总大肠菌群（滤膜法）
1、适用范围
生活饮用水、水源水
2、仪器
高温蒸汽灭菌器、滤器、口径0.45μm滤膜、培养箱、冰箱、天平、无齿镊子、直径9cm平皿、灭菌试管、灭菌吸管、酒精灯、烧杯、量筒、1000ml容量瓶。
3、步骤
(1)储备培养基的制备
品红亚硫酸钠培养基：
加入蛋白胨10g、酵母浸膏5 g、牛肉膏5 g、乳糖10 g、琼脂20 g、磷酸氢二钾3.5
g、无水亚硫酸钠5 g、碱性品红乙醇溶液（50g/L）20mL、蒸馏水1000mL。
配制方法：
先将琼脂加到500ml蒸馏水中，煮沸溶解（用大烧杯），于另500ml蒸馏水中加入磷酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补足蒸馏水至1000ml，混匀后调pH值为7.2～7.4，再加入乳糖，分装，68.95kPa（115℃，10lb）高压灭菌20min，储备于冷暗处备用。（建议培养基用多少配多少）
乳糖蛋白胨培养基
蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，氯化钠5g，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水
1000ml。
配制方法：
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2-
7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的
试管中，于高压蒸汽灭菌锅中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
(2)平皿培养基的制备
将上面制备好的备用的培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的50g/L的碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸钠
置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭
菌。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色褪
成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）立即将此种培养基15ml倾入已灭菌的空平皿内。待冷却凝固后置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周。如培养基已由淡粉色变成深红色，则不能再用。
(3)滤膜灭菌
将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需要换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂。滤器用蒸汽灭菌器103.43kPa（121℃，15lb）高压灭菌20min。
(4)水样过滤
用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100ml水样（如水样含菌数多，可减少样量，或加水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门抽滤。
(5)培养
水样抽滤完后，再抽气5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养24h。
(6)结果观察
A.挑取符合特征的菌落进行革兰氏染色、镜检：
紫红色、具有金属光泽的菌落；
深红色、不带或略带金属光泽的菌落；
淡红色、中心色较深的菌落。
B.凡革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养基，于37℃培养
24h，有产酸产气者则判定为总大肠菌群阳性。
C.补充知识-革兰氏染色：细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精
脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为
两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G-）。为观察方
便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌
则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈
革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。(7)样品测定步骤
按下式计算滤膜上的总大肠菌群数，即：
总大肠菌群数（CFU/100mL）=
式中：m——数出的总大肠菌群数；
V——过滤的水样体积（mL）
V m*100
大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系及介绍 相互关系 大肠菌群（总大肠菌群） >粪大肠菌群&耐热大肠菌群> 大肠杆菌 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 二、总大肠菌群
所谓总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 三、耐热大肠菌群与粪大肠菌群的比较 北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。一般欧洲学者认为，“粪大肠菌群”的提法不太科学，耐热大肠菌群的范围比粪大肠菌群范围大。 耐热大肠菌群的卫生学意义 作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。 作为粪便污染指标菌，耐热大肠菌群与大肠菌群、大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等）和食物中毒者。因此，食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。
https://www.doczj.com/doc/1e4344722.html,/asphtml/GB071.htm https://www.doczj.com/doc/1e4344722.html,/ 粪大肠菌群计数步骤GB/T 4789.39-2008 一、设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 。 2 冰箱：2℃~ 5 ℃ ． 3 恒温水浴箱：44.5 ℃±0.2 ℃ 。 4 天平：感量0.1g 。 5 均质器。 6 振荡器。 7 无菌吸管：1 mL （具0.01 mL 刻度）、10 mL （具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 8 无菌锥形瓶：容量500 mL 。 9 无菌培养皿：直径90 mm 。 10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 二、培养基及试剂 1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（lauryl sulfate tryptose , LST ）肉汤 2 EC 肉汤（E.coli broth ) 3 无菌生理盐水：称取8.5g 氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃ 高压灭菌15 min。 4 4mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中 5 1 mol/L 盐酸（HCl ）：移取浓盐酸90 mL ，用蒸馏水稀释至1 000 mL
操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品，置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min ~10000r/min 均质1 min ~2 min ，制成1：10 样品匀液，或置225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍打式均质器拍打1 min ~2 min ，制成1 : 10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mL 置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 : 10 的样品匀液。 6.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5 ~ 7.5 之间，必要时分别用1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。 6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1：10 样品匀液1 mL ，沿管壁缓缓注人盛有9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100 的样品匀液。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过巧min 。 6.2 初发酵试验 每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤，每管接种1 mL （如接种量需要超过1 mL ，则用双料LST 肉汤）, 36 ℃±1 ℃ 培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为粪大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 6.3 复发酵试验 用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物1 环，移种于45 ℃ EC肉汤管中。
水中总大肠菌群的测定复习试题 （多管发酵法） 一、填空题 1.总大肠菌群主要包括有、、肠杆菌属、等菌属的细菌。 答：埃希氏菌属；柠檬酸杆菌属；克雷伯氏菌属。 2.总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可适用于，操作，需要时间。 答：各种水样；较繁；较长。 3.配制乳糖蛋白胨培养液时，将、、、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH值为，再加入溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在答：蛋白胨；牛肉浸膏；乳糖；7.2～7.4；115；20；暗处。 4.平板分离：经初发酵试验培养 h后，发酵试管颜色变黄为，小玻璃倒管内有为产气。 答：24；产酸；气泡。 5.配制伊红美蓝贮备培养基：先将加至900ml蒸馏水中，加热融化，然后加入及，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整pH值为。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器中，在℃灭菌 min，贮存于备用。 答：琼脂；磷酸氢二钾；蛋白胨；7.2～7.4；115；20；冷暗处。 二、选择题 1.下列物质中不是配制品红亚硫酸钠培养基所需要的。 A、蛋白胨； B、琼脂； C、溴甲酚紫乙醇溶液； D、磷酸二氢钾 答：C 2.测定水源水中总大肠菌群时，将水样作稀释。 A、1：10； B、1：100； C、1：1000； D、1：10000 答：A
三、判断题 1.大肠菌群在水中能自行繁殖。（） 2. 滤膜法主要适用于杂质较多的水样，操作较繁。（） 答：1.√ 2. × 四、问答题 1. 请解释总大肠菌群？ 答：总大肠菌群是指那些能在37℃48h内发酵乳糖酸产气的、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽孢杆菌。 2.多管发酵法测定总大肠菌群的原理是什么？ 答：多管发酵法是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，以求得水样中的总大肠菌群。 3.在何种情况下用多少三倍浓度的培养基接种？ 答：接种体积为10ml时，试管内应装入有3倍浓度乳糖蛋白胨培养液5ml。 4.在进行水质生物实验时，灭菌的意义是什么？ 答：使水中一切活的生物体（包括无性繁殖的和芽孢繁殖的形态）及病毒失活或消除。 5.总大肠菌群测定步骤与粪大肠菌群测定有什么异同之处？ 答：相同之处：初发酵时，水样都稀释成三个浓度，接种乳糖蛋白胨培养基，在37℃培养24h，对产酸产气者定为初发酵阳性。 不同之处：对粪大肠菌群检测做复发酵时，接种的培养基，培养的温度与大肠菌群检测不同，培养的时间相同。
粪大肠菌群多管发酵法 1、培养基、试剂与仪器 本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。 单倍乳糖蛋白胨培养液： 称取23.0g乳糖蛋白胨营养液于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每试管约8ml（先用移液管吸取7ml至试管中，再用滴管吸取营养液放至小玻璃管中，直至营养液溢出。注意小玻璃管中不能有气泡，若出现气泡，应将气泡排出后再注入营养液。），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 EC 培养液： 称取37.0gEC肉汤于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每管8ml（操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 培养基的存放 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。 验所需仪器 超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、酒精灯、天平、电炉、500ml广口瓶、烧杯、玻璃棒、玻璃发酵管、试管架、移液管、移液枪、接种环2步骤 前期准备 器皿灭菌（高压蒸汽灭菌）：所用采集水样的广口瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头等器皿均需放入高压锅灭菌。 广口瓶：将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖，用牛皮纸、报纸等防潮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好，用绳子绑好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
玻璃试管（已经装好营养液）、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头：用牛皮纸、报纸等防潮纸将其包裹好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。 采样：采取水样时，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中，约距水面10~15cm处，拔瓶盖，瓶口朝水流方向，使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直到充满水样为止。采好水样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。 采好的水样，应迅速运往实验室，进行检验，一般从取样到检验不宜超过 2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。 4.2 水样接种量 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。 相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表1。(根据实验经验，经过紫外消毒的水样取0.1mL、0.01mL、0.001mL体积进行检测，可根据水样的洁净度适当调整取样体积。) 表1 接种用水量参考表 如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1mL 或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。 4.3 初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃下培养24h±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。 4.4 复发酵试验
关键词：菌落总数；大肠菌群；食品 我国的国家标准绝大多数食品都制订了菌落总数和大肠菌群的指标，并对其数量做了详细的规定，菌落总数和大肠菌群是食品中安全性指标，是影响产品质量问题的常见指标，常常受到生产企业和消费者的高度父注，菌落总数的报告单位是cfu／g (ml )，大肠菌群的报告位是mpn／100g ( ml)，那么cfu，mpn是什么含义呢，有的食品微生物检测中菌落总数结果很高但大肠菌群很低，有关企业对此不太理解，现在将做一下解释说明。 L菌落总数(cfu) 菌落总数是用来判定食品在被加工过程中被污染的程度及卫生质量的重要指标，食品的生产加工过程叶中，卫生质量的高低首先决定食品原料的来源．原料的卫生与否，是否被污染过，这是根本原因，其次是环境卫生水平的高低，再次就是加工人员和加工工具的卫生状况，要保证食品卫生安全就必须保证所加工的原料来源，环境，加工工具和人员符合卫生标准，但是如何判定食品生产加工过程中是否符合卫生要求，以便对被检产品做出一个科学的评价，菌落总数的多少在一定程度上反映出卫生质量的优劣，也可以用这一方法观察出食品中细菌的繁殖动态，以便于对被捡样品进行卫生评价时提供科学依据。 菌落总数中的菌落英文意思是(colony)，定义为细菌和其他几种做微生物在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。各种细菌的菌落各自具有一定的特征，按其特征的不同可以在某种程度上鉴别某种细菌，为卫生检验提供依据，菌落总数是指在被检样品的单位重量( g )．体积(m1) 或表面积(clni) 内所含能于某种固体培养基上在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。其培养的原理是以检样在被稀释到一定体积后，吸取一定量的检样，检样中的细菌细胞和培养基混合后，每个细菌细胞部形成一个肉眼可见的菌落的假设为基础的．由于检验中采用的是37℃有氧条件下培养。因而并不能测出每克或每毫升样品内的实际活菌数，其中的微嗜氧菌，厌氧菌，冷营养菌在此条件下都不能生长，有特殊营养要求的一些细菌的生长也受到了限制，因此培养的只是一群能在普通营养琼脂中发育中发育的嗜中温的需氧兼性厌氧的细菌总数，只有具备每种细菌生长要求的特定的环境条件，才能将所有细菌全部培养出来，因此要的到全部的茼落总数应将检样接种到不同的培养基上，但国家的食品卫生标准对食品中菌落总数的规定并不需要接种不同的非选择性培养基，原因就是标准所规定的数值全部是在37℃有氧条件下测定得出的。 Cfu是colong forming units的英文缩写，意思是菌落形成单位数，鉴于食品检样的细菌
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规 程 1目的 规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。 2范围 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms ）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 3术语和定义 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 最可能数most probable number ，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 4责任 质量部组织制订、化验室负责实施。 5内容 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下: 恒温培养箱：36 C± 1 Eo 冰箱：2 E?5 Eo 恒温水浴箱：46 E± 1 Eo 天平：感量g o 均质器。 振荡器。 无菌吸管：1 mL （具mL刻度）、10 mL （具mL刻度）或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶：容量500 mLo
无菌培养皿：直径90 mm
pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 菌落计数器。 培养基和试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose , LST ）肉汤：见附录A 中。 煌绿乳糖胆盐（ Brilliant Green Lactose Bile 结晶紫中性红胆盐琼脂（ Violet Red Bile Agar 磷酸盐缓冲液：见附录 A 中。 无菌生理盐水：见附录 A 中。 无菌1 mol/L NaOH :见附录A 中。 无菌1 mol/L HCl ：见附录 A 中。 大肠菌群MPN 计数法 检验程序 大肠菌群MP 计数的检验程序见图1。 图1大肠菌群MPN 计数法检验程序 操作步骤 样品的稀释 固体和半固体样品：称取 25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌均质杯内，8000 r/min ?10000 r/min 均质1 min ?2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min ?2 min ,制成1:10的样品匀液。 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的 样品匀液。 样品匀液的pH 值应在? 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调 节。 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL ,沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液 面），振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 ,BGLB 肉汤：见附录A 中。 ,VRBA :见附录A 中。
总大肠菌群（滤膜法） 1、适用范围 生活饮用水、水源水 2、仪器 高温蒸汽灭菌器、滤器、口径0.45μm滤膜、培养箱、冰箱、天平、无齿镊子、直径9cm平皿、灭菌试管、灭菌吸管、酒精灯、烧杯、量筒、1000ml容量瓶。 3、步骤 (1)储备培养基的制备 品红亚硫酸钠培养基： 加入蛋白胨10g、酵母浸膏5 g、牛肉膏5 g、乳糖10 g、琼脂20 g、磷酸氢二钾3.5 g、无水亚硫酸钠5 g、碱性品红乙醇溶液（50g/L）20mL、蒸馏水1000mL。 配制方法： 先将琼脂加到500ml蒸馏水中，煮沸溶解（用大烧杯），于另500ml蒸馏水中加入磷酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补足蒸馏水至1000ml，混匀后调pH值为7.2～7.4，再加入乳糖，分装，68.95kPa（115℃，10lb）高压灭菌20min，储备于冷暗处备用。（建议培养基用多少配多少） 乳糖蛋白胨培养基 蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，氯化钠5g，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水 1000ml。 配制方法： 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2- 7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的 试管中，于高压蒸汽灭菌锅中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 (2)平皿培养基的制备 将上面制备好的备用的培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的50g/L的碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸钠 置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭 菌。 用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色褪
食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠菌群计数 1范围 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 2术语和定义 2.1 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.2 最可能数most probable number，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 3检验原理 3.1 MPN法 MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。 3.2 平板计数法 大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。 4 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 4.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 4.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 4.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。 4.4 天平：感量0.1 g。 4.5 均质器。 4.6 振荡器。 4.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
4.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 4.9 无菌培养皿：直径90 mm。 4.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 4.11 菌落计数器。 5 培养基和试剂 5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。 5.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。 5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。 5.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。 5.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。 5.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。 5.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。
水中大肠菌群的检测法 ——（多管发酵法）一、实验原理 大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。 多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。本实验为精简实验，所以省略了平板分离和复发酵试验后两部分，直接通过第一部分初发酵试验的颜色变化进行判断是否存在大肠菌群。 初发酵试验 水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。48小时后仍不产气的为阴性结果。 二、实验器材 1.水样 中心湖的湖水 2．试剂 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管 3．仪器及其它用品 移液枪，16支试管（16支德汉氏小套管） 三、实验步骤 初发酵试验 取16支发酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5ml三倍乳糖蛋白胨培养液，1支加入9ml自然水。然后往16支试管各倒置一支汉氏小套管。完成后包装好，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min左右。将取回来的中心湖水样稀释20倍。待试管冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1ml水样，向装有一倍的乳 酸蛋白胨培养液的另5支试管中加入1ml 10-1水样。将各试管充分混均，置于37℃恒温箱中
总大肠菌群 在饮用水的微生物安全监测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标，而不是直接测定肠道致病菌。 总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。 一多管发酵法 1应用范围 1.1本法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度含量高的水质中总大肠菌群的测定。 1.2水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在。 2原理 根据总大肠菌群应具有的生物特性， 产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。 3仪器 3.1显微镜 3.2革兰氏染色用有关器材。 3.3高压蒸汽灭菌器。 3.4干热灭菌箱。 3.5恒温箱。
3.6冰箱。 3.7放大镜。 3.8试管、平皿（直径 4培养基 4.1乳糖蛋白胨培养液 4.1.1成分 蛋白胨10g 牛肉膏3g 乳糖5g 氯化钠5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 蒸馏水1000ml 4.1.2制法 将蛋白胨、牛肉膏、 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液， 灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。4.3品红亚硫酸钠培养基（供多管发酵法用）4.3.1成分 蛋白胨10g
乳糖10g 磷酸氢二钾3.5g 琼脂15~30g 蒸馏水1000ml 无水亚硫酸钠5g左右 5%碱性品红乙醇溶液 4.3.2储备培养基的制备如革兰氏阴性无芽胞杆菌， 9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中 1ml 1000ml蒸馏水中加热溶解， 充分混匀，分装于装有倒管的试管中，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸160℃灭菌2h 调整pH为7.2~7.4，再加入1ml置高压蒸汽灭菌器中，以115℃乳糖及氯化钠置于 20ml 先将琼脂加至900蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH值为7.2~7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌中以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.3.3平皿培养基的配制 将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10min以灭菌。
摘要：菌落总数和大肠菌群是食品中安全性指标，针对食品微生物检测中茵落总数结果很高但大肠菌群很低进行分析。 关键词：菌落总数；大肠菌群；食品 我国的国家标准绝大多数食品都制订了菌落总数和大肠菌群的指标，并对其数量做了详细的规定，菌落总数和大肠菌群是食品中安全性指标，是影响产品质量问题的常见指标，常常受到生产企业和消费者的高度父注，菌落总数的报告单位是cfu／g (ml )，大肠菌群的报告位是mpn／100g ( ml)，那么cfu，mpn是什么含义呢，有的食品微生物检测中菌落总数结果很高但大肠菌群很低，有关企业对此不太理解，现在将做一下解释说明。 L菌落总数(cfu) 菌落总数是用来判定食品在被加工过程中被污染的程度及卫生质量的重要指标，食品的生产加工过程叶中，卫生质量的高低首先决定食品原料的来源．原料的卫生与否，是否被污染过，这是根本原因，其次是环境卫生水平的高低，再次就是加工人员和加工工具的卫生状况，要保证食品卫生安全就必须保证所加工的原料来源，环境，加工工具和人员符合卫生标准，但是如何判定食品生产加工过程中是否符合卫生要求，以便对被检产品做出一个科学的评价，菌落总数的多少在一定程度上反映出卫生质量的优劣，也可以用这一方法观察出食品中细菌的繁殖动态，以便于对被捡样品进行卫生评价时提供科学依据。 菌落总数中的菌落英文意思是(colony)，定义为细菌和其他几种做微生物在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。各种细菌的菌落各自具有一定的特征，按其特征的不同可以在某种程度上鉴别某种细菌，为卫生检验提供依据，菌落总数是指在被检样品的单位重量( g )．体积(m1) 或表面积(clni) 内所含能于某种固体培养基上在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。其培养的原理是以检样在被稀释到一定体积后，吸取一定量的检样，检样中的细菌细胞和培养基混合后，每个细菌细胞部形成一个肉眼可见的菌落的假设为基础的．由于检验中采用的是37℃有氧条件下培养。因而并不能测出每克或每毫升样品内的实际活菌数，其中的微嗜氧菌，厌氧菌，冷营养菌在此条件下都不能生长，有特殊营养要求的一些细菌的生长也受到了限制，因此培养的只是一群能在普通营养琼脂中发育中发育的嗜中温的需氧兼性厌氧的细菌总数，只有具备每种细菌生长要求的特定的环境条件，才能将所有细菌全部培养出来，因此要的到全部的茼落总数应将检样接种到不同的
水质 总大肠菌群测定作业指导书 1 含义及执行标准 1.1 含义 总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24小时内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 1.2 方法原理 多管发酵技术是以最可能数（most probable number ，简称MPN ）来表示试验结果的。它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN 表获得结果的。 1.3 水环境质量标准 表1-1 总大肠菌群地下水质量分类指标 （GB/T 14848-93） 表1-2 总大肠菌群生活饮用水卫生标准 （GB 5749-2006） 表1-3 总大肠菌群渔业水质标准 （GB 11607-89） 1.4 水污染物排放标准 表1-4 总大肠菌群船舶污染物排放标准 （GB 3552-83） 2 分析方法 2.1 方法名称、方法来源及适用范围
方法名称：多管发酵法 方法来源：《水和废水监测分析方法》(第四版)国家环保总局2002年第五篇第二 章五(一) 方法适用范围：此法适用于各种水样（包括底泥）的总大肠菌群测定。 2.2仪器 高压蒸汽灭菌器 电热干燥箱 恒温培养箱 显微镜 冰箱 采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压 蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。 2.3 标准菌株制备 将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。必须包 括大肠埃希氏菌和山夫登堡沙门氏菌两种对照。接种完后需记录：母种的来源，母种和工作 种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯 度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。 2.4 培养基 2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌比例，三倍配制（蒸馏水除外），用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 2.4.3 品红亚硫酸钠培养基：市售品红亚硫酸钠培养基，按铭牌配制，分装于三角烧杯内，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 2.4.4 伊红美蓝培养基：市售伊红美蓝培养基，按铭牌配制，分装于三角烧杯内，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 2.3.5培养基存放于带紫外灯的灭菌物品专用贮藏柜中，当培养基颜色变化，或体积明 显变化时废弃不用。 2.5分析步骤 2.5.1 生活饮用水 ①初发酵实验：在二个装有已灭菌的50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的大试管中（内有倒 管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100ml；在10支装有已灭菌的5ml三倍浓缩乳糖 蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10ml，混匀后置于 37℃恒温箱培养24h。 ②平板分离：经初发酵试验培养24h后，发酵试管颜色变黄为产酸，小玻璃倒管内有气泡为
一．填空题 1.总大肠菌群多管发酵法测定的步骤分为____________、_____________和______________。 2.粪大肠菌群多管发酵法的初发酵试验，是将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，在____℃培养____h，产酸产气则为阳性。 二、判断题 1.总大肠菌群测定时，如果不能实现常规的检验步骤，例如水样运输途中不能保证所要求的温度，或采样后不能在允许的时间内进行检验等，都可采用延迟培养法。（） 2.对受污染严重的水体样品，如果在初发酵中未发现产气，则应将其培养到48h，然后再进一步证实有无大肠菌类细菌。( ) 3．如果粪大肠菌群测定的接种体积为10ml，则试管内应装有三倍乳糖蛋白胨培养液10m1，如接种量为1m1，则接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10m1中。( ) 4．粪大肠菌群多管发酵法的复发酵试验，是将培养物转接到EC培养液中，在35℃下培养24h。( ) 5．水中总大肠菌群和粪大肠杆菌的快速测定法，适用于医院污水、生活污水、垃圾渗滤液以及其他行业(如餐饮业、食品加工等)排入地表水中的污水。( ) 三、选择题 1．我国目前以为总大肠菌群的报告单位，MPN值再乘即为该体积水样中的总大肠菌群数。( ) A． 100m1， 10 B． 1 L， 1 C， 1 L， 10 四．简答题 1.简述多管发酵法测定水源水中总大肠菌群的初发酵操作步骤。 2.如果总大肠菌群和粪大肠菌群测定水样接种量不是10ml、1m1和0.1ml而是较低或较高三个浓度的水样，应如何计算总大肠菌群数或粪大肠菌群数?试写出计算公式。
答案 一．1.初发酵试验 平板分离 复发酵试验 2. 37 24 二．1.正确 2.正确 3.错误 4.错误 5.正确 三.1.C 四. 1.答案：(1)将水样做1∶10稀释。(2)在各装有5m1三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入10ml 水样；在各装有10m1乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入1ml 水样；在各装有10m1乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入1m1 1∶10的稀释的水样。(3)将各管充分混匀，置37℃恒温箱培养24h 。 2.答案：如果接种的水样量不是10m1、1m1和0.1m1，而是较低或较高的三个浓度的水样，可先查MPN 表求出MPN 指数，再经过下面的公式换算成每100m1的MPN 值。MPN 值乘以10，即为1L 水样中的总大肠菌群数(或粪大肠菌群数)。 ()()ml ml MPN MPN 接种量最大的一管 指数值10?=
水和饮料中细菌总数和总大肠菌群的测定 1、实验目的 1.1学习水样的采取方法、了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。 1.2学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。 1.3学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。 2、实验原理 2.1水中细菌总数可说明被有机物污染的程度，细菌数越多，有机物质含量越大。所谓细菌总数是指1mL或1g检样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，37℃经24h培养后，所生长的菌落数。本实验所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。 2.2所谓大肠菌群，是指在37℃、24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。 水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。 2.3水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。多管发酵法包括：初发酵试验、平板分离和复发酵试验。 2.3.1初发酵试验 发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉式小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖产酸产气。培养基内加溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基由紫变黄。发酵管经37℃培养24h，小套管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明说中存在大肠菌群，为阳性结果。但是，有个别其他类型的细菌此条件下可能产气，且产酸不
水质大肠菌群（MPN）检索表 （总接种量55.5 mL，其中5份10 mL水样，5份1mL水样，5份0.1 mL水样） 接种量，mL MPN/100m L 接种量，mL MPN/100m L 10 1 0.1 10 1 0.1 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 4 5 2 4 5 7 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3 4 5 4 6 8 10 12 14 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 2 3 4 5 2 4 6 7 9 11 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 1 2 3 4 5 6 8 10 12 15 17 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 1 2 3 4 5 4 6 7 9 11 13 1 1 1 1 1 1 3 3 3 3 3 3 1 2 3 4 5 8 10 12 15 17 19 0 0 0 0 0 0 3 3 3 3 3 3 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 1 1 1 1 1 1 4 4 4 4 4 4 1 2 3 4 5 11 13 15 17 19 22 0 0 0 0 4 4 4 4 1 2 3 8 9 11 13 1 1 1 1 5 5 5 5 1 2 3 13 15 17 19 接种量，mL MPN/100m L 接种量，mL MPN/100m L 10 1 0.1 10 1 0.1 0 0 4 4 4 5 15 17 1 1 5 5 4 5 22 24 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5 5 5 1 2 3 4 5 9 11 13 15 17 19 2 2 2 2 2 2 1 2 3 4 5 5 7 9 12 14 16
规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。 2范围 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 3术语和定义 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 最可能数most probable number，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 4责任 质量部组织制订、化验室负责实施。 5内容 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 冰箱：2 ℃～5 ℃。 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 天平：感量 g。 均质器。 振荡器。 无菌吸管：1 mL（具 mL 刻度）、10 mL（具 mL 刻度）或微量移液器及吸头。无菌锥形瓶：容量500 mL。 无菌培养皿：直径90 mm。
pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 菌落计数器。 培养基和试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中。煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中。结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中。 磷酸盐缓冲液：见附录A 中。 无菌生理盐水：见附录A 中。 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中。 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中。 大肠菌群MPN 计数法 检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。 图1 大肠菌群MPN 计数法检验程序 操作步骤 样品的稀释 .1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2
实验三水中大肠菌群的检测 （多管发酵法） 一、实验目的 1. 了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义。 2．学习检测水中大肠菌群的方法。 二、实验原理 1.相关性 大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。大肠杆菌能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 水体中的病原微生物常因数量较少而难以检出，即使检出结果为阴性，也不能保证无病原微生物存在；同时检出手续也很复杂。所以，在实际工作中常借用检查水体中有无“指示菌”存在及其数量多少来判定水质是否被污染。大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个。 大肠菌群是作为粪便污染指标提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中 2.检测安全 大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系。 3.抗逆性 因为水中致病性的治病菌比较少，同时饮用水中的大肠杆菌的数量也是较少的，而大肠菌群与治病菌的抗逆性一样，所以检测大肠杆菌就能反应出水样的质量。 4. 数理统计 通过对某些现象的频率的观察来发现该现象的内在规律性，并作出一定精确程度的判断和预测；将这些研究的某些结果加以归纳整理，逐步形成一定的数学概型，这就是数理统计的原理。就本次实验来讲，15支培养液中（其中有三类），5支装入的10ml水样，5支装入1ml水样，5支装入0.1ml水样，通过培养后，看各个种类的培养液中显示为阳性（黄色）的有几支，通过这些数据和报告中的表格，可算出每100ml水样中细菌的可能数。
滤膜法测定总大肠菌群 1 主题内容与适用范围 本方法规定了生活饮用水中总大肠菌群的滤膜测定方法。 本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。 2 方法提要 用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。 3 培养基与试剂 3.1 品红亚硫酸钠培养基 3.1.1 成份 A 蛋白胨10g B 酵母浸膏5g C 牛肉膏5g D 乳糖10g E 琼脂15~20g F 硫酸氢二钾3.5g G 无水亚硫酸钠5g左右 H 碱性品红乙醇溶液(50g/L) 20mL I 蒸馏水1000mL 3.1.2 储存培养基的制备 先将琼脂加到500mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补充蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2~7.4，再加入乳糖，分装，115℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。 3.1.3 平皿培养基的配制 将上法制备的储存培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。 用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿中。待冷却凝固后置冰箱内备
用。此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。如培养基已由淡粉色变为深红色，则不能再用。 3.2 乳糖蛋白胨培养基 3.2.1 成份 A 蛋白胨10g B 牛肉膏3g C 乳糖5g D 氯化钠5g E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL F 蒸馏水1000mL 3.2.2 制法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加入1mL1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4 仪器 4.1 滤器。 4.2 滤膜，孔径0.45~0.65μm。直经根据滤器规格，目前常用的有3.5cm和4.7cm两种。 4.3 抽滤设备。 4.4 无齿镊子。 4.5 培养箱: 36±1℃。 4.6 冰箱: 0~4℃。 4.7 天平。 4.8 显微镜。 4.9 平皿: 直径为9cm。 4.10 灭菌刻度吸管: 1mL,10mL。 5 检验步骤 5.1 准备工作 5.1.1 滤膜灭菌: 将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。