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羧甲基几丁质的制备和性能研究
蒋丽霞顾其胜王文斌
【摘耍】目的制备羧甲基几丁质并对其性能进行研究。方法以新鲜虾壳为原料制备几丁质，然后采用碱化和醚化反应以及提纯工艺制备羧甲基几丁质。采用双突跃电位滴定法测定脱乙酰度、元素分析法测定取代度、傅立叶
变换红外光谱仪和核磁共振仪分析羧甲基的取代位置，采用凝胶色谱结合多角激光光散射仪测定相对分子质量及其分布，并按照ＧＢ／Ｔ１６８８６医疗器械生物学评价对其生物学性能进行检测。结果通过将新鲜虾壳进行脱钙和去除蛋白质后制备的几丁质进行碱化和醚化反应可成功制备羧甲基几丁质。采用双突跃电位滴定法测得羧甲基几丁质的脱乙酰度为１３．７６％，采用元素分析法测得的脱乙酰度和取代度分别为１４．５３％和１．２３９０。红外光谱图显示取代位置为Ｎ，Ｏ取代；”Ｃ—ＮＭＲ谱图显示羧甲基几丁质是以６位上的一级取代为主，各位置的取代大小依次为６位羟基、一ＮＨｚ和３位羟基。凝胶色谱结合多角激光光散射仪测定结果显示羧甲基几丁质的重均相对分子质量和数均相对分子质量及其分布系霰分别为６．２５×１０５、５．６０×１０５和１．２２。生物学性能检测结果显示羧甲基几丁质是一种无菌、无热原、无急性全身毒性、无细胞毒性、无皮内刺激、无皮肤致敏反应、无遗传毒性的生物材料，植入人体后对组织无毒副作用。结论通过碱化和醚化反应从几丁质中制备的羧甲基几丁质是一种脱乙酰度较低、取代度高、生物相容性良好的高分子生物医用材料。
【关■词】几丁质羧甲基几丁质制备性能
中田分类号：Ｒ３１８Ｑ６１文献标识码：Ａ
ＰＲＥＰＡＲＡＴＩｏＮＯＦＣＡＲＢＯＸＹＭＥＴＨＹＬＣＨＩＴＩＮＡＮＤＳＴＵＤＩＥＳＯＮＩＴＳＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ／ＪＩＡＮＧＬｉｘｉａ，ＧＵＱｉｓｈｅｎｇ，ＷＡＮＧＷｅｎｂｉｎ．ＳｈａｎｇｈａｉＱｉｓｈｅｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，２０１１０６，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ．Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｘｉａｊｉａｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＪＩＡＮＧＬｉｘｉａ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｘｉａｊｉａｎ９１８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｐｒｅｐａｒｅｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｈｉｔｉｎａｎｄｓｔｕｄｙｉｔｓｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＣｈｉｔｉｎｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍｆｒｅｓｈｓｈｒｉｍｐｓｈｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｎｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｈｉｔｉｎｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆａｌｋａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｅｔｈｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｗｅｌｌａｓｂｙｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｔｈｅｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎｄｅｇｒｅｅｏｆｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｈｉｔｉｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｔｈｅｄｏｕｂｌｅ—ｊｕｍｐｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃｔｉｔｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；ｔｈｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｄｅｇｒｅｅｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｔｈｅｅｌｅｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ；ｔｈｅｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｐｏｓｉｔｉｏｎｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｔｈｅＦｏｕｒｉｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｆｒａｒｅｄｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｐｐａｒａｔｕｓ
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［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＣｈｉｔｉｎＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｈｉｔｉｎＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＰｒｏｐｅｒｔｙ
作者单位：上海其胜生物材料技术研究所（上海，２０１１０６）
通讯作者：蒋丽霞，工程师，研究方向：天然降解生物材料，Ｅ—ｍａｉｌｌｉｘｉａｊｉａｎｇｌ８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
几丁质在自然界分布很广，存在于某些菌类的细胞壁，某些藻类以及虾、蟹、昆虫等的骨骼及外壳中，在地球上的年产量仅次于纤维素，是第二大天然资源。几丁质、壳聚糖的化学结构与纤维素相似（图１）。这三种
万方数据
中国修复重建外科杂志２００７年２月第２１卷第２期
化合物结构上的差别仅仅是Ｃ一２位的官能基团（Ｒ）不同，纤维素是Ｒ为羟基（一ｏＨ）的葡萄糖聚合物，几丁质是Ｒ为一ＮＨＣＯＣＨ。的Ｎ一乙酰基葡萄糖胺的聚合物，壳聚糖是Ｒ为一级胺（一ＮＨ。）的葡萄糖胺聚合物。几丁质不溶于水、酸和碱中，而几丁质脱乙酰基后得到的壳聚糖则不同于几丁质，它是一种聚电解质，溶于稀酸中。几丁质和壳聚糖因其良好的生物相容性和生物可降解性，作为生物医用材料的应用引起了越来越多学者的兴趣，在医学上的应用也不断得到发展［１。］。其溶解性能的影响限制了其应用，但可以利用几丁质和壳聚糖的Ｃ一３和Ｃ一６位上各有一个一ＯＨ，以及壳聚糖在Ｃ一２位上的氨基进行化学改性而得到许多水溶性衍生物，扩大其应用范围。如将壳聚糖在碱性条件下和丙烯腈反应可生成腈乙基壳聚糖；用ａ一氯代酸和碱性几丁质反应能生成羧甲基几丁质和羧乙基几丁质，也可与碱性壳聚糖反应生成羧甲基壳聚糖和羧乙基壳聚糖；用环氧乙烷和碱性几丁质反应能生成羟乙基几丁质等［４。７］。水溶性的几丁质和壳聚糖由于其水溶性，更适合于人体环境，因此，进一步扩大了几丁质和壳聚糖在医学领域的应用［８’９ｊ。
我们的实验以新鲜虾壳为原料，洗净，分别用ＨＣＩ和ＮａＯＨ溶液浸渍以去除钙盐和蛋白，洗涤至中性，烘干得到几丁质。然后将几丁质用浓碱进行碱化反应，用氯乙酸进行醚化反应生成羧甲基化几丁质，最后进行深加工提纯以去除杂质和细菌。对羧甲基几丁质的脱乙酰度、取代度、相对分子质量和分布系数以及结构进行表征，以及生物学性能的无菌、热原、细胞毒性、溶血实验、皮内刺激及致敏、皮下植入、急性全身毒性和遗传毒性实验进行了检测，表明羧甲基几丁质符合生物医学材料的要求，是一种生物相容性良好的水溶性新型生物医学材料，具有较大的潜在应用价值和广阔的发展前景。
１实验方法
１．１材料
新鲜虾壳（上海长荣冷冻食品厂），氯乙酸（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ公司，德国），ＮａＯＨ（上海化学试剂公司）。实验所用试剂均为分析纯。
１．２羧甲基几丁质的制备
将新鲜虾壳去除虾头、脚和尾，用清水清净，脱水后置于５％ＨＣｌ溶液中浸泡去除钙质，用清水洗涤至中性、脱水。再置于１０％ＮａＯＨ溶液中浸泡以去除蛋白质和色素，用清水洗至中性后脱水，于５５～６０℃烘箱内烘干，用不锈钢粉碎机进行粉碎制得几丁质粉备用。
称取１０ｇ几丁质粉于重量百分率为５０％ＮａＯＨ溶液中进行碱化。将碱化后的几丁质加入１００ｍｌ反应介质异丙醇中，缓慢加入氯乙酸于３０‘Ｃ下反应２０ｈ。用８０％乙醇反复洗涤，将沉淀物溶解在蒸馏水中，用ＨＣｌ调节至中性，砂芯过滤，用９５％乙醇沉淀后，再用９５％乙醇洗涤多次，真空干燥，得到羧甲基几丁质。最后进一步纯化以去除杂质和细菌，得到医用级的水溶性羧甲基几丁质。
１．３理化性能测定
１．３．１脱乙酰度测定按照双突跃电位滴定法［１阳测定壳聚糖脱乙酰度的方法，测定羧甲基几丁质样品的脱乙酰度。用过量的ＨＣｌ溶解羧甲基几丁质样品，ＨＣＩ与羧甲基几丁质中的一ＮＨ。等摩尔反应后，溶液中含有过量的ＨＣｌ。用ＮａＯＨ标准溶液滴定时，ＮａＯＨ溶液首先中和过量的ＨＣｌ，ｐＨ值出现急剧上升，即第一个突变，然后ＮａＯＨ标准溶液再中和与羧甲基几丁质一ＮＨ：结合的ＨＣｌ，达到滴定等当点时，ｐＨ出现第二个突变，两个突跃点消耗的ＮａＯＨ摩尔数相当于样品中的一ＮＨ：摩尔数。计算公式：Ｄ．Ｄ（％）＝—ＡＶ—Ｘ—ＣｌＮａ—ＯＨ—Ｘ—ｌ—０－—ｓＸ一１６。式中：ＡＶ（ｍ１）为两突跃点之Ｉｌｌ×０．０９９４。’、。‘
…“７。。７“…、…、‘一间消耗的ＮａＯＨ标准溶液体积之差；ＣＮ。ｏＨ（ｍｏｌ／Ｉ．）为ＮａＯＨ标准溶液的摩尔浓度；ＩＴＩ（ｇ）为样品质量（去除水分）；Ｄ．Ｄ（％）为样品的脱乙酰度；１６为一ＮＨ：的相对分子质量；０．０９９４为理论一ＮＨ。含量。
１．３．２取代度测定采用元素分析法［１¨测定羧甲基几丁质的取代度（元素分析仪，ＣＨＮ—Ｏ—ＲＡＰＩＤＨｅｒａｅｕｓ公司，德国）。同时也可用此方法测定羧甲基几丁质的脱乙酰度。
１．３．３红外光谱测定用Ｎｉｃｏｌｅｔ５７００型傅立叶变换红外光谱仪（Ｎｉｃｏｌｅｔ公司，美国）测定羧甲基几丁质的红外光谱和取代位置，ＫＢｒ压片。
１．３．４核磁共振波谱测定用ＶａｒｉａｎＭｅｒｃｕｒｙＶ。３００核磁共振仪（ＶａｒｉａｎＭｅｒｃｕｒｙ公司，美国）测定羧甲基几丁质的１３Ｃ—ＮＭＲ谱，以Ｄ。Ｏ为溶剂，甲醇为内标。
１．３．５相对分子质量和相对分子质量分布系数测定相对分子质量和相对分子质量分布系数用凝胶色谱（Ａｇｉｌｌｅｎｔ１１００系列单元泵，Ａｇｉｌｌｅｎｔ公司，美国）结合ＤＡＷＮＤＳＰ型多角度激光光散射仪（Ｗｙａｔｔ技术公司，美国）进行检测，ＯｐｔｉｌａｂＤＳＰ示差折光指数检测器（溶液浓度检测器，美国Ｗｙａｔｔ技术公司）。分离柱用ＴＳＫ５０００ＰＷ～ＴＳＫ６０００，测定温度为２５‘Ｃ，淋洗液为０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，流速为１．０ｍｌ／ｍｉｎ。
１．４生物学性能检测
万方数据
１．４．１无菌实验在无菌环境中，将羧甲基几丁质溶解于无菌蒸馏水中，按照《中华人民共和国药典》（２００５年版）二部附录Ｘ１Ｈ规定的方法检测。
１．４．２热原实验（细菌内毒素实验）．将羧甲基几丁质用细菌内毒素检测用水溶解至１ｍｇ／ｍｌ，按照《中华人民共和国药典》（２００５年版）二部附录Ｘ１Ｅ规定的方法测定。
１．４．３急性全身毒性实验在无菌操作条件下，将羧甲基几丁质用生理盐水注射液溶解至浓度为２ｍｇ／ｍｌ，以生理盐水注射液作为空白对照液，以５０ｍｇ／ｋｇ剂量静脉注射至小白鼠体内后，分别于注射后立即，４、２４、４８和７２ｈ时观察。其他实验步骤按照ＧＢ／Ｔ１６８８６．１１规定的方法检验。
１．４．４细胞毒性实验将羧甲基几丁质用细胞培养液溶解至２ｍｇ／ｍｌ。采用高密度聚乙烯为阴性对照，天然乳胶为阳性对照，不含实验材料的基本介质，并配１０％血清作为空白对照，与实验样品相同条件下进行处理。按照ＧＢ／Ｔ１＿６８８６．５规定的浸提液实验方法检验，供试液接触培养细胞４８ｈ，检测细胞相对增殖率。１．４．５皮内刺激实验羧甲基几丁质用生理盐水注射液配制成２ｍｇ／ｍｌ溶液作为供试品，按照ＧＢ／Ｔ１６８８６．１０规定的方法检验，注射后分别于即时，２４、４８和７２ｈ时观察并记录注射点的红斑、水肿反应记分。１．４．６皮肤致敏实验将羧甲基几丁质用生理盐水注射液配制成２ｍｇ／ｍｌ的溶液作为供试品，按照ＧＢ／Ｔ１６８８６．１０规定的最大剂量致敏实验方法检验。在猛推后２～４ｈ观察皮肤反应，在激发贴片移去后２４、４８和７２ｈ观察皮肤反应。在观察过程中实验动物出现的任何反应、模式、特征以及持续时间都要和对照条件进行比较。在实验位点任何皮肤炎症反应大于对照条件的都认为是可能的致敏反应。
１．４．７短期皮下植入实验家兔皮下植入实验用来评价样品材料植人活体组织内对周围组织产生局部病理反应的可能性。将羧甲基几丁质用生理盐水注射液配制成２０ｍｇ／ｍｌ的溶液，按照ＧＢ／Ｔ１６８８６．６规定的方法检验，每植入点皮下注入０．５ｍｌ。１４ｄ后取样镜下观察周围组织的反应情况。
１．４．８遗传毒性实验羧甲基几丁质用生理盐水注射液配制成２ｍｇ／ｍｌ的溶液，按照ＧＢ／Ｔ１６８８６．３规定的鼠伤寒沙门氏菌微粒体突变（Ａｍｅｓ）实验、微核实验和染色体畸变实验方法检验。
２结果
２．１羧甲基几丁质的理化性能
２．１．１脱乙酰度采用双突跃电位滴定法测得羧甲基几丁质脱乙酰度为１３．７６％（图２），采用元素分析法测得脱乙酰度为１４．５３％（表１），两者结果较接近。２．１．２取代度和取代位置羧甲基几丁质的化学式为［Ｃ６Ｈ１００４Ｎ?（Ｃ２Ｈ３０）。?（Ｃ２Ｈ２０２Ｎａ）ｂ?ｃＨ２０］。，用元素分析法测定其Ｃ、Ｎ、Ｈ的含量以及取代度见表１。
表１元素分析法测得羧甲基几丁质的脱乙酰度和取代度
Ｔａｂ．１Ｄｅｇｒｅｅｓｏｆｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ（ＤＤ）ａｎｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ（ＤＳ）ｆｏｒｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｈｉｔｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｔｈｅｅｌｅｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ
ｍｅｔｈｏｄ
２．１．３红外光谱和核磁共振波谱测定从红外图谱可知此产品为Ｎ，Ｏ取代的羧甲基几丁质（图３）。游离一ＮＨ：在１５１９ｃｍ－１附近未产生明显的吸收峰，说明制备的羧甲基几丁质中基本无游离一ＮＨ。。
羧甲基几丁质的１３Ｃ—ＮＭＲ图谱和吸收峰所对应基团的化学位移见图４和表２，从各峰的强度和羧甲基基团在几丁质链上的取代位置来看，所制备的羧甲基几丁质是以６位上的一级一ＯＨ取代为主，在各个位置的取代大小的顺序依次是６位一ＯＨ、一ＮＨ：和３位一ＯＨ。
表２羧甲基几丁质的化学位移（”Ｃ—ＮＭＲ）
Ｔａｂ．２Ｃｈｅｍｉｃａｌｓｈｉｆｔｓｏｆｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｈｉｔｉｎ（１３Ｃ—ＮＭＲ）
基团
Ｇｒｏｕｐ
化学位移（ａ／１０“）
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓｈｉｆｔ（ａ／１０一６）
２．１．４相对分子质量和相对分子质量分布系数测定采用示差折光指数检测器测得羧甲基几丁质溶液的折光指数增量（ｄｎ／ｄｃ）为０．１４ｍｌ／ｇ。羧甲基几丁质的重均相对分子质量Ｍｗ为６．２５×１０５，数均相对分子质量Ｍｎ为５．６０×１０５，相对分子质量分布系数为１．２２，羧甲基几丁质的积分重量分布见图５。
２．２生物学性能检测
２．２．１无菌实验按《中华人民共和国药典》（２００５年版）二部附录ＸＩＨ规定的方法进行无菌检测，结果呈阴性。
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中国修复重建外科杂志２００７年２月第２１卷第２期?０
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图１纤维素、几丁质、壳聚糖的化学结构Ｒ：纤维素为一ＯＨ几丁质为一ＮＨＣＯＣＨ３壳聚糖为一ＮＨ２图２羧甲基几丁质的双突跃电位滴定曲线图３羧甲基几丁质的红外光谱图图４羧甲基几丁质的”Ｃ—ＮＭＲ图谱图５羧甲基几丁质的分子■积分重量分布图
Ｆｉｇ．１Ｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，ｃｈｉｔｉｎａｎｄｃｈｉｔｏｓａｎＲ：ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；一ＯＨｃｈｉｔｉｎ：一ＮＨＣＯＣＨ３ｃｈｉｔｏｓａｎ：一ＮＨ２Ｆｉｇ．２Ｔｈｅｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｄｏｕｂｌｅ—ｊｕｍｐｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃｔｉｔｒａｔｉｏｎｆｏｒｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｈｉｔｉｎＦｉｇ．３ＴｈｅＩＲｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｈｉｔｉｎＦｉｇ．４Ｔｈｅ１３ＣｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｈｉｔｉｎＦｉｇ．５Ｔｈｅｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｗｅｉｇｈｔｆｒａｃｔｉｏｎｐｌｏｔｆｏｒｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｈｉｔｉｎ
２．２．２细菌内毒素实验根据鲎属变形细胞测定方法，测得内毒素含量小于０．２２Ｅｕ／ｍｇ。
２．２．３急性全身毒性实验实验组动物一般状态良好，两组动物的临床表现正常。７２ｈ后未发现动物死亡，且动物体重数据下降均在可接收范围内。表明羧甲基几丁质溶液无急性全身毒性作用。
２．２．４细胞毒性实验空白对照品为０级，阴性对照品浸提液为１级，阳性对照品浸提液为４级，实验样品溶液为１级。在空白对照、阴性对照、阳性对照均成立的条件下，羧甲基几丁质的细胞毒性是轻微的。２．２．５皮内刺激实验注射后各时间点生理盐水注射液的原发性刺激指数为０．０，羧甲基几丁质溶液的原发性刺激指数为０．０，与对照组无明显差异。羧甲基几丁质溶液对皮肤无刺激作用。
２．２．６皮肤致敏实验各时间点所有动物的临床表现均正常，未观察到显著的致敏作用。羧甲基几丁质溶液在豚鼠中未显著导致延迟皮肤接触致敏作用。２．２．７短期皮下植入实验植入后１４ｄ病理分析结果示，羧甲基几丁质在家兔体内降解并吸收，且周围组织无任何不良反应。羧甲基几丁质皮下植入后组织相容性良好。２．２．８遗传毒性实验羧甲基几丁质的Ａｍｅｓ实验结果示，在平板菌斑抑制筛选中，羧甲基几丁质溶液未引起显著的抑制作用；在Ａｍｅｓ平板掺人测定中，测交品系的自发回复突变率无２倍或者２倍以上的增加。羧甲基几丁质溶液不会对鼠伤寒沙门氏菌测交品系有致突变作用。微核实验过程中所有动物临床表现均正常；显微镜下观察，在阳性对照和阴性对照成立的条件下，被测样品无显著的遗传毒性作用，未出现细胞毒性的迹象。羧甲基几丁质溶液不会对小鼠产生遗传毒性。
染色体畸变实验过程中，所有动物的临床表现均正常。受试物各剂量组的精子畸变率与阴性对照组比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），而阳性对照组与阴性对照组比较差异有统计学意义（尸＜０．０１）。羧甲基几丁质溶液未对小鼠产生遗传毒性的作用。
３讨论
３．１羧甲基几丁质制备的影响因素
羧甲基几丁质的制备工艺对羧甲基几丁质的溶解性能、理化性能和生物学性能影响很大。首先，几丁质的制备过程中钙盐和蛋白质是否处理彻底对几丁质的
万方数据
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＲｅｐａｒａｔｉｖｅａｎｄＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅＳｕｒｇｅｒｙ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ２００７，Ｖ０１．２１，Ｎｏ．２
碱化和醚化反应程度起重要作用，从而影响羧甲基几丁质的整个性能。其次，碱化反应过程，由于几丁质分子间有较强的氢键，通过碱化可使几丁质充分膨胀，而碱的浓度直接影响几丁质的膨胀，碱浓度愈大，膨胀效果愈好，羧甲基化反应越完全，羧甲基几丁质的取代度也越高，因此氢氧化钠浓度一般选择在４０％～５０％间。第三，碱化和醚化反应温度对羧甲基几丁质的动力黏度有重要影响，为确保反应完全和防止羧甲基几丁质的降解引起动力黏度下降，一般控制温度在３０℃以内，最好不要超过５０‘Ｃ；同时，为了最大限度防止氧化降解的发生，采取在完全氮封隔氧条件下进行碱化反应。第四，为了提高碱对几丁质的渗透性使反应完全以及减少副反应，必须有部分游离碱，因此在反应过程中必须严格控制碱和醚化剂的摩尔比。
３．２理化性能
３．２．１羧甲基几丁质脱乙酰度脱乙酰度是表征几丁质中乙酰化和脱乙酰化部分之间的平衡程度，为氨基葡萄糖单元在羧甲基几丁质分子链中所占比例。在羧甲基几丁质的碱化反应过程中采用常温碱化，目的是防止碱化过程中脱去乙酰基。因此，在此反应中，脱乙酰基反应只是碱化反应过程中的副反应。根据文献［４，１２，１３］报道，测定壳聚糖脱乙酰度的方法很多，如元素分析法、紫外光谱法、凝胶渗透色谱法、酸碱滴定法、苦味酸法、电位滴定法等，这些测定方法各有其特点。由于羧甲基在氨基上的取代，对酸碱滴定等方法产生影响。采用红外光谱法时，由于生物高分子的多分散性，链长不一，内标误差也较大。我们的实验采用双突跃电位滴定法测定壳聚糖脱乙酰度，利用了滴定曲线中的两个突跃之间所消耗的ＮａＯＨ量来计算，可以有效消除几丁质吸附的残碱和残酸对检测结果产生的影响，具有准确可靠、重复性好等优点ｈｏ］。此方法测得的脱乙酰度是１３．７６％，较小，表明几丁质在此工艺条件下乙酰基得到了很好地保护，脱乙酰化副反应被有效地抑制。采用元素分析法测得的结果为１４．５３％，和双突跃电位滴定法测得的结果比较接近，说明双突跃电位滴定法是一种比较理想的测定脱乙酰度的方法。３．２．２羧甲基几丁质取代度和取代位置取代度是指平均每个氨基葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖单元上被羧甲基化的数目。对于Ｏ一羧甲基几丁质和Ｎ一羧甲基几丁质，其平均取代度只能小于或等于２，而对于Ｎ，Ｏ一羧甲基几丁质，其取代度为小于或等于３。目前已报道的羧甲基壳聚糖取代度的测定方法主要有灰份测定法、胶体滴定法、电位滴定法、元素分析法、红外光谱法等。元素分析法的优点在于产品处于任何状态，均能测定各元素的组成，且准确度很高。但元素分析法是靠Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ的组成来推断其结构式的，因此对样品的纯度要求很高［１１｜。我们的实验通过元素分析法测得所制备的羧甲基几丁质的取代度为１．２３９０，说明至少进行了两个位置以上的取代。在随后的红外光谱图中也得到了证实。傅立叶变换红外光谱能显示与键的拉伸和弯曲相关的吸收谱带。在几丁质分子链上，与化学性质有关的功能基团是乙酰氨基葡萄糖单元上的６位伯羟基、３位仲羟基和２位乙酰氨基以及糖苷键。其中糖苷键比较稳定，不易断裂，也不与其他羟基形成氢键；乙酰氨基化学性质稳定，但参与氢键形成。所以，通常几丁质的化学反应只涉及到两个羟基。但由于几丁质在碱化反应过程的副反应会脱去部分乙酰基，因此，在几丁质的羧甲基化反应中还会涉及到脱乙酰基后的一ＮＨ：。羧甲基可分别取代在几丁质的６位一ＯＨ、３位一ＯＨ和２位一ＨＮ。上；也可同时取代在几丁质的３、６位一ＯＨ上或２、３位和６位一ＮＨ。上全部取代［８’９］。据文献报道，几丁质的红外光谱中最重要的峰是１６６５ｃｍ叫（酰胺Ｉ）、１５５５ｃｍ叫（酰胺Ⅱ）和１３１３ｃｍ＿１（酰胺ｉ１１）的酰胺吸收峰［１］。从图３可看出，在１６６８ｃｍ＿１（酰胺Ｉ）、１３２１ｃｍ叫（酰胺Ⅲ）和１６０４ｃｍ一、１４１８ｃｍ啊１分别为羧酸中的Ｃ—Ｏ双键和Ｃ—Ｏ单键的伸缩振动峰，说明样品中含有羧基，而且１６６５ｃｍ＿１—１６６８ｃｍ～，１３１３ｃｍｌ—１３２１ｃｍ＿１发生移动，１５５５ｃｍ＿１消失。这些峰是Ｎ，Ｏ羧甲基几丁质区别于几丁质的重要标志。由于样品是羧甲基化钠盐，所以羧基中的一ＯＨ在３０００ｃｍｌ以上的伸缩振动峰未出现。醇羟基在３４００ｃｍ一１左右未出现宽峰，说明此处发生了醚化。３４４０ｃｍ＿１处的峰是仲胺Ｎ—Ｈ伸缩振动峰和。一Ｈ伸缩振动峰，１１１９ｃｍ“和９４５ｃｍ叫是环状结构的峰，２９２７ｃｍ＿是Ｃ—Ｈ的振动峰，１０６３ｃｍ＿１是Ｃ—Ｏ（一ＣＯＨ）的振动峰。游离一ＮＨ。在１５１９ｃｍ＿１附近未产生明显的吸收峰，说明制备的羧甲基几丁质中基本无游离的一ＮＨ：，表明在碱化过程中副反应发生的脱乙酰化而产生的一ＮＨ：，在随后的羧甲基化反应发生了Ｎ一位取代，从而可避免一ＮＨ。的暴露而影响羧甲基几丁质的生物学性能。
从图４和表２可知，１７８８／１０＿６处可见一个极强的吸收峰，是Ｏ—ＣＨ。Ｃ＊ＯＯＨ的化学位移；１７４．８３／１０＿６处的吸收峰是ＮＨ—Ｃ＊ＯＣＨ。的化学位移，说明几丁质乙酰氨基的存在。在７０．８、７３．９和５５．８３／１０＿６处也各有一个吸收峰，分别为。一Ｃ＊Ｈ２ＣＯＯＨ（Ｃ一６）、Ｏ—Ｃ＊Ｈ。ＣＯＯＨ（Ｃ一３）及ＮＨ—Ｃ＊Ｈ：ｃＯＯＨ的化学位移，可以看出，峰的大小依次是６位、３位和一ＮＨ。。从以上峰的强度和羧甲基基团在几丁质链上的取代位置来看，所制备的羧甲基几丁
万方数据
中国修复重建外科杂志２００７年２月第２１卷第２期
质是以６位上的一级一ＯＨ取代为主，羧甲基在Ｏ一位上的取代明显高于Ｎ一位上的取代，在各个位置的取代大小顺序依次是６位一ＯＨ、一ＮＨ。和３位一ＯＨ［１４。６｜。３．２．３相对分子质量检测相对分子质量的测定一般采用黏度法，但黏度法测量的只是聚合物的相对黏均分子量。多角度激光光散射仪结合凝胶色谱检测可以准确测量高分子多糖的各种相对分子质量以及相对分子质量分布［１７｜。羧甲基几丁质的相对分子质量决定了其某些特性，如黏度，从而对产品的最终用途产生影响，因此直接或间接了解羧甲基几丁质的相对分子质量是很必要的。依据最终用途和应用时相对分子质量的敏感度要求，羧甲基几丁质相对分子质量分布存在较宽幅度将成为其应用中的一大问题。在这种情况下，检测多分散性就将变得十分重要。我们实验所得羧甲基几丁质的相对分子质量分布系数为１．２２，是比较理想的。根据有关文献报道［１引，商业用壳聚糖的相对分子质量分布系数一般在１．５～３．０。
３．３生物学评价
生物学评价是生物材料安全性评价的重要组成部分，通过一系列体内或体外实验方法，综合评价生物材料对生物体可能的有害作用，以保证临床使用的安全性。
无菌是满足生物医用植入材料的安全性必须具备的条件，而且细菌的存在还可能导致内毒素含量的增加。我们的实验结果说明通过除菌过滤去除羧甲基几丁质中细菌是能满足去除细菌要求的，但在正常的生产中，为了确保产品的安全性，应定期对除菌过滤设备进行除菌效果的验证。
羧甲基几丁质中的内毒素水平对于它在生物医用品中的用途十分关键，因为植入人体的内毒素含量有一个受控的限量，尤其是植人人体的材料，应考虑其可接受水平。在严格控制生产器具的条件下，用此工艺生产羧甲基几丁质的内毒素含量是能满足植入人体的生物材料要求的。
我们实验生产的羧甲基几丁质是一种植入性生物医用材料，因此，根据ＧＢ／Ｔ１６８８６．１医疗器械生物学评价第１部分：评价与实验选择和国外标准选择，进行了急性全身毒性、细胞毒性、皮内刺激、皮肤致敏、皮下植入、遗传毒性的生物学性能检测［】８’１引。结果显示羧甲基几丁质的各项生物学性能均符合国家关于植入性生物医用材料的要求，说明羧甲基几丁质是一种无菌、无热原、无急性全身毒性、无细胞毒性、无皮内刺激、无皮肤致敏反应、无遗传毒性的组织相容性良好的植入性生物材料，植入人体后对人体组织无毒副作用。
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１９ＧＢ／Ｔ１６８８６．１－２００１医疗器械生物学评价．第１部分：评价与试验．
（收稿：２００６—０８—２１修回：２００６１２－０４）
（本文编辑：刘丹）
万方数据
羧甲基几丁质的制备和性能研究
作者：蒋丽霞， 顾其胜， 王文斌， JIANG Lixia， GU Qisheng， WANG Wenbin
作者单位：上海其胜生物材料技术研究所,上海,201106
刊名：
中国修复重建外科杂志
英文刊名：CHINESE JOURNAL OF REPARATIVE AND RECONSTRUCTIVE SURGERY
年，卷(期)：2007，21(2)
被引用次数：3次
参考文献(19条)
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引证文献(2条)
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