蛋白质结构解析的方法对比综述
工程硕士李瑾
摘要：到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射法和NMR法，这两种方法各有优点和不足。
关键词：x射线衍射法 NMR法
到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射法和NMR法。其中X射线的方法产生的更早，也更加的成熟，解析的数量也更多，第一个解析的蛋白的结构，就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和不足[1]。
首先是X射线晶体衍射法。该方法的前提是要得到蛋白质的晶体。通常是将表达目的蛋白的基因经PCR扩增后克隆到一种表达载体中，然后转入大肠杆菌中诱导表达，目的蛋白提纯之后摸索结晶条件，等拿到晶体之后，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，得到蛋白质的原子结构[2]。
x射线晶体衍射法的优点是：速度快，通常只要拿到晶体，最快当天就能得出结构，另外不受肽链大小限制，无论是多大分子量的蛋白质或者RNA、DNA，甚至是结合多种小分子的复合体，只要能够结晶就能够得到其原子结构。所以x射线方法解析蛋白的关键是摸索蛋白结晶的条件。该方法得到的是蛋白质分子在晶体状态下的空间结构，这种结构与蛋白质分子在生物细胞内的本来结构有较大的差别。晶体中的蛋白质分子相互间是有规律地、紧密地排列在一起的，运动性较差；而自然界的生物细胞中的蛋白质分子则是处于一种溶液状态，周围是水分子和其他的生物分子，具有很好的运动性。而且，有些蛋白质只能稳定地存在于溶液状态，无法结晶[2]。
核磁共振NMR（nuclear magnetic resonance）现象很早就被科研人员观察到了，但将这种方法用来解析蛋白质结构，却是近一二十年的事情。NMR法具体原理是对水溶液中的蛋白质样品测定一系列不同的二维核磁共振图谱，然后根据已确定的蛋白质分子的一级结构，通过对各种二维核磁共振图谱的比较和解析，在图谱上找到各个序列号氨基酸上的各种氢原子所对应的峰。有了这些被指认的峰，就可以根据这些峰在核磁共振谱图上所呈现的相互之间的关系得到它们所对应的氢原子之间的距离。[3]可以想象，正是因为蛋白质分子具有空间结构，在序列上相差甚远的两个氨基酸有可能在空间距离上是很近的，它们所含的氢原子所对应的NMR峰之间就会有相关信号出现[4] 。通常，如果两个氢原子之间距离小于0.5纳米的话，它们之间就会有相关信号出现。一个由几十个氨基酸残基组成的蛋白质分子可以得到几百个甚至几千个这样与距离有关的信号，按照信号的强弱把它们转换成对应的氢原子之间的距离，然后运用计算机程序根据所得到的距离条件模拟出该蛋白质分子的空间结构。该结构既要满足从核磁共振图谱上得到的所有距离条件，还要满足化学上有关原子与原子结合的一些基本限制条件，如原子间的化学键长、键角和原子半径等[4]。
NMR解析蛋白结构常规步骤如下：首先通过基因工程的方法，得到提纯的目的蛋白，在蛋白质稳定的条件下，将未聚合，而且折叠良好的蛋白样品（通常是1mM－3mM，500ul，PH6－7的PBS）装入核磁管中，放入核磁谱仪中，然后由写好的程序控制谱仪，发出一系列的电磁波，激发蛋白中的H、13N、13C原子，等电磁波发射完毕，再收集受激发的原子所放出的“能量”，通过收集数据、谱图处理、电脑计算从而得到蛋白的原子结构[5] [6]。
用NMR研究蛋白质结构的方法，可以在溶液状态进行研究，得到的是蛋白质分子在溶液中的结构，这更接近于蛋白质在生物细胞中的自然状态[7]。此外，通过改变溶液的性质，还可以模拟出生物细胞内的各种生理条件，即蛋白质分子所处的各种环境，以观察这些周围环境的变化对蛋白质分子空间结构的影响。在溶液环境中，蛋白质分子具有与自然环境中类
似的运动性，可以观察到整个结构表面的一些松散链段的运动性，而蛋白质的活性部位往往是在整个结构的表面，因此NMR方法为蛋白质与蛋白质、蛋白质与底物或小分子的相互作用提供了一个有效的观察手段[8]。到目前为止，用该方法来解析蛋白质结构已经十非常成熟。它的优点就是，蛋白在液体中得到结构，是一个动态的结构，事实上所有已发表的NMR结构都是十个或者二十个结构的ensemble（集合），这就是因为这些结构都是进行能量优化后符合条件的结构，或者说就是溶液中的蛋白结构。因为是动态就很容易的研究蛋白与其他蛋白或者配基的相互作用[9] [10]。缺点是，该方法受蛋白质大小的限制，到目前为止NMR解析蛋白结构的上限是50kd[11]。
从1980年代初NMR法出现至今，核磁共振技术在生物大分子的结构研究方面有了飞速的发展，一方面是由于仪器技术本身的发展，能够产生的磁场越来越强；计算机的计算速度也越来越快，更多地是由于实验方法上的创新和发展，由二维的核磁共振实验发展成三维甚至更多维的实验[12]。借助于基因技术可以得到同位素富集的蛋白质样品,核磁共振的实验也从原来单一的核发展到三种甚至四种核同时在一个实验中共振而产生相关信号。核磁共振方法的应用范围也从原来单一的蛋白质分子的空间结构研究发展到蛋白质动力学方面的研究，蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸以及小分子的相互作用和药物筛选中蛋白质分子与药物分子的结合等方面[13]。在此过程中，NMR技术始终处于发展的前沿，围绕这一技术提出的许多原创性观点和方法已被广泛地接受和应用。随着人类基因组学和蛋白质组学研究的不断深入，蛋白质结构组学的研究也会随之兴起，核磁共振技术在这方面的应用会更多更广。这些应用的需求反过来也会促进核磁共振技术本身的进步和发展，使之更趋成熟和完善。
参考文献：
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[13]. 王乐希, 郑珩, and 劳兴珍, 蛋白质分子柔性对接方法研究进展. 药物生物技术, 2008(04).