Hebei Medical University 硕士学位论文
科学学位
TXNIP 在高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞自噬中的作用及
分子机制
研 究 生： 孔祥凤 导 师： 段惠军教授
专 业： 病理学与病理生理学 二级学院： 基础医学院
2016年3月
授予单位代码 10089 学号或申请号 20132537 中国图书分类号
R361
河北医科大学
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目录
中文摘要 (1)
英文摘要 (4)
英文缩写 (8)
研究论文TXNIP在高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞自噬中的作用及分子机制
前言 (9)
材料与方法 (11)
结果 (21)
附图 (23)
讨论 (33)
结论 (35)
参考文献 (36)
综述自噬与糖尿病肾病关系的研究进展 (42)
致谢 (53)
个人简历 (54)
TXNIP在高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞自噬中的作用
及分子机制
摘要
目的：糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常见的并发症之一，糖尿病患者一旦出现明显蛋白尿则病情通常难以逆转，往往发展至终末期肾功能衰竭，是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一。
近年来的研究发现，细胞自噬（Autophagy）在DN中扮演着重要的角色。自噬是细胞内一个基本过程，它将细胞内成分运输到溶酶体降解，维持着体内平衡和细胞完整性。正常情况下，细胞自噬功能处于基础水平，以维持细胞正常的生理功能。越来越多的研究表明，细胞自噬受损与糖尿病肾病之间密切相关，并参与了糖尿病肾病的发生与发展。在STZ诱导的早期糖尿病小鼠肾小管上皮细胞中，自噬标志物LC3-II和自噬溶酶体降解产物P62表达增多提示自噬活性可能减弱。
硫氧还蛋白相互作用蛋白（Thioredoxin interacting protein,TXNIP）在细胞内普遍存在，高糖能够诱导TXNIP过表达，导致细胞发生氧化应激反应，引起细胞损伤和细胞外基质蛋白沉积，促进细胞凋亡。我们先前已有研究表明高糖诱导的系膜细胞TXNIP表达明显上调，活性氧（Reactive oxygen species,ROS）产生增多，系膜细胞出现凋亡与表型转化。
目前，有研究结果显示，糖尿病肾病患者的肾小管上皮细胞自噬活性减弱，自噬体累积过多，自噬标志蛋白LC3-II和溶酶体降解标记物P62表达增高；在肾小管上皮HK-2细胞中，敲低TXNIP后自噬活性明显增强，提示TXNIP与糖尿病肾小管细胞自噬损伤有关。但是，TXNIP在高糖诱导的肾小球系膜细胞自噬中的作用还未见报道。因此，本实验通过体外培养的小鼠系膜细胞（Mouse mesangial cells,MMCs），研究高糖条件下MMC细胞中TXNIP与自噬的关系并探索其相关分子机制。
方法：pBAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA干扰质粒，使用FuGENE R6转染试剂将TXNIP siRNA质粒和空白质粒分别转染MMCs在37°C，5% CO2培养箱中，以含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液培养细胞,并将实验细胞分组：①正常对照组（5.5 mmol/L glucose,NG）、甘露醇对照组（5.5
mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol,M）、高糖组（30 mmol/L glucose,HG）干预刺激2、6、12、24、48、72小时后收集细胞; ②正常对照组（5.5 mmol/L glucose,NG）、甘露醇对照组（5.5 mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol,M）、高糖组（30 mmol/L glucose,HG）、空白质粒对照组（30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo质粒,HG+V）、TXNIP siRNA敲低组（30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA质粒,HG+T）、巴佛洛霉素组（5.5 mmol/L glucose+50 nmol/L Bafilomycin A1,BA组）、硝基酪氨酸组(30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA质粒+0.02 mg/ml Nitrotyrosine,HG+T+N）、雷帕霉素组(30 mmol/L glucose+1 ng/ml Rapamycin,HG+R）都在干预刺激24小时后收集细胞。采用Western blot 检测TXNIP、LC3-II、P62、Nitrotyrosine和p-mTORC1 蛋白表达；采用Real-time PCR检测TXNIP、LC3-II和P62 mRNA 表达；倒置显微镜检测细胞形态学；透射电镜和共聚焦显微镜检测自噬体；流式细胞术和MitoSOX检测ROS。
结果：
1高糖对系膜细胞自噬的影响。
与正常对照组相比，经高糖诱导的系膜细胞中TXNIP、LC3-II和P62的表达随时间点呈波峰变化，且在24h时达到峰值；甘露醇对照组中系膜细胞中TXNIP、P62及LC3-II表达未见明显变化。
2系膜细胞的形态变化。
倒置显微镜观察结果显示，正常对照组及甘露醇对照组中系膜细胞呈星多角形、不规则、贴壁生长；经高糖和巴佛洛霉素A1诱导的系膜细胞呈椭圆形、与瓶底的粘附性下降；而TXNIP敲低组的系膜细胞形态相比高糖组呈多角形、与瓶底粘附性增高。
3敲低TXNIP对高糖诱导系膜细胞自噬体的影响。
透射电镜观察结果显示，与正常对照组相比，经高糖和巴佛洛霉素A1诱导的系膜细胞中检测到自噬体明显增多；而甘露醇对照组无明显改变；TXNIP敲低组相比于高糖组，自噬体明显减少。
4敲低TXNIP对高糖诱导的系膜细胞自噬相关蛋白表达的影响。
与正常对照组相比，经高糖和巴佛洛霉素A1诱导之后，系膜细胞中TXNIP、LC3-II、P62和p-mTORC1表达显著增高；而甘露醇对照组系膜
细胞自噬相关蛋白表达未见明显变化；TXNIP敲低组系膜细胞中的TXNIP、LC3-II、P62和p-mTORC1相比于高糖组表达明显减少。
5敲低TXNIP对高糖诱导的系膜细胞ROS的影响。
与正常对照组相比，经高糖、巴佛洛霉素A1诱导之后，系膜细胞中的ROS产生增多；然而，相比于高糖组，TXNIP敲低组及硝酸酪氨酸组系膜细胞中ROS生成明显减少。
6雷帕霉素对高糖诱导的系膜细胞自噬的影响
与正常对照组相比，经高糖诱导之后，系膜细胞中TXNIP、LC3-II、P62、p-mTORC1和Nitrotyrosine表达增高；经雷帕霉素处理之后系膜细胞中TXNIP、LC3-II、P62、p-mTORC1和Nitrotyrosine的表达明显减少。
结论：
1 HG可能抑制MMC细胞自噬活性。
2 HG诱导MMC细胞中TXNIP过表达，系膜细胞自噬体增多。
3敲低TXNIP可能通过减少ROS产生，减少LC3-II、P62的表达，通过mTOR信号通路，使HG诱导的细胞自噬活性增加。
关键词：硫氧还蛋白相互作用蛋白，自噬，高糖，系膜细胞，微管相关蛋白1轻链3-II，泛素结合蛋白P62，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1
The role of TXNIP on autophagy in mouse glomerular mesangial cells induced by high glucose and its related molecular
mechanism
ABSTRACT
Objective:Diabetic nephropathy (DN) is one of the most common diabetic microvascular complications. Once obvious proteinuria occurred, the disease is difficult to reverse. Furthermore, the disease can develop to the end-stage renal kidney failure,which is the primary reason for the diabetes patients die.
In the past decades, the previous study proposed that the cell autophagy (Autophagy) plays an important role in the DN. Additionally, autophagy is a basic process, which is helpful for degrading cell components by transporting the them into lysosome, facilitating the balance and integrity of cell. In normal state, the function of cell autophagy is under the basic level, beneficial for the normal physiological founction. Moreover, an increasing number of studies have found that there is close relation between the injury of cell autophagy and DN, and the the injury of cell autophagy was responsible for the occurrence and development of the diabetes. In the renal tubular epithelial cells of early diabetic mice induced by STZ, the increase of autophagy marker LC3-II and the autophagy-lysosome degradation products of P62 shows that the activity of cell autophagy may be reduced.
Thioredoxin-interacting protein (TXNIP) is widespread in a cell, which can be induced to be over expressed by hyperglycemia, leading to Oxidative Stress Response. As a result, the cells were injured with the accumulation of extracellular matrix proteins to accelerate the apoptosis of cell. What is more, our previous research confirm that the expression of TXNIP in HG-induced MMCs is significantly increased, the ROS (Reactive oxygen species，ROS) generates more and appeareds apoptosis with phenotype transformation in MMCs.
Recently, the latest researches suggest that the activity of autophagy in tubular epithelial cell reduced with the autophagosome accumulating, while the expression of autophagy-lysosome degradation products of P62 and autophagy marker LC3-II significantly enhanced. As for the HK-2 renal tubular epithelial cells, the activity of autophagy obviously enhanced with the TXNIP in HK-2 cells being knowdowned, indicating TXNIP is related to the injury of autophagy in diabetic nephropathy tubular cell. Nevertheless, the role of TXNIP in the glomerular mesangial cells induced by high sugar autophagy has not been investigated yet. In our work, not only the relationship between autophagy and TXNIP in the MMC cells was investigated, but also its molecular mechanism was explored in detail by conducting culturing experience of the mesangial cells (Mouse mesangial cells, MMCs) in vitro.
Methods: For pBAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA interference plasmid, TXNIP siRNA plasmid and blank plasmid are used to transfect MMCs respectively with FuGENER6 transfection reagent. 37°C, 5% CO2 in incubator, Cells are cultured in DMEM-F12 containing 10% fetal bovine serum. Experimental cells: ①normal control group ( 5.5 mmol/L glucose, NG ), mannitol control group ( 5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol, M ), high glucose (30 mmol/L glucose,HG), It needs to collect cells with stimulus for 2, 6, 12, 24, 48, 72 h②normal control group ( 5.5 mmol/L glucose, NG ), mannitol control group ( 5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol, M ), high glucose (30 mmol/L glucose,HG), blank plasmidcontrol group( 30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo-blank plasmid, HG+V ), TXNIP siRNA plasmid group ( 30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA plasmid, HG+T ), bafilomycin A1 group ( 5.5 mmol/Lglucose+50 nmol/L bafilomycin A1, BA ), nitrotyrosine group ( 30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA plasmid+0.02 mg/ml Nitrotyrosine, HG+T+N ), rapamycin group ( 3 mmol/L glucose+1 ng/ml rapamycin, HG+R ).They need to collect cells with stimulus for 24h to detect the expression of TXNIP, LC3-II, P62, nitrotyrosine, p-mTORC1 by Western blot and mRNA of TXNIP, LC3-II, P62 byReal-time PCR. We detect the morphology of cells by the inverted electron microscope,
the autophagosome by the electron microscopy and onfocal microscope, the ROS by the flow cytometry and MitoSOX.
Results:
1 The effect of hyperglycemia on the mesangial cell autophagy.
The expressed value of the TXNIP, LC3-II and P62 after being induced by the hyperglycemia displayed volcanic trend, and reached the maximum after the 24 hour time. Whereas, there is no obvious change of expression occurred in TXNIP, P62 and LC3-II.
2 Mesangial cell morphological changes.
The results of the inverted microscope suggest that the mesangial cells in normal and mannitol control group present star polygon, irregular, adherent growth. After being induced by high glucose and bafilomycin A1, these mesangial cells are oval with declined bottle adhesion. While the mesangial cell morphology became polygon with the bottle bottom adhesion increasing in the TXNIP knockdown group.
3 The effect of siRNA TXNIP on the autophagosome in HG-induced MMCs.
In contrast to the normal comparison group, the TEM images show that the autophagosomes increase significantly being induced by the high glucose group and bafilomycin A1 group, but no obvios change occurred in the mannitol controlled group. However, the autophagosome in siRNA TXNIP group was less than that in high glucose induced group.
4 The effect of siRNA TXNIP on autophagy related protein expression in HG-induced MMCs.
Compared to the normal controlled group, the expression of TXNIP, LC3-II, P62 and p-mTORC1 enchanced significantly, but there is no obvious change in mannitol group on the protein expression. Additionally, the expression of TXNIP, LC3 - II, P62 and p - mTORC1 in mesangial cells knocked by TXNIP reduced.
5 The effect of siRNA TXNIP on ROS in HG-induced MMCs.
Compared to the normal control group, the ROS in the MMCs increased
after being induced by high glucose, Bafilomycin A1 and Nitrotyrosine, while the ROS decrease obviously with the siRNA TXNIP.
6 The effect of siRNA TXNIP on p-mTORC1 in HG-induced MMCs.
Compared to the normal control group, the expression of TXNIP, LC3-II, P62, p-mTORC1 and Nitrotyrosine in the HG-induced MMCs increased, while the expression of TXNIP, LC3-II, P62, p-mTORC1 and Nitrotyrosine decrease obviously in the rapamycin group.
Conclusion:
1 HG may inhibit the activity of cell autophagy．
2 HG is responsible for the overexpresssion of TXNIP and increased autophagosome in cells.
3 TXNIP interference achieves regulating function by ROS, and suppress the expression of LC3-II and P62, by the mTOR signaling pathway to regulate the activity of autophagy in HG-induced MMCs.
Key words: TXNIP, Autophagy, HG, MMC, LC3-II, P62, mTORC1
英文缩写
英文缩写英文全称中文全称
DN Diabetic nephropathy 糖尿病肾病
TXNIP Thioredoxin-interaction protien 硫氧还蛋白相互作用蛋白TRX thioredoxin 硫氧还蛋白
VDUP-1 vitamin D3-upregulated protein 1 维生素 D3-上调蛋白 1 TBP-2 thioredoxin binding protein-2 硫氧还蛋白结合蛋白-2 m TOR Mammalian target of rapamycin 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白LC3 Microtubules associated protein1
微管相关蛋白1轻链3 Light chain3
cDNA complement DNA 互补脱氧核糖核苷酸
HG high glucose 高糖
NG normal glucose 正常糖
MMC mesangial cell 系膜细胞
DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜
Rapa Rapamycin 雷帕霉素
Baf-1 Bafilomycin A1 巴佛洛霉素A1
NT Nitrotyrosine 硝基酪氨酸
ONOO-peroxynitrite 过氧亚硝基阴离子
腺苷酸活化蛋白激酶AMPK Adenosine monophosphate
activated kinase
OS Oxidative Stress 氧化应激
Atg Autophagy related genes 自噬相关蛋白
ROS reactive oxygen species 活性氧自由基
RNS reactive nitrogen species 活性氮自由基
TXNIP在高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞自噬中的作用
及分子机制
前言
糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常见的并发症之一，糖尿病患者一旦出现明显蛋白尿则病情通常难以逆转，往往发展至终末期肾功能衰竭，这是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一。
近年来的研究发现，细胞自噬（Autophagy）在DN中扮演着重要的角色[1-3]。自噬是细胞内一个基本过程，是将细胞内成分运输到溶酶体降解，并维持体内平衡和细胞完整性[4]。越来越多的研究表明，自噬与DN 的发病机理密切相关[5]，在STZ诱导的早期糖尿病小鼠肾小管上皮细胞中，自噬标志物LC3-II和自噬溶酶体降解产物P62的表达增多提示细胞自噬活性可能减弱[6,7]。
目前研究发现自噬可能参与了糖尿病肾病的重要信号通路。糖尿病肾病中主要的营养信号通路包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和沉默信息调节因子1（Sirt1），这三种营养信号通路对自噬有着重要的调控作用[8,9]。mTOR是经典营养敏感通路，是以mTORC1和mTORC2两个不同的蛋白复合体调节自噬活动。在糖尿病肾病中，mTORC1直接抑制自噬起始因子Ulk1的活性达到对自噬的抑制，然而mTORC1过度激活将会造成肾脏损伤[10-13]。有研究发现，在STZ 诱导的糖尿病小鼠，阻断mTORC1信号通路能够减少肾小球α-平滑肌肌动蛋白的表达，导致肾小球系膜基质的积累和肾脏肥大等[14,15]。在肾小球足细胞特异性缺失mTORC1的糖尿病小鼠，蛋白尿明显减少，避免肾小球系膜扩张和肾小球硬化，抑制DN的进一步发展[16,17]。这些研究足以表明mTORC1是自噬负调节蛋白，能够直接磷酸化Ulk1复合体抑制自噬活性。那么，高糖对系膜细胞自噬的影响是否通过mTOR信号通路实现？
巴佛洛霉素A1 (Bafilomycin A1,Baf-1) 是一种细胞内H+-ATP酶的特异性抑制剂，巴佛洛霉素A1广泛应用于判断细胞自噬的金标准，它既能阻断细胞自噬过程中自噬泡与溶酶体的融合，又能抑制自噬溶酶体蛋白酶的活性[22,23]。在本实验中巴佛洛霉素A1是作为高糖诱导的系膜细胞发生
自噬的对照。雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)是目前新型的强效免疫抑制剂，它能与雷帕霉素靶蛋白特异性结合抑制mTORC1蛋白激酶活性，从而诱导自噬发生[18]。最新有研究发现，在STZ诱导的糖尿病肾病模型中，雷帕霉素能够阻断mTOR信号通路，减少肾小球平滑肌肌动蛋白的表达，系膜基质的积累和肾脏肥大，从而抑制糖尿病肾病的发生[20,21]。同样有研究发现，在高糖诱导的系膜细胞中，高糖能够抑制系膜细胞自噬，雷帕霉素干预后可减轻高糖对自噬的抑制作用，从而调节自噬[19]
TRX系统包括TRX、NADPH和硫氧还蛋白（TRXR），其中TRX 系统发挥着重要还原反应的功能。硫氧还蛋白相互作用蛋白（Thioredoxin- interacting protein,TXNIP）是TRX结合蛋白，通过抑制TRX活性诱导氧化应激[29]。已有研究表明，高糖诱导的系膜细胞和肾小管上皮细胞TXNIP 蛋白表达明显上调[30,31]。最新研究提示，高糖诱导的肾小管上皮细胞，TXNIP能够增加ROS生成，从而抑制细胞自噬活性[32]。那么，在高糖诱导的肾小球系膜细胞中，TXNIP是否也通过增加ROS来调节系膜细胞自噬？
硝基酪氨酸（nitrotyrosine,NT）是一种蛋白质氧化产物，是过氧亚硝基阴离子（ONOO-）或NO2与酪氨酸反应形成的内源性物质。过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite,ONOO-）与糖尿病肾病的发生发展密切相关[24,25]。有研究发现，硝基酪氨酸在高糖诱导的系膜细胞过表达，能够造成细胞内ROS显著增加并且降低细胞内抗氧化酶活力，同时造成细胞内脂质过氧化物大量积累，最终使细胞线粒体膜电位去极化，细胞发生氧化应激，最终导致细胞凋亡[26-28]。因此，硝基酪氨酸在本实验中作为系膜细胞敲低组对照。
综上，本实验旨在研究TXNIP与高糖诱导的体外培养的小鼠系膜细胞自噬的关系以及相关作用分子机制。
材料与方法
1 材料
1.1细胞株及质粒来源
小鼠肾小球系膜细胞(MMCs,ATCC no. CRL-1927)购自美国菌种保藏中心(Manassas,V A）。pBAsim-U6-Neo质粒载体来自Takara公司，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因和鼠U6启动子。
1.2主要仪器
细胞培养箱
超净工作台
电子天平
电热恒温培养箱
电热恒温干燥箱
电子恒温水浴箱
台式高速冷冻离心机
紫外可见分光光度计
旋涡混合器
超低温冰箱
压力蒸汽灭菌器
垂直电泳槽
转移电泳仪
DYY-7B型稳压稳流电泳仪Odyssey FC成像仪
梯度基因扩增仪
实时定量PCR仪
恒温摇床
TGL-16B型离心机
透射电镜
光学显微镜
Epics-XL II型流式细胞仪日本三洋
苏州净化设备厂
北京赛多利斯天平有限公司重庆实验设备厂
天津市华北实验仪器有限公司天津市华北实验仪器有限公司北京四环科学仪器厂
上海光谱仪器有限公司
上海精科实业有限公司
青岛海尔
博迅实业有限公司医疗设备厂美国伯乐公司
美国伯乐公司
美国伯乐公司
美国Li-COR Biosciences公司德国Biometra公司
安捷伦科技有限公司
上海泰恒科学仪器有限公司上海安亭科学仪器厂
日本日立公司
日本Olympus
美国Beckman Coulter公司
1.3主要试剂
兔抗TXNIP单克隆抗体
鼠抗P62单克隆抗体
兔抗LC3单克隆抗体
兔抗mTOR多克隆抗体
兔抗p-mTOR多克隆抗体
鼠抗Nitrotyrosine多克隆抗体兔抗β-actin多克隆抗体
ECL增强化学发光试剂盒
辣根酶标记山羊抗兔IgG
辣根酶标记山羊抗鼠IgG PVDF膜
预染蛋白分子量marker DAB显色试剂盒
三羟甲基氨基甲烷(Tris)
脱氧胆酸钠
苯甲磺酰氟
Tween 20
TritonX-100
丙烯酰胺（ACR）
DEPC水
EDTA
PCR反转录试剂盒
Real Time-PCR扩增试剂盒DMEM-F12培养基
胎牛血清
胰酶消化液
青链霉素混合液
硝基酪氨酸
巴佛洛霉素A1
雷帕霉素美国Abcam公司
美国Abcam公司
美国Abcam公司
美国Abcam公司
美国Cell Signal公司
美国Abcam公司
美国Abcam公司
美国Thermo Scientific公司北京中杉公司进口分装
北京中杉公司进口分装
美国Milipore公司
美国NEB公司
北京中杉生物技术有限公司天津市华东试剂厂
美国Amresco公司
德国Boehringer公司
美国Amresco公司
美国Amresco公司
美国Sigma公司
美国Sigma公司
北京Solarbio公司
日本Takara公司
日本Takara公司
美国Gibco公司
美国Hyclone公司
美国Gibco公司
美国Sigma公司
美国Sigma公司
美国Abcam公司
百灵威科技有限公司
DMSO
BSA
酵母提取物
胰蛋白胨
琼脂糖
甘露醇
葡萄糖
FuGENE R6Transfection Reagen DCFH-DA 美国Sigma公司北京Solarbio公司北京Solarbio公司美国Sigma公司美国Sigma公司美国Sigma公司美国Sigma公司美国Promega公司美国Sigma公司
1.4试剂配制
1)高糖DMEM-F12培养液：葡萄糖0.27 mg，无血清DMEM-F12培养基
50 ml，调整高糖浓度至30 mmol/L，过滤除菌，4℃保存。
2)甘露醇DMEM-F12培养液：甘露醇0.27 mg，DMEM-F12培养基50 ml，
调整甘露醇浓度至30 mmol/L，过滤除菌，4℃保存。
3)APS试剂：APS 0.1 g，蒸馏水1 ml，4℃保存。
4)Tris-Cl PH 6.8试剂：Tris-Cl 6.05 g，加蒸馏水至80 ml，滴定调PH值
至8.8后补蒸馏水至100 ml，再加入SDS 0.4 g充分混合，装入标记的玻璃瓶，4℃保存。
5)Tris-Cl PH 8.8试剂：Tris-Cl 18.2 g，加蒸馏水至80 ml，滴定调PH值
至8.8后补蒸馏水至100 ml，再加入SDS 0.4 g充分混合，装入标记的玻璃瓶，4℃保存。
6)6×buffer缓冲液：甘油3.0 ml，DTT 0.93 g，溴酚蓝1.2 mg，SDS 1.0
g，4×Tris HCl/SDS 7 ml，滴定调PH值至6.8，0.5 ml/管分装，-20℃保存。
7)电泳缓冲液：甘氨酸14.5 g，Tris 3.05 g，SDS 1 g，蒸馏水1000 ml。
8)转膜缓冲液：甘氨酸14.5 g，Tris 3.05 g，甲醇200 ml，蒸馏水800 ml，
4℃预冷备用。
9)TBST缓冲液：NaCl 9 g，Tris 1.21 g，Tween-20 500 ul-1 ml，浓HCL 500
ul-1 ml调pH值至7.4，蒸馏水1000 ml。
10)5% BSA封闭液：BSA血清粉1 g，TBST缓冲液20 ml。
11)PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2PO4 1.56 g，KH2PO4 0.2 g，蒸
馏水1000ml。
12)细胞裂解液：Tris-cl 0.121 g，氯化钠0.42 g，EDTA 0.02 g，焦磷酸钠
0.5 g，TritonX-100 0.5 ml，加入蒸馏水50 ml混合均匀，分装4℃保
存。1 ml细胞裂解液中加入10 ul PMSF试剂，1 ul原矾酸钠试剂，现配现用。
13)PMSF试剂：PMSF 0.0174 g，1 ml异丙醇，溶解后4℃保存。
14)原矾酸钠试剂：原矾酸钠0.4 g，1 ml蒸馏水，溶解后-20℃保存。
2 实验方法
2.1细胞实验
2.1.1细胞复苏
从液氮中快速取出冻存的系膜细胞，立即放入预热的37℃电子恒温水浴箱中，尽量在1分钟内摇晃至完全融解，将融解的系膜细胞悬液吸入适量预热的DMEM-F12培养液的无菌培养皿中，轻轻吹打细胞使之充分混匀，在37℃，5% CO2细胞培养箱中常规培养。
2.1.2细胞传代
系膜细胞传代采用胰蛋白酶-EDTA消化法。倒掉原培养液，用无菌PBS洗涤2次后，加入1 ml消化液，倒置显微镜下观察3 min，见系膜细胞突起回缩，间隙增大，细胞变圆，用手轻轻拍打皿底可见系膜细胞脱离壁即消化适度，加入培养液终止消化，用吸管轻轻吹打系膜细胞，使系膜细胞悬液充分混匀后，按所需密度接种于新的无菌培养皿中。
2.1.3细胞冻存
系膜细胞经胰蛋白酶-EDTA消化，加入适量DMEM-F12培养液，1000 rpm离心3 min，弃去上清液，加入无菌冻存液（DMEM-F12培养液：胎牛血清：DMSO=5：4：1），分装到标记好的冻存管，放入冻存细胞器，于-80℃过夜，次日转入液氮中保存。
2.1.4细胞培养
系膜细胞以含10%胎牛血清、100 IU/ml青链霉素混合液的DMEM-F12培养液，在37℃，5% CO2培养箱中常规培养，每天更换培养液一次，相差倒置显微镜观察细胞生长状态。长满培养皿的90％左右即可进行消化传代。
2.1.5细胞分组
将系膜细胞分为3组：正常糖对照组（5.5 mmol/L glucose，NG）、甘露醇对照组（5.5 mmol/L glucose+30 mmol/L mannitol，M）、高糖组（30 mmol/L glucose，HG），分别干预刺激0、2、6、12、24、48、72 h后收集细胞，进行相关指标的检测。
确定高糖刺激系膜细胞自噬相关蛋白表达最高时间点，所有实验细胞在该时间点刺激进行,再将细胞各分组如下：①正常对照组（5.5 mmol/L glucose,NG）、甘露醇对照组（5.5 mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol,M）、高糖组（30 mmol/L glucose,HG）、空白质粒对照组（30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo质粒,HG+V）、TXNIP siRNA敲低组（30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA质粒,HG+T）、巴佛洛霉素组（5.5 mmol/L glucose+50 nmol/L Bafilomycin A1,BA组）；②正常对照组（5.5 mmol/L glucose,NG）、高糖组（30 mmol/L glucose,HG）、TXNIP siRNA 敲低组（30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA质粒,HG+T）、硝基酪氨酸组(30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA质粒+0.02 mg/ml Nitrotyrosine,HG+T+N）；③正常对照组（5.5 mmol/L glucose,NG）、高糖组（30 mmol/L glucose,HG）、雷帕霉素组(30 mmol/L glucose+1 ng/ml Rapamycin,HG+R）。
2.2细胞转染实验
2.2.1质粒提取
1)将P1提前加入1：1000的lyseblue；70%乙醇、异丙醇-4℃备用；
2)摇好的150 ml锥形瓶菌液分装到50 ml离心管，10000 rpm离心2 min；
3)弃去上清液加入10 ml P1，震荡器混匀，注意溶液不要外洒；
4)加入10 ml P2颠倒4-6次混匀，室温下静置5 min直至溶液变蓝；
5)加入10 ml P3颠倒4-6次直至溶液完全无色；
6)将溶解物倒入QIA，注意不要插入活塞室温下10 min；
7)平衡His-Tip柱子，加入10 ml QBT使其进入树脂直至滴完；
8)QIA插入活塞打入His-Tip，下连废液瓶使液体缓慢滴完，质粒留在柱
子上；
9)加入60 ml QC冲洗His-Tip；
10)上接过滤器，下连干净的50 ml离心管，15 ml QF提取质粒；
11)加入10.5 ml异丙醇，室温下静置5 min；
12)将适量异丙醇移入30 ml注射器，持续压力过滤后加入2 ml 70%乙醇
洗质粒，挤压若干次直至完全干燥；
13)QIA过滤器用滤纸吸干直至无乙醇味；
14)5 ml注射器加入1ml TE，将液体重复过滤移入高压灭菌标记的EP管，
定量，-20℃保存。
2.2.2质粒转染
将系膜细胞按一定比列均匀传入无菌培养皿，37℃，5%CO2培养箱常规培养，待细胞长至皿底约70% 左右时，取两个EP管分别加入9 μl FuGENE R6 和271 μl无血清DMEM-F12混匀，室温下孵育5 min。然后再分别加入TXNIP siRNA质粒和TXNIP siRNA空白对照质粒各3 μg，混匀室温下孵育20 min，使脂质体充分包裹质粒。将DNA-脂质体混合物分别加入无菌培养皿中，用吸管轻轻吹打混匀，37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。在倒置显微镜下观察转染细胞形态并高糖刺激24 h后收集细胞。
2.3蛋白印迹
将系膜细胞传代长到一定密度后，并于高糖刺激细胞0、2、6、12、24、48、72 h以及按如上进行细胞实验分组刺激24 h后收集细胞并提取蛋白。
2.3.1细胞蛋白提取
预冷的生理盐水洗涤系膜细胞三次，尽量将每皿残留液体甩干，加入冰冷的细胞裂解液300 μl，冰浴静置1 h，移入标记的EP管，4℃、12000 rpm离心20 min，吸取上清，移入另标记的EP管并-80℃保存。
2.3.2细胞蛋白定量
考马斯亮蓝试剂法蛋白定量：实验设空白管、标准管和样品管三种，考马斯亮蓝原液用蒸馏水1：4 稀释，每组试管3 ml考马斯亮蓝稀释液，标准管50 μl标准蛋白，空白管50 μl生理盐水，其余各管分别蛋白质样品10 μl。生理盐水将各管体积补齐，振荡混匀后室温放置10 min，于紫外分光光度计下检测，波长为595 nm。空白管调零，分别测定标准管和各管样品的吸光度值，蛋白质浓度（mg/mL）=样品吸光度值/标准管吸光度值×标准蛋白浓度×5，将蛋白样品等量分装-80℃保存。
2.3.3电泳及转膜
1)每个样品加入适量6×上样buffeer缓冲液，100℃高温加热变性3 min，
快速离心15 s；
2)12% SDS聚丙烯酰胺凝胶固定于垂直电泳槽，加入电泳缓冲液，拔去
梳子，将100 ug的蛋白样品加到凝胶孔内；
3)恒定电压进行凝胶电泳。浓缩胶电压90 V，进入分离胶蛋白质预染
Marker开始分离，电压改为120 V。溴酚蓝指示剂迁移到凝胶下端约
1 cm处，停止电泳；
4)电泳完毕，按照蛋白质分子量标准切取目的蛋白胶条，标记好后放入
转膜液中。在100%甲醇中浸入1 min并激活相应标记的PVDF膜，蒸馏水清洗3次放入转膜液；
5)塑料转移盒中依次组装：海绵、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤
纸和海绵，各层之间避免有气泡；
6)塑料转移盒置于电转移槽，4℃条件下，90 V恒压转膜，根据目的蛋
白分子量的大小，转膜时间控制在1-2 h；
7)转膜完毕，将PVDF 膜取出放入TBST稀释的5% BSA中，37℃封
闭2 h；
8)加入5% BSA稀释的抗TXNIP、LC3、P62、mTOR、p-mTOR、
Nitrotyrosine、β-actin 抗体（稀释比例1：1000）4℃孵育过夜；9)TBST洗膜15 min×3，加入TBST稀释的辣根酶过氧化物标记的二抗
（稀释比例1：4000），37℃孵育1 h；
10)TBST洗膜15 min×3，将ECL试剂盒A液和B液等量混合，滴加膜
上反应1 min，将PVDF膜放入Odyssey FC成像系统中显影。底片经扫描仪透扫后，用美国UVP公司LabWorks 4.5软件对Western条带进行定量分析，以目的条带和β-actin 条带积分光密度值比值作为最终结果。
2.4 RT-PCR荧光定量
2.4.1 Trizol法提取系膜细胞RNA
所有操作均在冰浴下进行，所使用的器材、枪头、EP 管和试剂均经1‰DEPC水浸泡和高压消毒处理。具体步骤如下：
1)生理盐水洗涤细胞3次，尽量将液体吸干，加入Trizol裂解液1 ml，
裂解系膜细胞15 min，反复吹打移至1.5 ml EP管并做好标记；
2)分别加入200μl三氯甲烷，漩涡振荡混合器上剧烈振荡30 s，冰浴静
醋酸铅对人肾小球系膜细胞凋亡及Caspase-3的表达影响 贾庆华杨霄鹏杨志华哈小琴﹡唐瑜 （中国人民解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心，甘肃省干细胞与基因药物重点实验 室，甘肃兰州730050，﹡通讯作者） 摘要目的探讨醋酸铅对人肾小球系膜细胞（HRMC）凋亡作用及Caspase-3活性的影响。方法醋酸铅（5、10、20μmol/L）染毒HRMC 6、12、24、48h后，四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测细胞增殖。经醋酸铅（5、10、20μmol/L）染毒24h 后Hochest33342染色法检测观察细胞形态学变化；细胞免疫化学法、RT-PCR和Western Blotting检测Caspase-3的转录与表达。结果与空白对照组相比，不同浓度的铅均不同程度的抑制了HRMC的增殖(P<0.01)。Hochest33342-PI染色显示出醋酸铅组细胞成凋亡形态学改变。细胞免疫化学法、RT-PCR和Western Blotting结果显示醋酸铅组的Caspase-3转录与表达升高。结论醋酸铅可促进人肾小球系膜细胞凋亡, Caspase-3参与了凋亡过程。 关键词: 醋酸铅；人肾小球系膜细胞；Caspase-3；凋亡 The Caspase-3 expression in the toxic effect of lead acetate on the human renal mesangial cells(HRMC) JIA Qing-hua Yang Xiao-peng Yang Zhi-hua HA Xiao-qin Tang Yu (Experimental Center of Medicine, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command of Chinese PLA, Key Labaratory of Stem Cell and Gene Drug in Gansu Province, Lanzhou 730050, Gansu Province, China) Abstract Objective To investigate the effects of lead acetate on apoptosis and activity of caspase-3 in human renal mesangial cells(HRMC). Methods After treated with 5、10、20μmol/L lead acetate 6、12、24、48h, methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) was performed to measure HRMC proliferation. Hochest33258-PI staining was applied to observe the morphological changes, and the transcription and expression level of Caspase-3 was detected with immunohistochemical method, RT-PCR and Western blotting after lead(5、10、20μmol/L) treating HRMC 24h. Results Lead acetate significantly inhibited the cell viability of HRMC(P<0.01). Characteristical changes of apoptosis in HRMC were observed in the treated group. RT-PCR、western blotting and immunohistochemical analysis indicated the transcription and expression of Caspase-3 was increased by the treatment. Conclusion Lead acetate could induce apoptosis in HRMC with a possible mechanism which may be related to the activation of caspase-3. Key words: lead acetate; human renal mesangial cells(HRMC); Caspase-3; apoptosis 铅是环境中广泛存在的一种强重金属毒物，对机体的各个系统都有损害，特别是对肾脏。肾脏承担了近2/3排泄途径再由尿道排出[1]，当排泄率降低而吸收率升高，更易造成铅在体内的蓄积，最终导致铅中毒。大量研究动物实验已经证明铅中毒引起肾脏功能的损伤[2,3]，但其损伤机制尚不清楚。目前有关醋酸铅肾 甘肃省支撑计划项目(090NKCA106)
什么是系膜增生肾小球肾炎 系膜增生肾小球肾炎，这种肾脏疾病对我们来说是比较陌生的，那么什么是系膜增生肾小球肾炎呢？这个问题对于我们来说，也是需要了解一下的。接下来本文就为大家介绍系膜增生肾小球肾炎的相关知识，感兴趣的朋友可以一起来看看哦！下面请大家看详细的介绍。 系膜增生肾小球肾炎是根据光镜所见的一种病理形态学诊 断的肾炎，是一组以弥漫性肾小球系膜细胞增生及不同程度系膜基质增多为主要特征的肾小球疾病。1977年世界卫生组织正式 将其列为一种原发性肾小球肾炎病理类型。 系膜增生肾小球肾炎的病因仍未明确。部分病例起病前有感染史，以上呼吸道感染居多， 系膜增生肾小球肾炎但病原不明，感染对系膜增生性肾小球肾炎确切的作用也不清楚。鉴于免疫荧光检查有多种表现，推测系膜增生性肾小球肾炎的致病因素可能存在多种。
系膜增生肾小球肾炎的治疗方法应根据临床表现结合病理特点选择使用，并须通过长期随访，调整治疗方案。一般治疗同其他肾脏疾病。 1、单纯血尿病理改变仅有轻度系膜增生，中度以下蛋白尿伴或不伴血尿，24h尿蛋白定量小于1.5g，病理改变为轻度或中度系膜增生的患者，轻者无须特殊治疗。对于尿蛋白定量1～2g/24h的患者，给予常规量糖皮质激素治疗，有助于缩短缓解时间，减轻肾脏的病理改变。 2、大量蛋白尿或肾病综合征此类患者无论病理改变轻重，均应给予足量的糖皮质激素治疗。即便病理学改变为系膜增生轻微、无弥漫性Ig和（或）补体沉积，也不伴局灶节段性肾小球硬化者，也要给予泼尼松（强的松）治疗。 3、合并高血压及肾功能不全此型为系膜增生性肾炎中预后最差者。病理改变显示中度至严重弥漫性系膜增生伴局灶节段性
高迁移率族蛋白1刺激人肾系膜细胞增殖并分泌纤维化相关 因子 摘要】目的：探讨高迁移率族蛋白1（high mobility group prptein,HMGB1)在促使人肾系膜细胞(human renal mesangial cell, HRMCs)增殖及分泌纤维化相关因子中的作用。方法：用不同浓度梯度的重组HMGB1刺激体外培养的人肾系膜细胞，以CCK-8测定人人肾系膜细胞增殖情况，以ELISA方法检测培养上清液中纤维化相关因子TGF-β1的分泌量，以real-time PCR法测定细胞周期蛋白cyclinD、PNCA蛋白的表达。结果：一定浓度的HMGB1可刺激人肾小球系膜细胞的增殖，细胞内细胞周期蛋白cyclinD、PNCA基因表达增加，细胞培养上清液中TGF-β1浓度增高。结论：HMGB1通过刺激人肾小球系膜细胞增殖并分泌TGF-β1参与了肾脏纤维化过程。 【关键词】高迁移率族蛋白1；人系膜细胞；纤维化；TGF-β1；增殖；细胞因子【中图分类号】R68 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）36-0023-03 Effect rHGMB1 on proliferation of human renal mesangial cells and secretion of fibrosis-related cytokines. Zhou Jianguang,Chen Yu. Department of General Medicine, The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310019, China. 【Abstract】Objective To investigate the role of HMGB1 in inducing human renal mesangial cells (HMCs) to proliferate and secret fibrosis-related cytokines. Methods Recombinant protein HMGB1 (rHMGB1) was incubated with HMCs and then proliferation assay was carried out with CCK-8; cyclinD and PCNA genes were determined with real time PCR; supernate of cultured HRMCs with rHMGB1 was examined for detection of TGF-β1 with ELISA method. Results HMGB1 promoted proliferation of HRMCs; HMGB1 increased expression of cyclinD and PCNA genes involving cell proliferation; rHMGB1 increased secretion of TGF-β1 in supernate of cultured HMCs. Conclusion rHMGB1 was involved in fibrosis of kidney by inducing HRMCs to proliferate and secret fibrosis-related cytokines. 【Key words】HMGB1; Human renal mesangial cells; Fibrosis; Cytokines; Proliferation; TGF-β1 肾脏纤维化是多种疾病导致肾功能衰竭的共同通路。肾脏系膜细胞的增殖，纤维化相关因子对肾脏固有细胞的刺激，是肾脏纤维化的两个重要因素。慢性的炎症反应又是导致肾脏纤维化的另一重要因素。高迁移率族蛋白1（high mobility group prptein, HMGB1)是晚期炎症因子，可诱发和促进炎症反应，也和多个脏器的纤维化有关。狼疮性肾炎的主要病理表现为增生性肾小球肾炎。我们在前期狼疮小鼠的研究中发现，系膜增生明显的小鼠肾脏组织HMGB1表达明显升高。据此推测HMGB1可能促进人肾系膜细胞的增殖，后者分泌纤维化相关因子，促使肾脏纤维化的进程。本实验拟通过体外细胞学实验观察重组HMGB1对人肾系膜细胞增殖和纤维化相关因子分泌的影响。 1.材料和方法 1.1 材料和试剂 CCK-8试剂盒购买自江苏碧云天生物有限公司，逆转录试剂盒以及Real time-PCR试剂盒购自TAKARA公司。ELISA试剂盒（TGFbeta1）购自RD公司。人肾系
填空 弥漫性硬化性肾小球肾炎的特点是大量肾小球____________及__________。纤维化、玻璃样变性 肾盂肾炎是_________和__________感染性__________性炎。 弥漫性新月体性肾小球肾炎电镜检查见_________不规则__________部分 _________出现__________，_________。 急性毛细血管内增生性肾小球肾炎免疫荧光检查见毛细血管壁的________有 ________的IgG、C3沉积。 有一患者临床表现为少尿，血尿、蛋白尿、管型尿、水肿和高血压，经治疗后在短时间内痊愈，应诊断为下列哪种肾小球肾炎B A：新月体性 B：毛细血管内增生性 C：慢性硬化性 D：轻微病变性 第2题：关于肾细胞癌的组织来源下列哪项正确 d A：起源于血管内皮细胞 B：起源于系膜细胞 C：起源于移行上皮 D：起源于肾小管上皮 第3题：肾于肾炎细胞感染的主要途径是：b A：血源性感染 B：上行性感染 C：坏死后感染 D：以上都不是 第4题：有广泛新月体形成的是下列哪型肾小球肾炎：d A：膜性肾小球肾炎 B：IgA肾病 C：膜增生性肾小球肾炎 D：毛细血管外增生性肾小球肾炎 第5题：下列哪项不符合慢性肾盂肾炎：a A：双肾病变对称 B：双肾病变不对称 C：皮髓分界不清 D：肾盂肾盏变形 第6题：肾盂肾炎最常见的致病菌是：d A：葡萄球菌 B：链球菌 C：痢疾杆菌 D：大肠杆菌 第7题：关于肾母细胞瘤，下列哪项不正确： A：成人多见 B：瘤体巨大 C：肿瘤有多种成份 D：切面呈多色彩性 第8题：纤维化玻璃样变的肾小球相互靠近集中的现象见于下列哪型肾炎：b A：慢性肾盂肾炎 B：硬化性肾小球肾炎 C：膜性肾小球肾炎 D：新月体性肾小球肾炎第9题：慢性肾盂肾炎肉眼检查可见肾脏表面有b A：弥漫细小颗粒 B：不规则凹陷瘢痕 C：多发性小脓肿 D：斑块状出血状 第10题：弥漫性膜性肾小球肾炎的病变特征是：b A：系膜弥漫性增生 B：毛细血管壁弥漫性增厚 C：系膜及基底底膜均增生 D：局灶性基底膜增厚 第11题：急性增生性肾小球肾炎患者出现高血压的主要原因是：d A：肾素增加 B细动脉硬化 C小动脉硬化 D：水钠潴留 第12题：新月体性肾小球肾炎免疫荧光检查结果显示d A：线状荧光 B颗粒状荧光 C：荧光阴性 D：以上均可 第13题：下列那项符合轻微病变性肾小球肾炎：c A：间质病变轻微B：肾小管病变轻微 C：肾小球病变轻微D：血管病变轻微 第14题：新月体形成过程中刺激球囊壁层上皮细胞增生的主要成分是 d A：红细胞B：白蛋白C：血小板D：纤维素 第15题：新月体内的细胞主要是：c A：脏层上皮细胞B：血管内皮细胞 C：壁层上皮细胞D：系膜细胞 第16题：下列哪项符合急性肾盂肾炎：a A：肉眼观有大小不等的小脓肿形成 B：系膜细胞明显增生C：发病机理为变态反应 D：肾小管上皮再生明显 某患者发现尿中有细菌及变性坏死的中性白细胞，应诊断为下列哪种疾病 c A：肾小球肾炎B：肾萎缩C：肾盂肾炎D：肾积水 第18题：急性增生性肾小球肾炎肉眼观病变特征为：a A：大红肾B：大白肾C：脓肿肾D：出血肾 第19 下列哪型肾小球肾炎发病与T细胞功能异常有关d A：膜性肾小球肾炎B：膜增生性肾小球肾炎 C：硬化性肾小球肾炎D：轻微病变性肾小球肾炎 第20题：关于肾小球肾炎的发病机制，下列哪项错误：d A：体液免疫性损伤B：细胞免疫反应参与 C：主要由炎症价质所致D：感染因子直接引起
Caspase与细胞凋亡
Caspase与细胞凋亡 沈阳市第一人民医院神经内科 （110041）李莉 摘要：细胞凋亡，又称程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程。是细胞内由基因编码调控的按严格程序执行的细胞自杀过程。细胞凋亡是细胞生长发育过程的重要生命现象，是目前生物医学领域中的一个重要研究课题。阐明细胞凋亡的分子机制可对一些疾病的防治（如肿瘤，神经退行性疾病等）产生积极影响。许多实验提示细胞凋亡涉及一个瀑布式（Cascade）基因表达过程。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）在细胞凋亡中发挥始动和效应作用。本文就其生物学特性及其在凋亡中的作用机制作一综述。 关键词：Caspase；细胞凋亡
细胞凋亡的原词Apoptosis由两个拉丁字组成。Apo指离开，ptosis是落下，意思是细胞凋亡有如秋天落叶，到一定时候即失去生命力，遂即脱落，细胞凋亡，又称程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程，是细胞内由基因编码调控的，按严格程序执行的细胞自杀过程。通常需要30到60分钟，细胞凋亡形态学上的变化主要有DNA破碎，染色质凝集，细胞皱缩，线粒体肿胀和凋亡小体形成，而整个过程的结束以凋亡小体被吞噬为标志。多数类型细胞在凋亡的最后阶段发生细胞核DNA的降解：DNA降解成180-200bp或其倍数的片段，因此在琼脂糖凝胶电泳上可见到有特征性的梯形图谱。目前对凋亡的研究深入到分子水平，发现多种半胱氨酸蛋白酶（Cysteine aspartase）在细胞凋亡之中发挥着重要作用。 1、什么是Caspase 通过对美丽线虫（nematode caenorhabditis elegans）的细胞死亡机制的研究发现，至少有3个基因直接参与了细胞凋亡的调节。ced-3、ced-4直接介导细胞死亡，为促凋亡基因，其编码的蛋白分别为CED-3、CED-4、ced-3在细胞中起关键作用，称为线虫自杀基因，CED-3则称为死亡蛋白酶；ced-9则拮抗其作用，为抗凋亡基因，其编码的蛋白质为CED-9。后来发现CED-3与哺乳动物的白介素-1β转换酶（Caspase-1，原名为interleukin-1β-converting enzyme，ICE）具有高度同源性，CED-4，CED-9则分别与Apaf-1（apoptosis protease-activating factor-1）、Bcl-2同源。Bcl-2基因家族产物包括促进及抑制凋亡的两个蛋白质亚群[1]。哺乳动物的ICE 类蛋白是一组半胱氨酸蛋白酶[2]；且有以下共同特点：①和ICE有同源性；②有高度保守QACXG（X为R、Q或G）五肽序列[3]；③有发挥酶活性所必须的半胱氨酸；④特异地裂解天门冬氨酸位点；⑤前体蛋白均无活性，均需经蛋白水解后才产生活性；⑥转染不同细胞可诱导凋亡。因
系膜增生性肾小球肾炎患儿Bax蛋白表达与外周血淋巴细胞凋亡的关系 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的明确病理类型为系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)的原发性肾病综合征(nephrotic syndrome，NS) 患儿外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes，PBLs)Bax蛋白的表达与PBLs凋亡的关系。探讨MsPGN-NS患儿糖皮质激素(glucocorticoid，GC)抵抗的部分机制。方法所有患儿和正常儿童均于清晨空腹条件下采取静脉血，以密度梯度离心法分离PBLs，所得细胞用植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)或PHA+1×10-6mol/L地塞米松(dexamethasone，Dex)处理，培养24 h和48 h后应用流式细胞仪检测Bax蛋白的表达及细胞凋亡率。结果①MsPGN-NS患儿与正常儿童Dex组PBLs Bax蛋白表达量均显著高于空白对照组(P0.01)，且呈时间依赖性(48 h24 h)，但各时间点MsPGN-NS患儿Dex组Bax 的表达均低于正常儿童相应组(P0.01);②MsPGN-NS患儿与正常儿童Dex组PBLs凋亡率均高于空白对照组(P0.01)，且呈时间依赖性
(48 h24 h)，但各时间点MsPGN-NS患儿Dex组细胞凋亡率均低于正常儿童组(P0.01)。结论MsPGN-NS患儿PBLs Bax蛋白表达水平与PBLs凋亡率呈明显正相关，但其表达显著低于正常对照组，提示Bax蛋白的低表达是导致MsPGN-NS患儿PBLs凋亡减少，进而造成GC抵抗的原因之一。 【关键词】系膜增生性肾小球肾炎;肾病综合征;外周血淋巴细胞;Bax;凋亡 )Abstract：Ojective To investigate the relationship between expression of Bax protein and apoptosis in peripheral blood lymphocytes (PBLs) in children with primary nephrotic syndrome (NS) with the pathology type of mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN), so to further explore the mechanism of glucocorticoid-resistance in children. Methods The PBLs in MsPGN-NS and normal children were isolated with Ficoll-Hypaque gradient centrifugation. Then they were treated with phytohemagglutinin (PHA) or PHA plus dexamethasone (Dex). At the 24th and 48th hour of culture, the expression levels of Bax protein and apoptosis proportion were measured by flow cytometric analysis. Results The Bax protein levels in PBLs of Dex in the control group were much higher than those in both the MsPGN-NS group and normal children (P0.01) in a time-dependence manner (48 h24 h). However, at each time point the Bax protein levels of
肾小球肾炎的常见发病机理 肾小球肾炎的三大发病机理。肾小球肾炎是肾病疾病的一种，经常引起肾功能衰竭。肾炎肾病一般早期症状不明显，到了晚期肾功能衰竭，危害病人的生命。肾小球肾炎分为原发性和继发性两种，下面我们听听专家是如何介绍的，原发性肾小球肾炎的发病机理。 肾小球肾炎的三大发病机理，专家给出如下解释： 1、免疫复合物沉积在肾小球上皮细胞： 上皮细胞受到损伤，其表面的C3b受体会进一步诱使大量免疫复合物沉积至上皮下，导致膜型肾病的产生。如果光学显微镜下仅有肾小球上皮细胞肿胀，电子显微镜下可见上皮细胞足突广泛融合变平，则为微小病变肾病，绝大多数病例预后良好。 2、免疫复合物沉积在肾小球系膜区： 大量的免疫复合物沉积肾小球系膜区，吸引炎性介质浸润，产生炎性反应。导致肾脏系膜细胞损伤，使系膜细胞增殖、收缩。系膜细胞增生、系膜基质增多，这就是系膜增生性肾小球肾炎，此时如果再有内皮细胞的增生，就是毛细血管内增生性肾小球肾炎。随着细胞分泌的介质、基质增多，毛细血管管腔狭窄，造成缺血缺氧，同时系膜细胞在炎性介质与基质的作用下表型转化为肌成纤维细胞，大量细胞外基质产生，病情恶化，肾脏纤维化进展;系膜细胞收缩，导致滤过面积较少，滤过的分数降低，基底膜受到损伤，通透性增加，有用物质漏出;再有系膜细胞的吞噬功能下降，使得免疫功能下降，大分子物质不能被吞噬，大量堆积最终使得系膜细胞表型转化为肌成纤维细胞，分泌不易被降解的ECM，健康肾脏功能的细胞逐步丧失。总之，受损的系膜细胞在肾脏纤维化中占据了中心位置。随着损伤细胞的扩大和蔓延，肾脏的健康肾单位愈少，肾脏纤维化逐步进展。 3、免疫复合物沉积在肾小球内皮下： 正常健康的肾小球内皮细胞有其正常的功能，当内皮细胞受到损伤，结构发生变化，功能也相应的产生变化。受损后的内皮细胞抗凝活性下降，促进了血小板的粘附与聚集，导致肾小球毛细血管微血栓形成，局部缺血缺氧;再者由于受损，NO(一氧化氮)、PGI2(前列环素)等血管扩张因子减少，分泌的血管紧张素增加，导致血管收缩，产生肾内高压;此外，受损后电荷滤过屏障产生障碍，基底膜受伤通透性增加。内皮细胞受损后的三种结果交互作用，进一步导致肾脏局部微循环障碍，部分肾小球硬化，并出现血尿、蛋白尿等临床表现。 研究表明，肾小球肾炎患者发病的机制有很多，主要为抗原抗体反应引起的变态反应。 由于各类感染以及药物等，抗原抗体结合形成免疫复合物，根据自身不同的体积以及所携带电荷的影响沉积在肾脏不同的固有细胞区域，分别沉积在内皮下、系膜区、上皮下位置，免疫复合物不断的沉积，对肾脏不同的固有细胞形成损伤。根据肾脏病变的性质、部位以及范围，分为不同的病理类型，微小病变肾病，膜性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎等。 肾小球肾炎的三大发病机理。肾小球肾炎发病机理很多，大多数都是由肾小球肾病疾病演变而来，常规检查时肾病病人会有很多检查，主要表现特征是面色苍白、乏力、生长发育迟缓等就诊，确诊时常已伴有不同程度的肾功能不全。希望大家能够注意多多预防肾病疾病，做好肾小球肾炎的预防与治疗工作。
低密度脂蛋白对培养的人肾小球系膜细胞的增殖作用及冬虫夏草对其的影响 * 摘要目的：探讨肾小球硬化的发病机理；并发现治疗肾小球硬化的治疗方法。方法：(1)通过测定［3H］胸腺嘧啶的掺入率，检测体外培养的人肾小球系膜细胞的增殖；(2)对人肾小球系膜细胞进行纯化和培养并对低密度、高密度脂蛋白进行［125I］标记。结果：(1)肾小球系膜细胞选择性结合和摄取［125I］LDL，(2)LDL刺激系膜细胞增殖且增殖作用具有双向性，(3)冬虫夏草对LDL 引起的细胞增殖具有抑制作用。结论：LDL刺激系膜细胞增殖可能直接参与肾小球硬化的发病，高脂血症对肾脏的损害可能由肾小球系膜细胞介导；抑制系膜细胞增殖可能对肾小球硬化的防治具有一定的可行性。 主题词人类；脂蛋白类，LDL；冬虫夏草；肾小球硬化症，病灶性Proliferation of cultured human mesangial cells caused by LDL and the adserse effect of Cordyceps WANG Xiao-Xia, WU Zhao-Long Shanghai Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai(200032) Abstract AIM:To study the pathogenesis of glomerulosclerosis in vitro and find a treatment method of glomerulosclerosis.METHODS：Human glomerular mesangial cells were purified and cultured: Low density lipoprotein(LDL) and high density lipoprotein (HDL) labelled with［125 I］; and human mesangial cells （HMC）proliferation measured by counting ［3 H］thymidine incorporation. RESULTS：(1) Cultured HMC uptake ［125 I］LDL selectively, (2)LDL stimulated HMC proliferation and had a biphasic effect on HMC proliferation, (3)Cordyceps militaris had a strong inhibition on HMC proliferation induced by LDL. CONCLUSIONS：HMC proliferation induced by LDL may directly participate in the pathogenesis of glomerulosclerosis. The deleterious effects of hyperlipidemia on the kidney may be mediated by HMC. Therefore, inhibiting HMC proliferation may be practicable in the treatment of progressive glomerulosclerosis. MeSH Human; Lipoproteins, LDL; Glomerulosclerosis, focal; Cordyceps sinensis 肾小球硬化是导致肾功能减退的主要因素之一［1］。研究发现，高脂血症与肾小球硬化关系密切。高脂血症时，大量脂质沉积在系膜细胞表面引起细胞增殖，可能是导致肾小球硬化的关键［2］，作用机理还不太清楚。为了在细胞水平
Annexin V-FITC细胞凋亡检测详细步骤及说明 1. 对于悬浮细胞： a. 在进行完细胞凋亡刺激后，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS 轻轻重悬细胞并计数。注意：PBS重悬不能省 略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。 b. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 c. 加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。 d. 加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。 e. 室温(20-25oC)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。 f. 如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光，流式检测细胞凋亡的效果及其验证请参考图1和图2。初次进行流式细胞仪检测时，建议选择一组适当的细胞参考图2设置未染色、PI单染和Annexin V-FITC单染这3个对照。如果用于荧光显微镜检测，1000g 离心5分钟，收集细胞，用50-100μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测。用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测。 2. 对于贴壁细胞的消化后检测：
P21在肾小球系膜细胞的表达变化及意义△ 柳飞，唐万欣，黄颂敏* 四川大学华西医院肾内科，四川 成都 610041 摘 要：目的：探讨高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21表达的影响及其在糖尿病肾病（DN）发病机制中的作用。方法：将培养的大鼠1097系膜细胞株分为8组：正常对照组，高糖组，甘露醇组，不同浓度胰岛素组，高糖加不同浓度胰岛素组。用RT-PCR法检测各组系膜细胞P21mRNA表达。流式细胞仪定量检测各组系膜细胞前向角度散射光（FSC）大小。结果：正常对照组系膜细胞中P21mRNA有一定表达。高糖组P21mRNA表达明显增加为正常对照组的3.89倍(p<0.01)；FSC为正常对照组的1.42倍(p<0.01)。不同浓度胰岛素组系膜细胞P21mRNA表达及FSC大小随胰岛素浓度增加而增加，但无统计学意义（p>0.05）。结论：(1) P21mRNA在正常肾小球系膜细胞有一定表达。(2) 高糖刺激可使系膜细胞P21mRNA表达上调，且与渗透压无明显关系。(3) P21mRNA表达上调可导致系膜细胞肥大，在糖尿病肾病发病机制中起重要作用。 关键词：糖尿病肾病 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21 细胞肥大 糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是糠尿病主要的微血管并发症之一。在西方发达国家，DN已成为终末期肾功衰（End-stage Renal Failure, ESRD）的首位病因。在我国，随着糖尿病的逐渐增加，糖尿病肾病也呈上升趋势。因此，深入研究DN的发病机制，制定更加有效的防治措施已成为肾脏病工作者面临的重要问题。 DN的发病机制尚未完全阐明，一般认为是多种因素共同作用的结果。DN早期即出现肾小球高滤过以及肾小球肥大。肾小球肥大可导致肾脏结构不可逆的变化，如肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终导致终末期肾功衰。近年来的研究证实各种因素对细胞生长的影响最终发生在细胞周期水平[1]。细胞周期调控依赖于一系列细胞周期调控蛋白。其中，P21是目前已知的具最广泛活性的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。P21的过度表达与许多细胞增殖抑制和肥大有关[2-4]。有研究表明，糖尿病早期肾脏肥大至少部分与肾皮质P21蛋白表达增加有关[5]。而系膜细胞肥大在早期肾小球肥大中起关键作用，这已在糖尿病患者和糖尿病大鼠动物模型研究中得到证实[6、7]。P21在肾小球系膜细胞肥大中发挥什么作用，目前国内外研究甚少。 本研究采用半定量RT-PCR法，观察高糖刺激，不同浓度胰岛素作用下，鼠1097系膜细胞中P21mRNA的表达及其变化。相应条件下，用流式细胞仪测量细胞前向角散射光大小，从而获得系膜细胞体积大小，从细胞分子水平探讨高糖、胰岛素干预下，P21在系膜细胞肥大-肾小球肥大的关系，为DN的防治寻求新的治疗靶。 1 材料和方法 *通讯作者△教育部博士点基金资助项目，编号20020610078
小鼠肾系膜细胞 小鼠肾系膜细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠肾系膜细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠肾系膜细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠肾系膜细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠肾系膜细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
细胞种类统计，培养基加抗生素 细胞名称PK-15 猪肾细胞； 形态特性上皮细胞样 生长特性贴壁生长 细胞数量100万-200万 培养条件EMEM+10%Hyclone灭活血清 特征特性PK-15细胞建系于1955（Stice,E）。是PK-1a细胞的克隆系。该细胞系可用于多种病毒的增值及特性研究。另外，电镜观察发现，PK-15细胞内有C-型病毒颗粒存在，是研究C-型病毒的材料。
细胞培养常用几款抗生素比较 １、最常用：青霉素、链霉素联合抑制细菌，即所谓的“双抗”，主要针对革兰氏阳性菌、阴性菌；对于细菌的感染也可用庆大或卡那霉素； ２、如果真菌污染严重，可用两性霉素／制霉菌素控制； ３、若为支原体污染，可用庆大霉素／四环素／红霉素； 关于细胞培养抗生素使用的建议：由于细菌和酵母等的污染很容易观察到，及时清理污染细胞可大大减少支原体、病毒的污染机会。潜在的支原体、病毒的感染会带来很大的危害。这些微生物的存在会影响细胞的理化性质，从而使研究者得到错误的实验结果。由于过滤技术的提高和超净台质量的改进，在规范细胞培养操作过程中引进污染的机会已经被大大减低。所以，建议常规的的细胞培养中不要使用抗生素。只有在培养污染源较多(如组织培养)或者非常珍贵的细胞株时才使用抗生素。 青霉素80万u+pbs 4ml,链霉素100万u+pbs 5ml,各自混匀后，再一起混匀，过滤分装在9个1ml EP管中，放在-20度，配1升培养基时加1ml,或者按这个比例临时加。
双抗就是青链霉素混合液，青链霉素混合液(100X) (Penicillin-Streptomycin Solution）双抗，是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内。青霉素-链霉素溶液(100X)中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。 青链霉素的浓度最终应为100单位/ml。 做法：青霉素是160万单位(0.96g)/瓶，链霉素是100万单位(1g)/瓶，取青霉素0.06g，链霉素0.1g，加10ml灭菌双蒸水，配制成青链霉素1万单位的母液，过滤后分装在小EP管中。使用时，可取1ml母液放入100ml的培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。
细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活 化（Caspase ）→进入连续反应过程 细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开 关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋 亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，比较清楚的通路主要有： 1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外 界因素是细胞凋亡的启动剂， 它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号， 引起细胞凋亡，我们以 Fas -FasL 为例：Fas 是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家 族成员，它与 FasL 结合可以启动凋亡信号 的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡 诱导复合物，这个复合物中包括带有死亡结构域的 Fas 相关蛋白 FADD 。Fas 又称CD95，是由325个氨基 酸组成的受体分子， Fas 一旦和配体 FasL 结合，可通过 Fas 分子启动致死性信号转导，最 终引起细胞一系 列特征性变化，使细胞 死亡。 Fas 作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但 FasL 的表达 却有其特点，通常只出现于 活化的 T 细胞和NK 细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效 地以凋亡途径置靶细胞于死地。 Fas 分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,deathdomain ）。三聚化 的 Fas 和FasL 结合后，使三个 Fas 分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同 死亡结构域的 蛋白FADD 。FADD 是死亡信号转录中的一个连接蛋白， 它由两部分组成：C 端（DD 结构域）和N 端（DED ） 部分。DD 结构域负责和Fas 分子胞内段上的 DD 结构域结合，该蛋白再以 DED 连接另一个带有 DED 的后 续成分，由此引起N 段DED 随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶 8（caspase8）酶原发生同嗜性交联，聚合多 个caspase8的分子，caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的 级联反应，即 Caspases ，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而 TNF 诱导的细胞凋亡途径 与此类似2）细胞色素C 释放和Caspases 激活的生物化学途径线粒体是细胞生命活动控制中心， 它不仅是 细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验 表明了细胞色素 C 从线粒体释放是细胞 凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素 C 在dATP 存在的条件下能与凋亡相关 因子 1（Apaf-1）结合， 使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体， caspase-9被激活，被激活的 caspase-9 能激 活其它的caspase 如caspase-3 等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡 诱导因子，如 AIF ，参与 激活caspase 。可见，细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。 促凋亡因子能诱导细 胞色素 C 释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素 C 从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的 关键问题。 多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途 经也有细胞色素 C 从线粒体 的释放。如对Fas 应答的细胞中，一类细胞（ type1）中含有足够的胱解酶 8（caspase8）可被死亡受体 活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达 Bcl-2并不能抑制Fas 诱导的细胞凋亡。在另一类细胞 （type2） 如肝细胞中，Fas 受体介导的胱解酶 8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号 需要借助凋 亡的线粒体途经来放 大，而 Bid-- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶 8 向线 粒体传递的信使。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚， 但是已经确定Caspase 即半胱天冬蛋白 酶在凋 亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是 Caspase 不可逆有限水解底物的级联放大反应 过程，到目前为止，至 少已有 14种Caspase 被发现，Caspase 分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱 氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase 基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β 和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括 caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase 家族一般具有以下特征：1)C 端同源区存在半胱氨酸激活位点，
细胞凋的亡概念 细胞凋亡(apoptosis)是指为维持内环境稳定，在一定的条件下，细胞遵循的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 从细胞功能上看，细胞凋亡对多细胞生物体具有重要的意义。一方面在生物发育过程中细胞凋亡可以清除没有功能的、不需要的、不正常的和有害的细胞，优化组织器官的结构和细胞数目，确保正常个体发育。另一方面在生物体整个生命过程中，每天都会产生许多功能异常的细胞，如癌变细胞、衰老细胞、被微生物侵袭的细胞等。细胞凋亡可以将这些细胞清除，并且由新诞生的功能正常的细胞替换。因此，体内细胞的诞生和死亡处于动态平衡，从而维持机体组织器官中细胞数量稳定和功能正常。 细胞凋亡信号转导通路 细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活(Caspase)→进入连续反应过程。由于细胞凋亡启动阶段的不同，其可分为三条主要通路，即线粒体通路、内质网通路、死亡受体通路。 线粒体通路，即通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活 Caspase。线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。此通路由含BH3 结构域的Bcl-2 家族成员(Bid、 Bad、 Bim、 Harikari 、Noxa等)与另外的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆的Bcl-2家族成员(Bax亚家族成员Bax，Bak 等) 相互用，导致后者的寡聚并插入线粒体膜，从而引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素 C (Cytc)和其他蛋白。Cytc 的释放是线粒体凋亡路径的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素 C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子 1(Apaf-1)结合，使其形成多聚体，而后通过 Apaf-1 氨基端的 Caspase 募集结构域(caspase recruitment domain CARD)募集胞质中的Caspase-9 前体，并促使 caspase-9 与其结合形成凋亡小体，被激活的 caspase-9能激活其它的 caspase 如caspase-3 和 caspase-7 等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如 AIF，参与激活 caspase，促凋亡因子能诱导细胞色素C 释放和凋亡小体的形成。 内质网通路，即由内质网失常引起，而非以细胞膜或线粒体为靶点的凋亡信号触发。内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所，同时也是Ca2+的主要储存库。内质网Ca2+平衡的破坏或者内质网蛋白的过量积累是关键步骤，它们会诱导位于内质网膜的Caspase-12 的表达，同时诱导胞质的 Caspase-7 转移到内质网表面。Caspase-7 可激活Caspase-12，而激活的Caspase-12 可进一步剪Caspase-3 从而引发细胞凋亡。 死亡受体通路：由各种外界因素作为细胞凋亡的启动剂，然后通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡。死亡受体为一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子受(TNFR)基因超