第23章病毒感染的实验诊断
一、教学大纲要求
（1）标本的采集、处理与运送注意事项
（2）病毒形态学检查方法
（3）病毒的分离与鉴定程序及方法
（4）病毒感染的快速诊断方法
二、教材内容精要
（一）标本的采集、处理与运送
根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。
（二）病毒形态学检查
1.光学显微镜
仅用于大病毒颗粒（如痘类病毒）和病毒包涵体的检查。
2.电子显微镜检查法
（1）电镜直接检查法
某些病毒感染的早期，临床标本中就可出现病毒颗粒。标本经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染，电镜下直接观察，可发现病毒颗粒，获得诊断。
（2）免疫电镜检查法
将病毒标本制成悬液，加入特异性抗体、混匀，使标本中的病毒颗粒凝集成团，再用电镜观察，可提高病毒的检测率。本法比电镜直接检查法更特异，更敏感。
3.超过滤法
用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。
4.超速离心法
根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。可用超速离心法测得病毒的沉降系数（S），借以计算病毒的大小。
5.X线晶体衍射法
根据X线衍射图谱，用数学方式处理来研究病毒结构亚单位和分子结构等。但标本必须为结晶，
可用于无包膜病毒的研究。
（三）病毒的分离与鉴定
1.病毒分离培养
实验室分离培养病毒的方法主要有三种：动物接种、鸡胚接种和组织培养。根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同，可分为：原代和次代细胞培养，二倍体细胞培养，传代细胞培养。
2.病毒在培养细胞中增殖的指标
（1）细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。
（2）红细胞吸附
（3）干扰现象
（4）细胞代谢的改变
3.新分离病毒的鉴定
（1）病毒核酸类型的测定用RNA酶及DNA酶可鉴定出病毒核酸的类型。另外，DNA病毒受5-氟尿嘧啶的抑制，而RNA病毒不受影响。用此方法亦可区分DNA与RNA病毒。
（2）理化性状的检测对脂溶剂的敏感性：有包膜的病毒（如正粘病毒、副粘病毒、逆转录病毒等）含有脂类，对乙醚、氯仿和胆盐等脂溶剂均敏感，经作用后病毒失去感染性，而无包膜的病毒对脂溶剂有抵抗。耐酸性试验：肠道病毒与鼻病毒均属于小RNA病毒科，均耐乙醚。但前者可耐pH3，而后者在pH3~5环境中很快被灭活，故可将两者相区别。
（3）血清学鉴定病毒型别的最后鉴定必须依靠血清学方法。将分离的病毒与已知的诊断血清作各种试验进行鉴定。
（四）病毒的血清学检测
血清学试验是诊断病毒感染和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的主要方法之一。血清学试验的方法很多，最常用的如中和试验、补体结合试验、血凝及血凝抑制试验等。
1.中和试验
中和试验是病毒型特异性反应，是指应用特异性抗体中和病毒的致病性或感染性的试验。将病人血清与一定量的已知病毒混合，作用一定时间后，接种于实验动物、鸡胚或细胞培养中，观察病毒的致病作用是否被中和而不出现感染指标。以此判断病人血清中有无特异性抗体存在。本法特异性高，但操作比较复杂，费时。主要用于鉴定病毒；分析病毒抗原的性质；测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果；测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病。
2.补体结合试验
特异性病毒抗原和相应的抗体结合形成免疫复合物时能结合补体。本实验操作繁琐，特异性较
中和试验低，但补体结合抗体出现早，消退快，有助于早期诊断。主要用于流行病学调查；病毒病的诊断；疫苗使用后人群抗体情况调查；检测病毒抗原；鉴定病毒属。
3.血凝及血凝抑制试验
血凝试验和血凝抑制试验为型特异性反应，其原理为某些病毒或病毒血凝素能选择性地引起个别种类的哺乳动物的红细胞发生凝集，当加入相应的特异性抗体时，这种凝集现象即被抑制。主要用途为发现与鉴定病毒；诊断病毒病；病毒分型；免疫机体后抗体效价的测定；浓缩病毒；病毒抗原分析（某些病毒可用交叉血凝抑制试验分析抗原成分）；病毒株变异相的测定等。
4.凝胶免疫扩散试验
以半固体琼脂糖为支架所进行的抗原、抗体的沉淀反应。本方法简便，特异性与敏感性均较高，而且衍生出对流免疫电泳和火箭电泳等更为敏感的检测技术。此法在病毒性疾病中主要用于诊断HBV 与乙型脑炎病毒等感染。
（五）病毒的分子生物学检测
1.分子杂交技术
分子杂交是利用放射性核素或非放射性核素标记的已知特异性核酸片段作为探针，检测标本中与探针有相同序列的目的核酸，常用的杂交方法：
（1）斑点杂交
（2）固相杂交技术
（3）原位分子杂交
（4）Sorthern印迹
（5）Northern印迹
（6）分支DNA技术
2.聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）
PCR是一种选择性体外酶促扩增DNA或RNA片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。常用技术有：
（1）巢式PCR
（2）半巢式PCR
（3）逆转录PCR（RT-PCR）
（4）多重PCR
（5）原位PCR
（6）定量PCR
(7)RNA捕获
(8)免疫PCR
3.凝胶电泳技术
核酸和蛋白质等生物大分子的分子量大小、所带电荷等存在差异，使其在电场中表现为泳动速度的不同，在介质中形成各自不同的条带，而使其分离开。凝胶电泳技术是常用的分离鉴定核酸、蛋白质等生物大分子方法之一，可直接用于如轮状病毒、呼肠病毒等病毒的检测和病毒PCR产物检测等。凝胶电泳根据所用载体不同又可分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等，根据电泳槽不同可分为圆盘电泳、垂直板电泳和水平电泳，前者已很少被使用。
（1）琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖作载体，常采用水平电泳分离、鉴定核酸。
（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳用于蛋白质和分子量在1kb以下核酸分离鉴定，分连续和不连续电泳。
（六）病毒感染的快速诊断
1.形态学检查
2.病毒抗原的检测
（1）免疫荧光技术
直接对标本或接种的组织培养进行早期抗原检测，可用标记荧光素的特异抗体直接从标本中检查病毒抗原（直接法），也可用未经标记的特异抗体先与标本中可能存在的抗原结合，然后加入荧光素标记的抗特异性抗体的免疫血清（一般为IgG型的抗体），使荧光抗体与特异性抗体结合，以检测标本中已与特异抗体结合的病毒抗原（间接法）。此法检测迅速、特异性高，但需有荧光抗体及荧光显微镜等设备。
（2）固相放射免疫测定
首先将特异性抗体吸附到微量反应板孔底部的塑胶小球或其他固相系统上，与待检的病毒抗原结合，洗涤后再加标记放射性同位素的特异性抗体，做成标记复合物，用γ-计算器检测。
（3）酶免疫技术
此法可检测多种病毒及其抗体，主要是酶免疫组化法和酶联免疫吸附试验法（ELISA）。前者又称免疫过氧化物酶染色，用酶标记的特异性抗体直接检测标本中的抗原，此法不仅能定性抗原，并能在显微镜下观察其定位和分布情况；ELISA是用酶标记的抗体或抗抗体来检测标本的病毒抗原或血清抗体。酶标抗体可被待检的抗原抗体固定在微孔反应板上，当加入的酶作用底物后则出现底物被酶分解的显色反应。此法克服了固相免疫法的缺点，其试剂安全、易保存、操作简便，而且其敏感性与特异性均与固相放免法相似。
（4）其他技术
如发光免疫分析技术、胶体金标记的免疫层析技术等。
3.早期抗体检测
检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染，特别是IgM抗体的存在对证实孕妇感染风疹病毒尤为重要。目前IF法、固相放免法和ELISA法都已应用于IgM的检测，但应注意类风湿因子（IgM）的干扰。
4.病毒核酸检测
第23章病毒感染的实验诊断 一、教学大纲要求 （1）标本的采集、处理与运送注意事项 （2）病毒形态学检查方法 （3）病毒的分离与鉴定程序及方法 （4）病毒感染的快速诊断方法 二、教材内容精要 （一）标本的采集、处理与运送 根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。 （二）病毒形态学检查 1.光学显微镜 仅用于大病毒颗粒（如痘类病毒）和病毒包涵体的检查。 2.电子显微镜检查法 （1）电镜直接检查法 某些病毒感染的早期，临床标本中就可出现病毒颗粒。标本经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染，电镜下直接观察，可发现病毒颗粒，获得诊断。 （2）免疫电镜检查法 将病毒标本制成悬液，加入特异性抗体、混匀，使标本中的病毒颗粒凝集成团，再用电镜观察，可提高病毒的检测率。本法比电镜直接检查法更特异，更敏感。 3.超过滤法 用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。 4.超速离心法 根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。可用超速离心法测得病毒的沉降系数（S），借以计算病毒的大小。 5.X线晶体衍射法 根据X线衍射图谱，用数学方式处理来研究病毒结构亚单位和分子结构等。但标本必须为结晶，
可用于无包膜病毒的研究。 （三）病毒的分离与鉴定 1.病毒分离培养 实验室分离培养病毒的方法主要有三种：动物接种、鸡胚接种和组织培养。根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同，可分为：原代和次代细胞培养，二倍体细胞培养，传代细胞培养。 2.病毒在培养细胞中增殖的指标 （1）细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。 （2）红细胞吸附 （3）干扰现象 （4）细胞代谢的改变 3.新分离病毒的鉴定 （1）病毒核酸类型的测定用RNA酶及DNA酶可鉴定出病毒核酸的类型。另外，DNA病毒受5-氟尿嘧啶的抑制，而RNA病毒不受影响。用此方法亦可区分DNA与RNA病毒。 （2）理化性状的检测对脂溶剂的敏感性：有包膜的病毒（如正粘病毒、副粘病毒、逆转录病毒等）含有脂类，对乙醚、氯仿和胆盐等脂溶剂均敏感，经作用后病毒失去感染性，而无包膜的病毒对脂溶剂有抵抗。耐酸性试验：肠道病毒与鼻病毒均属于小RNA病毒科，均耐乙醚。但前者可耐pH3，而后者在pH3~5环境中很快被灭活，故可将两者相区别。 （3）血清学鉴定病毒型别的最后鉴定必须依靠血清学方法。将分离的病毒与已知的诊断血清作各种试验进行鉴定。 （四）病毒的血清学检测 血清学试验是诊断病毒感染和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的主要方法之一。血清学试验的方法很多，最常用的如中和试验、补体结合试验、血凝及血凝抑制试验等。 1.中和试验 中和试验是病毒型特异性反应，是指应用特异性抗体中和病毒的致病性或感染性的试验。将病人血清与一定量的已知病毒混合，作用一定时间后，接种于实验动物、鸡胚或细胞培养中，观察病毒的致病作用是否被中和而不出现感染指标。以此判断病人血清中有无特异性抗体存在。本法特异性高，但操作比较复杂，费时。主要用于鉴定病毒；分析病毒抗原的性质；测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果；测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病。 2.补体结合试验 特异性病毒抗原和相应的抗体结合形成免疫复合物时能结合补体。本实验操作繁琐，特异性较
病毒感染细胞实验整体 流程及原理 Standardization of sany group #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理
病毒感染实验诊断 1. （1）一般原则是特异敏感、快速和简便。首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒。 （2）然后根据可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，确定实验诊断方法。 2. （1）对潜伏期短，发病时尚无抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。 （2）对潜伏期超过十天的感染，可检测特异性的IgM抗体来进行早期快速诊断，及区别初次和再次感染。 （3）对可在体内形成持续感染或潜伏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG 抗体有无4倍以上升高，或直接检测病毒核酸。 （4）对原因不明或有新病毒感染时，应采集标本进行病毒分离，同时应采取双份血清以确认分离的病毒为病原体。 （5）对同一症状可有多种病毒引起的情况，应同时检测几种相关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体。 （6）对由多个型别组成的病毒可测定它们的共同抗原。 第一节标本采集与运送 一、标本的采集 1. 采样时间：尽可能在发病的初期，急性期或患者人院的当天进行。 2. 标本种类的选择：根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。 常见分离病毒标本的选择： 3．常见标本的采集方法 (1) 血液：以无菌取抗凝血10ml。抗凝选用100n／ml肝素钠。用于分离CMV、HSV，、黄病毒、EBV、HIV-1及新生儿肠道病毒。 (2) 脑脊液：以无菌取脑脊液1～2ml，冰浴立即送检。在4℃可存放72h。用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。 (3) 宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm停留5秒取出，冰浴立即送检。用于分离HSV、CMV。 (4) 粪便标本：取2～4ｇ粪便加10ml运送液立即送检，用于分离腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。 (5) 含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV
病毒感染的实验诊断 病毒感染的实验诊断（一） ●考点 病毒的生物学性状 病毒的实验室检查方法 常见病毒的感染 [讲义编号NODE70103300270100000101：针对本讲义提问] 【内容讲解】 第一节概述 一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。 仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。 病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。 在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。 [讲义编号NODE70103300270100000102：针对本讲义提问] 一、病毒的基本性状 （一）形态结构 1.大小和形状： 大小：测量单位用纳米表示，一般在20-300nm之间。 形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、弹形、砖形、蝌蚪形等。 [讲义编号NODE70103300270100000103：针对本讲义提问] 2.结构 [讲义编号NODE70103300270100000104：针对本讲义提问] （二）病毒的增殖 病毒必须依赖宿主细胞，
以特殊的自我复制方式进行增殖。 病毒的复制周期： 吸附、穿入、脱壳、生物合成、 组装与成熟、释放6个阶段。 [讲义编号NODE70103300270100000105：针对本讲义提问] 异常增殖： 顿挫感染：病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能合成本身的成分或不能组装和释放有感染性的病毒颗粒。 缺陷病毒：由于病毒基因组不完整或基因位点改变而不能进行正常增殖的病毒。 干扰现象：当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种 [讲义编号NODE70103300270100000106：针对本讲义提问] （三）噬菌体 以细菌、真菌等为宿主，能引起细菌等裂解的病毒。 噬菌体特异性识别细菌表面受体，可用于进行细菌的鉴定与分型。 噬菌体感染细菌后产生两种后果： 溶菌周期和溶源性周期。
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒
1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较 慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较 病毒表达系统慢病毒表达系统（Lentivirus）腺病毒表达系统（Adenovirus）病毒基因组RNA病毒双链DNA病毒复制自主复制自主复制 是否整合病毒基因组整合于宿主基因组，长时 间、稳定表达外源基因病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬 时表达外源基因 感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞，适用于难转 染的原代细胞（如神经细胞）及体内 实验 感染分裂和不分裂细胞表达风度中水平表达高水平表达
第25章病毒感染的检查方法 与防治原则 第一节病毒的诊断 随着对病毒感染从生物学及分子生物学水平的研究进展，病毒的诊断技术已由传统方法扩展至新的快速诊断技术。病毒感染的快速诊断有利于对病毒感染者的治疗；例如对有些病毒（如疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒）感染已有较特异的抗病毒药物治疗。早期诊断及早期治疗对控制病毒感染十分重要。此外，从群体感染角度分析，确诊病毒感染的病原在监测病毒的流行病学（如新型流感病毒、肺出血型汉坦病毒的发现等）方面也有重要的现实意义。 标本的采集与送检用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本应采集病人急性期标本。根据不同病毒感染采取不同部位的标本（如鼻咽分泌物、脑脊液、粪便或血液）。由于病毒在室温中很易被灭活，应在采集和运送标本中注意冷藏。如欲检测抗体，早期单份血清可用于检测IgM抗体，而欲检测早期与恢复期的抗体效价的变化，则需采集早期与恢复期双份血清。血清抗体检测标本应保存于－20℃。 病毒的分离、培养与鉴定目前最常用的方法是细胞培养。在注明欲检测的病毒后，病毒分离培养的实验室将选择适当的原代培养细胞（敏感性高）及传代细胞系（便于在实验室保存）作病毒分离培养。接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类，例如用特异荧光抗体染色或抗体中和试验等。当无病毒增殖时，可能标本中病毒含量较低，未被检出，则需要盲目传代3次后方可明确标本中是否存在病毒。这一分离与鉴定病毒的全过程有时可长达2～3个月，而且仅在有设备、实验条件及合格工作人员的实验室方可进行。虽然这种方法所需时间长、步骤多，但在确定病原上是“黄金标准”，即其准确性高而无误。如我国台湾省确定由肠道病毒71型引起多数患儿发生脑膜炎并致死的研究报道，就是由分离培养及鉴定病毒所确诊。如欲提高病毒感染细胞培养的敏感性，可将病毒接种于内有盖玻片的细胞培养瓶，经低温离心后，以增加病毒与细胞接触的机率。再将盖玻片进行培养，并用单克隆抗体染色，藉以通过检测病毒的早期抗原进行诊断。 在流感病毒的分离培养中，最敏感而特异的方法是鸡胚接种，并用血凝和血
DOI ：10.7507/1002-0179.20150280作者简介：龙海燕（1989－），女，重庆人，在读硕士，E m a i l ：longhaiyan1989@https://www.doczj.com/doc/1c16423351.html, 通讯作者：冯萍，Email: fengp_62@https://www.doczj.com/doc/1c16423351.html, 网络出版时间：2015-05-14 15:16网络出版地址：https://www.doczj.com/doc/1c16423351.html,/kcms/detail/51.1356.R.20150514.1516.022.html 感染性疾病实验室诊断技术及其研究进展 龙海燕，冯萍 四川大学华西医院感染性疾病中心（成都 610041） 【摘要】 目前全球感染性疾病现状严峻，应用于感染性疾病诊断的实验室技术种类繁多，为了解感染性疾病实验室诊断技术及其最新进展，帮助临床工作者早期、快速、准确地诊断感染性疾病，降低感染性疾病暴发的危险性，及时启动感染性疾病的正确治疗等，现从病原学检测、免疫学技术、分子生物学技术、生物传感器、流式细胞术这几个方面对感染性疾病诊断技术进行综述。 【关键词】 感染性疾病；免疫学；分子生物学；生物传感器；流式细胞术 目前全球感染性疾病现状严峻，很多经典疾病卷土重来或出现了新特点，如新变异型克-雅病、重症急性呼吸综合征（SARS ）、新型冠状病毒感染、H7N9禽流感等。以前从未认识到的感染性疾病正在持续不断出现，包括人类免疫缺陷病毒（HIV ）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、霍乱弧菌和登革热病毒所致疾病等[1]。从不断新发和再发的感染性疾病中可以看出，感染性疾病仍然给人类的生存带来了巨大的挑战，因此对感染性疾病的诊断技术提出了更高的要求。本文就现有的感染性疾病实验室诊断技术和最新研究进展进行综述，为临床工作者对感染性疾病的诊治 提供参考。 1 病原学检测 传统的病原微生 物实验室诊断技术以分离、培养、染色、生物化学鉴定为主，目前仍是许多病原体检测的“金标准”。传统人工病原学检测方法操作复杂、检测周期长（2～5 d ），干扰因素多，敏感性与特异性也有限。为了缩短传统细菌“鉴定”时间，微生物鉴定自动化技术也应运而生，如V i tek 系统、Mi c roScan 系统、Phoenix 系统、Mini API 系统等。自动化微生物鉴定系统是根据微生物代谢特点，如细菌分解底物后反应液中pH 值的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌，鉴定时间约15～24 h 。Crowley 等[2]采用Vitek2自动化微生物鉴定系统和 Vitek2革兰染色阴性鉴定识别卡对707例G ?菌株进行鉴定，准确率98%，10 h 内可以出结果。此类鉴定系统大大缩短了检测时间，降低了劳动强度，为疾病的确诊争取了宝贵时间。 2 免疫学检测 免疫学技术是通过检测病原微生物的抗原或抗体来进行快速鉴定的技术。该方法简化了病原微生物的鉴定步骤，因此广泛应用于临床。感染性疾病传统的免疫学技术包括凝集反应、沉淀反应、中和反应等，如临床上常用的肥达反应、免疫固定电泳、抗链球菌溶血素O 试验等。近二十几年来，免疫学分析方法 发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，灵敏度和特异度显著提高。目前常用的标志物有放射性同位素、酶、荧光素、电子致密物、化学发光物质、DNA 等。 放射免疫沉淀实验是敏感性很高的免疫标记技术，精确度高且易标准化和自动化，但由于放射性同位素有一定的危害性，其临床应用受到一定限制。酶联免疫吸附试验（ELISA ）是目前免疫酶技术中应用最广泛的，由此发展出了阵列-ELISA （array-ELISA ），同时具备简便、高通量、快捷等特点[3]。时间 分辨荧光免疫分析及上转换发光免疫分析技术拥有灵敏度高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染、多标记等优点[4-6]。胶体金免疫层析技术操作简单、成本低、结果判读直观快速，虽然只能定性，但可用于基层单位，可进行现场诊断或大规模检测等[7]。免疫-聚合酶链反应（PCR ）是1992年Sano 等[8]建立的一种检测微量蛋白的免疫标记技术。它是用一段已知的DNA 分子来标记特定的检测抗体作为探针，然后用此探针与待检抗原结合反应，再通过 PCR 方法扩增吸附在抗原抗体复合物上的这段标记 ?综述?
慢病毒使用操作手册 一、慢病毒的储存与稀释: 1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） ①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 ②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。 二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验： 感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。 慢病毒感染目的细胞预实验 1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项： ①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 ②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 ③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含
实用指导（二）：慢病毒感染贴壁细胞实验步骤 和元生物|2016-03-1513:51 慢病毒慢病毒（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体，基因组为RNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。 以24孔为例： 第一天：准备细胞将状态良好的目的细胞接种到24孔板中，细胞计数后，进行铺板，每孔加入500ul培养基。保证第二天感染病毒时融合效率达到30-40%。通常，24孔板内以 5-8*10^4cells/孔的密度铺板。 第二天：病毒感染，换液1计算病毒加药量 选择合适MOI值，进行病毒感染。 加药量计算方法：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl）。 2弃去部分培养基 将每组中加入的病毒及感染增强剂的体积去掉，保证加入病毒和感染增强剂后，每孔中仍保持500ul的液体量。 3加入慢病毒加药量计算方法
（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl），培养基的总量必须充分覆盖住细胞。 4添加感染增强剂polybrene,保证终浓度为5ug/ml Polybrene是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10μg/ml）。过长时间暴露于Polybrene（>12小时）可对某些细胞产生毒性作用。 5病毒感染8~12小时后，观察细胞状态。 如细胞状态差，尽快换新鲜培养基；如细胞状态良好，可以在24小时内换液，但不宜超过24小时。弃去培养基后每孔加入500μl新鲜的完全培养基。5%CO2培养箱培养。 第五天：观察荧光表达情况病毒感染细胞72h后，在荧光显微镜下观察细胞，估计慢病毒感染目的细胞的效率。若荧光弱，可到96h后观察。如果96h仍无荧光，即感染实验失败。
第二章病毒 第五节病毒病的实验室诊断方法 畜禽病毒性传染病是危害最严重的一类疫病，给畜牧业带来的经济损失最大。除少数如绵羊痘等可根据临床症状、流行病学、病变作出诊断外，大多数病毒性传染病的确诊，必须在临床诊断的基础上进行实验室诊断，以确定病毒的存在或检出特异性抗体。病毒病的实验室诊断和细菌病的实验室诊断一样，都需要在正确采集病料的基础上进行，常用的诊断方法有：包涵体检查、病毒的分离培养、病毒的血清学试验、动物接种试验、分子生物学的方法等。 一、病料的采集、保存和运送 病毒病病料采集的原则、方法以及保存运送的方法与细菌病病料的采集、保存和运送方法基本是一致的，不同的是病毒材料的保存除可冷冻外，还可放在50%甘油磷酸盐缓冲液中保存，液体病料采集后可直接加入一定量的青、链霉素或其他抗生素以防细菌和霉菌的污染。 二、包涵体检查 有些病毒能在易感细胞中形成包涵体。将被检材料直接制成涂片、组织切片或冰冻切片，经特殊染色后，用普通光学显微镜检查。这种方法对能形成包涵体的病毒性传染病，具有重要的诊断意义。但包涵体的形成有个过程，出现率也不是100%，所以，在包涵体检查时应注意。（能出现包涵体的重要畜禽病毒见表2-3） 表2-3 能产生包涵体的畜禽常见病毒 病毒名称感染范围包涵体类型及部位 痘病毒类 狂犬病病毒 伪狂犬病病毒 副流感病毒III型 马鼻肺炎病毒 鸡新城疫病毒 传染性喉气管炎病毒人、马、牛、羊、猪、鸡等 狼、马、牛、猪、人、猫、羊、 禽等 犬、猫、猪、牛、羊等 牛、马、人 马属动物 鸡 鸡 嗜酸性，胞浆内，见于皮肤的棘层细胞中 嗜酸性，胞浆内，见于神经原内及视网膜的神经节 层的细胞中 嗜酸性，核内，见于脑、脊椎旁神经节的神经原中 嗜酸性，胞浆及胞核内均有，见于支气管炎、肺泡 上皮细胞及肺的间隔细胞中 嗜酸性，核内，见于支气管及肺泡上皮细胞、肺间 隔细胞、肝细胞、淋巴结的网状细胞等 嗜酸性，胞浆内，见于支气管上皮细胞中 嗜酸性，核内，见于上呼吸道的上皮细胞中 三、病毒的分离培养 将采集的病料接种动物、禽胚或组织细胞，可进行病毒的分离培养。供接种或培养的病料应作除菌处理。除菌方法有滤器除菌、高速离心除菌和用抗生素处理三种。如用口蹄疫的水疱皮病料进行病毒分离培养时，将送检的水疱皮置平皿内，以灭菌的pH7.6磷酸盐缓冲液洗涤数次，并用灭菌滤纸吸干、称重，剪碎、研磨制成1∶5悬液，为防止细菌污染，每毫升加青霉素1000IU，链霉素1000μg，置2～4℃冰箱内4～6h，然后用8000～10000r/min速度离心沉淀30min，
感染性疾病检查 感染性疾病是由病原微生物（细菌、病毒、真菌、支原体、立克次体、螺旋体）和寄生虫（原虫或蠕虫）感染人体后产生的疾病。实验室检查对感染性疾病的诊断具有特殊的意义。病原学检查包括病原体直接检出和病原体分离培养，可直接确定诊断。而免疫学检查抗原或抗体亦可提供重要依据。荧光定量PCR 检测快速、特异、灵敏，被用于感染性疾病的早期快速诊断。 第一节感染性疾病一般检测 一、白细胞常规检查 白细胞总数显著增多常见于化脓性感染（尤其是革兰阳性球菌），如流行性脑脊髓膜炎、败血症和猩红热等；某些病毒感染（如传染性单核细胞增多症）。革兰阴性杆菌感染时白细胞升高不明显甚至减低，如布鲁菌病、伤寒及副伤寒等。病毒咸染时白细胞通常减少或正常，如流行性感冒、登革热和病毒性肝炎等。蠕虫感染时嗜酸粒细胞通常增多，如钩虫、血吸虫、肺吸虫等。 二、血清C反应蛋白检验测定 【参考区间】成人和儿童：0~8. 0mg/L. 【临床意义】C反应蛋白（CRP) 是一种能与肺炎链球菌C多糖体反应的急性时相反应蛋白，由肝细胞合成，是一种经典的、灵敏的、急性时相蛋白，此反应不受放射治疗、化学治疗、皮质激素治疗影响。 （1) CRP作为急性时相蛋白在各种急性炎症、组织损伤、心肌梗死、手术创伤、器官移植排斥、放射性损伤等疾病发作后数小时迅速升高，峰值可达500mg/L.病变好转时，又迅速降至正常。其升高幅度与疾病的程度呈正相关。 （2) 细菌和非细菌感染（病毒、支原体等）的鉴别诊断：细菌感染发生炎症后6~8小时CRP即可明显上升，CRP升高与感染的程度呈正相关。非细菌感染（病毒、支原体等）大多正常。 （3) 鉴别风湿活动期和稳定期：风湿活动期CRP含量可高达200mg/L.病情好转逐渐下降到正常，稳定期不升高。 （4) 鉴别器质性与功能性疾病：前者升高，后者不升高。 （5) CRP测定有助于孕妇并发感染的观察，对羊膜破裂早产并伴有绒毛膜炎的孕妇，CRP测定具有准确和早期预报作用。 （6) 恶性肿瘤患者CRP大都升高，如CRP与 AFP的联合检测，可用于肝癌与肝脏良性疾病的鉴别诊断。 三、降钙素原测定 【参考区间】健康人群小于100ng/L. 【临床意义】降钙素原（PCT) 是一种糖蛋白，是降钙素（CT) 的前肽，在正常
2017年初级检验技师《微生物检验》练习题第27章病毒感染的实验诊断
2017 第二十七章病毒感染的实验诊断 一、A1 1、关于病毒的描述正确的是 A、原核细胞型微生物 B、非细胞型微生物 C、真核细胞微生物 D、较大微生物 E、以二分裂方式繁殖的微生物 2、包涵体检查在下列哪种病毒感染中有重要意义 A、流感病毒 B、巨细胞病毒 C、呼吸道合胞病毒 D、EB病毒 E、副流感病毒 3、病毒标本长期保存应置于 A、4℃ B、0℃ C、-20℃ D、-70℃ E、-196℃
4、用于分离培养病毒的标本冻存时加入的保护剂为 A、叠氮钠 B、硝酸甘油 C、二甲基亚砜 D、对氨基苯甲醛 E、丁二酮 5、用于分离柯萨奇病毒常接种下列哪种动物 A、小鼠 B、乳鼠 C、家兔 D、豚鼠 E、猴 6、下列实验室方法中哪种可确诊获得性免疫缺陷综合征（艾滋病） A、动物接种 B、免疫荧光法 C、酶免疫测定法 D、凝集试验 E、免疫印迹试验 7、引起婴幼儿急性胃肠炎的主要病原体是 A、新肠道病毒
B、志贺菌 C、Norwalk病毒 D、轮状病毒 E、大肠埃希菌 8、从流感病人的咽漱液中分离流感病毒，最好接种于 A、人胚羊膜细胞 B、小鼠腹腔 C、鸡胚羊膜腔 D、鸡胚尿囊腔 E、鸡胚卵黄囊 9、易在鸡胚尿囊腔中生长的病毒为 A、流感病毒 B、流行性乙型脑炎病毒 C、呼吸道合胞病毒 D、疱疹病毒 E、腺病毒 10、病毒的特征是 A、个体极小 B、没有细胞结构 C、专性细胞内寄生 D、以复制方式增殖
E、以上均是 11、病毒的核心是 A、核酸 B、蛋白质 C、多肽 D、脂类 E、糖蛋白 12、病毒在细胞内的增殖过程不包括下列哪一个 A、吸附与侵入 B、脱壳 C、病毒成分的合成及装配 D、释放 E、二分裂 13、病毒的衣壳是指 A、核酸 B、核酸外围的蛋白质 C、核酸外围的多肽 D、核酸外围的糖蛋白 E、核酸外围的脂类 14、甲型肝炎病程中传染性最强的阶段是 A、潜伏期
EB病毒感染的实验室指标 2016-03-08 EBNA二聚体带状模型 EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）属于4型疱疹病毒，类似其他疱疹病毒科的病毒，EBV感染包括增殖性感染（或称活动性感染）和潜伏感染两种状态，EBV感染人淋巴细胞和上皮细胞，初次感染后病毒可长期在人上呼吸道上皮细胞或淋巴组织中潜伏，潜伏感染和终生携带是EBV感染的重要特征。人群对EBV普遍易感，大多数人初次感染发生在儿童或青少年时期并可终生携带，在中国，8岁以上人群90％以上血清学阳性。 传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis，IM）是典型的EBV初次感染表现；值得注意的是在免疫抑制（如器官移植）、遗传缺陷（如X连锁淋巴组织增生）或潜伏感染的反复激活的情况下，EBV感染可能导致不良预后，如发展成为慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）和EBV相关的噬血性淋巴组织增生（EBV-HLH）。另外EBV还与儿童及成人的淋巴瘤等多种肿瘤发病有关。因而及时准确的实验室诊断有助于临床对EBV 感染的时相、机体状况和发生不良转归的风险进行评估，这对于儿童EBV感染性疾病的诊断及预后至关重要。 EBV-DNA阳性是EBV存在的直接证据。由于潜伏感染的存在，正常人外周血单个核细胞中也常有低载量的EBV-DNA检出（通常低于200拷贝数／m1）。在活动感染发生时EBV 在人淋巴细胞中大量增殖（IM患者一般可达103～105拷贝数／m1）并释放到血浆或淋巴液中。随着感染的控制，EBV感染进入潜伏状态，血浆或淋巴液中的病毒颗粒迅速消失，而外周血淋巴细胞中的EBV仍将以潜伏状态保持较高滴度数月～1年。对于复发性感染外周血EBV-DNA载量会更高，CAEBV可达105～106拷贝数／ml甚至更高，EBV-HLH一般在104～106拷贝数／ml之间。由于不同感染状态下病毒的状态和分布不同，EBV-DNA测定结果的解释因标本来源的不同而有不同。 1．全血：淋巴细胞是EBV感染的靶细胞，淋巴细胞中潜伏期EBV的存在和活动感染后长达数月的持续阳性使得该检测结果不能反映现症感染，也不适合急性感染如IM的诊断。因此外周血单个核细胞EBV-DNA定量测定更适合复发感染如CAEBV、EBV-HLH或移植相关EBV感染的诊断和检测。本方法的一个缺陷在于单个核细胞分离步骤繁琐，自动化程度低，定量结果受单个核细胞的分离效率影响较大。为解决这一问题，有研究者使用吸附法抽提全血DNA进行定量，现有大量商品化的抽提系统可供使用，抽提步骤自动化程度大大提高，且定量结果与分离单个核细胞的测定结果具有良好的相关性。 2．血浆或血清：血浆中的EBV-DNA来自活动感染期由感染淋巴细胞中释放的病毒颗粒，感染被控制后血液中游离的病毒颗粒和EBV-DNA又被免疫系统迅速廓清。因此血浆或血清中的EBV-DNA只有活动期感染时为阳性，恢复期和潜伏感染为阴性，这使得血浆EBV-DNA成为一个很好反映活动感染的指标，在IM、EBV-HLH和淋巴瘤等急慢性活动感染患者的血浆中均可检出，而潜伏感染者多为阴性。
第二十三章病毒感染的实验室诊断与防治原则 第一节实验室诊断 病毒感染的实验室检查包括病毒分离与鉴定、病毒核酸与抗原的直接检出以及特异性抗体的检测。临床医师根据流行病学资料，疾病的症状与体征综合判断可能为何种病毒感染，留取适宜的标本送检。 一、检材的采集与送检 病毒性疾病通常采集血液、鼻咽分泌液、咯痰、粪便、脑脊液、疱疹内容物、活检组织或尸检组织等。 供分离病毒、检出核酸及抗原的标本的，要求： （一）尽早采取 在发病初期（急性期）采取，较易检出病毒，越迟阳性率越低。 （二）部位适宜 由感染部位采取，如呼吸道感染采取鼻咽洗漱液或咯痰；肠道感染采取粪便；脑内感染采取脑脊液；皮肤感染采取病灶组织；有病毒血症时采取血液。 （三）冷藏速送 病毒离活体后在室温下很易死亡，故采得检材应尽快送检。若距离实验室较远，应将检材放入装有冰块或干冰的空器内送检。病变组织则应保存于50%的甘油缓冲盐水中。污染检材，如鼻咽分泌液、粪便等应加入青霉素、链霉素或庆大毒素等，以免杂菌污染细胞或鸡胚，而影响病毒分离。 检测特异性抗体需要采取急性期与恢复期双份血清，第一份尽可能在发病后立即采取，第二份在发病后2～3周采取。血清标本放4℃-20℃保存，试验前血清标本以56℃30分钟处理去除非特异性物质及补体。无菌性脑炎患者也可取脑脊液检测特异性lgM。 表23-1 病毒检材采集与检验结果的关系 采取标本的时期检查病毒及其成分测定抗体 潜伏期及前驱 期 刚发病或急性期 恢复期及康复期 较难查见 最多查见 很难查见 未增多 未增多或增多不明显 明显增多（常超过4倍）表23-2 供病毒分离的检材 临床表现常见病毒帮助诊断有用的检材 呼吸道感染腺病毒 巨细胞病毒 流感病毒 咽试、肛拭 咽试或含漱液、尿液 咽拭或含漱液
第8章细菌的感染的检查方法和防治原则 一、选择题 【A型题】 1．不属于血清学反应的试验是： A．协同凝集试验B．对流免疫电泳C．血凝抑制试验 D．血凝试验 E．Elek平板毒力试验 2．从有正常菌群存在的部位所采取的标本应接种在哪种培养基中分离培养病原菌？A．增菌培养基B．营养培养基C．选择鉴别培养基D．基础培养基E．特殊培养基3．分离培养细菌一般需多少时间？ A．4~8 小时B．8~12 小时C．12~16 小时D．16~20 小时E．20-24 小时 4．下列哪种细菌需 4~8 周培养才能长出可见菌落？ A．大肠杆菌B．葡萄球菌 C．破伤风梭菌D．白喉杆菌 E．结核杆菌 5．关于直接涂片镜检的叙述，下列哪项是正确的？ A．适用于所有细菌感染疾病的初步检查 B．方法简便易行，但均不能快速鉴定细菌 C．只适用于形态和染色性上具有特征的病原菌 D．其结果必须结合临床表现方有诊断价值 E．以上都不是 6、利用细菌生化反应鉴定细菌是根据： A．细菌酶活性差异B．细菌毒素活性差异C．细菌酶含量的差异 D．细菌毒素种类的差异E．细菌分解代谢产物的差异 7．白百破三联疫苗是指： A．白喉杆菌死疫苗、百日咳杆菌死菌苗、破伤风类毒素 B．白喉杆菌活疫苗、百日咳杆菌活菌苗、破伤风类毒素 C．白喉杆菌死疫苗、百日咳杆菌活菌苗、破伤风类毒素 D．白喉杆菌活疫苗、百日咳杆菌死菌苗、破伤风类毒素 E．白喉杆菌类毒素、百日咳杆菌死菌苗、破伤风类毒素 8．白百破三联疫苗与其三种单一疫苗比较，其优点是： A．可减少接种次数和剂量B．可减少接种次数，但增加剂量 C．可减少接种次数，而增强免疫效果D．可减少接种次数，但降低免疫效果 E．以上都不是 9．用马血清制备的抗毒素的缺点是： A．制备较困难B．纯度不高C．产量低D．可产生超敏反应E．不易保存 10．丙种球蛋白的优点是： A．来源广B．易制备C．易保存D．含多种微生物的抗体E．免疫效果好 11．采集细菌培养标本正确的作法是： A．采集有正常菌群的标本时需用洁净容器B．采局部病变标本前应先用消毒剂消毒局部C．必须在使用杭生素之前采集D．不能即时送检时均应置冰箱保存E．以上都不是12．关于血清学反应，正确的叙述是： A．用已知抗原侧抗体称血清学鉴定 B．用颗粒性抗原与抗体反应的试验称沉淀反应 C．用抗体致敏栽体（乳胶或红细胞等）与相应抗原反应称反向间接凝集试验 D．用于鉴定炭疽芽胞杆菌的絮状试验称 Ascoli 试验 E．抗 O试验是一种沉淀反应 13．关于ＰＣＲ技术，下列哪种叙述是错误的？ A．是一种有细胞的分子克隆技术B．是一种 DNA扩增技术 C．具有快速、灵敏和特异性强等特点D．可用于病毒 DNA片段的枪侧 E．也可用于细菌等微生物DNA片段的检侧 14．测定细菌对药物敏感性的方法，下列哪种是错误的？
项目三病毒 任务五病毒感染的实验室诊断 一、病毒的一般诊断程序 （一）标本的采集和处理 用于分离病毒的标本应含有足够量的活病毒，因此必须根据病毒的生物学特性、病毒感染的特征、流行病学规律以及机体的免疫保护机制，来选择所需要采集标本的种类、确定最适采集时间和标本处理的方法。标本采集必须无菌操作，如有细菌污染，可通过加抗菌素、过滤和离心等方法处理。由于大多数病毒对热不稳定，所以标本经处理后一般应立即接种。若需要运送或保存，数小时内可置于50％中性甘油内4℃保存，对需较长时间冻存的标本最好置于-20℃以下或干冰保存。 以感染病毒的动物病料采集为例，一般说来，应从病畜体内存在病毒最多的器官或组织采取病料。例如上呼吸道疾病取鼻分泌物，脑炎取脑组织，痘症取患部皮肤。采集病料的时间，以症状刚出现时为佳。检查抗体时，则采取一个病畜的初期和恢复期的血清，以了解抗体滴度的变化。 （二）病毒的分离培养 病毒与细菌不同，病毒是严格的活细胞内寄生的，因此分离培养病毒应采用寄主接种法、鸡胚培养法或细胞培养法，而且还必须根据不同病毒的要求进行选择，才能得到满意的结果。 1、寄主接种法 分离的标本接种于实验寄主的种类和接种途径主要取决于病毒寄主范围和组织嗜性，同时还应考虑操作、培养及结果判定的简便。 噬菌体标本可接种于生长在培养液或培养基平板中的细菌培养物。 植物病毒标本可接种于敏感植物叶片，产生坏死斑或枯斑。 动物病毒标本可接种于敏感动物的特定部位，嗜神经病毒接种于动物脑内，嗜呼吸道病毒接种于动物鼻腔。常用动物有小白鼠、大白鼠、地鼠、家兔和猴子等。在兽医病毒学实践中，还常用本动物进行实验感染试验。例如，应用健康马驹作马传染性贫血病毒接种试验；应用健康猪、鸡分别作猪瘟病毒、鸡新城疫病毒接种试验等等。接种病毒后，隔离饲养，每日观察动物发病情况，根据动物出现的症状，初步确定是否有病毒增殖。 2、鸡胚培养法 不同的病毒可选择不同日龄的鸡胚和不同的接种途径，如痘病毒接种于10～12d的鸡胚绒毛尿囊膜上，鸡新城疫病毒宜接种在10d尿囊腔和羊膜腔内，虫媒病毒宜接种于5d卵黄囊，继续培养观察。 3、细胞培养法 用机械方法或胰蛋白酶等方法将离体的活组织分散成 单个的细胞，在平皿中制成贴壁的单层细胞，然后铺上动 物病毒悬液进行培养。细胞培养是目前最常用的方法。 （三）病毒的鉴定 病毒鉴定是诊断病毒性疾病的可靠方法，也是病毒分 类的前提。一般可通过以下方法确证病毒的存在： 1、病毒的群体形态特征 （1）噬菌斑 噬菌斑测定一般采用双层平板法，将一定量经稀释的 噬菌体悬液与高浓度敏感菌悬液及半固体琼脂培养基(1％琼脂)混合均匀后，然后倒入含底层琼脂培养基(2％琼脂)的平板，经过一段时间培养后，在细菌菌苔上会出现一个个圆形局部透明区域，即噬菌斑。可以认为，每个噬菌斑是一个噬菌体侵染的结果，一个噬菌斑中的 图3-14 噬菌斑
第二十七章病毒感染实验诊断 一、A1 1、关于病毒描述对的是 A、原核细胞型微生物 B、非细胞型微生物 C、真核细胞微生物 D、较大微生物 E、以二分裂方式繁殖微生物 2、包涵体检查在下列哪种病毒感染中有重要意义 A、流感病毒 B、巨细胞病毒 C、呼吸道合胞病毒 D、EB病毒 E、副流感病毒 3、病毒标本长期保存应置于 A、4℃ B、0℃ C、-20℃ D、-70℃ E、-196℃ 4、用于分离培养病毒标本冻存时加入保护剂为 A、叠氮钠 B、硝酸甘油 C、二甲基亚砜 D、对氨基苯甲醛
E、丁二酮 5、用于分离柯萨奇病毒常接种下列哪种动物 A、小鼠 B、乳鼠 C、家兔 D、豚鼠 E、猴 6、下列实验室办法中哪种可确诊获得性免疫缺陷综合征（艾滋病） A、动物接种 B、免疫荧光法 C、酶免疫测定法 D、凝集实验 E、免疫印迹实验 7、引起婴幼儿急性胃肠炎重要病原体是 A、新肠道病毒 B、志贺菌 C、Norwalk病毒 D、轮状病毒 E、大肠埃希菌 8、从流感病人咽漱液中分离流感病毒，最佳接种于 A、人胚羊膜细胞 B、小鼠腹腔 C、鸡胚羊膜腔 D、鸡胚尿囊腔 E、鸡胚卵黄囊
9、易在鸡胚尿囊腔中生长病毒为 A、流感病毒 B、流行性乙型脑炎病毒 C、呼吸道合胞病毒 D、疱疹病毒 E、腺病毒 10、病毒特性是 A、个体极小 B、没有细胞构造 C、专性细胞内寄生 D、以复制方式增殖 E、以上均是 11、病毒核心是 A、核酸 B、蛋白质 C、多肽 D、脂类 E、糖蛋白 12、病毒在细胞内增殖过程不涉及下列哪一种 A、吸附与侵入 B、脱壳 C、病毒成分合成及装配 D、释放 E、二分裂