单克隆抗体(McAb)制备技术
1975年Khler和Milstein首次利用杂交瘤技术生产单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人们誉为“免疫学中的一场革命”，该项技术具有巨大生命力和发展前景，目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学、病毒学、生物化学、遗传学、药物学等许多领域的研究。下面以抗空肠弯曲菌共同抗原McAb的制备为例，介绍McAb的制备技术。
一、材料和方法
(一) 材料
1 PRMI1640培养液 PRMI1640培养基粉104g，双蒸馏水1000ml，抽滤或高压
蒸气灭菌，每瓶80ml分装。
2 完全PRMI1640培养液 PRMI1640培养液80ml,1mol/L Hepes
2ml,0.2mol/L谷
氨酰胺1ml，青、链霉素溶液(1000u/ml)1ml，灭活小牛血清20ml。
3 次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT母液×100)次黄嘌呤1361mg，胸腺嘧核苷387mg，蒸馏水加至100ml。在45～50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置 -20℃ 中保存。
4 氨基喋呤(A母液×100)氨基喋呤176mg，蒸馏水90ml，1mol/L NaOH 0.5ml，加蒸馏水至100ml，再加0.5ml 1mol/L HCl中和，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。
5 HAT选择性培养基完全PRMI1640培养液100ml,100×HT母液1ml，100×A母液1ml。用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。
6 HT培养液完全RPMI1640培养液100ml，100×HT母液1ml。用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。
7 50%聚乙二醇(PEG)溶液将PEG(MW4000)放在试管内加盖，121.3℃高压蒸气灭菌20min。使用前加入等量的pH值8.2无血清培养液，置56℃混合，直至完全溶解，移置37℃备用。
8 8-氮杂鸟嘌呤称取8-氮杂鸟嘌呤20mg，溶于4mol/L NaOH 10ml 或0.36%Na2CO3 10ml中，以蒸馏水稀释至1000ml，过滤备用。
9 台盼蓝溶液台盼蓝100mg，溶于PBS 100ml中即成。
10 0.34mol/L蔗糖溶液蔗糖5.8g，蒸馏水50ml，高压蒸气灭菌，分装。
(二) 方法(以空肠弯曲菌共同抗原的单抗制备为例)
1. 动物免疫将提取的空肠弯曲菌共同抗原(CA)与等量的福氏完全佐
剂乳化，以皮下多点及腹腔注射途径对8周龄左右的BALB/c小鼠(雌雄不限)进行基础免疫，间隔14天后，改为福氏不完全佐剂，追加免疫，14天后再免疫一次，于融合前3天，经尾静脉用水剂抗原加强免疫一次。每次抗原用量为每只鼠25～50μg。
2. 细胞悬液的制备
(1) 骨髓瘤细胞：在进行细胞融合前的48h，用含10%小牛血清1640培养液，将供融合用的骨髓瘤细胞(NS1或SP2/0)作增殖培养。融合前24h 再以同样培养液将骨髓瘤细胞培养物换液1次，使细胞浓度于融合当天达到对数生长期的105细胞/ml，取数瓶骨髓瘤细胞，轻轻倒去瓶内原有培养液，加入无血清1640培养液少许，用毛细管吹打瓶壁数次，将细胞洗下(如用冷的1640培养液冲洗瓶壁细胞更容易洗下)。将骨髓瘤细胞悬液一并收入离心瓶中，悬浮于1640培养液中，轻轻混匀，吸出少量培养液进行细胞计数，并用台盼蓝染色观察死活细胞率，成活细胞应高于90%。细胞悬液以1 000 r/min离心10min，倾去上清液，再悬于无血清的1640培养液中供融合用。
(2) 免疫小鼠脾细胞：取上述加强免疫后3～4天的小鼠，挖去眼球放血，收集血液，离析血清，供检测抗体效价用。然后拉颈处死，用75%酒精将小鼠浸泡消毒，立即放超净台内，用消毒剪刀剪开小鼠腹腔，取出脾脏。用pH值7.4无血清1640培养液将脾脏冲洗，立即用镊子将脾脏放在消毒铜网上，置于玻璃培养皿内，然后倒入少量1640培养液，用5ml针筒芯子研磨脾脏使成浆状，将此吸入尖底刻度离心管内，于冰浴中静置5～10min，待大块脾组织下沉到底部，轻轻吸出上层脾细胞悬液，移入另一刻度离心管内，悬浮于30ml 1640培养液中。轻轻混匀，吸取少量溶液，进行细胞计数及活力检查，活细胞率不应低于90%。以1000 r/min离心10min，倒去上清，将底层脾细胞再悬浮于少量无血清1640培养液中。
取脾细胞的方法，除了在铜网上研磨外，还可用两个注射针头轻轻向一个方向将细胞从脾膜内梳刮下来，或在脾包膜上刺几个孔，然后用针头注入培养液，将细胞冲洗出来；或用剪刀反复将脾脏剪碎，以获得脾细胞。
(3) 小鼠腹腔巨噬细胞：取12周龄以上，最好是与骨髓瘤同系小鼠(其他小鼠
也可)，先挖去一只眼球放血，待血滴不出为止。放血的目的是避免取腹腔细胞时腹腔内出血，造成大量红细胞混入饲养细胞内。若小鼠不死，则可拉颈处死，浸入75%酒精中消毒，随即放入超净台内，用消毒镊子和剪刀剪开小鼠腹部外层皮肤，剪时要小心，切勿将腹膜剪破，使腹腔内液体流失。然后向上、下两侧方向拉开腹部皮肤，暴露腹膜。用消毒注射器抽取
0.34mol/L蔗糖溶液(或无血清1640培养液)4ml用镊子将腹膜提起，将溶液注入小鼠腹腔内。一只手固定针筒，针头停留在腹腔内，轻轻按摩腹壁1～2min，目的是促使巨噬细胞游出。然后用注射器抽回腹腔内液体，也可用毛细吸管将液体吸出，注入到预先置于冰浴中的尖刻度离心管内，置冰浴的目的主要是可以避免或减少玻璃管壁对巨噬细胞的吸附作用。若用塑料离心管则可减少细胞吸附。细胞悬液以1 000 r/min离心10min，倒去上清液，加入含20%小牛血清1640培养液中。通常每只小鼠可获得3～5×106个腹腔巨噬细胞。把沉淀细胞悬浮于20ml培养液中，混匀，分注于2块96孔(或4块40孔)培养板中，每孔0.1ml(约2滴)，培养板加盖后，放入37℃含5%～10%CO2培养箱中培养。24h后，可以放在倒置显微镜下观察。生长良好的饲养层，巨噬细胞或小淋巴细胞的胞体饱满，折光性强，部分或大部分细胞变成棱形。腹腔细胞培养物保持在良好的潮湿温箱内，至少可在7天内保持活力。
饲养层细胞经24h培养后，若细胞形态变小，无光泽，视野中不见棱形细胞，则不能供融合细胞的培养用。其原因可能是细胞培养板处理不当，或培养基中含有毒性物质，或培养条件不适(pH值、湿度、CO2等)所造成的。
加入巨噬细胞的作用，是由于杂交瘤细胞早期十分脆弱，细胞稀少时不易生长，加入一些巨噬细胞、胸腺细胞或脾细胞，满足了杂交瘤细胞对密度的依赖性，消除一些有毒或有抑制生长作用的细胞碎片，提供生长刺激因子等，促进杂交瘤细胞的生长。饲养细胞中，除巨噬细胞外，胸腺细胞、脾细胞均具有较好的效果。
3. 细胞融合的步骤细胞融合过程在37℃水浴箱内进行，并要求严格的无菌操作。 (1) 混合细胞：将上述制备的脾细胞和瘤细胞按细胞数的2～10∶1混合于刻度离心管，经1 000r/min离心10min，倾尽上清液，用力振动试管，将细胞打散，使细胞沉淀块疏松成糊状。
(2) 加入PEG：将离心管直立于操作环境中，在90s内滴加完50%PEG 溶液0.5ml，边加边摇动，加完后，静置90s。
(3) 终止PEG的作用：用无血清1640培养液终止PEG的作用。仍在边摇晃的情况下，在第一个30s内滴加1ml；在下一个30s滴加3ml，在最后90s内滴加16ml。加入培养液后，不要多摇动，以免影响细胞融合率，最后补充培养液至30～40ml，在室温中静置5min。
(4) 离心洗涤：以1 000 r/min离心沉淀10min，弃去上清液。加满无血清培养液，再离心10min，弃去上清液，以洗除残余的PEG。单克隆抗体(McAb)制备技术
(5) 加入培养孔内：把沉淀细胞用含20%小牛血清的HAT培养液50ml 混匀，分别加入到5块96孔培养板中，每孔0 1ml，每孔原有0 1ml
饲养细胞，故现在每孔有0.2ml培养液。将培养板置于37℃含5%～10%CO2培养箱中培养。
(6) 对照孔：第一行孔中为用15%小牛血清HAT液稀释的骨髓瘤细胞，细胞数约1×105/孔。骨髓瘤细胞在2～3天可见明显退变，如果不退变则表明HAT失效，或者细胞已由HGPRT- 回复成HGPRT+。
第二行孔中为用15%小牛血清HAT液稀释的脾细胞，细胞数4×105/孔。脾细胞在6～7天后也会见到退变现象，在上清液中有时可检测出抗体，这是脾细胞分泌出来的，随着换液，抗体浓度会愈来愈低，以至消失。如果脾细胞继续旺盛增殖，而且抗体浓度不降低，有两种可能性：一种是在换液时混入杂交瘤细胞，另一种是脾细胞本身可能在小鼠体内转化成能长期培养的免疫母细胞，这种可能性是很小的，一旦遇到应抓住不放，将它克隆化。可取少量细胞融合悬液，于显微镜下观察细胞融合情况。可能出现几种情况：未融合的脾细胞；未融合的骨髓瘤细胞；脾细胞与脾细胞的融合体；瘤细胞与瘤细胞的融合体；脾细胞与骨髓瘤细胞的融合体，通过显微镜下观察，可粗略地了解融合的情况及融合过程中细胞的破损率。
4.融合后混合细胞的培养
(1) 换液：在培养过程中，通常按半量换液法(即吸去每个孔1/2体积的培养液，再加入1/2体积新鲜的HAT培养液)换液，每次从每孔中吸出0.1ml培养液，加上0.1ml新鲜的HAT培养液。
第5、8及11天换以20%小牛血清HAT液，第14、18、22、25天换以20%小牛血清HT液。这要根据实际情况来决定，如果发现培养液变黄，应及时换液，特别是后期细胞克隆较大的，一般隔日换液一次。
换液时，应首先换对照孔，以免将杂交瘤细胞及抗体带入对照孔中。严格说，吸出上清液时，每孔只许用一个吸头，这样才不致于把一个孔中的细胞及抗体带入另一孔中，也可避免污染扩散。
(2) 观察：每天都应观察，一是看是否有污染，二是看细胞生长状态。一般经过3～5天培养，单个的杂交瘤细胞开始长成几个或十几个细胞的集落，大多数在8～10天时形成，个别至两周左右才能见到。
5.抗体阳性孔的检测当杂单克隆抗体(McAb)制备技术交瘤细胞的大小达到孔底面积的1/10时，就可检测上清液中的抗体，筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞，并尽早进行克隆化。不分泌抗体的杂交瘤细胞比分泌抗体的杂交瘤细胞生长得快，由于培养液中的营养有限，分泌抗体的杂交瘤细胞有被挤掉的危险，因此要早检测、早克隆。
第一次检测抗体一般在第二次换液的两天后，即融合后的第10天进行。过早检测，由于杂交瘤细胞太小，分泌抗体少，易出现假阴性；也可能由于免疫脾细胞分泌的抗体仍存在，出现假阳性反应。因此必须同时检测脾
细胞培养孔作为对照。第二次检测杂交瘤细胞培养上清液中抗体的方法，可以根据抗原的性质和需要的灵敏度来选择。常用的方法有酶联免疫吸附测定法、间接血凝试验、免疫荧光技术、放射免疫测定等。
在制备抗空肠弯曲菌CA的McAb中，应用间接ELISA进行杂交瘤分泌的McAb的检测。其主要过程：将提取的CA用pH值9.6碳酸盐缓冲液作适当稀释后，包被酶联反应盘，先置37℃ 1h，再于4℃冰箱包被过夜。次日用pH值7.4PBS(含0.1%吐温20)洗涤3次。检测时加入被测上清液，37℃感作1h，洗涤后，加入HRP兔抗鼠IgG结合物，继续在37℃感作1h，洗涤，加入底物溶液，室温下避光显色15min，终止反应后，测OD值，以被测孔的OD值高于NS1骨髓瘤细胞培养上清液对照OD值的4倍以上定为阳性。
6.杂交瘤细胞的克隆化克隆化的目的是为获得来自单一细胞的群体，是获取纯净均一的McAb不可缺少的步骤，也是得到稳定的杂交瘤细胞株的重要措施。早期杂交瘤细胞是很不稳定的，容易丢失染色体而变成非分泌抗体型，而且阳性株转变为阴性株，一般阴转率为50%；强阳性株也可以变成弱阳性株(由于分泌抗体减少或者其抗体的亲和力转弱)。就是经长期培养的杂交瘤细胞株也可能出现上述情况，只有通过早期克隆化及不断克隆化来选择稳定细胞株，以保证杂交瘤细胞长期稳定分泌抗体的功能。克隆化最常用的方法是液相有限稀释法、软琼脂法、显微镜操作法及应用荧光激活细胞分离仪等。下面介绍液相有限稀释法及软琼脂法。
(1) 液相有限稀释法：
①取小鼠腹腔细胞悬浮于HT1640培养液中，制备饲养细胞层；
②用毛细管将培养孔中的细胞轻轻吹打下来，并用相同培养液重复操作数次；
③于血细胞计数板上作细胞计数，然后用HT1640(含20%小牛血清)调整细胞数；
④初次克隆化应选择三个稀释度，即每孔(0.1ml)分别含有100个、10个、1个细胞，分别加于预制的含小鼠饲养细胞层的96孔细胞培养板中，每孔0.1ml，置37℃含5%～10%CO2的培养箱内培养。如果该杂交瘤生长能力弱，耐性小，有可能在100个细胞/孔得到克隆；
⑤第5天起，每天都应观察，对每孔中的细胞群落数进行记录，并对克隆化的培养孔上清液进行检测，对强阳性孔中的细胞做扩大培养。同时也应检测数个含有多个细胞群落的孔中的上清液，以备在已克隆化的孔均为抗体阴性时，可将多克隆的阳性孔再做克隆化；
⑥再次克隆化，要得到一个稳定分泌抗体的细胞株，一般要经2～3次克隆化。再次克隆化的方法与初次基本相同，也应加饲养细胞，细胞稀释度可用两个，即5～10个细胞/孔及1个细胞/孔。
(2) 软琼脂平板法：
①于6cm或9cm的无菌平皿内，以小鼠腹腔细胞贴壁，然后加入20%
琼脂 双倍浓度HT细胞培养液(1∶1)，铺于皿底，使其凝固；
②制备细胞悬液，将1份细胞与2份琼脂 HT细胞培养液混合，铺于上层；
③凝固后，置37℃含5%～10%CO2的温箱中培养。细胞集落在10天左右形成，可将克隆挑出继续进行克隆。
7.阳性杂交瘤细胞株的扩大培养、冻存、复苏当获得1株阳性杂交瘤
细胞时，要及时进行扩大培养、冻存，以防细胞株丢失。
(1) 扩大培养：一般在检测到分泌特异抗体的阳性杂交瘤克隆时，为
了严防差错，第2天必须重复检测1次上清液。同时取1只小鼠腹腔细胞，制备两瓶(5ml培养液/瓶)饲养细胞。饲养细胞配于含20%小牛血清的1640
培养液中培养18～24h，再将阳性杂交瘤细胞克隆孔内的细胞轻轻吹打下来，吸入含饲养细胞的培养瓶内，继续扩大培养。
(2) 移入小鼠腹腔：取同系小鼠(即与杂交瘤的骨髓瘤细胞属同一品系的)，在其腹腔内注射0.5ml液体石蜡油或降植烷，过3～7天后，可供细
胞移入。将阳性克隆孔内的细胞轻轻吹打下来，配于0.5ml1640培养液或
生理盐水中，注入预先注射过石蜡油或降植烷的小鼠腹腔内。
(3) 液氮冻存：把阳性细胞株冻存起来，是避免细胞中途丢失的最佳
方法。
①冻存培养基，基础1640培养基7份、小牛血清2份、二甲基亚砜1份；或基础1640培养基5份、小牛血清4份、二甲基亚砜1份。
②冻存的方法，将传代过程中生长良好的细胞，用毛细管轻轻吹下，
经1000 r/min离心10min，弃去上清液，加入冻存培养基1ml，将细胞悬
液移入2ml安瓿中，火焰封口，安瓿外面裹以橡皮胶布，注明细胞名称及
冻存日期，置-70℃中过夜，然后移入液氮罐中保存。
也可将安瓿悬于液氮罐口上，缓慢下垂，约经1h左右，将安瓿浸入液氮内。每株细胞应冻存5～8支。2～3天后立即复苏1支检查冻存效果，以后每年都要复苏一支，再克隆化，如发现有的杂交瘤抗体分泌转弱或转阴，应扩大培养强阳性株，再冻存，并将原冻存细胞废弃。
二甲基亚砜有防止细胞内形成冰结晶的作用。二甲基亚砜本身有毒性，是无菌的，配制时不需灭菌，其在高压蒸气条件下会破坏，因此怀疑冻存
液有污染，只能过滤除菌。
(4) 细胞复苏：将安瓿自液氮中小心取出，切勿用手直接接触，以免
手被冻伤，并谨防安瓿因封口不严或温差的影响而发生爆炸。将安瓿立即
放入37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻。然后将细胞转移至离心管
中，加入适量基础培养液，离心10min，弃上清液，加入5～10ml 15%小牛血清完全培养液，分装于两个小培养瓶中培养。也可不离心，将细胞吸出后，置于含饲养细胞层的细胞培养瓶内，加入完全培养基约为细胞培养瓶
容量2/3，置37℃培养4h后，小心倾去部分培养液，再补加新鲜的完全培养基继续培养。
细胞复苏时在含饲养细胞层的细胞瓶内，经数次传代后，饲养细胞消失，无碍原细胞株的生长。
二、单克隆抗体的生产、提纯与保存
(一) McAb的生产在建立杂交瘤细胞株后，可在体外大量培养，收集上清液而获得大量的单克隆抗体，以旋转瓶培养法为佳。先将细胞用一般静止培
养法在5%小牛血清培养基中适应2～3天。将30ml生长旺盛的细胞移至旋转瓶中，加入70ml 2.5%小牛血清培养液，充以10%CO2的空气，盖紧，37℃静置1～2天后，打开盖，加700ml 2.5%小牛血清培养液，再盖紧，37℃慢速(1 r/min)旋转，每天打开1次盖，让10%CO2通过一滤菌网与瓶内气体进行交换，当细胞不再生长，1～2天后收集培养液，离心，将上清液保存。用这种方法制备单克隆抗体，比较麻烦，抗体的含量较低。
目前一般多用小鼠腹腔接种的方法进行McAb的制备，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100～1000倍。方法是：取已成年的BALB/c小鼠，于腹腔内注入液体石蜡或降植烷0.5ml，1周后，再于腹腔内注入杂交瘤细胞3×105/0.5ml，10天左右即形成腹水。待小鼠腹腔明显胀大，用75%酒精消毒腹部，用7号注射针头刺入腹腔下部，然后轻按腹部，使腹水自
然滴出，一次可收得约5ml，多者10ml以上，间隔了2天后，可再次抽取，如此反复直至小鼠死亡。抽取的腹水，离心10min，取上清液保存。沉淀中的细胞可再给另外小鼠注射，其形成腹水的速度比原细胞快。为多获得腹水，应选择雌性小鼠，体重以重者为优。
(二) McAb的提纯不论是培养上清液还是腹水，如果用于诊断试验或ELISA 等，不需再提纯，如分析抗体的蛋白均一性，或做蛋白定量，则应进一步
纯化，以除去培养液、宿主及克隆细胞本身的一些无关蛋白质。提纯方法
与一般Ig的提纯方法相同。
(三) McAb的保存由于McAb对环境因素敏感，其稳定性远不如常规抗体，如有的McAb经冻干后完全失效。
上清液加0.1%的叠氮钠防腐剂，4℃可保存数月，由于有小牛血清，不需另加保护蛋白，腹水最好分装，于-20℃或-70℃长期冻存，用时以含1%BSA，0.1%的叠氮钠的PBS稀释，其中图3.9.1单克隆抗体制备流程图
BSA为保护蛋白，起稳定作用，在4℃还可保存数月，切忌反复冻融。提纯的McAb，加入1%BSA分装后冻存。McAb制备流程如图3.9.1。
三、单克隆抗体的鉴定
(一) McAb Ig类别及亚类鉴定方法是用兔抗小鼠各种类别及亚类的Ig抗血清与培养上清液进行免疫双扩散试验，根据出现的沉淀线来确定。由于培养上清液中抗体浓度较低，不易出现沉淀线，应先浓缩5～10倍。也可用多次加样的方法。
(二) McAb的其他性状鉴定必要时，可针对抗原决定基的属性、特异性、亲和力及其他生物学特性进行鉴定。
四、注意事项
(一) 免疫动物的选择用于免疫的动物，应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物，因为免疫动物品系和骨髓瘤细胞种系越远，融合的杂交瘤细胞越易发生免疫排斥反应，越不稳定。目前使用的瘤细胞系，仍限于小鼠和大鼠的骨髓瘤细胞系，其中多来源于纯系BALB/c小鼠，所以要选择该系小鼠用作免疫动物，一般认为，为了减少盲目性，融合前
，应测定免疫小鼠的抗体反应性，如果呈阳性，可供融合用，那些对特定抗原不产生血清抗体的小鼠，得不到特异的杂交瘤细胞。一般选择8～12周龄，重约20g，健康无病的纯系小鼠，雌雄均可应用。
(二) 免疫方案
1.抗原免疫用的抗原尽量设法提高其纯度，并保存其活性。同样浓度的抗原，若含有较多的杂质，会明显影响抗体的产生，并为杂交瘤细胞分泌抗体的筛选带来麻烦，获得所需的分泌特异抗体的杂交瘤细胞的机率也低。
2.免疫小鼠一次免疫务必同时免疫几只小鼠，以免小鼠中途死亡。每次注入抗原后，次日，小鼠会出现全身反应，体温升高、盗汗、耸毛等，此时对室温和饲养均需注意，以防小鼠死亡。在融合前末次静注或腹腔注射时，谨防速发型过敏反应发生，而导致小鼠死亡。
3.不同抗原的免疫方法可溶性抗原，在初次免疫用明矾沉淀抗原
100μg与2×109灭活百日咳杆菌混合皮下注射，间隔4～6周，用盐水抗原100～200μg加强免疫，3天后取脾作融合；细胞抗原免疫，用2×107个细胞注入小鼠腹腔，间隔2～3周，再重复一次，3周后用同样数量细胞注入小鼠腹腔，3天后取脾作融合。除上述常规免疫方法外，近年来还建立了脾内免疫法及体外细胞免疫法。脾内免疫是将抗原直接注入小鼠的脾脏，具有抗原用量小及免疫周期短的优点；体外细胞免疫，是将抗原加入于体外培养的淋巴细胞中，使之形成免疫细胞。
(三) 融合剂PEG对细胞有毒性，一般采用分析纯规格。浓度越高，对细胞的毒性越大。以40%～50%的浓度为宜，pH值以8.0～8.2促融率最高。PEG 对细胞的毒性，还随分子量增大而加大，分子量1000～4000之间，效果较
好，不同牌号的PEG甚至同一厂家不
同批次的产品其毒性及促融率也不一样，应预先进行试验。
(四) 操作中的污染污染是杂交瘤技术中最常遇到的问题，它往往可使一个即将建株的细胞毁于一旦。所以对所用试剂、器材、环境要根据其要求进
行彻底的消毒灭菌。要严格无菌操作。发现污染及时处理，避免污染扩大，如果一旦发现某一培养板或培养瓶污染时，要及早废弃，一般的处理方法
不能有效地控制污染的扩散。如有价值的阳性株被
污染时，要设法挽救，可将孔壁上细胞吹打下来，配置于0.5ml生理盐水中，注射于7～8天前已腹腔注射石蜡油或降植烷的同系小鼠腹腔内，经过小鼠腹腔内培养，微生物可被腹腔内的巨噬细胞吞噬掉。取出的阳性细胞，继续用培养瓶传代培养。
(五) 融合后的克隆株不生长有时遇到融合的细胞不生长或开始的头几天
生长，以后细胞逐渐萎缩，甚至在HAT培养基中死去。这种现象的原因很多，如培养液偏碱，影响细胞发育；HAT培养基中的A过多，对细胞毒性大；HT含量不足，不能为融合细胞提供足够的营养；培养箱内CO2不足，湿度不够；另外瘤细胞株的好坏也是影响融合成败的关键因素，所以一定要选用
生长良好的瘤细胞供融合用。如发现克隆不生长或生长缓慢时，除检查上
述因素并予以纠正外，还应向此孔内添加小鼠饲养细胞，一般其状况能得
以改善。
(六) 用液氮冻存的脾细胞进行细胞融合问题用这种方法保存免疫的脾细
胞可随用随取，而且简单易行，融合率可达94%~100%，抗体阳性率达14%~36%。但因脾细胞不能在体外培养，应用一般方法保存易存死亡，所以掌握脾细
胞的冻存技术，对于McAb的制备至关重要。
专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过________________________，赋予生物以 _____________________，创造出______________________________________。基因工程是在____________上进行设计和施工的，又叫做__________________。 1. （1 （2 （3 2. (1)两种DNA ②区别：E· (2)与DNA 酸二酯键。 3. （1 （2 _____________________的双链___________DNA （3）其它载体： _________________________________ (二)基因工程的基本操作程序 第一步：__________________________ 1.目的基因是指： ______________________________________________________ 。 2.目的基因可采取_______________-获得，也可以用_____________________。人工合成目的基因的常用方 法有________________和_________________。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：_____________________ 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是________________，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 _______________。此方法的受体细胞多是 ____________。将目的基因导入微生物细胞：★原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少， 最常用的原核细胞是 ____________，其转化方法是：先用 ________处理细
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
生物选修三易考知识点背诵 专题1 基因工程 1.基因工程:又名或 操作环境:；操作对象:；操作水平: 基本过程: 特点:；本质（原理）： 2．基因工程的基本工具 Ⅰ.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别，并且使 断开。 （3）结果：产生的DNA片段末端——。 （4）要获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ Ⅱ.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（和）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：前者来源于，只能连接；而后者来源于， 能连接，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的区别：DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的 末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接的末端，形成磷酸二酯键。 Ⅲ.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件： ①能在受体细胞中上，并随染色体DNA同步复制； ②具有一至多个，供外源DNA片段插入； ③具有，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的。 （3）其它载体： 3.基因工程的基本操作程序 第一步： (1)获取目的基因的方法：、、
(2)PCR技术 ①原理： ②条件：、、、 ③PCR技术与体内DNA复制的区别： a. PCR不需要酶；体内DNA复制需要； b. PCR需要酶（即Taq酶），生物体内的聚合酶在高温时会变性； c. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制受生物体遗传物质的控制。 (3)注意：构建基因文库需要哪些操作工具？ 第二步：——基因工程的核心 基因表达载体组成： +复制原点 （1）：是一段有特殊的DNA片段，位于基因的首端，是识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。没有启动子，基因就不能转录。 （2）：也是一段有特殊的DNA片段，位于基因的尾端，使转录终止。 （3）标记基因的作用：，常用的标记基因是。 第三步：将目的基因导入受体细胞 常用的转化方法： (1)导入植物细胞：采用最多的方法是法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。 (2)导入动物细胞：最常用的方法是技术。此方法的受体细胞多是。 (3)将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用处理细胞，使其成为，有利于促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 注意：重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是。第四步： （1）首先要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，方法是采用。用 （2）其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用方法是。 用 （3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是。 （4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状，需要。
第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术 本章考点 1.概念 2.杂交瘤技术基本原理 3.杂交瘤抗体的制备技术 4.基因工程抗体 由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。 传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。 第一节杂交瘤技术基本原理 单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 一、B细胞杂交瘤技术 1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。 2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT 培养基上长期存活与繁殖。 3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
生物选修三知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间 的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间 的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末 端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
）最常用的载体是质粒,裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反 转录法_和化学合成法_。 技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞_ 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。 一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) ↓2～3周后 第二次免疫1×10７／0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射
│(一般0.8～1ml 0.2ml／点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 (二) 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 ↓ 拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 ↓
单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
细胞工程 考点一植物细胞工程1.细胞工程 (1)操作水平：细胞水平或细胞器水平。 (2)目的：按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。 2.植物细胞的全能性 (1)概念：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。 (2)原理：细胞内含有本物种的全部遗传信息。 (3)全能性表达条件：具有完整的细胞结构，处于离体状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件。 3.植物组织培养技术 (1)原理：植物细胞具有全能性。 (2)过程： 4.植物体细胞杂交技术 (1)概念：将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。 (2)原理：体细胞杂交利用了细胞膜的流动性，杂种细胞培育成杂种植株利用了植物细胞的全能性。 (3)过程(4)意义：克服不同种生物远缘杂交的不亲和性。 5.植物细胞工程的实际应用 (1)植物繁殖的新途径 ①微型繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。 ②作物脱毒技术：选取作物无毒组织(如茎尖)进行组织培养，获得脱毒苗的技术。 ③人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子。 (2)作物新品种的培育 ①单倍体育种 a.实质：花药离体培养过程就是植物组织培养过程。 b.流程：花药单倍体幼苗――――――――→ 秋水仙素诱导 染色体数目加倍 纯合子。 c.优点：后代不发生性状分离，都是纯合子，能够稳定遗传，明显缩短了育种年限。 ②突变体的利用：筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。 (3)细胞产物的工厂化生产 1.植物组织培养的关键 (1)条件：离体，一定营养物质，激素(生长素、细胞分裂素)等。
高考生物必背知识点总结 1．人工诱导多倍体最有效的方法：用秋水仙素来处理，萌发的种子或幼苗。2．单倍体是指：体细胞中含本物种配子染色体数目的个体。单倍体特点：植株弱小，而且高度不育。 单倍体育种过程：杂种F1 单倍体纯合子。 单倍体育种优点：明显缩短育种年限。 3．现代生物进化理论基本观点：种群是生物进化的基本单位，生物进化的实质是种群基因频率的改变。突变和基因重组，自然选择及隔离是物种形成过程的三个基本环节，通过它们的综合作用，种群产生分化，最终导致新物种形成。在这个过程中，突变和基因重组产生生物进化的原材料，自然选择使种群的基因频率定向改变并决定生物进化的方向，隔离是新物种形成的必要条件。 4．物种是：指分布在一定的自然区域，具有一定形态结构和生理功能，而且在自然状态下能相互交配和繁殖，并能够产生可育后代的一群生物个体。 5．达尔文自然选择学说意义：能科学地解释生物进化的原因，生物多样性和适应性。 局限：不能解释遗传变异的本质及自然选择对可遗传变异的作用。 6.基因重组只发生在减数分裂过程和基因工程中，(三倍体，病毒，细菌等不能基因重组。) 7.细胞生物的遗传物质就是DNA，有DNA就有RNA，有5种碱基，8种核苷酸。 8.双缩尿试剂不能检测蛋白酶活性，因为蛋白酶本身也是蛋白质。 9.高血糖症，不等于糖尿病，高血糖症尿液中不含葡萄糖，只能验血，不能用本尼迪特试剂检验，因为血液是红色的。 10.洋葱表皮细胞不能进行有丝分裂，必须是连续分裂的细胞才有细胞周期。 11.细胞克隆，就是细胞培养，利用细胞增值的原理。 12.细胞板不等于赤道板，细胞板是植物细胞分裂后期由高尔基体形成，赤道板不是细胞结构。 13.激素调节是体液调节的主要部分，CO2刺激呼吸中枢使呼吸加快属于体液调节。 9.注射血清治疗患者不属于二次免疫，(抗原加记忆细胞才是)，血清中的抗体是多种抗体的混合物。 10.刺激肌肉会收缩，不属于反射，反射必须经过完整的反射弧(这个点昨天一摸理综就考了)，判断兴奋传导方向有突触或神经节。 11.递质分兴奋行递质和抑制性递质，抑制性递质能引起下一个神经元电位变化，但电性不变，所以不会引起效应器反应。
细胞工程 植物细胞工程) 1.细胞工程 (1)操作水平：细胞水平或细胞器水平。 (2)目的：按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。 2.植物细胞的全能性 (1)概念：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。 (2)原理：细胞内含有本物种的全部遗传信息。 (3)全能性表达条件：具有完整的细胞结构，处于离体状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件。 3.植物组织培养技术 (1)原理：植物细胞具有全能性。 (2)过程： 4.植物体细胞杂交技术 (1)概念：将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。 (2)原理：体细胞杂交利用了细胞膜的流动性，杂种细胞培育成杂种植株利用了植物细胞的全能性。 (3)过程 (4)意义：克服不同种生物远缘杂交的不亲和性。 5.植物细胞工程的实际应用 (1)植物繁殖的新途径 ①微型繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。 ②作物脱毒技术：选取作物无毒组织(如茎尖)进行组织培养，获得脱毒苗的技术。 ③人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子。 (2)作物新品种的培育 ①单倍体育种 a.实质：花药离体培养过程就是植物组织培养过程。 b.流程：花药单倍体幼苗纯合子。 c.优点：后代不发生性状分离，都是纯合子，能够稳定遗传，明显缩短了育种年限。 ②突变体的利用：筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。 (3)细胞产物的工厂化生产 1.植物组织培养的关键 (1)条件：离体，一定营养物质，激素(生长素、细胞分裂素)等。 (2)培养基状态：固体培养基(需再分化生根培养基及生芽培养基)
单克隆抗体的制备 一、教学目标 知识目标：1、单克隆抗体的概念 2、单克隆抗体的制备过程，以及过程中涉及的具体筛选过程。 3、单克隆抗体的应用，和普通抗体相比的优点。 能力目标：1、学会从复杂的制备过程中找出简单的流程图 2、注意前后知识点的对比学习。 情感态度价值观：从生物导弹的应用了解单克隆抗体目前在抗癌方面的贡献，并努力掌握更多的相关知识。 二、教学的重点难点： 单克隆抗体的制备过程，以及过程中涉及的具体筛选过程。 三、教学课时：1课时 四、教学过程： 【一】锚式问题：从“生物导弹”一个新颖而又陌生的画面入手。引发学生的探究热情。具体结合材料和图片来介绍生物导弹。资料：“生物导弹”是免疫导向药物的形象称呼，它由单克隆抗体与药物或放射性同位素配合而成，因带有单克隆抗体而能自动导向，在生物体内与特定目标细胞或组织结合，并由其携带的药物产生治疗作用。 问题：生物导弹中的关键成分是什么？什么是单克隆抗体？ 【二】自主探究（4分钟，学生看课本完成） 1、长期人们怎样获得抗体？这样的抗体有什么缺点？ （给动物反复注射抗原，然后在动物的血清中提取抗体。抗体产量低、纯度低、特异性差）2、B淋巴细胞在分泌抗体时有什么特点？B淋巴细胞实际指的是什么细胞？ （一个或是一种B淋巴细胞只能分泌一种抗体；效应B细胞或是浆细胞） 分析：这两个问题比较简单，而且在课本中能直接找到答案，学生迅速阅读课本就能完成。【三】继续探究（10分钟，学生看课本，查阅资料，讨论合作完成） 1、写出单克隆抗体制备的过程简图（略，见课件） 2、怎么获得免疫小鼠，目的是什么？ （给小鼠注射特定的抗原，使小鼠发生特定的体液免疫，产生相应的B淋巴细胞） 3、为何选择B淋巴细胞和骨髓瘤细胞？ （B淋巴细胞能产生特定的抗体，单不能无限增殖；骨髓瘤细胞能无限增殖） 4、过程中大致需要几次筛选？怎么筛选？目的是什么？ （主要是2次。第一次为了筛选出杂交瘤细胞；第二次筛选出能大量产生特定抗体的杂交瘤细胞。） 5、最终获得单克隆抗体的办法有几种？分别是？ （两种。体内在小鼠的腹水中提取；体外在细胞的培养液中提取） 6、单克隆抗体制备过程涉及的技术及其原理有哪些？ （细胞融合：原理是细胞膜具有流动性；动物细胞培养原理：细胞增殖） 分析：上述的6个问题涉及的内容是本节课的重点和难点，也是考点，需要和学生一起系统化的梳理，并强调重点内容作好笔记。 【四】继续探究总结 1、单克隆抗体的“单”和“克隆”分别指的是什么？ （单：单个能产生大量抗体的杂交瘤细胞；克隆：无性繁殖即有丝分裂）
单克隆抗体(McAb)制备技术 1975年Khler和Milstein首次利用杂交瘤技术生产单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人们誉为“免疫学中的一场革命”，该项技术具有巨大生命力和发展前景，目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学、病毒学、生物化学、遗传学、药物学等许多领域的研究。下面以抗空肠弯曲菌共同抗原McAb的制备为例，介绍McAb的制备技术。 一、材料和方法 (一) 材料 1 PRMI1640培养液 PRMI1640培养基粉104g，双蒸馏水1000ml，抽滤或高压 蒸气灭菌，每瓶80ml分装。 2 完全PRMI1640培养液 PRMI1640培养液80ml,1mol/L Hepes 2ml,0.2mol/L谷 氨酰胺1ml，青、链霉素溶液(1000u/ml)1ml，灭活小牛血清20ml。 3 次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT母液×100)次黄嘌呤1361mg，胸腺嘧核苷387mg，蒸馏水加至100ml。在45～50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置 -20℃ 中保存。 4 氨基喋呤(A母液×100)氨基喋呤176mg，蒸馏水90ml，1mol/L NaOH 0.5ml，加蒸馏水至100ml，再加0.5ml 1mol/L HCl中和，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。 5 HAT选择性培养基完全PRMI1640培养液100ml,100×HT母液1ml，100×A母液1ml。用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。 6 HT培养液完全RPMI1640培养液100ml，100×HT母液1ml。用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。 7 50%聚乙二醇(PEG)溶液将PEG(MW4000)放在试管内加盖，121.3℃高压蒸气灭菌20min。使用前加入等量的pH值8.2无血清培养液，置56℃混合，直至完全溶解，移置37℃备用。 8 8-氮杂鸟嘌呤称取8-氮杂鸟嘌呤20mg，溶于4mol/L NaOH 10ml 或0.36%Na2CO3 10ml中，以蒸馏水稀释至1000ml，过滤备用。 9 台盼蓝溶液台盼蓝100mg，溶于PBS 100ml中即成。 10 0.34mol/L蔗糖溶液蔗糖5.8g，蒸馏水50ml，高压蒸气灭菌，分装。 (二) 方法(以空肠弯曲菌共同抗原的单抗制备为例) 1. 动物免疫将提取的空肠弯曲菌共同抗原(CA)与等量的福氏完全佐
制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程如图: 单克隆抗体制备（免疫2-3月，总周期4-6 月） 准备抗原 动物免疫——选择免疫动物 Elisa测抗血清--------- ? ￥ 分离脾细胞骨髓瘤细胞 细胞融合（融合剂：PEJ HAT培养基筛选杂交瘤细胞 筛选阳性细胞------- * （三天内做完流式）“ 阳性克隆并扩大培养呻—细胞冻存 性！ 扩大培养收集上清动物接种收集腹水 单克隆抗体纯化保存 1、抗原提纯与动物免疫： 选择BALB/c健康小鼠。如为细胞抗原，可取 1 X 107个细胞作腹腔免疫；可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。免疫3?4只小鼠，间隔一般2?3周，末次免疫后3?4天，分离脾细胞。 2、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择Sp2/0细胞株，将昆明鼠的腹腔细胞作为饲养细胞 3、细胞融合 将两种细胞混合后加入PEG（融合剂）使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG 消除PEG的作用。注意：细胞比例、培养液成分、反应时间 4、有限稀释法筛选阳性株 筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株（一般稀释至0.8个细胞/孔）细胞培养至覆盖0 %?20%孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA 测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。 5、单克隆抗体的制备与保存 筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠，先用液体石蜡进行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5?10ml的腹水，冻存。6、单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法
专题2 细胞工程 （一）植物细胞工程 1.理论基础（原理）： 全能性表达的难易程度： 2.植物组织培养技术 （1）过程：离体的植物器官、组织或细胞―→愈伤组织―→试管苗―→植物体 （2）用途：。（3）地位：是培育、培育植物新品种的最后一道工序。 3.植物体细胞杂交技术 （1）过程： （2）诱导融合的方法：物理法包括等。化学法一般是用 作为诱导剂。（3）意义： （二）动物细胞工程 1. 动物细胞培养 （1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的，将它分散成，然后放在适宜的中，让这些细胞。 （2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用 处理分散成→制成→转入培养瓶中进行培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就，称为。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面时，细胞就会，这种现象称为。 （4）动物细胞培养需要满足以下条件 ①：培养液应进行处理。通常还要在培养液中添加一 定量的，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防 止。 ②：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入 等天然成分。 ③：适宜温度：哺乳动物多是；pH：。 ④：95%＋5%。O2是所必需的，CO2的主要作用 是。 （5）动物细胞培养技术的应用： 2.动物体细胞核移植技术和克隆动物 （1）哺乳动物核移植可以分为核移植（比较容易）和核移植（比较难）。
（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞； 卵(母)细胞。 （3）体细胞核移植的大致过程是：（下图） （4）体细胞核移植技术的应用： ①② ③④ ⑤ （5）体细胞核移植技术存在的问题： 克隆动物存在着问题、表现出缺陷等。 3.动物细胞融合 （1）动物细胞融合也称，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来细胞遗传信息的单核细胞，称为。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有等。 （3）动物细胞融合的意义：克服了，成为研究 的重要手段。 （4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较： 比较项目细胞融合的原理细胞融合的方法诱导手段用法 植物体细 胞杂交 细胞膜的流动性去除细胞壁后诱 导原生质体融合 离心、电刺激、 振动，聚乙二醇 等试剂诱导 克服了远缘杂交 的不亲和性，获得 杂种植株 动物细胞 融合 细胞膜的流动性使细胞分散后诱 导细胞融合 除应用植物细胞 杂交手段外，再加 灭活的病毒诱导 制备单克隆抗体 的技术之一 4.单克隆抗体 （1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种。从血清中分离出的抗体 。 （2）单克隆抗体的制备过程： 注入小鼠 细胞融合 分离 抗原注入小鼠体内 B淋巴细胞骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 细胞培养 选择培养细胞 培养基 体内培养体外培养 从腹水提取从培养液提取 单克隆抗体 核移植 胚胎移植
单克隆抗体制备的技术原理 单克隆抗体是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的抗体，具有单一、特异与纯化的特性。该抗体在医学临床诊断及治疗上具有极其重要的作用。因此它的问世在现代免疫学上具有划时代的意义。 大家知道，当外源性物质在人体或动物血液中出现时，机体中有一些淋巴细胞便会做出反应，产生一些特殊的免疫球蛋白，叫做抗体。而那些外源性物质则称为抗原。抗体与抗原能发生特异结合，从而清除异物，达到保护肌体的作用。抗原不同，它所诱发的抗体也不一样。如细菌或病毒表面存在着几种抗原，因此它们就会对应地诱发出几种不同的抗体。过去人们为了获得抗体，就根据上述原理，反复注射某种抗原到动物（如兔、羊、马等）体内，然后从其血清中分离出所需的抗体。长期以来，用这种经典方法得到的抗体，往往存在着两个严重的缺点：第一，这些抗体不是均质的，而是一种抗体的混合物，特异性差，效价低；第二，抗体的产生是有限量的，因为分泌抗体的成熟淋巴细胞寿命很短，一般只能存活几天，无法大量生产。 为了克服上述缺点，许多免疫学家曾进行了长期的研究与探索，这一难题终于在1975年被国外两名免疫学家考勒和米尔斯坦解决了。他们利用自己创立的杂交瘤技术，使产生抗体的淋巴细胞能在体外长期存活，并源源不断地分泌抗体。这就是有高特异性和非常均质的单克隆抗体。 单克隆抗体的技术原理并不十分复杂。它是把能产生单一抗体的淋巴细胞与有增殖能力的骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，又称杂交瘤。由于这些杂种细胞继承了双亲细胞的遗传物质，因此它们不仅能表现出淋巴细胞分泌单一抗体的能力，而且还能表现出骨髓瘤细胞在体外大量繁殖的本领。就这样，取长补短，使杂交瘤变成了一座制造单克隆抗体的理想“工厂”。 目前制备单克隆抗体的具体方法，主要有以下三步（图2－9）。 第一步：将抗原注射到小鼠体内进行免疫，取出受免脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合。 第二步：用选择培养基，选出杂交瘤细胞，逐一克隆或扩增，从中挑出能产生抗体的杂交瘤细胞。 第三步：将杂交瘤细胞接种在培养瓶中扩大培养或注射到动物的体液中作为腹水癌生长，然后再分离纯化单克隆抗体。
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都