起在流通领域实施，2008年1月1日～12月31日为标准实施过渡期。 化学品分类、警示标签和警示性说明安全规范急性毒性 1 范围 本标准规定了化学品引起的急性毒性的术语和定义、分类、判定流程、类别和警示标签、类别和标签要素的配置及警示性说明的一般规定。 本标准适用于化学品引起的急性毒性按联合国《化学品分类及标记全球协调制度》的危险性分类、警示标签和警示性说明。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 6944—2005 危险货物分类和品名编号 联合国《化学品分类及标记全球协调制度》(GHS) 联合国《关于危险货物运输的建议书规章范本》 3 术语和定义 急性毒性acute toxicity 经口或经皮肤摄入物质的单次剂量或在24 h内给与的多次剂量，或者4 h的吸入接触发生的急性有害影响。
毒理学实验二经口急性毒性试验 一、实验目的 1、掌握实验动物分组方法 2、测定LD50的试验设计原则 3、小鼠的经口灌胃技术 二、试剂和材料 1、实验动物： (1)动物品种：健康成年ICR小鼠，体重18g?22g (2)样品来源：首都医科大学实验动物部 2、器材：注射器(1ml)、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物 秤。 3、试剂：敌敌畏(1400mg/ml)、苦味酸染液(标记用)。 三、实验内容 1、健康实验动物的选择和性别鉴定 选择健康的雄性小鼠(健康标准：毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。动物出现圆圈动作可能为中耳炎，废弃。) 肛门与生殖孔距离：大者为雄性，小者为雌性 2、实验动物称重、编号和随机分组 选择体重在18-22 g的小鼠，采用随机分组的方法(动物按体重分为几个体重段，再从每个体重段分出各组动物)，每组10只小鼠，用黄色的苦味酸饱和液 标号1~9,10号小鼠不标记。 3、受试化学物溶液的配制 (1)确定灌胃量：0.1ml/10g (2)确定最高给药量，计算溶液浓度，估计给药总体积 (3)药品称量及稀释 4、小鼠灌胃技术 左手固定，右手持灌胃器，插入动物口腔，沿咽后壁徐徐插入食道，深度为口腔至剑突的距离。 5、毒性体征的观察和LD50计算 (1)毒性体征的观察： 染毒后注意观察小鼠中毒的发生、发展过程及死亡数和死亡时间 按表格记录动物体征及出现时间，记录死亡情况及时间，观察期为30 min
(2) LD50的计算： a 实验各组剂量的确定：设 5组，每组雌雄动物各10只 剂量组距d 为： lg LD 100 一 lg LD 0 组数-1 d 为相邻两个剂量组剂量对数之差 利用lgLD0依次加d ,取反对数，即可得出各组剂量 b 、LD50的计算(见附件)： 1 lg LD 50 = X k d' (P i P i 1) Xk:最大剂量的对数 d :相邻两组对数剂量之差 数 Pi :各组死亡率 i :组数 C 、求半数致死量的95%可信区间 标准误公式： S lg LD 50 = d ni :实验动物数。 ?1 lg (lg LD 50 - 1 .96 S lg LD 50 ) 四、实验过程 1、人员分工：本次实习同学分两个大组(A 组和B 组)，分别在不同实验室。每大 组分5个小组，分别处理雌雄动物，每小组 10只动物。 集体活动：1、2、3、4、5组各1人，进行受试物配制。 P i (1 - P i ) ni - 1 95% 可信区间:
87 BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITRO The following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalia n cell cultures followi ng con tact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or in direct patie nt con tact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specime n cannot be determ in ed, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to preve nt con tam in ati on with microorga nisms and other foreign matter. Three tests are described (i.e., the Agar Diffusi on Test , the Direct Con tact Test and the Elution Test ).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its inten ded use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; con tact ing media; in ks; adhesives; absorptio n, adsorptio n, and permeability of preservatives; and con diti ons of storage. Evaluatio n of such factors should be made by appropriate additi onal specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its in ten ded use. Materials that fail the in vitro tests are can didates for the in vivo tests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88 . USP R EFERENCE S TANDARDS 11 —USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS. Cell Culture Preparation —Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells in serum-suppleme nted minimum esse ntial medium hav ing a seedi ng den sity of about 10 5 cells per mL. Incubate the cultures at 37 1 一in a h±midified
五种农药对小鼠的急性毒性试验 绪论 随着现代农业的飞速发展，农药的应用越来越广泛，在农林作物的病虫防治中,农药一直发挥着巨大作用,尤其是本世纪60-70年代,人们大量使用农药,几乎使粮食产量增长一倍,但随着农药长期的、大量的、不合理的使用,导致了对环境的严重污染并对人体健康产生极大的影响。它们对动、植物和人类的危害越来越严重。一方面它们可以直接进入生物体内引起急性、慢性中毒和畸变，同时还通过径流、排污、挥发等途径进入土壤、大气和水体，引起各种生态环境下生物的死亡，并通过食物链的富集影响人类的食品安全。目前，因农药使用与管理失控而引发的一系列水域环境污染以及食品安全等问题，已引起政府相关部门和业内学者的广泛重视。当前，随着有机氯农药的禁用，菊酯类和有机磷类等成为我国目前使用较广泛的农药。 《中华人民共和国农药管理条例》指明，农药是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草和其他有害生物以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学合成物或者几种物质混合物及其制剂。农药残留是指农药使用后残存于环境、生物体和食品中的农药及其衍生物和杂质的总称。动植物在生长期间、食品在加工和流通中均可受到农药的污染，导致食品中农药残留。 相关报道表明，农药利用率一般为10%，约90%的残留在环境中，过多地使用农药，大量未被利用的农药经过降雨、农田渗滤和水田排水等进入水体，同时，还有大量散失的农药挥发到空气中，最后汇入水域，沉降积淀在土壤中，通过农作物吸收和食物链进入人体进行累积，并对人体健康造成危害。目前中国一些食品，如茶叶、大米、肉、蛋等食品中农药残留量常超过规定标准，过多的残留量对人体健康会造成危害。为此，论述农药残留对人体健康的危害效应及其毒理机制和防治措施，以期对防治食品中农药残留对人体健康的危害提供理论依据。 在哺乳类实验动物中，由于小鼠个体小，饲养管理方便，生产繁殖快，质量控制严格，价廉可以大量供应，又有大量的具有各种不同特点的近交品系，突变品系，封闭群及杂交一代动物，小鼠实验研究资料丰富参考对比性强；更重要一点乃是全世界科研工作者均用国际公认的品系和标准的条件进行试验，其实验结果的科学性、可靠性、重复性高，自然会得到国际认可。 本文以百草枯、甲氰菊酯、乐果、草甘膦和敌敌畏五种常用农药为实验材料, 检测了它们对
如有侵权请联系网站删除 细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、 15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1、倒去培养瓶内的培养液； 2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 3）加入胰酶500ul/0.5ml 2?10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 4）加入含10%FBS勺培养液1?1.5ml［培养液：胰酶=（2?3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 6）将单细胞悬液吸入10?15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清 液； 7）加入含10%FBS ffl胞培养液1?2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养 24-72 小时（37 C，5%CO2,使细胞贴壁； 10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物； 11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）； 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。 当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 12）向每孔加入10让（约10%）CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）； 13）将培养板在培养箱内孵育1?4小时（半小时测一次OD值）； 14）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 精品资料
实验二 急性经口毒性实验 一、实验目的： （一）通过本次实验掌握经口灌胃技术，半数致死剂量的意义。 （二）通过本次实验学习半数致死剂量的计算及毒性判定。 二、测定方法： 本实验以灌胃方式测定敌敌畏DDV 的半数致死量（经口LD50=50～92mg/kg ）。 （一）实验仪器、动物及分组： 1. 健康成年小鼠(18g ～25g)，雌雄各半。动物秤、灌胃针、烧杯、编号笔、解剖剪、小磁盘、鼠笼。 2. 实验前动物要在实验环境中适应3～5 d 时间，以了解其正常活动情况和健康状 况，并淘汰不健康或体重不符合要求的动物 。 3. 本次实验取体重18-25 g 的小鼠，实验时，将小鼠称体重、编号、按随机分组原则，将实验动物分成6组，每组24只，雌雄各半。 （二）剂量选择： 1. 首先查阅与受试化学物结构及理化性质相近似的化学物的LD50，以此值作为受试化学物的预期毒性中值，即中间剂量组，再上下各推1-2 个剂量组，进行预实验。 2. 各剂量组的间距可根据LD50 计算方法要求按等比级数或等差级数安排。 3. 本实验用机率单位法计算LD50，要求按等比级数排列，常用1：0.8，如敌敌畏的最高剂量为125 mg/kg ，其次剂量组为125 mg/kg *0.8=100 mg/kg ，依次类推为80 、64 和51.2 mg/kg 五个剂量组。 （三）受试化学物配制与稀释 1. 溶剂： 水溶性受试化学物以蒸馏水为溶剂配制成溶液。 脂溶性受试化学物以吐温-80、二甲基亚砜、植物油等配制。 2. 受试物的稀释 等容量稀释法，各个剂量组的动物均给予相同单位体重体积的受试化学物，按照事先设计的剂量分别稀释配制为几种不同的浓度的受试物溶液。 例如本次实验五个剂量组: 各剂量组动物给予相同单位体重体积受试物均为10ml/kg 。 等容量稀释法 D ：设计的染毒剂量， mg/kg V ：动物给药量（相同单位体重体积）均为 10ml/kg X ：各组需配制的受试物溶液的浓度（mg/ml ） 如：第一组染毒剂量D=51.2mg/kg ，动物按V= 10ml/kg 体重给药，配制的受试物浓度为X=51.2mg/10ml 依次类推：五个组所需配制的受试物浓度分别为 第一组：51.2mg/10ml 第二组： 64mg/10ml 第三组： 80mg/10ml 第四组： 100mg/10ml 第五组： 125mg/10ml 另设一个阴性对照组 各剂量组小鼠灌胃容量计算: V D X
细胞毒性实验设计方案 1. 准备材料：DMEM高糖)胰酶双抗(青霉素/链霉素)DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4% 多聚甲醛指甲油6 孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45 pm滤膜 灭菌：50mL , 10mL 5mL离心管两种枪头 2. 实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 (SiO^SS-HA/DOX ,在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX 的细胞毒性。实验组为SiO2-SS-HA/DOX SQ2-SS-HA、DOX 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX SQ2-SS-HA、DOX空白对照组为纯细胞。培养基中含有10%(v/v) FBS和1%(w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SQ2-SS-HA/DOX SiO2、HA DOX药物载体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型： 培养基的配置：双抗1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37°C温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，力卩5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。(每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。) ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL冻存于-20 C，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%勺酒精放入超净台。
制剂长期毒性研究技术 指导原则 公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-
北京市医疗机构制剂长期毒性研究 技术指导原则 一、概述 长期毒性研究可为医疗机构制剂（以下简称“制剂”）的研发提供重要的安全性参考信息，是非临床安全性评价的重要内容。通过长期毒性研究，可预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量毒关系和时毒关系、可逆性等；判断受试物长期给药的毒性靶器官或靶组织；推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围；提示临床试验中需重点监测的指标；提供临床试验中解毒或解救措施的参考。 本指导原则适用于中药制剂、化学制剂的长期毒性试验研究。 二、一般要求 长期毒性研究应遵守《药物非临床研究质量管理规范》，遵循毒理学研究中随机、对照、重复的基本原则进行试验设计和开展研究工作。 研究机构必须具有法人资格，具备从事药物安全性评价的相关设备、设施及资质，必须取得相应实验动物使用许可证，具有与所使用的实验动物级别相符的实验环境。 试验项目负责人必须获得相关专业领域副高级以上职称（含副高），所有参加研究的人员必须经过相关专业的业务培训。 三、基本内容 制剂的开发背景和研究基础各不相同，在长期毒性研究立题之前应进行文献查阅，根据申报品种的立题依据、临床意义、处方来源、使用历史、有效性与安全性等背景资料进行综合考虑。 （一）试验项目的选择 1.制剂注册申请
（1）中药制剂若满足以下全部条件，可免于进行长期毒性试验： ①根据中医药理论组方； ②处方中的药味用量不超过法定药品标准规定； ③处方组成中不含有法定标准中标识有毒性及现代毒理学证明有毒性的药材（毒性药材是指历版中国药典，部颁标准，进口药材标准，省、自治区、直辖市的中药材标准中标注为大毒/剧毒和有毒的药材，如制附子、制川乌、制草乌等）； ④处方组成不含有十八反、十九畏配伍禁忌； ⑤利用传统工艺配制（即制剂配制过程没有使原组方中治疗疾病的物质基础发生变化的）； ⑥急性毒性试验（采用最大给药容量、最大给药浓度）未见明显毒性反应； ⑦临床实际用药周期为1周以内。 实际用药周期超过1周者，如符合上述条件，且该处方在本医疗机构具有5年以上（含5年）使用历史、能提供可靠的临床安全性资料，亦可免于进行长期毒性试验。 （2）申请配制的化学制剂属已有同品种获得制剂批准文号的，可免于进行长期毒性试验。 （3）本医疗机构已有品种的改剂型品种，如果配制工艺无质的改变且临床用量、给药途径相同，可以免报长期毒性研究资料（缓释、控释制剂除外）。否则，应按临床拟用途径比较改变前后的长期毒性反应。 （4）化学制剂注射剂品种，参照新药的注射剂相关研究技术要求进行试验研究，提供申报资料及文献资料。 2.制剂补充申请
细胞毒性实验方案 Prepared on 22 November 2020
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖)胰酶双抗(青霉素/链霉素） DAPIMTT(5mg/mL)DMSOPBS4%多聚甲醛指甲油6孔培养板96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL)一包μm滤膜 灭菌：50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10%(v/v)FBS和1%(w/v)双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO2-SS-HA/DOX、SiO2、HA、DOX药物载体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗1%血清12%DMEM87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代：
毒理学实验二经口急性毒性试验 一、实验目得 1、掌握实验动物分组方法 2、测定LＤ５０得试验设计原则 3、小鼠得经口灌胃技术 二、试剂与材料 1、实验动物: (1)动物品种:健康成年IＣR小鼠,体重18g～22g (2)样品来源:首都医科大学实验动物部 2、器材:注射器(1ml)、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物秤。 3、试剂:敌敌畏(1400mg/ｍｌ)、苦味酸染液(标记用)。 三、实验内容 1、健康实验动物得选择与性别鉴定 选择健康得雄性小鼠(健康标准:毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。动物出现圆圈动作可能为中耳炎,废弃。) 肛门与生殖孔距离:大者为雄性,小者为雌性 2、实验动物称重、编号与随机分组 选择体重在1８-22 g得小鼠,采用随机分组得方法(动物按体重分为几个体重段,再从每个体重段分出各组动物),每组10只小鼠,用黄色得苦味酸饱与液标号１ ~9,10号小鼠不标记、 3、受试化学物溶液得配制 (1)确定灌胃量:0、１mｌ/10ｇ (2)确定最高给药量,计算溶液浓度,估计给药总体积 (3)药品称量及稀释 4、小鼠灌胃技术 左手固定,右手持灌胃器,插入动物口腔,沿咽后壁徐徐插入食道,深度为口腔至剑突得距离。 5、毒性体征得观察与LＤ５０计算 (１)毒性体征得观察: 染毒后注意观察小鼠中毒得发生、发展过程及死亡数与死亡时间 按表格记录动物体征及出现时间,记录死亡情况及时间,观察期为３0 min （2）ＬD５０得计算: ａ、实验各组剂量得确定:设5组,每组雌雄动物各10只。 剂量组距 d 为: ｄ为相邻两个剂量组剂量对数之差 利用lgLD０依次加d,取反对数,即可得出各组剂量。 b、LD5０得计算(见附件):
病毒感染细胞的实验整体流程和原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方 面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。
试验目的：急性毒性试验是在24小时内给药1次或2次（间隔6-8小时），观察动物接受过量的受试药物所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析毒性作用的主要靶器官、分析人体过量时可能出现的毒性反应、I期临床的剂量选择和观察指标的设计提供参考信息等。 一、啮齿类动物单次给药的毒性试验 （一）试验条件 1.动物品系：常用健康的小鼠、大鼠。选用其他动物应说明原因。年龄一般为7-9周龄。同批试验中，小鼠或大鼠的初始体重不应超过或低于所用动物平均体重的20%.实验前至少驯养观察1周，记录动物的行为活动、饮食、体重及精神状况。 2.饲养管理：动物饲料应符合动物的营养标准。若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应注明生产单位。应写明动物饲养室内环境因素的控制情况。 3.受试药物：应注明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。 （二）试验方法： 由于受试药物的化学结构、活性成分的含量、药理、毒理学特点各异，毒性也不同，有的很难观察到毒性反应，实验者可根据受试药物的特点，由下列几种实验方法中选择一种进行急性毒性试验。 1.伴随测定半数致死量（LD50）的急性毒性试验方法。 2.最大耐受剂量（MTD）试验方法：最大耐受剂量，是引起动物出现明显的中毒反应而不产生死亡的剂量。 3.最大受试药物量试验方法：在合理的浓度及合理的容量条件下，用最大的剂量给予实验动物，观察动物的反应。 4.单次口服固定剂量方法（Fixed-dose procedure）。选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量。 实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试药物后再禁食3-4小时。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试药物的有关资料，由上述四个剂量中选择一个作初始剂量，若无有关资料作参考，可用500mg/kg作初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg 进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，那就用下一个挡次的剂量进行预试，如该动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试药物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续再观察7天。 在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量最少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，由前面所述的四种剂量中选择出可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量；如预试结果表明，50mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次试验。
医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验 1 范围 GB/T 16886 的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。 这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育； a）用器械的浸提液，和／或 b）与器械接触。 这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T 16886 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T 16886.1-2001,idt ISO 10993- 1:1997）CB/ T 16886. 12-2000 医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idt ISO 10993- 12 :1996） 3 术语与定义 GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。 3.1 阴性对照材料negative control material 按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。 注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。 3.2 阳性对照材料 pos itive control material 按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。 注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。 _____________________________________ 1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie, Maryland, USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。 2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMS Portex Ltd,Hythe, Kent,CT21 6JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC 聚氨甲酸乙酯可从Hatano 研究所食品和药品安全中心（Ochiai 729-5 , Hanagawa257-Japan) 获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO 对使用该产品不提供担保。
毒理学实验二经口急性毒性试验 1、实验目的 1、掌握实验动物分组方法 2、测定LD50的试验设计原则 3、小鼠的经口灌胃技术 二、试剂和材料 1、实验动物： （1）动物品种：健康成年ICR小鼠，体重18g～22g （2）样品来源：首都医科大学实验动物部 2、器材：注射器（1ml）、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物秤。 3、试剂：敌敌畏（1400mg/ml）、苦味酸染液（标记用）。 3、实验内容 1、健康实验动物的选择和性别鉴定 选择健康的雄性小鼠（健康标准：毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。动物出现圆圈动作可能为中耳炎，废弃。） 肛门与生殖孔距离：大者为雄性，小者为雌性 2、实验动物称重、编号和随机分组 选择体重在18-22 g的小鼠，采用随机分组的方法（动物按体重分为几个体重段，再从每个体重段分出各组动物），每组10只小鼠，用黄色的苦味酸饱和液标号1~9,10号小鼠不标记。 3、受试化学物溶液的配制 （1）确定灌胃量：0.1ml/10g （2）确定最高给药量，计算溶液浓度，估计给药总体积 （3）药品称量及稀释 4、小鼠灌胃技术 左手固定，右手持灌胃器，插入动物口腔，沿咽后壁徐徐插入食道，深度为口腔至剑突的距离。 5、毒性体征的观察和LD50计算 （1）毒性体征的观察：
染毒后注意观察小鼠中毒的发生、发展过程及死亡数和死亡时间 按表格记录动物体征及出现时间，记录死亡情况及时间，观察期为30 min （2） LD50的计算： a、实验各组剂量的确定：设5组，每组雌雄动物各10只。 剂量组距 d 为： d为相邻两个剂量组剂量对数之差 利用lgLD0依次加d，取反对数，即可得出各组剂量。 b、LD50的计算（见附件）： C、求半数致死量的95%可信区间 4、实验过程 1、人员分工：本次实习同学分两个大组(A组和B组)，分别在不同实验室。每大组分5个小组，分别处理雌雄动物，每小组10只动物。 集体活动：1、 2、 3、 4、5 组各1人，进行受试物配制。 各小组活动： 每小组1人（共4人），进行动物标记。（1-10号） 每小组1人（共4人），进行体重记录。（1-10号） 每小组1人（共4人），进行灌胃。（1-10号） 每小组1人（共4人），根据体重吸取受试物（0.1ml/10g）
鱼的急性毒性试验 一、实验目的和要求： 通过本试验，熟悉和掌握鱼类急性毒性试验的设计、条件、操作步骤，以及试验结果的计算、分析和报告等全过程。 二、实验原理： 鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变直至死亡。在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验至少进行24h，最好以96h为一个实验周期，在24h、48h、72h、96h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50%时的受试物浓度。鱼类毒性试验在研究水污染及水环境质量中占重要地位。通过鱼类急性毒性试验可以评价受试物仅用于测定化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理的有效成都，也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。 三、实验材料： 1.实验鱼的选择和驯养 12×6 小锦鲤鱼体长7-12cm 体宽3-5cm 体重 7-12g 不同浓度的苯酚（mg/L）0、24、48、96、192、384 2、实验仪器设备 （1）实验容器 实验容器一般用玻璃或其他化学惰性材质制成的水槽。容器体积可以根据试验鱼的体重确定，通常以每升水中鱼的负荷不得超过2g（最好为1g）。一些小型鱼类幼鱼可选择500ml 或1000ml烧杯为实验容器。容器的深度必须超过16cm，水体表面积越大越好。同一实验应采用相同规格和质量的容器。为防止鱼类跳出容器，可在容器上加上网罩。实验容器使用后，必须彻底洗净，以除去所有毒性残留物。 （2）其他 吸光光度计 3、实验用水：曝气水 四、操作步骤： 1、设置5个浓度组，1个空白对照组，选择不同浓度的苯酚（mg/L）0、24、48、96、 192、384。每个浓度放入12条小锦鲤鱼。采用直接投毒方式，将配制的苯酚溶液直接倒入水槽中，搅拌均匀。分别分为1、2、3、4、5、6组。染毒后观察其活动状况，并