茶 叶 科 学 2004，24（2）：124—128 Journal of Tea Science
收稿日期：2003–10–24 修订日期：2004–02–12
基金项目：安徽省国际合作项目（02088004）、安徽省自然科学基金项目（01041303）及教育部优秀青年教师基金项目内容 文章编号：1000—369X （2004）02—0124—05
茶色素中茶黄素类的HPLC 定量
李大祥，宛晓春*，刘莉华，夏涛
（安徽农业大学农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室，安徽 合肥，230036）
摘要：应用高速逆流色谱结合Sephadex LH-20和半制备HPLC 对茶色素中三种主要茶黄素（茶黄素，TF1；茶黄素单没食子酸酯，TF2+TF3；茶黄素双没食子酸酯，TF4）进行了分离纯化，并以它们为标样，建立了茶色素中三种主要茶黄素的HPLC 定量法。精密度和加样回收率实验结果表明，TF1、TF2+TF3和TF4的变异系数分别为2.6～8.5%、2.0～3.8%和2.0～3.9%，三者总量的变异系数为2.2～4.1%。应用该法对Sigma 公司的混合茶黄素标样测定表明，其相对误差为3.4%。对自制茶色素中茶黄素类含量分析表明，茶黄素类总量可达20.5%、其中TF1、TF2+TF3和TF4的含量则分别为6.0%、9.1%和5.4%。茶色素中茶黄素类HPLC 定量方法的建立，对于茶色素质量控制具有重要的实际价值，并有助于茶色素的开发以及药理功能的深入研究。 关键词：茶色素；茶黄素；HPLC 定量
中图分类号：TS272.7 文献标识码：A
HPLC Quantitation of Theaflavins in Tea Pigments
LI Da-xiang, WAN Xiao-chun, LIU Li-hua, XIA Tao
(Key Laboratory of Tea Biochemistry & Biotechnology, Ministry of Agriculture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)
Abstract: In this study, theaflavin(TF1), theaflavin monogallate(TF2+TF3) and theaflavin digallate(TF4) in tea pigments are isolated and purified with high speed counter current chromatography combined with Sephadex LH-20 and semi-preparative HPLC. With the purified theaflavin, the standard curves have been set up by HPLC for theaflavins quantitation. The results on the accuracy and recovery determination showed that the coefficient of variation of TF1, TF2+TF3, TF4 and total theaflavins range from 2.6～8.5%, 2.0～3.8%, 2.0～3.9% and 2.2～4.1% respectively. Using HPLC quantitation, the relative error of total theaflavins amounts in the standard theaflavins from Sigma company is 3.4%. The total amounts of theaflavins in tea pigments are 20.5%, in which TF1, TF2+TF3 and TF4 are 6.0%, 9.1% and 5.4% respectively. This method is useful to quantify theaflavins and to control the quality of tea pigments, which could promote the studies on their pharmacological effects. Key words: Tea pigments, Theaflavins, HPLC quantitation
茶色素是茶叶中多酚类及其氧化衍生物的混合物,主要成分为茶黄素类、茶红素类。近代药理学研究表明,茶色素具有防癌抗癌、防紫外线照射、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗龋护齿等多种药理功能。其中，茶色素中的主体成分之一茶黄素类具有极强的生理活性，在茶色素的药理功能中发挥着较大的作用，甚至
某些方面的药效比儿茶素还要强[1]。因此目前市场上对茶色素中的茶黄素类的含量提出了较高的要求。
茶黄素类是一类具有苯骈卓酚酮结构的混合物，主要由儿茶素类配对氧化聚合而成。红茶中的茶黄素类主要由茶黄素单没食子酸酯(包括茶黄素-3-单没食子酸酯、茶黄素-3’-
2期李大祥，等：茶色素中茶黄素类的HPLC定量 125
单没食子酸酯)、茶黄素-3,3’-双没食子酸酯和茶黄素组成。红茶中茶黄素类的含量一般为0.3%～1.5%。传统的茶黄素类测定方法Roberts法和Flavognost（α-氨基乙基二苯硼酸酯）法[2]由于局限在以红茶为对象，不适宜于红茶提取物和茶色素的测定。另外，茶色素不仅可由红茶直接提取而得到，而且还可由茶多酚自动氧化、酶促氧化或化学氧化[3-5]而制得，因而在TF和TR在含量上存在差异，而不适宜用Roberts法和Flavognost法的换算系数。本研究应用高速逆流色谱（HSCCC）并结合Sephadex LH-20和半制备HPLC对茶色素中的茶黄素（TF1）、茶黄素单没食子酸酯（TF2+TF3）和茶黄素双没食子酸酯（TF4）进行分离纯化，以纯化的单体作为标样，建立了茶黄素的HPLC定量方法。这对于茶色素制品中的茶黄素类的测定和茶色素的质量控制有着积极的意义，有助于进一步推进茶色素药理功能的研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
试材为斯里兰卡红碎茶（一级）；混合茶黄素类标样（tea extract from black tea, Minium 80% theaflavins, T-5550, Lot:102K1027），购自Sigma公司；高效液相色谱HPLC分析用试剂均为美国TEDIA公司色谱纯，其余为国产分析纯。Sephadex LH-20为Pharmacia公司产品。
高速逆流色谱（少量制备型）为定制；柱层析系统：2.5×30 cm层析柱，中科院上海生化所MP-D(280 nm)紫外检测器，上海新波无线电厂HL-2恒流泵，YOKOGAWA 3057便携式记录仪；HPLC系统：Waters600泵，2487双波长紫外检测器。
1.2 试验方法
1.2.1 茶色素的制备
斯里兰卡红碎茶按1︰20加入煮沸的蒸馏水，超声提取30 min（三次），合并水提液，过滤，滤液在50°C—60°C下减压浓缩，浓缩液用等体积氯仿萃取三次，所得水相用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并酯层，40°C—50°C 下减压浓缩至粘稠状，加适量95%乙醇转溶，70°C真空干燥得茶色素制品。
1.2.2 茶黄素类单体的HSCCC分离
在参照江和源的研究基础上[6]，选用正己烷︰甲醇︰乙酸乙酯︰水（1︰1︰3︰6）为溶剂系统。取适量茶色素溶解，注入进样环，进行逆流色谱分离。等有色物质开始流出后，进行分部收集，至流出液在380 nm下的吸光值在0.08以下时停止收集。测定分部收集的溶液在380 nm下的吸光值。以吸光值为纵坐标，洗脱体积为横坐标，绘制出色谱图。
根据色谱图的色谱峰，合并相应的收集液，在50°C下减压浓缩至粘稠状，95%乙醇转溶，70°C真空干燥至干得TF1、TF2+TF3和TF4粗品。
1.2.3 茶黄素类单体的纯化
将充分预胀的Sephadex LH-20凝胶装柱（2.5×30 cm），用45%丙酮洗脱，流速0.4 ml/min，收集主峰，50°C-60°C下减压浓缩至粘稠状，95%乙醇转溶，70°C真空干燥至干，得TF1粗品、TF2+TF3和TF4纯品。其中TF1再经Ultrasphere ODS C18 5 μm柱纯化。
将纯化后TF1、TF2+TF3和TF4，进行HPLC分析其纯度。分析条件[7]如下：Nuclesoil C18 3 μm (4.6×100 mm)；Ａ相为2%乙酸，Ｂ相为乙腈，Ａ相在0-50 min内由92%线性变化至69%；检测波长280 nm，380 nm；流速1.2 ml/min；温度为室温；进样体积为5 μl。
1.2.4 茶黄素类单体的HPLC定量
精密称取一定量的茶黄素类纯品，95%乙醇溶解，25 ml容量瓶定容，得标准母液。后得滤液。将滤液分别稀释2倍、4倍、6倍和8倍，得系列标准液。将它们分别进样，进行ＨPLC分析，得出280 nm下的绝对峰面积，并根据各样品的实际含量建立各自的标准曲线。其中HPLC分析条件同1.2.3。
126 茶叶科学 24卷
1.2.5 HPLC的精密度和加样回收率实验
精密称取由斯里兰卡红茶提取的茶色素，95%乙醇溶解，10 ml容量瓶定容，0.45 μm膜过滤，滤液备用。取部分进行茶黄素类的含量测定，部分进行下述的精密度和加样回收率实验。
精密度实验：将1.2.5所配茶色素样品微膜过滤的滤液连续进样5针，进行日内精密度实验。同时，将该溶液每天进样一针，进行日间精密度分析。分别计算标准差（SD）和变异系数（CV）。
回收率实验：取微膜过滤的茶色素溶液300 μl，分别加入100 μl的TF1、TF2+TF3和TF4单体的标准母液，混匀后连续进样5针，进行HPLC分析（HPLC分析条件同1.2.3）。计算标准差（SD）和变异系数（CV）。
1.2.6 Sigma公司混合茶黄素标样的HPLC测定
精密称取提取物，95%乙醇溶解，25 ml 容量瓶定容，0.45 μm膜过滤，滤液进行HPLC 分析（HPLC分析条件同1.2.3）。
1.2.7 茶色素中茶黄素类的Roberts法测定
按Roberts法进行[2]。
2 结果与分析
2.1 茶黄素类单体的HSCCC分离
茶色素经HSCCC分离后所得色谱图如图１所示。峰１为TF1，峰２为TF2+TF3，峰３为TF4。其粗品得率分别为18.9%、8.5%、3.8%。经ＨPLC分析，在280 nm下，其相对峰面积分别为10%、60%和75%。
2.2 茶黄素类单体的纯化及标准曲线的建立
TF2+TF3和TF4单体粗品经Sephadex LH-20纯化后，得率分别为43.2%、33.1%。经ＨPLC分析，在280 nm下，其相对峰面积分别为95.4%、99.9%。TF1单体粗品经Sephadex LH-20和半制备HPLC柱纯化后得率为5.5%，经ＨPLC分析（280 nm），其相对峰面积为95.2%。故从茶色素中分离纯化的TF1、TF2 + TF3和TF4单体的得率分别为1.0%、3.7%、1.2%。
在HPLC分析条件下，将TF1、TF2+TF3和TF4标准母液及系列稀释液分别进样，得出各单体在280 nm下的绝对峰面积，根据其各单体的具体含量，得出各单体的线性回归方程如下：
TF1：Y=1.9848 × 10-9X + 1.5742 × 10-5…………………..…..r = 0.9968
TF2+TF: 3Y=1.1829 × 10-9X + 5.0636 × 10-6………………………r = 0.9987
TF4：Y=8.0628 × 10-10X + 2.0879 × 10-5………………………r = 0.9994
（其中，X为280 nm HPLC图谱上的绝对峰面积；Y为进样体积中对应单体的含量（mg））
根据进样体积中的单体含量、样品总体积和样品重量，从而得出样品中实际单体的相对含量。其具体计算公式如下：
各茶黄素单体含量（%）= [ Y×（样品总体积 / 进样体积）/ 样品重量(mg)] × 100
2.3 精密度和加样回收率实验
茶色素溶液连续5针进样，进行日内精密度实验。其结果如表2。TF1、TF2+TF3和TF4的测定SD分别为0.1338±0.0034 mg/ml、0.2417±0.0049 mg/ml和0.1377±0.0028 mg/ml，CV分别为2.6%、2.0%和2.0%，总茶黄素类（TF1+TF2+TF3+TF4）的测定SD为0.5132±0.0111 mg/ml，CV为2.2%。
茶色素溶液每天进样一针，进行日间精密度分析。其结果如表2。TF1、TF2+TF3和TF4的测定SD分别为0.1525±0.0129 mg/ml、0.2496±0.0059 mg/ml和0.1429±0.0049 mg/ml，CV分别为8.5%、2.4%和3.4%，总茶黄素类（TF1+TF2+TF3+TF4）的测定SD为0.5450±0.0222 mg/ml，CV为4.1%。
将混有TF1、TF2 + TF3和TF4标液的茶色素溶液连续进样5针，进行回收率实验。结果如表2。TF1、TF2+TF3和TF4的回收率(%)
2期 李大祥，等：茶色素中茶黄素类的HPLC 定量 127
为102.1±4.0、105.3±4.0和106.9±4.2，CV 分别为 4.0%、3.8%和 3.9%，总茶黄素类（TF1+TF2+TF3+TF4）的回收率(%)为104.7±4.0，CV 为3.9%。
2.4 茶色素和Ｓｉｇｍａ公司混合茶黄素标样
中茶黄素类的测定
根据TF1、TF2+TF3、TF4的标准曲线以及茶色素浓度（2.73 mg/ml ）和茶色素中的TF1(0.1338 mg/ml)、TF2+TF3(0.2417 mg/ml)、TF4(0.1377 mg/ml)的分析，计算出经斯里兰卡红茶提取的茶色素其中的F1、TF2+TF3、TF4的含量分别为6.0%、9.1%和5.4%，故茶黄素总量为20.5%。将混合茶黄素标样配成 5.14 mg/25 ml 的溶液，经HPLC 分析（其在280 nm 下色谱图如图2），TF1、TF2+TF3和TF4在280 nm 下总的相对峰面积为91.45%，故得出其实际总茶黄素类浓度为4.70 mg/25 ml 。根据
HPLC 分析和已建立的标准曲线得出其中的TF1、TF2+TF3和TF4的浓度分别为 1.34 mg/25ml 、2.14 mg/25ml 和1.06 mg/25ml ，故测得总茶黄素类浓度为4.54 mg/25ml ，其与实际值的相对误差为3.40%。
2.5茶色素中茶黄素类的Roberts 法测定
按Roberts 法进行测定茶色素溶液，其结果如表3。根据计算公式茶黄素类含量（%）=E 460nm ×6.69及稀释倍数得出茶黄素类的含量为13. 0%。
表3 茶色素中茶黄素类含量的Roberts 法测定
Table 3 The content of theaflavins in tea pigments
determination with Roberts method
重复 replicants Abs(460nm) 1
0．191 2
0．197 均值 Average
0．194
表2 茶黄素HPLC 方法的精密度和加样回收率分析
Table 2 The accuracy and recovery assay of HPLC method for theaflavins analysis
项目 Items
变异系数（CV ，%） TF1 (mg/ml) TF2+TF3 (mg/ml) TF4 (mg/ml) TF1+TF2+TF3+TF4 (mg/ml) 均值±标准差 （Mean ±SD ） 0.1338±0.0034 0.2417±0.0049 0.1377±0.0028 0.5132±0.0111 日内精密度
interday assay, n=5 变异系数 （CV, %） 2.6
2.0
2.0
2.2
均值±标准差 （Mean ±SD ） 0.1525±0.0129 0.2496±0.0059 0.1429±0.0049 0.5450±0.0222 日间内精密度 intraday assay, n=5 变异系数 （CV, %） 8.5 2.4 3.4 4.1 均值±标准差 （Mean ±SD ） 102.1±4.0 105.3±4.0 106.9±4.2 104.7±4.0 回收率实验
recovery assay, n=5
变异系数 （CV, %）
4.0
3.8
3.9
3.9
图1 茶黄素类单体的HSCCC 分离的色谱图 Fig. 1 The HSCCC chromatograph of theaflavins
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图3 混合茶黄素标样的HPLC图谱
Fig. 3 The HPLC chromatograph of theaflavins standards
3 讨论
茶色素是茶叶的深加工制品，与红茶相比，在含量与组成上差异较大，并且茶色素可由茶多酚酶促氧化、自动氧化和化学氧化而制成，因而传统的红茶中茶黄素类及茶红素类的测定方法已不适于茶色素中茶黄素类的定量。茶色素的定量问题是困扰当前茶色素研究、生产与开发的一大难题[8]。本研究应用Roberts 法测定茶色素(TPs-3)中的茶黄素类含量为13.0%小于HPLC测定中的20.5%的含量。而利用茶多酚进行酶促氧化、自动氧化和化学氧化制备的茶色素中，其茶黄素类在组成上与红茶直接提取的茶色素存在差异，而本研究建立的HPLC定量方法不仅可以相对准确地测定出不同来源茶色素中茶黄素类的含量，而且还能测定出各主要茶黄素的含量，这对于茶色素的质量控制有着积极的意义。
茶色素的主要成分为茶黄素类和茶红素类。但由于它们的主要前体物质儿茶素类的极性与茶黄素比较接近，因而在茶黄素类的分离中，有儿茶素混杂其中。HPLC分析表明，在380 nm下，从图谱上看，茶黄素单体的相对峰面积较高。但在280 nm下，其相对峰面积则较低，这是因为有儿茶素的存在（图略）。故笔者以280 nm来检测茶黄素类单体的纯度，并以该波长下的绝对峰面积建立了茶黄素类单体的标准曲线。另外，此HPLC分析条件可以同时测定茶色素中的儿茶素类含量和咖啡碱含量。故此茶黄素类HPLC定量法可以方便的测定茶黄素类含量、儿茶素含量和咖啡碱含量，再以差减法估算出茶红素类的含量，这对于表征茶色素中化学成分的具体含量，具有重要的实际意义，有助于推动茶色素药理学的研究。
参考文献：
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