南开大学
硕士学位论文
利用B基因的过表达或敲除来改变番茄果实中类胡萝卜素的组成
和含量
姓名：赵楠
申请学位级别：硕士
专业：生物化学及分子生物学
指导教师：王宁宁
20040501
利用Ｂ基脚的过表达或敲除米改变番茄果实中娄胡萝ｈ素的组成和含量摘要
摘要
番茄红素和Ｂ胡萝ｈ素是两种重要的类胡萝ｈ素，它们不但在高等植物生长发育中起重要的作用，而且对人体健康和营养也非常重要。有报道显示它们能有效治疗多种慢性疾病，而且大量的摄取还可以降低多种癌症的发病率。改进农作物中类胡萝ｈ素含量和组成，以提高农作物的营养价值成为近年的研究热点。番茄果实及其制品是人类摄取番茄红素的主要来源，也是ｐ胡萝ｈ素的重要来源。因此，本课题致力于利用基因工程技术改进番茄中番茄红素和Ｂ胡萝ｈ素的含量，从而分别获得富含番茄红素和Ｂ胡萝ｈ素的优质番茄。
番茄红素Ｂ一环化酶是番茄果实类胡萝ｈ素合成途径中最后的限速酶，它催化番茄红素转化为Ｂ胡萝ｈ素。当番茄红素Ｂ一环化酶过表达时，番茄中会积累０胡萝ｈ素；而当番茄红素Ｂ一环化酶表达被抑制时，番茄中会积累番茄红素。番茄中番茄红素Ｂ一环化酶是一个多基因家族，现已发现两种编码番茄红素０一环化酶的基因，ＣＲＴ［。一Ｂ和Ｂ。由Ｂ基因编码的有色体特异性的番茄红素０一环化酶在番茄花和果实中特异性表达。
为提高番茄果实中Ｄ胡萝ｈ素的含量，本人根据ＧｅｎＢａｎｋ报道的核酸序列信息设计特异性引物，通过ＰＣＲ方法，从微型番茄Ｍｉｃｒｏ－－Ｔｏｍ核基因组ＤＮＡ中克隆到了Ｂ基因的编码区，将Ｂ基因与植物组成型表达ＣａＭＶ３，＾Ｓ启动子融合，构建成双元载体ｐＬｅＢＺＮ，导入农杆菌，利用农卡ｒ菌介导的遗传转化方法转化到微型番茄Ｍｉｃｒｏ－－Ｔｏｍ中，现通过抗性筛选和ＰＣＲ鉴定，已经筛选出一些转基因植株。转基因植株的花和成熟果实中Ｂ胡萝ｈ素和番茄红素含量有待于进一步检测，同时，还有许多假定的转基因番茄有待于进一步的筛选和鉴定。
另一方面，为了利用ＲＮＡ干扰技术敲除番茄中的Ｂ基因以提高番茄果实中番茄红素的积累，本人从Ｂ基因组中克隆了３２７ｂｐ的ＤＮＡ片段，分别正向和反向插入ＲＮＡｉ表达载体ｐＫＡＮＮＩＢＡＬ的克隆位点，并进一步构建Ｂ基因的双链ＲＮＡｉ表达载体ＬｅＲＮＡｉＺＮ以进行微型番茄的转化，这部分实验正在进行当中。
关键词：番茄红素，Ｂ胡萝ｈ素，Ｂ基因编码的有色体特异性的番茄红素０一环化酶，农杆菌介导的遗传转化，转基因微型番茄Ｍｉｃｒｏ－－Ｔｏｍ
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Ａｂｓｔｒａｃｔ
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前言’
、类胡萝卜素的整：物学特点：
类胡萝卜素是一大类来源于擞异戊二烯的识索，在全部光合生物和部分非光合的生物体中都有合成。在高等植物中，类胡萝ｈ索是光合膜（即摸囊体膜）的必要的组成
部分，爨鸯臻获竞裁，竞保护弱撬氧诧剂兹圣＃蠲。类趣萝｝、豢还是檀耱生长调节物矮脱落酸生物合成的前体，并且能够抑制被叶绿索过量激活而产生的有害活性氧，保护光合作用元件…【２１ｆ３】。类胡萝ｈ素猩防止类脂过辍化反应方面的作用也已被证明【”。此癸，在薅等檀物中，炎葫萝｝豢辫舅一重要功裁是为慕些特殊器富懿蕊、鬃实等提供独特的蒋、橘黄、红等色彩，来吸引动物采蜜、摄食以利于授粉和种子的传播。在这
些器官中，类胡萝ｈ素作为次缎代谢产物（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）在有色体
ｆ
（ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔ）孛会或著裹度获繁。类麓萝》索戆蒸本结构为Ｃ４０类舅茂二燧，耄８个异戊二烯单位组成。类胡萝卜索的多烯烃锻包括１５个共价双键，负责他们专一的吸收光谱和光化学特性啪【６ｌ。
除了在离等植秘生长发育过纛中稠重要｛筝麓驭辩，类麓箩卜素对久体健瘫窥营养也非常鬣要。脊椎动物不合成类胡萝ｈ素，依靠饮食中的类胡萝ｂ素作为合成视黄素类物质的来源，例如视黄醛（主要视觉色素），视蓠醇（维生絮Ａ）和视黄酸（一种控制形态发垒豹物质）。褫黄素类秘霞靛主要蔚俸是§麓萝Ｆ素，融澜维生素Ａ繇，在这令分子的两个末端包古两个Ｂ一紫岁兰酮环。在人饮食中Ｂ胡劳ｈ素缺乏会引起从夜盲症到结膜干燥症和角膜软化症等瘸瘥，最终导数失明。维生索Ａ缺乏还会产生腹泻，呼吸道疾病帮ｄ，ＪＬ精疹等疾病豫撇。入的姣食补充以类胡萝Ｉ索、番茄红豢和§胡萝ｈ素已缀被显示能有效降低与冠心瘸（ＣＨＤ）和浆魃癌症有关的慢性疾病【９１。估计全世界
●
有１．２４亿令孩子缺乏维生素Ａ，因此联合国儿熊基金会提倡避过增加维生索Ａ的摄入，以达到每年防止ｌ箩到４多的孩予中１００万一２００万人的死亡”啦。
由于类胡萝ｈ索对于人体健康的重要意义．改进农作物中类胡萝ｈ索含量和组藏，潋撬裹农馋物戆蘩奏赞篷成为涯年豹疆究热点。虽然类秘萝》素奁攘锈孛夔生臻合成途径在２０世纪６０年代中期已经确定，但懋编码该途饪中酶的基因署日ｅＤＮＡ在最
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近几年内才被分离鉴定。而在类胡萝ｈ素形成基因的克隆方面所取得的巨大进展已经为对植物体中类胡萝ｈ素合成的遗传学操作的研究提供了可能性。
二、类胡萝卜素的生物合成途径：
高等植物的类胡萝ｈ素来源丁类异戊：二烯途径””。乙酰ＣｏＡ通过３羟基一３一甲基戊二酰基ＣｏＡ（ＨＭＧＣｏＡ）和甲羟戊酸（ＭＶＡ）形成异戊烯基焦磷酸（ＩＰＰ），ＩＰＰ是高等植物体内所有类异戊二烯化合物的前体。在链延伸开始之前，ＩＰＰ发生异构形成它的同分异构体——二甲烯丙基焦磷酸（ＤＭＡＰＰ）。ＤＭＡＰＰ和一个ＩＰＰ分子缩合成一个ＣＩＯ化合物——香ＩＪ『基焦磷酸。再加上两个单位ＩＰＰ形成Ｃ２０的二香叶基焦磷酸（ＧＧＰＰ），其他必要的生物合成途径的共同前体。二分子的ＧＧＰＰ尾尾相连形成八氢番茄红素（类胡萝ｈ素的生物合成途径中第一个Ｃ４０的碳水化合物）。八氢番茄红素经历一系列４个去饱和作用依次形成六氢番茄红素、‘一胡萝ｈ素、链孢红素、番茄红素。这些去饱和反应产生一系列碳碳双键，这些双键构成了类胡萝ｈ色素的生色团，把无色的八氢番茄红素改变成粉红色的番茄红素。线形、对称的番茄红素环化形成两种类型（Ｂ环和ｅ环）胡萝ｈ素［６１。番茄红素环化成胡萝ｈ素是类胡萝ｈ素生物合成途径的分支点。Ｂ胡萝ｈ素（有两个１３环）是一个重要的末端产物，是植物中其它几个类胡萝ｈ素。例如叶黄酸的前体。ｎ胡萝ｈ素，（带有一个Ｂ环和一个ｅ环）是叶黄素（绿色植物光合膜里重要的类胡萝ｈ素）的直接前体ｍ１（图１）。
三、１３胡萝卜素和番茄红素的化学特性及生理功能：
Ｂ胡萝ｈ素是含有４０多个碳原子的碳氢化合物，两端各有一个紫罗兰酮环，中间由多条含有多个共轭双键的直链连接。它易溶于脂类和有机溶剂。在小肠和肝脏中，Ｂ胡萝ｈ素在双加氧酶的作用下生成两分子视黄醛，并可进一步氧化成视黄酸或在醇脱氢酶作用下还原成视黄醇（维生素Ａ）¨３¨１４…”。Ｂ胡萝ｈ素含有多个双键，故其化学性质活泼，易被空气氧化，易受紫外线照射而被破化。最新研究成果表明，０一胡萝ｈ素可以减少肺癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、宫颈癌、口腔癌等癌症的发病率，尤其对肺癌效果明显。Ｂ一胡萝ｈ素对癌症的治疗还能起到辅助作用。对心脑血管疾病也有良好的预防效果，可降低这方面疾病的发生率。此外，Ｂ一胡萝ｈ素还用于治疗红细胞生成性原卟啉病、蛔虫病、老年性白内障、多年未能根治的牛皮癣，手术后伤
到旦旦基因鲢遒垂生堂毯睦垂塑翌鲞曲墨塞生差塑蔓Ｅ垂艘塑』蕴塑盘重敖宣口长期不愈合等。Ｂ胡萝ｎ素在医药上主要用于维生素Ａ缺乏症和光敏患者的治疗，对牛皮癣，术后伤口长期难以愈合、慢性咽炎、气管炎等也有很好的疗效。另外，更有研究指出，将抗氧化维生素涂抹在皮肤ｌ，不仅能防止紫外线伤害，还能促进既有
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伤害的修护，使皮肤保持弹性，让新皱纹的增生率减缓２３％，并使原有的皱纹减少８％，因此，Ｂ一胡萝ｈ素也已经逐渐应用在化妆品等新兴市场。
综上所述，随着研究的进一步深入及人民生活水平的提高，Ｂ一胡萝１－素市场潜力巨大。
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在类胡萝ｂ索中，清除单线态氧能力最高的组分为番茄红素，是目前常用的抗氧化剂维生素Ｅ的１００倍。¨ｌ：多类胡萝ｈ素对癌细胞增殖有抑制作用，而最近的研究证明，番茄红素对某些特殊癌细胞的增殖抑制作用比ｎ胡萝ｈ素和Ｂ胡萝ｐ素更强。例如美国流行病学调查Ⅲ１表明番茄红索摄入量的增加使前列腺痛的危险度下降。Ｓｉｌｖｉａ等人在意大利北部进行的调查结果证明：番茄红索高摄入对预防包括口腔癌、食道癌、胃癌、结肠癌及直肠癌等消化道癌有重要意义Ⅲ１。其他肿瘤细胞的体内和体外研究结果也同样支持流行病学的调查结果。例如：Ｌｅｖｙ（１９９５）报道，番舶红素对子宫内膜癌细胞（Ｉｓｈｉｋａｗａ）、乳腺癌细胞（ＭＣＦ７）和肺癌细胞（ＮＣＩ［ｔ２２６）有较强的生长抑制作用［ｉ９１。这些研究成果使得番茄红素成为目前最受关注的类胡萝ｐ素色素之一，是功能食品研究和化妆品与食品添加剂研究的新焦点【ｌ”。
四、利用基因工程技术提高植物中番茄红素和１３胡萝卜素含量的研究进
展：
人体自身不能合成番茄红素，在低等植物中没有发现番茄红素，高等植物体的绿色部分也没有番茄红素的积累。到目前为止，只有番茄、西瓜、红色系列的红萝ｐ和红色葡萄柚等数种植物的花或果实中有较高含量的番茄红素，其中番茄果实及其制品是人类摄取番茄红素的主要来源。人们希望有番茄红素含量丰富的植物被发现和期待培养出高含量的新品种。同时，利用生物工程技术提高类胡萝ｈ素的合成能力，以获得高番茄红素和高Ｂ胡萝ｐ素含量的优质农作物品种的研究工作方兴未艾｜１９】。
虽然近年来伴随类胡萝ｐ素重要生理功能的发现，利用基因工程技术提高农作物类胡萝ｈ素含量的研究成为新热点，但目前成功的相关转基因植物报导不多。起初，由于八氢番茄红素合成酶（ＰＳＹ）和八氢番茄红素去饱和酶（ＰＤＳ）是类胡萝ｈ素合成途径中分支酶，可以将底物不可逆的转向类胡萝ｈ素方向，许多科学家都把目标投向这两个基因。例如：２００１年、２００２年德国科学家分别把类胡萝ｈ素合成关键酶转入水稻获得转基因“金色水稻”。Ｋｕｍａｇａｉ等人通过过表达八氢番茄红素合成酶，使烟草和水稻中的类胡萝ｈ素含量获得提高【２０¨２”。Ｒｏｅｍｅｒ等将细菌中编码八氢番茄红素去饱和酶基因加上ＣａＭＶ３５Ｓ启动予，转入番茄，获得了Ｂ胡萝ｈ素提高的番茄｜２２】。但是，这种情况在转基因植物中虽检测到类胡萝ｂ素的合成，但比天然累积类胡萝ｈ素植物
舞凌登蒸灏箍羹嚣述羹塾鏊塞臻蠹麓整黑釜宝爨塑莲釜麦夔餐拣麴鑫蕊…——…夔蛊中的禽爨鼹低很多”３ｌ；同时，由于向懋茄红素台成支路的流向增大，往往导致冀它以辩发二灞粪｛毫台褥为藩｛李麴台戏途轻蔑耪缺乏，嚣对转基搿撩拣辩生长黢裔遂菠不剃影响，饿安羹缀成型表遮，℃氮番秀蕃红凑合成酶基蠲的转基因番漪巾。茵为与程生长激素纛霉素的合成途径竞争ＧＧＰＰ前体导致植株矮化镣现象，因丽无法应用于农业生产Ⅲ】。壤运趸年，臻蠢鸯熬嚣巍转爨类鞠萝卜索含或途径孛装螽瓣隰逮瓣——簧麓数索彗环化酶。
五、餐藻毵素§环纯夔：
２０００颦苏色刭科警家剃篇誊黻突变俸Ｂｅｔａ黪礤究缭栗褒嬲：备菇荣实舞熬嚣蝣誉茄红豢低积累是由予黪６染色体上肇拷贝虽性蕊阁Ｂ所编码的番茄红豢§一环化酶Ｏｙｃｏｐ鞘，?Ｆｌｅ§～ｃｙｃｌａｓｅ）褒袭达，器致番蒺经素环｛乞菠癍生成叠一馥萝｝￣累＃８。
誉菇缎索Ｂ一环他酶催化植物和蔽藻类细菌中的番茄红豢环化形成§一胡萝ｐ素。浚酶继他线懿罄菇红索分子寒端环能彩藏嚣令§一紫罗酮环。缡褥番菸级素§一环他鹣熬ｃＤＮＡ穗经获蚤麴、熘莘、功黪表达翁大强耔毯孛菱隧戮渤｛。疆突袭鹱，与类麓萝ｈ豢合成途径早期的那魑酶不同，蒋茄红素§一环化酶基因的ｍＲＮＡ水平在暴实成熟瓣“ｂｒｅａｋｅｒ”除段下辫阱ｌ。
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进表达游黼瓤藩ｐ—环化熊
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整予霍滚经豢瑟一琢诧簿基戳转最主镶会器致豢滚象实戏熬潜§一麓箩｝褰懿糗鬃，而下调时会导致褥茄果实成熟时番茄红素的积累，因此珂以通过对这个酶的正向秘受窝稍控遮爨分裂辍鬃蠡～鞠萝Ｉ素葶羹饕菸级豢熬瓣弱。
六、槭物转基因技术；
转麓囡鼓零是臻用入王方法有嚣麓邋霉霪努源蓥鞭或ＤＮＡ簿入受终生熬缀筑中，稳定弱蘩会、装达并遗鼹黟综合技术印ｌ。遂届卡年来，蘧着裔簿禳镪酶爨藏壤棼、缝绂
型臌旦基国数照鸯这基熊睦塞区蠹噩茧基玺嫩塞羹蔓亡鏖鲢壅ｆ盛ｉｇ查冀————————盥分纯帮再生，以及基因重鳃按术发震鹣目鉴成熟，植物转基因技术褥到了ｌ｝；｛蕊广泛豹应用，它对予分子遗传学静研究年嚣植物改良都有非常夔要翡意义。在罄礁疆突土，对于植物基闵的表达与调控、分子元件的签定与利硝等，禧物蒸因转化技术无疑是～个有利的研究工具；在改良农艺性状上，它可阻大大缩短育种年限，加快育种避程；燹为重要的是，植物基因转化打破了物种问基因交流的群限，目的基因的来源极为广泛，不仅可以来自不同的植物物种，还可以来自动物和微生物等ｍｌ。
转基因技术方法
醋前，禧物蒸因转化方法主要有农拇藩法、基因枪法、嚣微注射法、原生矮咎壹接转化法、花粉管通道法等，其中农杆菌介导的遗传转化占据着不可替代静优势，应用最为广泛。农秆菌法是一种天然的植物转蘩因方法。农杆菌可通过植物细胞的伤日感染植物，并将其Ｔｉ质粒上的Ｔ－ＤＮＡ片段随机整合到植物宿主的染色体基闺组中。利用这一特性可以将目的基因插入Ｔ－ＤＮＡ片段中，再通过Ｔｉ质粒而导入宿主植物细煦中。孩方法的优点是：
［１］转化梳理清楚；
［２］可转移较大的ＤＮＡ片段，且能够保证插入片段的宪整性；
［３］目的基因多是单拷贝或低拷贝插入，在一定程度～Ｅ可避免转录后基因沉默的发生；［４］转移片段优先插入转浓活性区域，转化效率高；
［５］转化蔗的遗传稳定性离：
［６］可壹接爆不冠豹攘物组织进行基戮转移；
［７］不需舔生蕨体培养再生檀株的壤券技术，阂焉可缩短获褥转慕毽褴株的周期；
Ｃ８］不需要昂贵的仪器设备。
但此方法应用的前提条件是受体植物材料必须对农杆菌敏感，故它主要应用于双予叶撞物和少数单予时摭物的研究中，另妯此法涉及的技术髓广、操作要求离且组织培养比较繁琰印｝。进入２０世纪∞筝｛弋以后，随着人们对农枵蕊镘染枫划的避一步了解和转化技术的不断菠遴，毹括选取合邋酶外植体、采瑷广谱农杆蘸蔼抹、应用更奔效的启动子和筛选剂如潮霉素等等，迸～步提高了农秆蔺介导的遗传转仡静频率，扩
型量曼筮鞠趋毽垂姿奠蘸黪逛逮童蚤堑墨煞斑燕茧蔓￡蠢曲燮撼塑盒量——蓝奁大了其应用的范围∞ｌ。
本窝验正是在照基础上，参考和改遥前入的农秆菌介导的番茄遗霞转化方法，建立农杆菌介导的微型番茄子叫‘遗传转化体系，将目的基因转化到受体植株Ｍｉｃｒｏ—Ｔｏｍ中。
七、ＲＮＡｉ技术：
ＲＮＡ干扰撬割ｒＲＮＡ干扰印所谓的ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ），是研究人员针对转泵焉水平上静基因沉默现象提出的一种新的解释机制。它的分子生物学基础如下：当转化的外源基因或侵入植物圣搴蛇ＲＮＡ痿毒与檀憋内源基因舆鸯较高网源性对，二者的ｍＲＮＡ之闻能
够进行配对，形成二级结构。这｝薅，植物体内一种称为Ｄｉｃｅｒ韵酶能够谈剐这种二缓结构，行使双链外切酶活性，将全长ｄｓＲＮＡ降解成２１“２５ｂｐ长的短ｄｓＲＮＡ，短ｄｓＲＮＡ与Ｄｉｃｅｒ蛋自结会，形成一秘被穗为于裁缝小孩蛋皇复台传（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｓｉＲＮＰ）。ＳｉＲＮＰ中的短ｄｓＲＮＡ通过与冀同种的全长ｍＲＮＡ之间的同源序列进行配对，Ｄｉｃｅｒ再次行使其核酸酶活性，将全长ｍＲＮＡ切断，从而达到抑制ｍＲＮＡ髓浮斡星的瑚１。Ｗｅ—Ｓｃｈａｒｆ簿的实验支持了以上鼹点。Ｗｅ—Ｓｃｈａｒｆ遴过隧梃诱交的方法褥到了一株不发生ＲＮＡ介等的基因沉默的菌株，并从中克隆到了一条相关基因
ｍｕｔ一良研究发现ｍｕｔ－６具有ＲＮＡ解旋酶的活性。相反，如果将体外台成的ｄｓＲＮｈ大
●
藿转入蟪物体内，粼霹醴诱导签囡ｌ况默｛３０ｌｆ３１１。
经过长期研究，人们逐渐总结了ＲＮＡ干扰的几个重要特征Ｉ”】１３”：（１）发生在ｍＲＮＡ的水平上。通过对目的ＲＮＡ的降鳃达到基因沉默。（２）特辩性高。由于ＲＮＡ干扰由２ｔ、２５ｂｐ豹核巷酸滓戮介罨，蜃以痒剜静特髯缝稷商。挺瓣貉计算，锩懿率只有～吾亿分之…。（３）ＲＮＡ干扰具有传递性。ＰＴＧＳ的机制不但在被外源基因或瘸毒侵入的部位产生，丽且还可以通过胞问连丝传递到植物体的其他部位。研究发现，将一株能够表达ＧＵＳ蘩因豹转鏊鞠黄蕊镑替簸接在翼寿ＧＵＳ纂因淀默鹣旗本上，秘萤魄其有了ＧＵＳ基因沉默的特征。
Ｒ凇于扰磅究豹应鼹
ＲＮＡ干扰具有抗痫毒、抑制转鹰子活动、防止自私基因皴度扩增等作用。对于生
型盈旦垫瑚艘照垂堕煎礁隧逛墼壁受蒴基粪生遴塑蔓基塞照照旗垒！盒量———翦奁物体发商和基因调控也具有重要意义。可以利辩ｌＲＮＡ干扰技术产生抗病毒的植株和转基霞援貔，使之产生稳应予疯毒繁薅关疆萋困熬ｄｓＲＮＡ，觚露羝藐瘸毒游入侵。
利闱ＲＮＡ干扰技术可以产生多基因突变，这在传统的遗传学足难以寰现的。ＲＮＡ二Ｆ挽可以剥焉一个基困家族的多令基因具有阑源序列这一特性，设割—“段傈守区的ｄｓＲＮＡｉ警入体内，可珏同时抑制多个具有嗣滚序列的基禹。
高效的旗因静默的载体
２００１年，骚究入员发现，｜遥曩三物体内导入麓够在其中产生鲁奏互｛｝（ｈａｉｒｐｉｎ）的ＲＮＡ避样结构的构建，能够有效地提高基因静默的效率哪胁Ｈ３６１。在此基础上，Ｗｅｓｌｅｙ等人设计出高效的基因静默的载体ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ和ｐＫＡＮＮＩＢＡＬ‘”１。本人的实验中使用了载讳ｐＫＡＮＮＩＢＡＬ（嚣季芎辩方法）。
八、课题意义：
邋｛建阻甄特殊代瀣途径中关键酶基因的表达采获褥毫鹣溪农俸耪薪赫耱，已经成为现代农业生物技术的有力手段，并在植物各种基因的功能研究中有广泛庶用即】ｆ３８】。但以彼的研究工作多浓蹋反义ＲＮＡ按术，常发生无效或非专一性抑制等现象。ＲＮＡｉ技零是邋两年篌旗双镰ＲＮＡ于莸鏊戮表达鼢褒象藤逐步发震积戚熬起来酌、一静薪酌辫制特殊媾因在有机体内的表达和功能的分子生物学方法。它比反义ＲＮＡ按术更简便、商效，褥且具有更麓的专一性，殿此已经迅速发展为特殊基因乃至基因缀功熊研究的先进手段之一渊【“。
如前文所述，番茄红素和胡萝ｈ素都对人粪的健康十分有益，但在其盛体功能上又有蓑器，焉量它们在天然攘物中含量套隈，不舅获雩罨。
因此，本课题中本人从Ｍｉｃｒｏ－－Ｔｏｍ中克降了Ｂ基因的编码区，一方面使其与一个３５Ｓ扁动子相连，构建Ｂ基因缌成型表达载体，从而获得§胡萝ｂ索蕊寓集的转基因貔震器蕊；另～方箍采箱ＲＮＡ予撬技术（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ），鞠建双链ＲＮＡ表达载体（ｄｏｕｂｌｅ—ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｃｏｎｓｔｒｕｃｔ），转化Ｍｉｃｒｏ—Ｔｏｍ植株，以此敲除Ｂ基因在Ｍｉｃｒｏ～Ｔｏｍ中的表达，通过阻断番茄红豢的环化反应来终止以番茄红素为底耪整续迸行的代诱｜途径，以获褥蚕麓蠡素裹耋集静ＲＮＡｉ转基因侥覆番蓬。
到目点基凼盟过塞选亟越隧墨堕变蚤监塞主羞塑蔓Ｌ塞曲塑盥塑宣量塞墼挝抖皇直选
一、实验材料
１．植物材料
新型模式植物Ｍｉｃｒｏ—Ｔｏｍ
实验材料与方法
微型番茄（Ｌｙｃｏｐｏｒｓｉｅｏｎｅｓｃｕｄｅｎｔｕｒｎ）（称作Ｍｉｃｒｏ—Ｔｏｍ）是一种新型模式植物，
其生命周期短，从播种到果实成熟只需７０一９０天，且生长密度高，约１３５７株／平方米：
农杆菌介导的Ｍｉｃｒｏ—Ｔｏｍ子叶转化频率高，约达８０％；Ｍｉｃｒｏ—Ｔｏｍ中只有两个主要基
因（ｄｗａｒｆｇｅｎｅａｎｄｍｉｎｉａｔｕｒｅｇｅｎｅ）与普通番茄不同。上述特征大大方便了番茄
的突变和转基因，为获取番茄饱和突变体提供了新的前景，且使基于转座技术的基因
标签、基因捕获和基因敲除的应用更为便利。Ｍｉｃｒｏ—Ｔｏｍ的生长条件为：光周期，１６ｈｒ
光／Ｓｈｒ暗；温度，２５－－＋＿ＩｏＣ，其转基因方法按Ｍｅｉｓｓｎｅｒ等（１９９７）进行…】。
２．质粒与菌株
菌株：Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ：Ａｇｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ［，ＢＡ４４０４
双元载体：ｐＣＡＭＢＩＡｌ３０１
ＲＮＡｉ载体：ｐＫＡＮＮＩＢＡＬ
图２双元载体ｐＣＡＭＢＩＡｌ３０１环形图谱
Ｆｉｇ．２ｍａｐｏｆｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒ
ｐＣＡＭＢＩＡｌ３０Ｉ
型旦Ｂ基因曲过塞生煎熊睦盎魏壅鲎地墨塞生耋塑蔓￡耋鲢塑盛塑盘量塞墅丝趔生直藿
二、实验方法：１．目的基因的获得图３ＲＮＡｉ载体ｐＫＡＮＮＩＢＡＬ环形图谱Ｆｉｇ．３ｍａｐｏｆＲＮＡｉｖｅｃｔｏｒｐＫＡＮＮＩＢＡＬ
１．１特异引物的设计
１．１．１组成型表达Ｂ基因的双元载体ｐＬｅＢＺＮ的引物设计
根据ＧｅｎＢａｎｋ已发表的Ｂ基因（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ—ＡＦ２５—４７９３）ＤＮＡ的序列信息设计特异引物，在５’端分别带入Ｂｇｌｌｌ年ＮＢｓｔＥＩＩ酶切位点：
ＬｅＢ一１：５’一Ａ堡ＡＴ￡！ＧＡＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣ一３’（十）
’
ＢｇｌＩＩ
ＬｅＢ一２：５’一ＧＧＴｃ垒ｃｃＴＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＣＴＡＧＡ一３’（一）
’
由于此基因序列内无内含子，故可直接以其核基因组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增
此基因，全长为１．５ｋｂ。
型旦！墨ｌ翌的遘盘生煎默睦塞堕变量芷墨塞虫耋塑堕＆塞曲塑盛塑盒量塞坠挝挝生立选１．４．２测序
经酶切和ＰＣＲ鉴定，将与预期结果相符的阳性克隆进行测序。
２．双元载体的构建
２．１组成型表达Ｂ基因的双元载体的构建及转化子的检测
分别提取大肠杆菌中的ｐＭＤ—Ｂ和ｐＣＡＭＢＴＡｌ３０１质粒。通过ＢｇｌＩＩ和ＢｓｔＥＩＩ两种限制性内切酶分别双酶切这两个质粒。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收ｐＣＡＭＢＩＡｌ３０１质粒的大片段（９．８ｋｂ）和目的基因片段（１＿５ｋｂ）。回收的片段经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ。在含５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＬＢ培养基平板上筛选转化菌株。将此构建的质粒命名为ｐＬｅＢＺＮ（图４）。
挑单菌落接菌于【。Ｂ液体培养基中培养，提取质粒。对转化子进行酶切鉴定和ＰＣＲ鉴定。采用ＢｇｌＩＩ和ＢｓｔＥＩＩ双酶切进行检测。
图４构建双元载体ｐＬｅＢＺＮ质粒酌流程图
为方便ＰＣＲ检测阳性克隆、测序及最终利用ＰＣＲ方法检测可能的转化苗，设计一条新的引物用于检测。在距ｐＣＡＭＢＩＡｌ３０１质粒Ｂｇｌ１１切点上游２４０ｂｐ的３５Ｓ启动子区
剥墁Ｂ垂圆曲照垂鲨亟墅睦盘重变萱些墨塞主差－窭蔓Ｅ耋曲塑盛卸盒爨————塞坠挝挝与友鎏内设计一条引物３５Ｓ—ｌ：５一ＧＣＧＡＴＡＡＡＧＧＡ从ＧＧＣＣＡＴＣＧ一３。
对ｐＬｅＢＺＮ转化子的ＰＣＲ检测以质粒为模板，以３５５一ｌ及ＬｅＢ一２为引物进行。经酶切和ＰＣＲ鉴定，将与预期结果相符的阳性克隆ｐＬｅＢＺＮ测序，测序引物为ＺＮＣｌ。ＺＮｃ１：５’——ＡＴＧＡＴＣＡＣＧＴＣＧＡＡＴＴＧＡ（；ＣＣＣ——３’
２．２ＲＮＡｉ表达载体ｐＬｅＲＮＡｉＺＮ的构建及转化子的检测
＼忆；。
图５构建双元载体ｐＬｅＲＮＡｉＺＮ质粒的流程图
ｌｒ往ｒｏｎ
分别提取大肠杆菌中ＲＮＡｉ一１的和ｐＫＡＮＮＩＢＡＬ质粒。通过ＢａｍＨＩ和ＣｌａＩ两种限制性内切酶分别双酶切这两个质粒。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收ｐＫＡＮＮＩＢＡＬ质粒的大片段（６ｋｂ）和目的基因片段（３２７ｂｐ）。回收的片段经Ｔ４ＤＮＡ连接煳～
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塑｛旦ｇ基固的遵垂生堂越瞳墨塑堑妥董星垂虫耋塑蔓￡塞盟塑盛塑笪量塞殓挝整｝量友挂酶连接，转化大肠杆菌ＤＨ５Ｑ。在含５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＬＢ培养基平板上筛选转化菌株。将此质粒命名为ｐＫ—ＲＮＡｉｌ。
继续分别提取质粒ｐＫ—ＲＮＡｉ１和ｐＭＤＲＮＡｉ２。通过ＫｐｎＩ和Ｘｈｏ］两种限制性内切酶分别双酶切这两个质粒。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收ｐＫＡＮＮＩＢＡＩ。质粒的大片段（６ｋｂ）和目的基因片段（３２７ｂｐ）。同收的片段经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＤＨ５ｎ。在含５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＬＢ培养基平板上筛选转化菌株。最终获得ＲＮＡｉ载体质粒ｐＬｅＲＮＡｉＺＮ（图５）。
挑单菌落接菌于ＬＢ液体培养基中培养，提取质粒。对转化子进行酶切鉴定和ＰＣＲ鉴定。采用ＢａｍＨＩ和Ｃｌａｌ以及Ｋｐｎｌ和Ｘｈｏｌ两对酶进行双酶切检测。
３．农杆菌的转化及阳性克隆的筛选和鉴定
将经过鉴定的重组质粒ｐＬｅＢＺＮ转化到农杆菌ＡｇｒｏＬＢＡ４４０４菌株中，然后在含有５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素及２５ｍｇ／Ｌ链霉素的ＹＥＰ固体培养基上筛选转化菌株，提取质粒并酶切和ＰＣＲ鉴定阳性克隆，将其分别命名为Ａｇｒｏ—Ｂ。
４．Ｍｉｃｒｏ—Ｔｏｍ的转化和转基因植株的筛选和检测
４．１Ｍｉｃｒｏ—Ｔｏｍ的转化
４．１．１培养无菌苗：用消毒液消毒ＭｉｃｒｏＴｏｍ种子，种在１／２ＭＳ培养基上：
４．１＿２菌种活化：
（１）将农杆菌Ａｇｒｏ—Ｂ接种于３ｍＬ含５０ｍｇ／ｌ。卡那霉素及２５ｍｇ／Ｌ链霉素的ＹＥＰ液体培养基中，２８。Ｃ下振荡培养１天；
（２）取ＩｍＬ菌液加至２０ｍＬ新鲜液体ＹＥＰ培养基中，继续振荡培养至适宜的０．Ｄ。，值（见结果部分）：
（３）将菌液转入ＳＯｍＬ离心管中，３０００ｒｐｍ，离心２０分钟收集菌体：
（４）用液体Ｍｓ培养基（含ＩＯＣｌ叫乙酰丁香酮，Ａｓ）按照１：１（ｖ／ｖ）重新悬浮农杆菌菌体，此菌液准备用来侵染植物。
４．１．３侵染菌液：取８天苗龄的Ｍｉｃｒｏ—Ｔｏｍ幼苗，切除子叶端部，并将每片子叶切成
型耍Ｉ菱躐艘蕉垂鲨壁蘧鲶艇壁变量蕉墨基璺簇秘蔓Ｅ蠢敛塑溅蛰盒量．一一塞熊丝整蔓直鎏两块，置于已经备好的菌淑中侵染数分钟；
４。１．４共培养：欷掰＃于片，掰无菌滤鬃壤于，时西朝下敖至予暗培莠誉（ＭＳ＋Ｂ。ｖｉｔａｍＪｎｓ＋ｌｍｇ／ＬＩＡＡ＋ｉｍｇ／Ｌｚｅａｔｉｎ＋ｌＯＯｉｘｂｔＡＳ）上，暗培养两天；４．１．５脱菌培养：将外攮钵移至脱菌培养基（ＭＳ＋Ｂｓ｝￣ｌｍｇ／ｌ。ｌＡＡ＋ｌｍｇ／Ｌｚｅａｔｉｎ＋４００ｍｇ／ＬＣｅｆ）上，光下培养３天；
４．１．６诱导生芽：将外植体移至不定芽分化培养基（Ｍｓ＋适当浓度的潮霉索）中，每隔两嬲继代一次；
４．１．７诱导生根：当褥生芽长至约２厘米高时，将其转入不定根分亿培养基（Ｍｓ＋适当浓度的潮霉素）中，每隔两周继代一次；
４。Ｉ。８将叟校较努豹麓株移入±中，继续蛰莽至开蕊、缝实。
４．２转化植株的检测
４，２，１转化Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ撼拣躯ＰＣＲ梭测：
从融转入土中的每一棵Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ植株分别剪取一小片叶片，抽取核ＤＮＡ，进行ＰＣＲ检测，确定目的片段是否已整合到植物基因组中（以未做转化的野生溅Ｍｉｃｒｏ—Ｔｏｍ棱ＤＮＡ凳模板，终为受对照；露时以Ｅ－ｃｏｌｉｐｌ。ｅＢ烈囊粒炎模蔽，终鸯菠瓣爨）ｅ检测引物为：３５Ｓ～１＆ＬｅＢ一２。
实验结果
１。组成璀表达Ｂ基因的双元裁体ｐＬｅＢＺＮ的构建
１．ｔ目的基因的ＰｅＲ扩增
以Ｍｉｃｒｏ—Ｔｏｍ核基因组ＤＮＡ为模扳，以ｌ。ｅＢ—ｌ和ＬｅＢ～２为引物，根掘所设计的反应条｛孛遴行ＰＣＲ反应，扩增产物缓豫鼹耱凝蔽电泳分褥，与ＤＮＡ分子量酝ａｒｋｅｒＤＬ２，０００对比发现，扩增出约１．５ｋｂ的产物。与预期大小完全一致（见图６）。
Ｍｌ
图６８基瘸ＰＣＲ产物豹璩§鹭糖凝胶堍泳强谣
Ｆｉｇ，６Ｅｌｅｃｔｒｏ订ｈｏｒｅｓｉｓｍａｐｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｆｏｒＢｇｅｎｅ
［ＬａｎｅＭ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ（２０００ｂｐ：１０００ｂｐ：７５０ｂｐ：５００ｂｐ：２５０ｂｐ：ｌＯＯｂｐ）
Ｌａｎｅ１：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｆｏｒＢｇｅｎｅ（１．５ｋｂ）］
１。２Ｐｅｌｔ产携豹Ｔ／Ａ悫隆
将获得的ＰＣＲ产物通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连按到ｐＭＤｌ８～Ｔ泼体上，连接产物转化到大肠枉蘩ＤＨ５ａ驰感受态细胞中，邋过蓝童掰逸挑选阳蛙竞隆。将获褥的阳性克隆命名为ｐＭＤ—Ｂ。
６