生物学通报２００９年第４４卷第８期绿色荧光蛋白的首次应用者——查尔菲
郭晓强１冯志霞２．
（ｉ解放军白求恩军医学院生化教研室河北石家庄０５００８１２柯棣华医学院英语教研室河北石家庄０５００８１）
摘要绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）是２０世纪６０年代发现的一种在紫外
线下可发出绿色荧光的蛋白．进入２０世纪９０年代后开始被广泛应用于生命科学和环境检测
等研究领域。１９９４年，查尔菲首次成功将ＧＦＰ转入细胞内并观察到绿色荧光。从而开创了ＧＦＰ
应用的先河，为随后ＧＦＰ的广泛应用和深入研究奠定了基础。查尔菲是一位线虫触觉机理研
究领域的专家，但在ＧＦＰ应用方面的贡献却使他于２００８年分享了诺贝尔化学奖。
关键词查尔菲绿色荧光蛋白线虫触觉
中国图书分类号：Ｑ１０文献标识码：Ｅ
绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）是一种２０世纪６０年代从水母中鉴定成功的可在紫外线照射下发出绿色荧光的蛋白，但该重大科学发现一直未引起科学界的注意。直到１９９４年才有科学家将ＧＦＰ成功转入细菌内并观察到绿色荧光的出现，这意味着ＧＦＰ可作为一种重要的生物示踪物而应用于生命科学研究。随后ＧＦＰ研究进入一个崭新时期。被广泛应用于科学研究之中．成为当前生命科学领域中的一项重要工具。而最早将ＧＦＰ应用于生命科学研究且分享２００８年化学奖的就是美国哥伦比亚大学生物学讲座教授马丁?查尔菲（ＭａｒｔｉｎＣｈａｌｆｉｅ）。
１早期研究
１９４７年２月１日．
查尔菲出生于美国伊
利诺伊州的芝加哥。并
在这里完成了自己的
初等教育。孩童时期，
查尔菲就对自然科学
原理表现出极大的兴
趣，但由于缺乏引导
者．因此没有进行真正
意义的科学实验。小学时期，查尔菲的爱好之一仅是将报纸上的漫画剪下来粘贴于剪贴簿，然而进入高中后查尔菲开始接触科学，参加每周的科学俱乐部．这些经历培养出查尔菲对科学研究的重大兴趣，也成为他献身科研的巨大动力。
１９６５年，查尔菲进入哈佛大学，原打算选择数
学作为专业，但后来却转到了生物化学方向，他被生物化学深深吸引的原因是该学科综合了化学、数学和生物学等自己的多个兴趣．并且内容新颖且充满乐趣。大学３年级时，查尔菲跟随黑斯廷斯（ＷｏｏｄｙＨａｓｔｉｎｇｓ）学习细胞生理学课程，环腺苷酸（ｃｙｃｌｉｃＡＭＰ，ｃＡＭＰ）在钠离子运输中的作用原理，激发了查尔菲的科研思路，并完成自己的第１篇科研论文。随后。查尔菲花费一个夏天的时间在韦伯（ＫｌａｕｓＷｅｂｅｒ）实验室工作。着手研究天冬氨酸氨甲酰基转移酶（ａｓｐａｒｔａｔｅｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ，ＡＴＣ）的活性位点．尽管他全身心地投入科研。然而整个夏天却一无所获。令人沮丧的结果使查尔菲对生物学失去了兴趣，随后一年，在完成生物化学专业需要的课程外．查尔菲开始关注其他感兴趣的课程，如法律、戏剧和苏联文学等。大学期间，查尔菲还是一位著名的游泳健将，大学４年级，查尔菲曾作为哈佛大学游泳队队长带队获得ＨａｒｏｌｄＳ．Ｕｌｅｎ奖。
１９６９年，查尔菲从哈佛大学毕业。但随后却做起了临时性工作．包括为父母的服装厂推销服装和在康涅狄格州一家中学教书等。１９７１年夏天。查尔菲申请到耶鲁大学生理学家扎杜奈斯基（ＪｏｓｅＺａｄｕｎａｉｓｋｙ）实验室工作，这次以青蛙视网膜为材料，发现了ｃＡＭＰ对氯离子跨膜运输有重要影响。查尔菲的这次成功重新树立了他在生物学方面的信心。因此１９７２年重新回到哈佛大学，进入生理系跟随珀尔曼（ＲｏｂｅｒｔＰｅｒｌｍａｎ）进行博士学习，这期间查尔菲使用大鼠嗜铬细胞瘤的悬浮培养细胞为材料研究儿茶酚胺的生物合成和释放过程。１９７７年，
查尔菲获得神经生物学博士学位，原打算寻找一个 万方数据
万方数据
万方数据
绿色荧光蛋白的首次应用者——查尔菲
作者：郭晓强， 冯志霞， Guo Xiaoqiang， Feng Zhixia
作者单位：郭晓强,Guo Xiaoqiang(解放军白求恩军医学院生化教研室,河北石家庄,050081)， 冯志霞,Feng Zhixia(柯棣华医学院英语教研室,河北石家庄,050081)
刊名：
生物学通报
英文刊名：BULLETIN OF BIOLOGY
年，卷(期)：2009,44(8)
被引用次数：1次
参考文献(7条)
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本文读者也读过(10条)
1.李夏.陈素文.喻达辉.LI Xia.CHEN Su-wen.YU Da-hui绿色荧光蛋白及其在转基因动物研究中的应用[期刊论文]-南方水产2005,1(5)
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8.刘新生贯彻室内环境污染控制标准发挥国家级检测机构示范带动作用[期刊论文]-建筑2003(11)
9.赵夫鑫.张小瑛.ZHAO Fu-xin.ZHANG Xiao-ying中国西部现代化建设中的生态环境脆弱瓶颈探讨[期刊论文]-湖南财经高等专科学校学报2010,26(4)
10.刘克俭.张鄂.张晓芹.汪利民.张裕曾.郑红燕.殷丽霞不同公路养护作业环境有害因素的检测与评价[期刊论文]-中华劳动卫生职业病杂志2006,24(11)
引证文献(1条)
1.亓毅飞.谭卓卓.黄嘉琪外源EGFP基因在肿瘤细胞中的稳定表达[期刊论文]-生物学杂志 2011(4)
本文链接：https://www.doczj.com/doc/1616727926.html,/Periodical_swxtb200908026.aspx
绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用 田 涛,王 琦3 (中国农业大学农学与生物技术学院,北京 100094) 摘 要 荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。近年来,来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。其中绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP,来源于水母)具有独特的应用价值。在活体研究中,GFP相对于其它报告蛋白(如β2半乳糖苷酶)在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性。对GFP作为分子标记物在微生物学中的应用进行回顾,对GFP在微生物与宿主相互作用、生物膜(biofilm)、生物降解、细菌与原生动物相互作用、基因转导、基因表达、蛋白质定位以及生物传感器等领域的应用进行讨论,并扼要介绍了一些应用于荧光观察和定量分析的方法。 关键词 绿色荧光蛋白;标记;微生物;表达 中图分类号 Q93-31 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2005)01-0068-06 The Application of G reen Fluorescent Protein(GFP)as Molecular Marker in Microbiology TIAN Tao,WAN G Qi (Coll.of A gron.&Biotech.Chi na A gric.U niv.Beiji ng100094) Abstract The application of fluorescent dyes in microbiology has been paid close extensive attention.Recently,flu2 orescent proteins originated from bioluminescent organisms have enriched research means in microbiology,among them green fluorescent protein(GFP)stemmed from jellyfish possesses unique application values.Study in vivo, GFP has many superiorities over other reported proteins,sayβ2galactosidase,in microbio2physiological and biochemi2 cal studies in situ and real time.In this paper,the applications of GFP as molecular marker in microbiology were re2 viewed,the applications of it on interactions between microbes and hosts,bio2membrane,biodegradation,interac2 tions between bacteria and protozoa,gene transfer,gene expression,protein location,as well as biosensors were also discussed.S ome observation and quantitative analysis methods applied on fluorescence were also briefly introduced. K eyw ords green fluorescent protein(GFP);marker;microbe;expression 自然界中的许多生物都具有发光的能力,如细菌、真菌、萤火虫、深海鱼类和腔肠动物等。它们的发光能力是由一类称为“荧光蛋白”的蛋白质赋予的。这些蛋白质由不同基因编码,不具有同源性,其发光机制在进化上也不相同。GFP标记系统是首次发现的不需要其他辅助条件的生物发光标记系统。GFP的激发光谱和发射光谱在活体和离体条件下完全相同,而虫荧光酶素的发射光谱在离体和活体条件下并不相同[1]。 天然的GFP是一种多肽,由238个氨基酸组成,分子量27ku。能够将蓝光转化成绿色荧光[2,3]。Inonye和Tsuji证实GFP的活性发色团是一个三肽,其成熟过程需要有氧的参与[4,5]。野生型的GFP无论是在发光生物中,还是在提纯后的溶液中都具有395nm的最大吸收峰和510nm的最大发射峰[6]。Cormack等用定点突变的技术将包围Ser2Tyr2G ly生色团的20个氨基酸进行突变,得到一系列吸收峰红移的突变体。 收稿日期:2004-03-20 作者简介:田涛 男,硕士。现从事植病生防与植物微生态学方向研究工作。 3 通讯作者 86微生物学杂志 2005年1月第25卷第1期 JOURNAL OF MICROBIOLO GY Jan.2004Vol.25No.1
学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景 姓名周紫嫣学 号014010110349 专业生物工程 指导教师周小萍职 称教师 中国·武汉二○一二年四月
目录 摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II 1 GPF的发现 (1) 2 GFP的结构及发光原理 (1) 2.1 GFP的结构 (1) 2.2 GFP的发光原理 (2) 3 GFP在生物技术中的应用 (2) 3.1 GFP作为报告基因 (2) 3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3) 3.3 GFP用于药物筛选 (3) 3.4 GFP作为生物传感器 (3) 3.5 GFP用于融合抗体 (4) 3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4) 3.7 GFP用于基因表达调控 (4) 4 GFP存在问题及发展前景 (4) 参考文献 (5) 致谢 (5)
生物技术实验报告 姓名：张龙龙 学号：2011506066 班级：11级生技02班
前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水 母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的 1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。 2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。 3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。 二．实验原理 基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。 本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达 三.实验材料及仪器 1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21； 2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。 四.实验内容 4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定： 1)实验试剂：LB培养基；溶液Ⅰ；Tris-HCl（pH=8）；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ； 酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸 DNA 染色剂；1%的琼脂糖凝胶；XhoⅠ(10U/μl)；NdeⅠ（10U/μl）；T 4 lisase。 2)实验步骤： 质粒的提取与鉴定
荧光 一、定义 荧光（fluorescence ）又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 二、原理 光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。 荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。但是，当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。当辐射波长与吸收波长相等时，既是共 荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。 三、荧光蛋白 1、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP ）
在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP 衍生的Emerald（祖母绿），它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L 和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。 下面主要介绍GFP及其衍生型荧光蛋白： （1）来源绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质 Aequorin 的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb 。 （2）性质 GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67 位残基（Ser65-Tyr66-Gly67 ）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP的激发光谱在400nm附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象（Photobleaching ），用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。 （3）野生型 野生型GFP（wild type GFP, wtGFP ）从一开始就引起了人们极大的兴趣，而且被用作新型的简单报告基因及体内标记，但GFP在异源生物体中的表达并非那么简单。例如，研究人员很早就发现需要在较高的温度下孵育才能在细胞或生物体中表达GFP，并且wtGFP在37℃的热稳定性差。这些都阻碍了它在转基因中的应用。这些难题促使人们进一步筛选分离wtGFP的变体。现在，人们已经找到了荧光强度更强且更耐热的变体。 这些变体多数为经突变的脱辅基蛋白，它们可防止高温导致的错误折叠。近年来出现的新型wtGFP基因突变体的激发和发射谱发生了改变，热稳定性和荧光强度得到了提高，GFP报告基因在小鼠中的应用就是以这些变体作为基础的。 （4）增强型绿色荧光蛋白（EGFP）现在，应用最为广泛的是红移变体增强型GFP （EGFP）。诸如EGFP这些红移变体的最大激发峰发生红向移动，大约为490nm，这一波长也恰好是多数分光设备、流式细胞仪及共聚焦显微镜的常用波长。EGFP有两个氨基酸突变，当被蓝光激发时，它发出的荧光要比wtGFP亮30-40 倍。wtGFP和包括EGFP在内的多数变体半衰期长，所以不适合精确追踪表达的减少或损耗。 （5）不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP） 为克服这一问题，人们在1998年构建了不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP）。原理就是将EGFP的cDNA融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase, ODC）基因的C-末端。ODC含有一个PEST序列，这个序列可促进该蛋白在细胞内的降解。虽然，目前这些不稳定变体还没有在小鼠中应用，但这些变体有利于实时追踪基因表达动力学的研究。 （6）增强型黄色荧光蛋白（EYFP）另一种红移变体是增强型黄色荧光蛋白（EYFP），该变体有四个氨基酸突变。在527nm时，EYFP的发射光从绿色变为黄绿色。EYFP荧光的亮度水平与EGFP相当。EYFP 抗酸性差、对卤化物敏感，使它的应用受到限制。在EYFP 基础上改进的突变体mCitrine[21] 和mVenus[22]是目前应用
荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用 Feb 20, 2010No Comments 随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。 我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapid photoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。 ?0?2 荧光标志物 小分子有机染料 小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不断增加之中。不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性，因此多与抗体联用（图1A~C）。?0?2 荧光蛋白 第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻
绿色荧光蛋白(GFP)原核表达情况分析 姓名：韩吉梅学号：2013107001 专业：作物栽培学与耕作学 摘要：将含有绿色荧光基因的重组载体导入大肠杆菌中,经IPTG诱导产生大量融合蛋白,用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量。考马斯亮蓝染色4小时再过夜脱色，观察目的蛋白的分子量大约为31.9kD,与预期值相符。 关键字：绿色荧光蛋白SDS-PAGE 原核表达 1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。由于GFP检测具有高灵敏度,操作简单,无需使用同位素等优点,近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域[1-2]。采用GFP作为标记基因,可直接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有
效的手段[3-4]。同时也正因为其荧光反应不是酶反应,所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质,或者GFP表达频率不高的情况下,GFP的检测可能会产生一些假相,不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP,制备出GFP抗体,利用抗原与抗体之间的特异性,在体外对GFP进行检测,可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题,可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度[5]。 原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。 2 材料与方法 2.1 材料 30%分离胶贮液分离胶缓冲液（Tris-HC l缓冲液pH8.9）浓缩胶贮液浓缩胶缓冲液10%SDS 20%过硫酸铵（AP）染色液脱色液1×SDS上样缓冲液1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液四甲基乙二
绿色荧光蛋白（GFP）的转化表达及免疫印迹检测 王媛0811142 南开大学生命科学学院生物技术08级 一、摘要： 本实验利用酶切方法检测载体中所含GFP片段后，通过转化的方法把绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌进行表达，通过免疫印记杂交方法（western blotting）分析GFP在大肠杆菌中的表达，在分离检测的全过程中（转化平板，细胞裂解，电泳，电转移），均可通过紫外灯清晰地检测到颜色亮丽的绿色荧光蛋白。 关键词：绿色荧光蛋白免疫印记杂交 二、引言： 绿色荧光蛋白是一种源于水母(Aequorea Victoria)等海洋无脊椎动物的蛋白，分子量为26.9KD。GFP的开放阅读框架长度约为740bp，编码238个氨基酸残基。GFP表达后折叠环化，在氧存在下，由65～67位的氨基酸残基环化，形成发色基团，无需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下就能发荧光，荧光性质稳定，可保持10分钟。GFP能在不同的细胞内稳定表达，无种属、组织和位置特异性，对细胞无毒性且检测方法简单，将其作为报告基因已广泛应用于细胞生物学和分子生物学领域。 免疫印记又称蛋白质印记，是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫检测技术。其原理是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极，从而将电泳分离的蛋白从凝胶转移至固相载体上。 三、实验材料、仪器及方法： 3.1 实验材料 3.1.1 菌种 E.coli DH5α(pETH)菌株 E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 E.coli BL21菌株 E.coli BL21 (pETH)菌株E.coli BL21 (pETH-GFP）)菌株 3.1.2 试剂与材料 LB培养基（自己配置灭菌）Amp（100mg/ml）IPTG(10mg/ml) CaCl2(1M) 50*TAE Acry/Bis 贮存液分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液泳动缓冲液（5*）上扬缓冲液（5*）转移缓冲液PBS 1.5% A.P.S 质粒小量提取试剂盒Eco RI限制性内切酶DNA Maker Protein Maker pH试纸 3.1.3 仪器 紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直板式电泳系统、半干式蛋白质印迹电转移系统等。3.2 实验方法 1、配置LB培养基，包括液体、固体培养基后灭菌；分别接种pETH-GFP/DH 5α（LA 4ml）一支，pETH/DH 5α(LA 4ml)一支，BL21（LB 4ml）四支 2、按照protocal,利用tiangen质粒提取试剂盒分别提取pETH-GFP/DH 5α、pETH/DH 5α质粒后，按照酶切体系混匀后，至于37℃温箱酶切2h。 3、制备0.8%琼脂糖凝胶，20ml每块，加入适量EB，按照点样顺序点样后，60V恒压电泳，约0.5~1h.后，凝胶自显影拍照（胶图见后面实验结果） 4、取40μlBL21菌液接种于4mlLB，37℃，200rpm，约2.5h,此时OD600=0.3~0.5，利用氯化钙法制备感受态细胞，制备完成至于冰上备用。 5、铺制平板，1块LB，4块LA，冷却凝固后于37℃倒置烘干备用。其中两块LA平板上面涂布IPTG（100μl+100μl水），正置备用。 6、按照阴性对照、空白对照、GFP基因转化表达、GFP基因的转化四组分别进行转化，涂板，37℃倒置过夜培养，紫外灯下观察，呈绿色荧光的单菌落即为转化子。记录各板菌落数
对绿色荧光蛋白的了解及应用 学院：生命科学学院 姓名：马宗英 年级：2011 学号：2011012923
前言 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一种具有奇妙特性的“光学蛋白质”。这种蛋白质从成分和结构上来说，没有丝毫的特殊性，它的组成单元是20种常见的氨基酸，二级结构也是普通的α螺旋和β片层。但是，这种蛋白质却具有一个非常特别的性质——发出绿色荧光。 【关键词】绿色荧光蛋白生命科学应用 一、绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现的。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。 野生型水母GFP的一级序列已由其cDNA序列推导出来[1]，它至少存在4种同源GFP，但这些突变并不影响GFP的基本功能，只是使突变的GFP具有了新的性质。 生色团是GFP发出荧光的物质基础，也是GFP结构中的一个重要组成部分。GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位的六肽内,65~67位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成的对羟基苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构,构成了GFP生色团的核心[2],见图1。图2为生色团的形成机制。 图1 多管水母中GFP生色团的化学结构和附近序列 图2生色团的形成机制 目前人们对GFP的荧光发光机制并不十分清楚，大家只是认为，GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机
制也有很大差异。 二、GFP在生命科学中的应用 1、作为蛋白质标签（protein tagging） 利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染到合适的细胞中进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内的活体观察。由于GFP只有238个氨基酸，相对较小，所以将其与其它蛋白质融合后并不影响自身的发光功能。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更为详尽的观察的新方法。如细胞分裂、染色体复制和分裂、发育和信号转导等过程的研究均是借助绿色荧光蛋白进行标记。 GFP作为蛋白质标签除用于特定蛋白质的标记定位外，还大量用于各种细胞成分的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。曾经有人将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境监测以及探测信号转导过程等等，以上都可以为传统生物学研究提供新思路和新方法。 2、药物筛选 利用细胞表面标记,通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪,可以分离与纯化特殊类型的细胞;同时还可利用不同颜色GFP衍生物标记相关蛋白质,来观察在单细胞内相互作用的靶细胞,再借助于荧光激活细胞分离器、等聚焦显微镜分离出目的细胞,从而可方便地用于大规模筛选新的药物。 另一方面，利用GFP来进行药物筛选由于必须与迁移的信号分子相偶联的限制，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。 3、用于免疫学 可采用基因工程的方法生产GFP标记抗体，以取代传统的免疫学标记方法，建立一种简便、快速的免疫诊断新技术。相比于一般的标记物，GFP对光稳定、对抗体的标记率可达100%，而且因为GFP是直接与抗体结合，所以无需添加任何底物，可以避免非抗原抗体结合的背景干扰等。 线粒体中表达的GFP是研究比较成功的一种小分子抗体，因为它可以在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构架抗体融合蛋白。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。 在制备抗体时，为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His 序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题，由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体，若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。 除了以上应用之外，绿色荧光蛋白还普遍应用于跟踪观察微生物、发育机理研究、细胞筛选以及生物传感器等许多生命科学研究中。 三、GFP的突变及其应用 GFP作为一种新型标记物，正受到科学界的广泛关注，而且野生型的GFP也不断地在被改造，著名的生物学家钱永健所完成的单点突变(S65T) 显著提高了GFP的光谱性质,其荧
绿色荧光蛋白的研究现状与应用 【摘要】绿色荧光蛋白（GFP）最早发现于水母体中，是一种十分重要的蛋白质。由于其众多的优点，现已在分子生物和细胞生物的研究中应用十分广泛。随着技术的进步和研究的进一步深入，GFP基因也在许多其他方面将发挥着越来越重要的作用。 【关键词】绿色荧光蛋白；生色团；报告基因 2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会授予三位科学家：日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁?查尔非(Martin Chalfie)和美国华裔科学家钱永健(Roger Y．Tsien)诺贝尔化学奖，以表彰他们在绿色荧光蛋白(GFP)研究方面做出的突出贡献。 1 绿色荧光蛋白的理论研究 1.1绿色荧光蛋白的发现 绿色荧光蛋白最早于1962年在维多利亚多管发光水母体内被发现，同时它也存在于水螅和珊瑚等腔肠动物体内。它的内源基团可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光，属于生物发光蛋白。绿色荧光蛋白在水母体内之所以能发光，主要依靠水母素的辅助。水母素和GFP之间能发生了能量转移，在钙的刺激下，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。 1.2绿色荧光蛋白的结构和发光原理 1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA并分析了其一级结构。野生型GFP基因组全长2600bp，由3个外显子和2个内含子组成，编码238个氨基酸，分子量约28kDa。GFP的三维立体结构是由11个β折叠围在四周形成一个中空的圆柱体，1条α折叠贯穿在圆柱体的中间，其中有一段位于65-67位的3个氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）形成的杂环咪唑啉结构组成生色团，位于圆筒中央并附着在α螺旋上。绿色荧光蛋白的发光原理是位于氨基酸第65位的Ser的羧基和67位的Gly的酰基经过亲核反应生成咪唑基，66位的Tyr通过脱氢使芳香团与咪唑基结合，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团发出荧光。GFP的最大和次大的激发波长分别是395nm和475nm。溶液中，395nm激发的荧光发射峰在508nm，375nm激发的荧光发射峰在503nm。 1.3绿色荧光蛋白的优点 绿色荧光蛋白的独特之处即它的优点很多，主要有：荧光反应不需要底物和任何其他辅助因子，只需要在蓝光和紫外光下照射，利用荧光显微镜甚至是直接用肉眼就可以观察，易于检测且灵敏度高；荧光性质稳定，对光漂白有较强的耐受性；无毒害，转化后细胞仍可连续传代；通用性好，无种属特异性；分子量小，易于构建载体；不受假阳性干扰，结果真实可靠；可进行活细胞定时定位观察；易于得到突变体。 2 绿色荧光蛋白的应用 1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP 应用研究的先河。也正是由于绿色荧光蛋白的许多优点，使得其应用十分广泛。 2.1作为报告基因 GFP通常用作报告基因，可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。GFP最显著的优势是荧光反应不需要底物和其他辅助因子。有利必有弊，
知识介绍 绿色荧光蛋白 马金石 (中国科学院化学研究所 北京 100190) 摘 要 绿色荧光蛋白是46多年前从多管水母体内发现的,它可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光。 由于它稳定的结构和光物理性质,又易于在细胞内表达,近些年作为标记物已经被广泛地应用于生命科学领 域。本文简要介绍了水母发光蛋白与绿色荧光蛋白的关系、绿色荧光蛋白的结构、发色团的形成、发光机制、变异体以及它的特点和应用。 关键词 绿色荧光蛋白 基因表达 结构 发色团 生物发光 Green Fluorescent Protein Ma Jinshi (Insti tute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing100190) Abstract Green fluorescent protein(GFP)was discovered46years ago from A equorea V ictoria,it can emit green light under exci tation of blue or UV irradiation.GFP as a marker for gene expression and localization of gene products has been widely used in life sciences for the past years because of its stable structure and photophysical property and easy expression in cells.A brief introduction on the relationship of aequorin and GFP,GFP structure,chromophore formation,and the mechanism of bioluminescence,also the variants,characteri stic and application are presented in this paper. Keywords Green fluorescent protein,Gene expression,Structure,Chromophore,Bioluminescence 由于对绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的发现、机理研究以及利用做出的特殊贡献,瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、马丁 沙尔菲(Martin Chalfie)和美籍华裔化学家钱永健(Roger Y Tsien)。 化学奖评选委员会主席贡纳尔 冯 海伊内和评委莫恩斯 艾伦贝里对绿色荧光蛋白的评价指出,这是当代生物学的重要工具,借助这一 指路标 ,科学家们已经研究出监控脑神经细胞生长过程的方法,这在以前是不可能实现的。他们说,下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出绿色荧光的蛋白质,即GFP。随后,马丁 沙尔菲在利用GFP做生物示踪分子方面做出了贡献;钱永健让科学界更全面地理解GFP的发光机理,对GFP作了改造,通过改变其氨基酸排序合成出了能吸收、发射不同颜色(蓝色、蓝绿色和黄色)光的荧光蛋白,为同时追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。 我国在生命科学领域已经广泛应用GFP,对它的介绍和应用的文章也有很多[1~6]。国外的综述可阅读钱永健和Zimmer的文章,最新的是Shaner等的文章[7~9]。化学界对它的了解可能较少,在此做个简单介绍。 1 生物发光与水母 先从生物发光说起,生物体的发光现象称为生物发光。植物界有细菌植物门的发光细菌和真菌植物门的发光蘑菇,动物界从原生动物到脊椎动物都有,脊椎动物中主要是鱼类。从发光生物的分布来 2008 10 25收稿,2008 11 04接受
■通信作者 E mail :baxiaoge1957@yahoo .com .cn 绿色荧光蛋白GFP 的研究进展及应用 吴沛桥1 ,巴晓革 2■ ,胡海1,赵静 1 (1.南京农业大学生命科学学院,南京210095;2.山东药品食品职业学院,威海264210) 摘要:源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP ),是一种极具应用潜力的标记物,有着 极其广泛的应用前景。我们就GFP 的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述。 关键词:绿色荧光蛋白(GFP );标记物;荧光特性;进展;改进;应用 中图分类号:Q51,503;R318 文献标识码:A 文章编号:1672-6278(2009)01-0083-04 Research Progress and Application of Green Fluorescent Protein WU Peiqiao 1 ,BA Xiaoge 2 ,HU Hai 1 ,ZHAO Jing 1 (1.Nanjing Agricultu ral University ,College of Life Science ,Nanj ing 210095,China ; 2.Shandong Drug and Food V ocatio nal College ,W eihai 264210,China ) A bstract :The green fluorescent protein (GFP )from the jellyfish Aequorea vietoria is a great potential for application of the marker ,has a wide range of applications .The article on the physical and chemical properties ,the fluorescence characteristics ,improvement and application of GFP are reviewed . Key words :Green fluorescent protein ;Marker ;Fluorescence characteristics ;Progress ;Improvement ;Application 1 引 言 发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象,一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光,而栉水母类发射蓝色荧光。绿色荧光蛋白(Green fluorescent pr otein ,GFP )是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962年Shimomura 等 [1] 首先从多管水母(Ae quoria victoria ) 中分离出一种分子量为20kD 的称为A equorin 的蛋白。由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色,因此,人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。随后,人们从不同动物体内提取出了各种不同的GFP ,其中研究较为深入的是来自多管水母科(Aequorleidae )和海紫罗兰科(Renillidae )的GFP ,即 Ae quoria GFP 和Renilla GFP 。 2 GFP 的理化性质,荧光特性及其改进 2.1 GFP 的理化性质 从水母体内分离到的GFP 基因,长达2.6kD ,由 3个外显子组成,分别编码69、98和71个氨基酸。GFP 本身是一种酸性,球状,可溶性天然荧光蛋白。A equoria GFP 分子量约27×103 ,一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽;而Renilla GFP 是分子量为54kD 的同型二聚体。两种GFP 有不同的激发光谱,A equoria GFP 在395nm 具有最高光吸收峰,肩峰为473nm ;Renilla GFP 在498nm 具有强烈的光吸收,肩峰为470nm 。两种GFP 含有相同的 生色团,发射光谱基本相同(λmax =508～509nm )。 GFP 性质极其稳定,易耐受高温处理,甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH <4.0或pH >12.0的条件下用6mol L 盐酸胍处理,一旦恢复中性环境,或去除变性剂,虽然变性的蛋白质并不能完全复性,但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH 变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是,它们在很大的pH 范围内(pH7～12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。Renilla GFP 的稳定性就更为显著。它在上述一系列的变性条件下都很稳定,不易变性。根据Sheen 生物医学工程研究 J ournal of Biomedical Engineering Res earch 2009,28(1):83～86
石河子大学 分子生物学实验结课论文 绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析 学生姓名 学号 专业 年级、班级 指导教师 所在学院 中国·新疆·石河子 2016年1月 绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析
摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。 关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达 1 前言 1.1实验目的 掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。 1.2实验背景 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。同时也正因为其荧光反应不是酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进行检测，可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。 原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种