北京索莱宝科技有限公司
SV40T转化人脐静脉内皮细胞贴壁培养
细胞名称：SV40T转化人脐静脉内皮细胞；PUMC-HUVEC-T1
形态特性：上皮样
生长特性：贴壁生长
培养条件：DMEM-H，10%FBS。
传代方法：1:3-4传代。
冻存条件：细胞冻存液
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。
特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。
3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。
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小鼠主动脉内皮细胞 小鼠主动脉内皮细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠主动脉内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠主动脉内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠主动脉内皮细胞产品简介： 1、产品名称：C57小鼠主动脉内皮细胞（Mouse Aortic Endothelial Cells） 2、组织来源：C57小鼠心肌主动脉 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠主动脉内皮细胞简介： 心肌主动脉是供给心脏血液的动脉。主动脉内皮细胞分离自正常C57小鼠心肌主动脉，呈单层扁平分布。内皮细胞或血管内皮是一薄层的专门上皮细胞，由一层扁平细胞所组成。它形成血管的内壁，是血管管腔内血液及其他血管壁（单层鳞状上皮）的接口。内皮细胞是沿着整个循环系统，由心脏直至最少的微血管。 本公司生产的C57小鼠主动脉内皮细胞采用混合酶消化而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，CK-18免疫荧光鉴定细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科 安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生) 人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定 余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生 [摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。 [关键词] 内皮细胞;培养 C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001 [Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient. [Key words] Endot helial cells;Culture 我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。 材料与方法 一、材料与培养用液的配制 CK 型倒置显微镜(日本Olympus Tokyo 公司),流式细胞仪(Coulter 公司),BB 5060型CO 2培养箱(美国Heraeus),Cryfuge500S 型低温离心机,胎牛血清(FBS,100ml/瓶,H yclone 公司),人血管内皮生长因子(VEGF,10 g/支,Pepro Tech 公司),CD31PE 购自Becton Dickison 公司(编号:340297)。 培养用液:(1)PBS 液:Nacl 8.5g 、Kcl 0.2g 、NaH 2PO 4H 2O 2g 、KH 2PO 40.2g 溶于1000三蒸水中,120!灭菌20m in,分装备用。(2)胶原酶(Gibco 公司,10mg/支)和胰蛋白酶(上海华美公司)分别溶于100ml PBS 中,浓度分别为0.1%和0.25%,抽滤消毒备用。(3)DMEM 培养基(购自BRL-Gibco 生命技术公司):按照说明书操作,将一袋干粉溶于1000ml 三蒸水中,抽滤消毒,加入胎牛血清终浓度为10%,4!贮存备用。 二、方法 1.内皮细胞原代培养:无菌获取新生儿脐带,立即用生理盐水冲洗血迹,剪去钳痕和血肿部位,再用PBS 液冲净脐静脉内血迹。将脐带一端用丝线结扎固定,用注射器向脐静脉另一端内注满0.1%胶原酶液,止血钳钳夹后放入水浴锅内孵育15min 。取出脐带松开血管钳释放酶细胞混合液于离心管中,再用PBS 液冲洗脐静脉后一并收集于离心管中,1000rpm ?8min 。弃去上清液,转移至35cm 2 培养瓶(Falcon 公司)中,加入DM EM 培养液(内含10%胎牛血清,青霉
小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠冠状动脉内皮细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠冠状动脉内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠冠状动脉内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠冠状动脉内皮细胞产品简介： 产品名称：小鼠冠状动脉内皮细胞（Mouse Coronary Artery Endothelial Cells）组织来源：小鼠冠状动脉 产品规格：5×105cells/25cm2培养瓶 小鼠冠状动脉内皮细胞简介： 冠状动脉是供给心脏血液的动脉，起于主动脉根部，分左右两支，行于心脏表面。冠状动脉内皮细胞分离自正常小鼠冠状动脉组织，呈单层扁平分布。内皮细胞或血管内皮是一薄层的专门上皮细胞，由一层扁平细胞所组成。它形成血管的内壁，是血管管腔内血液及其他血管壁（单层鳞状上皮）的接口。内皮细胞是沿着整个循环系统，由心脏直至最少的微血管。 本公司生产的小鼠冠状动脉内皮细胞采用混合酶消化获得，细胞总量约为 5
/ 产品说明 细胞名称：小鼠主动脉内皮细胞C57 货号：CRC57 物种来源：小鼠数量：1X10^6 传代次数：2~3是否肿瘤：否 培养条件:90%DMEM高糖培养基+10%胎牛血清培养温度温度：37℃ 注意事项： 1、收到细胞，请查看瓶子是否有破裂，培养基是否漏出，是否浑浊，如有请尽快联系。 2、收到细胞，如包装完好，请在显微镜下观察细胞。,由于运输过程中的问题，细胞培养瓶中的贴壁细胞有可能从瓶壁中脱落下来，显微镜下观察会出现细胞悬浮的情况，出现此状态时，请不要打开细胞培养瓶，应立即将培养瓶置于细胞培养箱里静止3-5小时左右，让细胞先稳定下，再于显微镜下观察，此时多数细胞会重新贴附于瓶壁。如细胞仍不能贴壁，请用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，如台盼蓝染色证实细胞活力正常请按悬浮细胞的方法处理。 3、收到细胞后，请镜下观察细胞，用恰当方式处理细胞。若悬浮的细胞较多，请离心收集细胞，接种到一个新的培养瓶中。弃掉原液，使用新鲜配制的培养基，使用进口胎牛血清. 刚接到细胞，若细胞不多时血清浓度可以加到15％去培养。若细胞迏到80%左右，血清浓度还是在10％。 4、收到细胞时如无异常情况，请在显微镜下观察细胞密度，如为贴壁细胞，未超过80%汇合度时，将培养瓶中培养基吸出，留下 5-10ML培养基继续培养：超过80%汇合度时，请按细胞培养条件传代培养。如为悬浮细胞，吸出培养液，1000转/分钟离心3分钟，吸出上清，管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。 5、将培养瓶置于37℃培养箱中培养，盖子微微拧松。吸出的培养基可以保存在灭菌过的瓶子里，存放于4℃冰箱，以备不时之需。 6、24小时后，细胞形态已恢复并贴满瓶壁，即可传代。（贴壁细胞）将培养瓶里的培养基倒去，加3-5ml（以能覆盖细胞生长面为准）PBS或Hanks’液洗涤后弃去。加0.5-1ml 0.25%含EDTA的胰酶消化，消化时间以具体细胞为准，一般1-3分钟，不超过5分钟。可以放入37℃培养箱消化。轻轻晃动瓶壁，见细胞脱落下来，加入3-5ml培养基终止消化。用移液管轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后将溶液吸入离心管内离心，1000rpm/5min。弃上清，视细胞数量决定分瓶数，一般一传二，如细胞量多可一传三，有些细胞不易传得过稀，有些生长较快的细胞则可以多传几瓶，以具体细胞和经验为准。（悬浮细胞）用移液管轻轻吹打瓶壁，直接将溶液吸入离心管离心即可。 7、贴壁细胞，悬浮细胞。严格无菌操作。换液时，换新的细胞培养瓶和换新鲜的培养液，37℃，5%CO2 培养。
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养 1.将15-20cm 长的新生儿脐带放入无菌的PBS 溶液中储存。 （注：4℃下最多贮存24 小时，室温下不超过6 小时，否则废弃） 2.用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS 溶液冲洗3-5 次，将污 血冲洗干净为止。 3.用手术钳夹紧脐带下端，加入15m l的胶原酶（1m g/ml）室温下消化15-20 分钟，并不时上下摇动脐带。 4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 m l无菌离心管中，用无 菌的PBS 溶液冲洗脐带2-3 次。 5.将收集液离心（2000 转/分）3 分钟。 6.倒去上清，加入10m l M199培养基（加入10U/m l的bF G F），用弯管吹散细 胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。 （注：每个培养瓶中加入3-4ml 无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2 小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。） 7.培养24 小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS 溶液清洗2-3 次，洗掉红细 胞和死细胞，加入10 m l新鲜的M199培养基。 8.以后每2 天换一次培养基（每次换掉2/3 的培养基）。 9.一般培养5-7 天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。 10.倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3 次，加入2-3m l消化液（0.25%胰酶 +0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3 倍的——————————————————————————————————————————————
人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定 作者：秦明春，王若光，秦莉花，刘小丽，李春梅，刘惠萍，叶赞 【摘要】目的探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法，提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。建立血管内皮细胞培养模型，为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法取2根脐带（至少20 cm）冲净淤血，采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液, 一根用0.2％胶原酶Ⅱ，另一根用0.1％胶原酶Ⅰ和0.25％胰酶等比混合消化液，比较两种酶的消化效果。收集细胞并用含有10 ng/mL的VEGF的培养基中培养，观察细胞的生长及传代。并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术观察细胞周期。结果两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞，胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶，且比较理想的消化时间均为13 min，细胞接种后4～5 h开始贴壁生长，1周左右可生长成单层，光镜下呈多角形，“铺路石”样排列，免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。细胞周期显示约有50.6%的细胞处于G0/G1期。结论胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法，而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，成功率高，可靠性大，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。 【关键词】人脐静脉内皮细胞；细胞培养；流式细胞术；细胞周期；分离；鉴定 Cultivation and in vitro identification of endothelial cells from human umbilical vein 〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕Ｏｂｊｅｃｔｉｖ ｅTo explore the primary culture method of human vascular endothelial cells(ECs) from umbilical vein, enhance the succes s rate of separating and culturing ECs in vitro, establish the model of human vascular ECs, and provide an experimental method for research of ECs. Methods The umbilical veins in human umbilical cords, 20 cm long, were fixed and filled the digestive fluids, 0.2% collagenenaseⅡin one cord and t he complex enzyme of 0.25% trypsin and 0.1% collagenaseⅠin an other, and the digestive results were compared. All the cells were collected and cultured in fluid with 10 mg/mL VE GF, their procreation and generation were observed, the morph ologic characteristics of ECs were observed with light micros copy and immunohistochemistry under inverted microscope, and t he cell cycle was observed by flow cytometer. Results Enough
iNOS在不同年龄正常和冠状动脉粥样硬化血管内皮细胞中的表达 发表时间：2018-11-22T15:10:00.447Z 来源：《中国医学人文》(学术版)2018年5月上第9期作者：苏琳 [导读] 如何通过iNOS抑制剂的使用，抑制iNOS 的表达，减少NO的生成，减少急性心肌坏死和凋亡，仍需要循证医学的不断探索。 浙江大学医学院附属邵逸夫医院全科医学科浙江杭州 310000 【摘要】目的：研究不同年龄段正常人群和冠状动脉粥样硬化患者血管内皮细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，验证iNOS 对冠状动脉粥样硬化疾病的作用。方法：每个年龄组（20-40岁、41-50岁、51-60岁、61-70岁、70岁以上）取心脏左前降支中的一段，每组正常人群及患者各2个。制成石蜡切片，通过免疫组化染色，观察结果。结果：iNOS在冠状动脉粥样硬化患者血管内皮细胞中的表达明显高于正常人群血管内皮细胞中的表达。结论：iNOS在冠状动脉粥样硬化患者血管内皮中的表达高，说明iNOS在冠状动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用。 【关键词】iNOS；冠状动脉粥样硬化；内皮细胞 冠心病是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型，也是严重危害人类健康的常见病。动脉粥样硬化的病理改变是内皮舒张因子产生减少及内皮细胞受损，平滑肌细胞增殖、脂质沉积，从而引起血管壁增厚乃至管腔狭窄，血管张力增加。一氧化氮（nitric oxide，NO）是体内的主要舒血管活性物质，具有维持血管张力，调节血压，扩张冠状动脉，调节心肌收缩与舒张[1]，增加心肌供血等作用。在体内，NO 主要由一氧化氮合酶（nitric oxide synthasen，NOS）催化L-精氨酸产生。NOS在体内广泛分布[2]，其中血管内皮细胞是最为集中的部位[3]。NOS 主要有三种不同的亚型[4]：神经型NOS（nNOS）、诱导型NOS（iNOS）及内皮细胞型（eNOS）。当内皮细胞受到炎症等细胞因子刺激时，iNOS 会受刺激诱导而开始表达[5]。iNOS一经表达，即具有高度的活性，且持续时间长，催化生成较高浓度的NO，参与心血管的许多病理过程[6、7]。本次实验用免疫组化Envision二步法检测iNOS在冠状动脉血管内皮中的表达，验证iNOS对冠状动脉粥样硬化疾病的作用。 1 材料 1.1 冠状动脉样本取自浙江大学司法鉴定中心。 1.2 免疫组化试剂一氧化氮合成酶1型，编号BA0360购于武汉博士德生物工程有限公司；羊抗免IgG抗体-HRP多聚体，编号PV-6001，购于北京中杉金桥生物技术有限公司；浓缩型DAB试剂盒，编号ZLI-9031/9032/9033，购于北京中杉金桥生物技术有限公司。 1.3 其它试剂和材料不同浓度二甲苯溶液、不同浓度酒精溶液、PBS缓冲液、苏木精染液、0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液、3%H2O2溶液、多聚左旋赖氨酸载玻片、树胶、微量加样器、冰箱、湿盒、切片架、显微镜。 2 方法 2.1 冠状动脉材料准备挑选出符合要求的非冠状动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化的尸体标本各10例，然后找到心脏冠状动脉左前降支，切取约2-4mm的一段血管，制成切片。 2.2 切片制成后，于60℃烘箱烘烤切片4-6小时。 2.3 HE染色 切片脱蜡将切片依次浸入：二甲苯I 10分钟，二甲苯II 5分钟，无水乙醇I 5分钟，无水乙醇II 5分钟，95%乙醇5分钟，90%乙醇5分钟，80%乙醇5分钟，水洗2分钟。 染色苏木精染色10分钟，水洗1分钟，1%盐酸乙醇分化数秒，再用水洗1分钟。用0.2%氨水返蓝约30秒，水洗1分钟。伊红染色5分钟，快速用水洗去染料。 脱水、透明、封固将切片依次浸入：80%乙醇20秒，90%乙醇20秒，95%乙醇I 3分钟，95%乙醇II 3分钟，无水乙醇I 5分钟，无水乙醇II 5分钟，二甲苯I 3分钟，二甲苯II 3分钟，二甲苯III 3分钟。 最后用中性树胶封片。 2.4 免疫组化法染色采用免疫组化envision二步法： 切片脱蜡和水化将切片放入60℃恒温箱中烘烤20分钟，取出后将组织切片依次置于下列溶液中浸泡：二甲苯I 10分钟，二甲苯II 10分钟，无水乙醇5分钟，95%乙醇5分钟，80%乙醇5分钟，70%乙醇5分钟。取出后用PBS洗三次，每次3分钟； 封闭内源性过氧化物酶活性将切片在3% H2O2溶液中浸泡15分钟。取出后再在PBS中洗一次，3分钟； 抗原修复用电磁炉加热水浴锅，水浴加热0.01ml/L枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）至95±3℃，将切片放入缓冲液中，稳定温度保持30分钟。结束后连枸橼酸钠缓冲液一起从水浴锅中取出，放在室温下自然冷却； 滴加一抗将自然冷却的切片用PBS洗两次，每次3分钟。然后滴加1：100稀释的一抗，稀释后抗体浓度为2μg/ml，液体完全盖过组织块，整个操作不能干片。滴加完一抗以后，抗ETA和抗ETB两套抗体的切片必须分开操作，不能相互接触。将滴加完一抗的切片放入湿盒切片架，放入4℃冰箱中过夜（约20小时）； 滴加二抗取出过夜后的切片，待其恢复至室温后，用PBS溶液洗三次，每次3分钟。滴加二抗，即山羊抗免IgG抗体-HRP多聚体，湿盒孵育30分钟，取出，PBS洗三次，每次3分钟； DAB显色按DAB试剂说明书，在进行DAB染色前数分钟配好DAB溶液。在水槽边向切片滴加DAB溶液，待颜色微黄后立即用水冲去多余染液； 苏木精复染将切片浸入苏木精染液中5分钟，取出用水洗净； 封片中性树脂封片。 3 结果 判定标准细胞浆被染成棕黄色作为阳性细胞判定标准。阳性细胞< 5 %为浅黄色（±）；5 %～25 %之间为棕黄色（+）；26 %～50 %之间为中度棕色（++）；> 50 %为深棕色（+++）。 从表1可看出：正常血管内皮和冠状动脉粥样硬化血管内皮中iNOS的表达差异明显。冠心病患者冠状动脉血管内皮细胞中iNOS阳性表
Human Coronary Artery Endothelial Cells (HCAEC) Catalog Number: 6020 Cell Specification Endothelial cells constitute the natural interface between the blood and the underlying tissue. Changes in endothelial cell function appear to play a key role in the pathogenesis of atherosclerosis. Endothelial cells synthesize and secrete activators as well as inhibitors of both the coagulation system and the fibrinolysis system in addition to mediators that influence the adhesion and aggregation of blood platelets. Endothelial cells also release molecules that control cell proliferation and modulate vessel wall tone [1]. Human endothelial cells produce antithrombotic and thrombotic factors such as t-PA and PAI-1 and respond to TNF-alpha by modifying growth characteristics, producing cytokines such as GM-CSF, expressing ICAM-1 on the surface and producing large amounts of nitric oxide and endothelin [2]. Endothelial injury, with consequent endothelial dysfunction, is caused by percutaneous transluminal coronary angioplasty [3] and may play an important role in subsequent restenosis [4]. Many of the endothelial processes can be studied in vitro using cultured cells, and HCAEC will surely be very useful to studying and understanding the molecular mechanisms involved in coronary artery diseases. HCAEC from ScienCell Research Laboratories are isolated from human coronary artery. HCAEC are cryopreserved at passage one and delivered frozen. Each vial contains >5 x 105 cells in 1 ml volume. HCAEC are characterized by immunofluorescent method with antibodies to vWF/Factor VIII and CD31 (P-CAM) and by uptake of DiI-Ac-LDL. HCAEC are negative for HIV-1, HBV, HCV, mycoplasma, bacteria, yeast and fungi. HCAEC are guaranteed to further expand for 15 population doublings at the conditions provided by ScienCell Research Laboratories. Recommended Medium It is recommended to use Endothelial Cell Medium (ECM, Cat. No. 1001) for the culturing of HCAEC in vitro. Product Use HCAEC are for research use only. It is not approved for human or animal use, or for application in in vitro diagnostic procedures. Storage Directly and immediately transfer cells from dry ice to liquid nitrogen upon receiving and keep the cells in liquid nitrogen until cell culture needed for experiments. Shipping Dry ice. Reference [1] Elhadj, S. and Forsten, K. E. (2001) Chronic shear stress affects bovine aortic endothelial cell secreted proteoglycan production in vitro. Bioengineering Conference, Vol. 50:767-768. [2] Donnini, D., Perrella, G., Stel, G., Ambesi-Impiombato, F. S., Curcio, F. (2000) A new model of human aortic endothelial cells in vitro. Biochimie 82:1107-14. [3] Vassanelli C, Menegatti G, Zanolla L, Molinari J, Zanotto G, Zardini P. (1994) Coronary vasoconstriction in response to acetylcholine after balloon angioplasty: possible role of endothelial dysfunction. Coron Artery Dis. 5:979-986. [4] Meurice T, Vallet B, Bauters C, Dupuis B, Lablanche JM, Bertrand ME. (1996) Role of endothelial cells in restenosis after coronary angioplasty. Fundam Clin Pharmacol. 10:234-242.
血管内皮细胞功能与心血管疾病关系的研究进展 摘要：血管内皮细胞（VEC）功能与心血管疾病的发生和发展密切相关, 本文综述了血管内皮细胞合成与释放的一氧化氮、内皮素、血管紧张素Ⅱ等多种生物活性物质及VEC功能紊乱与心血管疾病的关系，研究VEC功能与心血管疾病形成之间的相互关系将为心血管疾病的治疗提供新思路、新策略。 关键词：血管内皮细胞；一氧化氮；内皮素；血管紧张素Ⅱ；心血管疾病 现已证明VEC除了完成血液和组织液的代谢交换以外，还是机体最大的内分泌腺【1】，可以产生和分泌十余种生物活性物质，具有维持正常的血管张力、血液的正常状态和动态平衡等作用，并通过其屏障和分泌功能，影响着炎症反应的发生、发展，参与调节机体的免疫应答。VEC功能紊乱在高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化（AS）等心血管疾病的发病过程中具有重要意义。 1血管内皮细胞功能【2】 VEC的功能极其重要和复杂。1维持血管内膜的光滑，防止血小板及白细胞粘附，防止有害物质侵入血管壁。2具有半透膜的作用，维持血液、组织液中物质的交换。3合成并释放多种生物活性物质，如一氧化氮（NO），PGI2,，内皮素（ET）等，调节血管张力，维持正常血压。4合成致栓及抗栓物质，维持其动态平衡，如肝素，组织型纤溶酶原激活物（t-PA）及血管性假血友病因子（vWF）等。5 合成胶
原基底膜及血管平滑肌保护层。6合成血管生长因子及血管紧张素转化酶（AEC）。7影响血管壁对脂蛋白等物质的代谢。 2血管内皮细胞功能的标志物质【3~5】 2.1 一氧化氮(NO)。NO由血管EC释放，EC以L一精氨酸和分子氧作为底物，在NO合酶作用下生成NO 继之进入邻近的平滑肌细胞，激活鸟苷酸环化酶分解GTP使c—GMP增加，导致血管平滑肌舒张。NO还有抑制血管平滑肌增殖、抗血小板聚集和抗血栓形成作用【 3.5】。基础状态下，EC作为血藏感受器，转化血液切变力的机械信号为化学剌激，促使NO释放，维持血管张力和血流量相对恒定。乙酰胆碱、5_羟色胺、P物质，缓激肽、凝血酶、腺苷、TXA2、组胺{细胞因子如白介素-1、肿瘤坏死因子以及内毒素，都能促使NO释放。 2．2 PGI2。EC通过环氧化酶及前列环素合成酶途径代谢花生四烯酸产生PGI2，再通过第二信使cAMP发挥生物学效应。凝血酶、缓激肽、组胺，腺苷、高密度脂蛋白、TXA2、白三烯、血小板生长因子、组织缺氧和血流动力学应激等，促使EC释放PGI2。PGI2和NO 协同扩张血管，防止血小板聚集和抗血栓形成【5】。 2．3ET1988年Yanagisawa【6】从猪主动脉EC中分离提纯出21 个氨基酸组成的多肽,称内皮素。ET 受体中B型主要分布在EC,激活后可使EC释放NO、PGI2,但其舒血管效应常被A型受体兴奋所致平滑肌细胞强烈而持久的收缩所掩盖。有实验表明,给大鼠持续滴注ET1 后血液浓缩,微动脉和微静脉收缩,微循环血流量减少,血栓形成;
HUVEC 人脐静脉血管内皮细胞General Information: Culture Method:
具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系， 时和我们联系武汉普诺赛生命科技有限公司 全国免费服务电话：400-650-3656 邮箱：techsupport@https://www.doczj.com/doc/1e16545888.html, sales@https://www.doczj.com/doc/1e16545888.html, 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象 发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需 细胞因子等，确保细胞培养条件一致。若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。 3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题贴壁细胞会有少量 从瓶壁脱落，将细胞置于培养箱内静置培养过夜，隔天再取出观察。此时多数细胞均会贴壁，若细胞仍不能贴壁请用台盼蓝染色测定细胞活力，如果证实细胞活力正常，请将细胞离心后用新鲜培养基再次贴壁培养；如果染色结果显示细胞无活力，请拍下照片及 4. 静置细胞贴壁后，请将细胞瓶内的培养基倒出，留6~8mL 维持细胞正常培养，待细胞 汇合度90%左右时正常传代。 5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传 代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件。 6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和技术部 沟通交流 告知细胞的
人脐静脉内皮细胞的原代培养和传代、 冻存、复苏及鉴定 1人脐静脉内皮细胞的分离及培养 1.1 原代血管内皮细胞的获取与培养 在细胞的获取方法上，有机械刮取、组织块移植和酶消化法3种。前两种易混杂其他血管壁细胞,近年已逐渐被酶消化法取代。其中胰蛋白酶灌注法及胶原酶消化法获取原代人脐静脉血管内皮细胞的方法。 1.1.1胰蛋白酶消化法 在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。一端插上带有胶管的玻璃管后结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。待脐静脉内的残血除净后，用37℃磷酸盐缓冲液(浓度0.01 mol/L，pH=7.6)冲洗2次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶8~10 mL，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。37℃孵育12 min，在此期间经常翻动脐带，使酶溶液在血管内流动，促使内皮细胞与酶均匀接触。取出脐带轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胰蛋白酶注入50 mL锥形离心管中，加入小牛血清2 mL终止酶反应，再以30 mL磷酸盐缓冲液冲洗管腔，流出液一并入离心管，1000 r/min离心10 min，弃上清(小牛血清及磷酸盐缓冲液)，加入含有10%小牛血清的IMDM培养液，充分混合制成细胞悬液。取0.1mL细胞悬液在血细胞计数板计数。最后调细胞数，以1×105mL接种至24孔培养板中，每孔1mL。置于5% CO2，37℃静止培养24 h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。以后每隔2天换液1次，维持细胞的营养和内环境稳定。 1.1.2胶原酶消化法 在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，用磷酸盐缓冲液
初步清洗，找到脐静脉后，用50 mL注射器吸取磷酸盐缓冲液反复灌注冲洗，洗净残留的血液后用止血钳封住一端，用注射器从另一端灌入15mLⅡ型胶原酶。超净台内温度一般高于室温，此条件下胶原酶作用15min，期间可不时晃动。消化完毕打开止血钳，将消化液流入事先准备好的离心管中，用注射器吸取1倍于消化液体积的内皮细胞培养基灌洗消化后的血管，收集并与消化液合并，900 r/min离心10min，弃去上清，加入事先孵育至37℃的细胞培养液，吹打均匀。取明胶包被的六孔细胞培养板，吸去明胶，每孔加入内皮细胞悬液2.5mL，置于5% CO2饱和度的37℃孵箱中静置培养，24 h后更换培养液以除去未贴壁的细胞。然后每隔3d换液1次至生长汇合。 1.2 传代内皮细胞的培养 原代内皮细胞融合后用培养液冲洗2次，然后用0.25%胰酶和0.25%乙二胺四乙酸以1：1的比例充分混匀后加入到内皮细胞中，每孔0.3 mL。边消化边在倒置显微镜下观察。细胞出现皱缩、边缘略变圆、彼此分离或呈大片状分离，此时即可吸弃消化液终止消化。加入含有10%小牛血清的培养液，用吸管吹打，制成细胞悬液，计数后按10个细胞/mL，并置于5% CO2饱和度的37℃孵箱中继续静置培养。每隔2~3d换液1次。 1.3 人脐静脉内皮细胞的冷冻和复苏 传代细胞贴壁80%后0.25%胰酶消化，离心1200 r/min，5min，弃上清，加入冻存液(含10%甘油、90%细胞外基质)重悬后置4℃30 min，-20℃2 h，-80℃过夜后置入液氮中保存。复苏时在37.2℃水浴中迅速轻摇解冻，胎盘蓝染色，计算细胞存活率。 1.4 影响脐静脉内皮细胞体外生长的因素 影响脐静脉内皮细胞体外生长的因素包括： 1培养液的pH值。最适pH值为7.0~7.2，脐静脉内皮细胞耐酶不耐碱，pH 值为7.4时贴壁困难，pH值7.6以上贴壁细胞脱落受损失去活力。
简便有效分离培养大鼠主动脉内皮细胞的 一种新方法 【摘要】目的：探索分离、培养鼠主动脉内皮细胞的有效方法。方法：将鼠主动脉内膜翻向外，结扎两端，置于50 mL培养瓶中培养、传代，Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色。结果：培养6～8 d 时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长；12～14 d 时贴壁细胞覆盖大部分培养瓶面，约80%的细胞汇合成单层；传代细胞生长旺盛；细胞汇合后呈现典型的“鹅卵石”样内皮细胞特征，内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性；未见杂细胞。结论：此方法无损伤、不需要酶消化，能比较容易的获得高纯度大鼠原代主动脉内皮细胞，适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。 【关键词】主动脉·体外培养·内皮细胞·大鼠 A new method for isolation and culture of the endothelial cells of the rat aorta 【ABSTRACT】Objective:To investigate a modified method of isolating and culturing the endothelial cells from the rat aorta for endothelial bioresearch. Methods:Turned inside out, the aorta of the rat, of which the intima tunica was exposed, was ligated at both ends and cultured in a 50 mL culture bottle. Results:A small amount of cells migrated out from the aorta 6
血管内皮细胞与心血管疾病的关系及其研究进展 刘群峰,马 虹综述 (中山医科大学附属第一医院心内科,广东广州510089) 关键词:血管;内皮;综述文献 中图分类号:R543 文献标识码:A 文章编号:100523271(2000)022******* 血管内皮细胞(V EC)为衬贴于血管内腔面的单层扁平细胞,其表面积可达1000m2以上。V EC 分泌多种调节血管功能的活性物质,与心血管疾病有密切关系。最近已有研究试图通过干预治疗以恢复某些心血管疾病患者的内皮功能,改善预后,这是心血管疾病治疗方法中新的探索。现就V EC与心血管疾病的关系及其研究进展作一简要综述。 1 血管内皮细胞合成与释放的血管活性物质 1.1 V EC合成与释放的缩血管活性物质 V EC 合成与释放的缩血管活性物质包括内皮素(ET)、内皮依赖性收缩因子(EDCF)、前列腺素H2(PGH2)、血栓素A2(TXA2)、血管紧张素 (A g )等。其中ET可分为ET21,ET22,ET233种。ET21是目前发现的最强烈的缩血管活性多肽,它通过激活磷脂酶C起到有丝分裂原的作用,刺激血管平滑肌细胞(V S M C)内c2fo s,c2m yc原癌基因的表达,增加V S M C的DNA合成,促进V S M C的增殖,因此在动脉粥样硬化形成的过程中起重要作用[1]。 1.2 V EC合成与释放的舒血管活性物质 V EC 合成与释放的舒血管活性物质包括前列环素(PG I2)、内皮依赖性舒张因子(EDR F)、内皮依赖性超极化因子(EDH F)等。现已知EDR F的化学本质是一氧化氮(NO),在V EC有产生NO的体系,左旋精氨酸(L2A rg)是合成NO的前体物,乙酰胆碱(A ch)与内皮细胞膜上的M2受体结合后,使内皮细胞中的三磷酸肌醇(IP3)浓度升高,进而升高[Ca2+],在钙调素的辅助作用下,激活细胞内的一氧化氮合成酶(NO S),NO S在辅酶存在时便可使L2 A rg转变为对羟基2L2A rg,后者与氧发生反应生成等克分子量的NO和L2胍氨酸[2]。NO通过激活鸟苷酸环化酶使细胞内cG M P增高,而产生一系列生物效应:松驰血管平滑肌、维持血管舒张状态;抑制血小板的粘附聚集;抑制白细胞粘附分子CD11, CD18的活性或其表达;抑制平滑肌细胞分裂增殖;减少胶原纤维、弹力纤维的产生;清除自由基,抑制脂质过氧化反应。内皮源性一氧化氮(EDNO)对血管内皮功能完整性有重要作用,包括3个方面:①保持血管内皮依赖性舒张活性;②维持血管内膜的无血栓形成表面;③维持血管内膜的非增殖状态[3]。 2 血管内皮细胞与心血管疾病 2.1 血管内皮细胞与高血压 在原发性高血压患者及实验性高血压动物,均发现血浆ET水平较正常人及动物高,其升高水平与高血压程度相关。高血压时血管的结构和功能发生明显改变,阻力血管的基础的和A ch诱发的EDR F合成与释放均显著降低[4]。 2.2 血管内皮细胞与冠心病 L efer等(1991)在动物实验中发现,心肌缺血再灌注后V EC的功能可发生紊乱,特征是舒血管物质释放减少,缩血管物质作用增强。在缺血造成的V EC损伤中,白细胞参与并释放损害V EC的物质,这在冠状循环中尤其明显。 国内外已有大量的临床及实验资料表明,急性心肌梗死时,血浆中内皮素水平明显升高,可升至原来的3倍～5倍,梗死面积越大,内皮素水平越高,而且,这种变化在心肌梗死的早期就已发生。 2.3 血管内皮细胞与心力衰竭 Katz等研究了充血性心力衰竭的动物模型及原发性扩张型心肌病患者冠状循环中内皮舒张功能的变化,发现心力衰竭时患者血管内皮结构及功能均受到损害,自分泌舒血管物质能力下降,相反,缩血管物质的释放增多[5]。心力衰竭时内皮功能障碍的可能机制包括:①肿瘤坏死因子(TN F)增多减少内皮NO S的合成; ②血管紧张素转换酶(A CE)活性增高加快缓激肽降解;③氧自由基增多减弱EDR F NO的活性;④血流量的减少使内皮NO S的表达减弱;⑤内皮依赖性血管收缩物质如环氧合酶依赖因子的增多减弱了NO的扩血管作用;⑥内皮受体信号传导途径受损[6]。长期的A CE抑制剂治疗可以改善心力衰竭已 ? 6 2 1 ?心脏杂志(Ch in H eart J)2000,12(2)