正相色谱和反向色谱及C18柱子
反相与正相的区别在于，固定相与流动相的极性大小。反相：固定相的极性小于流动相的极性正相：固定相的极性大于流动相的极性反向色谱流动相极性大于固定相极性测定样品时极性大的先出峰，正向反之
在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基（-CN）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分配比K值，随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。
该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。
反相键合相色谱法
在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称ODS或C18）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。
目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：
一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。
分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水+有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制是把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。.
一般地，固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。
1.C18是连接了18烷基碳链的反相固定相的总称。ODS 是以硅胶为基质键合的C18填料，而C18还包括其他基质的填料，比如高聚物小球为基质，氧化铝为基质，氧化锆为基质等键合C18链形成的反相固定相，这些可以称为"C18"，但是不是ODS。
2.RP-18也是C18中的一种，不同的公司对C18填料有不同的商
业名称，本质应该都是一样的。Merck公司的填料喜欢叫RP-18。比如Merck 的LiChrospher RP-18，Superspher RP-18，Purospher RP-18。因此，我认为说"RP-18"是改进型的不妥当。Merck的改进表现在前边的名字上,比如LiCHrospher, Superspher, Purospher表现的是不同的性能
C8是硅胶键合辛烷基，C18是硅胶键合十八烷基，C18的极性较C8的极性小，C18对分析物的保留性能强于C8，含碳量对分离效果和主要组分的保留时间起很大的影响，所以含碳量高，主要组分的保留时间越长。
C8和C18都是反相色谱柱的一种，适用于分析弱极性的物质，C8适合分析弱极性物质里极性稍强的一类物质，C18适合分析弱极性物质里极性更弱的物质。这是他们极性上的差别，但是差别并不是特别明显，一般能用C8分析的物质，在C18上也能分离。
C18比C8的碳链更长，因此带来更好的保留特性。因此C8就更适合分析大分子类的物质，比如一些球蛋白等，都用C8和缓冲盐洗脱剂来配合使用。相反，分子量较小的物质，经常用C18来进行分析和分离。键合相不同，导致同种组分在不同色谱柱上的保留时间不一致，对各组分的保留能力也会不同，峰位置就变化啦。C18前面看到“ODS”的字样，ODS是英文octadecyl silane的所写，意思是十八(烷)基硅烷，是以硅胶为基质键合的C18填料，由于大部分的C18柱都是硅胶基质，因此有时你还会看到色谱柱上只标称二者之一。其中以ODS居多。有时你还会看到ODS-x，x是不同的数字，
这个x虽然是数字，但是不同厂家的产品代表的含义不同，一般以含碳量区分，但这也不是绝对的。有时还可能看到RP-18或RP-8，RP-18和C18意义基本一致，但是不同的厂家有不同的规定。
RP－C8、RP－C18，这里的RP是指"Reversal Phase"，就是“反相”的意思，所以RP－C8、RP－C18就是指反相C8和反相C18。其实C8和C18也没怎么见过用于正相，它们本身就是反相柱，只是商家为了区别其它的C8或C18做出的一个标识。
键合烷基的链长对键合相的样品负荷量、溶质的容量因子及其选择性有不同的影响，当烷基键合相表面浓度相同时，随着烷基链长增加，碳含量成比例增加，溶质的何留值增加。C18
C6、C8短链烷基，由于分子尺寸较小，与硅胶表面键合时可以有比长链烷基更高的覆盖和较少的残余羟基，适合极性样品或做离子抑制的样品的分析。
一般说，C18比C8的分离效果好。但是如果遇到性质差别比较大的样品，也就是说比较容易分离的样品，C8比C18的效率高
正相色谱柱与反相色谱柱有哪些区别？ 色谱柱的安装： 1、首先应确认柱和仪器的接头以及管路是否匹配。为减少死体积，进样阀、柱子、检测器之间的连接管路内径尽可能使用内径较小的管线，同时控制进样器、色谱柱和检测器之间连接管线的长度。安装色谱柱之前，确认流路系统中的溶剂是否正常。对分析较复杂的样品建议安装保护柱。 2、为了使色谱柱与仪器系统达最佳的连接效果，应尽量使用与色谱柱接口相匹配的螺帽和锥形接头，如原来的接头长期匹配其他类型的色谱柱，建议在连接新色谱柱前应检查匹配情况，避免造成色谱柱的损坏或因色谱柱不匹配造成的漏液。 3、使用PEEK 材料的通用接头，只需用手拧紧不需要特定扳手，使用压力为5000psi；使用温度不得超过100℃。 流动相平衡： 1、在进行样品检测前，至少使用20倍柱体积流动相使色谱柱充分平衡。流动相一定要使用色谱级别的溶剂。如使用水相的缓冲液应当天配制以保持新鲜避免细菌产生。 2、流动相使用前需用微孔滤膜过滤,消除流动相中颗粒对色谱系统和色谱柱的损坏。缓冲液与其他流动相混合后应重新过滤避免溶解度变化造成产生新的沉淀。不应使用纯水作为流动相冲洗C18色谱柱，以免柱性能损坏（添加5％的有机溶剂冲洗色谱柱，同时可以达到对缓冲盐清洗的作用。还可以使色谱柱更容易平衡）。 3、流动相需脱气后使用，可避免因气泡导致的泵和检测器的工作不正常。如果测试时使用的流动相与色谱柱保存使用的流动相有较大区别，应该使用过度分布的形式进行平衡。避免由于流动相的突然变化造成柱压增加过大或流动相缓冲盐结晶造成对色谱柱和仪器系统的损坏。正相色谱柱比反相色谱柱需要更长的平衡时间。 样品制备与操作： 1、样品应当尽可能溶解在能与流动相相互溶的溶剂中。除特殊指明外，如使用强溶剂溶解样品柱子的分辨率将可能降低。 2、样品溶液在进样前应使用针头式过滤器对样品预先过滤。频繁改变流动相组成，会加速降低柱效。
高效液相色谱柱 怎样选择色谱柱 现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。 1、正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团(NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。 2、反相色谱 反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。 二、聚合物填料 聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～14均可使用。相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。 三、其他无机填料 其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。 怎样选择填料粒度 目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、5um
液相色谱仪色谱柱使用及 维护 Prepared on 22 November 2020
液相色谱仪色谱柱使用及维护 每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！ 新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。 卡套柱的安装（不加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 5．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 6．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。 卡套柱的安装（加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将"子弹头"预柱放入卡套片内
5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 7．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱） 注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。 1．将修补工具中的2套入柱芯的顶端 2．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧 3．一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网 4．用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平 6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端 7．柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入 8．压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平 平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会
3-1 柱的结构 1、堵棒（或导管） 2、接头 3、接头 4、密封圈 5、螺帽 6、柱密封圈 7、柱管 8、柱填料9 10、过滤片 3-2 柱的分类： 根据所有的担体材料分为三种： a.硅胶型：机械强度高，易制成小颗粒，理论塔板数高。 b.聚全物型：在广泛的PH值范围内稳定 c.羟基磷灰石型：对蛋白质等生物高分子样品有特殊的选择性。 根据分离方式分类： a.硅胶型
1）正相：SIL－－磷脂、NH －－糖、维生素E，CN－－甾类激素。 2）反相：ODS（C18）、（C8 CN TMS Pheny1）低分子量化全物。 3）离子交换： WAX（弱碱阴离子交换）－－核苷酸、蛋白质 WCX（弱酸阳离子交换）－－蛋白质 SAX（强碱阴离子交换）－－核苷酸 SCX（强酸阳离子交换）－－儿茶酚胶 4）凝胶过滤： Diol－－蛋白质GF－－
蛋白质 b.聚合物型： 1）反相：ODP－－50－－肽，蛋白质，低分化合物。 2）离子交换：ISC－－氨基酸，胍类化合物，ISA－－糖，IC－－无机离子，PA－－蛋白质，ES－－蛋白质。 3）配位交换：SCR（磺化聚苯乙烯）－－糖。 4）离子排阻：SCR-101H 102H －－有机酸 5）凝胶过滤：ION－－多糖GS－－水溶性分子 6）凝胶渗透色谱（GPC）：GPD
－－合成分子、橡胶。 7）羟基磷灰石型：HPC－－蛋白质、核苷酸 按尺寸分类： 1.制备：30mm 50mm 内径，半制备：20mm内径。 2.分析：标准型柱：4_8mm内径。 快速色谱柱：3mm内径、5cm长、4.6mm内径。 小孔径柱：2.5mm内径，微孔径柱1mm内径。 3-3柱的技术指标 *耐压：不小于40Mpa。 *渗透性：反相－－流动相甲醇1ml/min，压力3Mpa。
亲水作用色谱（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。本文简介了HILIC的起源、定义、分离特点；比较了HILIC和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术的特点，并对其使用中的注意事项进行了总结。 1. HILIC的概念 亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。2. HILIC的分离机制 HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。 3.HILIC影响保留的主要因素 普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。 影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显著增加样品的保留因子。在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂。一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显著的亲水作用。如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。 Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid. 4. HILIC与RP-HPLC的比较 传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。 HILIC正好可以解决这些问题，它提供了一种与传统RPLC互补的保留方式，能够使在RPLC 上保留较弱或没有保留的物质在HILIC柱上提供合适的保留，如图2所示：
前言 液相色谱的分离原理是,在色谱柱流动相中样品的不同组分与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用,由于作用力的大小、强弱不同,各种组分在固定相中滞留的时间也不同,因而先后从以 固定相中流出而得到分离。因此液相色谱分离的关键之一是色谱柱中的固定相。柱效的好坏直接影响目标化合物的分析和检测。但在液相色谱运行过程中,色谱柱极易发生问题,因此掌握正确使用和维护 色谱柱的知识非常必要。色谱柱使用过程中容易发生柱堵塞引起系统压力过高;柱效低引起峰拖尾、变宽;柱污染、损坏导致鬼峰等问题。引起这些问题的内在原因有: (1) 硅羟基的死吸附。色谱柱的基材硅胶粒子表面存在硅胶羟基。任何物质在色谱柱中都存在双分配效应,即在流动相与固定相之间进行分配,又在流动相与硅羟基之间进行分配。被分析物质被硅羟基吸附称为非特异性吸附,或称死吸附。当硅羟基对被分析物质的吸附趋近于饱和状态时,色谱柱柱效下降,峰形出现拖尾、变宽。 (2) 重金属。色谱柱的基材硅胶粒子无论纯度多高,无论怎样处理,都会有不少于5 ×10- 6 的重金属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,产生不对称峰或拖尾峰。例如儿茶素和大多数中药,因含有多酚结构,极易被金属氧化物氧化,影响其分离效果。 (3) 碳流失。固定相经长期使用,会有部分碳链被流动相洗脱下来,随流动相一起流出色谱柱外, 造成碳流失。 (4) 缓冲液中盐的析出。在做色谱分析时,有时流动相中会含有缓冲盐溶液。分析结束后,如果没有先用含一定配比的水相流动相冲洗,而直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐,将柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。 (5) 色谱柱变干。如果对色谱柱保存不当,使色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色谱柱的损伤,影响分离效果。 2 色谱柱的使用 新柱使用前应先检查产品包装、外观是否完好。认真阅读说明书及性能测试报告,了解新柱子的最佳性能指标,如某色谱条件下的柱压、柱效等。有时分析用的流动相与柱子的保存试剂不同,故在分析样品之前,应使用合适的试剂将柱子中的保存试剂清洗出来。要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。反相C18 柱通过出厂测试后多保存在乙腈中,可用10～20 倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。流速要缓慢提高,如开始0. 3～0. 5mL/ min , 10～15min 后可慢慢加快。 硅胶柱和极性色谱柱通过出厂测试后一般保存在正庚烷中。如果分析时需要使用含水的流动相,则使用前须用乙醇或异丙醇冲洗,流速0. 1～0. 3mL/ min ,将正庚烷冲洗干净后,再用流动相平衡。 实验过程中可以记录色谱柱的一些性能指标,如柱效、柱压等,供今后参考。每次分析样品前,要用流动相对色谱柱进行平衡,待基线平稳后再进样分析。梯度洗脱用初始流动相平衡。一次样品分离完成后,要有足够的时间使系统恢复平衡,再进行下一次分析。一般流动相平衡时间为30min ,若系统中有盐或水,平衡时间应延长。 3 色谱柱的清洗与保存 色谱柱清洗是日常的重要维护工作。如果样品分子残留在柱子、接头、流通池中,会污染系统,影响对其它样品的分析,降低柱效。因此分析工作结束后,要用适当的溶剂清洗系统中残留的样品。在反相系统中, 若流动相中无酸、碱、盐类物质, 可用90 %甲醇冲洗30～60min ,若含酸、碱、盐类物质,则要先用10 %甲醇或乙腈,或用与分析用流动相相同的
正相、反相和极性胶联柱使用手册 更多资料请访问：https://www.doczj.com/doc/1a5693091.html, Chrompack HPLC Normal-,Reversed phase and Polar bonded columns 注意 此色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（pH>7.0）或酸性溶剂（pH<2.0）会导致柱子损坏。 1 简介 此柱填充的是反相或者极性胶联型态的硅胶基质材料的硅胶。硅胶形态的柱子用于正相（非水）条件。 反相（C8，C18，ODS，RP-8和RP-18）通常用于反相条件（水相）。 极性胶联型（APS，diol，CN和NH2）依照应用目的，可以用于正相和反相条件。建议不要将一个相同的柱子用于差别非常大的条件下，这是因为柱子在特定的条件下，固定相的性质会发生变化，所以在其他的条件下，会影响柱效。也不建议将硅胶柱用在反相条件下或者将方向柱用在正相条件下，这是因为这种过程会发生重复性差的问题（每一次注射之间和柱与柱之间的比较）。 2 色谱柱老化 在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。 A．在反相条件下老化 要老化这类柱子，首先要使用乙腈或者甲醇淋洗，然后你选用的洗脱液进行平衡。 在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。 如果流动相中使用了添加物（例如缓冲液或离子对试剂），建议使用正确比例的但不含此添加物的流动相进行缓冲冲洗。缓冲冲洗应当首先以低流速进行，最后再使用正常流速。 B．在正相条件下老化 柱效可能会受水与固定相的键合的严重影响。柱子的干燥（激活）或润湿（失活）可能是需要的。使用的溶剂可能是水饱和的或者是无水的。干燥柱子可以使用无水的二氯甲烷。 C．对于极性键合柱的特殊说明 由于这些柱子可以用于反相或者正相条件，在进行老化以前，一定要首先检查你要使用的淋洗溶剂或洗脱液是否可以与封装在柱子里的溶剂相混溶。如果这些溶剂不能混溶，必须先使用一个合适的缓冲溶剂进行冲洗。 3 洗脱液 注意第节和第2节。一定不要使用pH低于2或者高于7的缓冲液，这是由于它们会改变固定相的性质。极性键合柱最好使用在3到5 之间。在使用以前，洗脱液要进行脱气，以及使用0.5微米的滤膜过滤，以免发生检测和泵送问题。 一定要在开始使用系统以前检查水溶液中有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。 4 流量和压力 增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。 如果你想更换柱子，，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。
正相色谱和反向色谱及C18柱子 反相与正相的区别在于，固定相与流动相的极性大小。反相：固定相的极性小于流动相的极性正相：固定相的极性大于流动相的极性反向色谱流动相极性大于固定相极性测定样品时极性大的先出峰，正向反之 在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基（-CN）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分配比K值，随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。 该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。 反相键合相色谱法 在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称ODS或C18）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。 目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：
一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。 分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水+有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制是把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。. 一般地，固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。 1.C18是连接了18烷基碳链的反相固定相的总称。ODS 是以硅胶为基质键合的C18填料，而C18还包括其他基质的填料，比如高聚物小球为基质，氧化铝为基质，氧化锆为基质等键合C18链形成的反相固定相，这些可以称为"C18"，但是不是ODS。 2.RP-18也是C18中的一种，不同的公司对C18填料有不同的商
常用色谱柱简介 气相色谱毛细柱 （键合，聚二甲基硅氧烷） HP-1，DB-1，P-1，CP-SIL5CB， Ultra-1,007-1,RTx-1,AT-1 类似固定相：SE-30，SP-2100，OV-1，OV-101,使用 温度：-60℃-320℃ 应用范围：烷烃，芳烃，多环芳烃，醇，酚，酮，酯，醛，胺，卤代烃，吡啶，糖衍生物，氨基酸衍 生物，维生素衍生物，镇痛药，农药，溶剂，胆固SPB-50型中等极性柱 醇，香料，咖啡，食品添加剂等。 (键合, 50%二苯基,50%二甲基聚硅氧烷) 对照品牌：HP-50，HP-17，DB-17，RTx-50，AT-50 SPB-5型弱极性柱 类似固定相：OV-17, SP-2250,使用温度：30℃-310℃（键合，5%苯基，95%甲基聚硅氧烷） 应用范围：烷烃，低沸点芳烃，多环芳烃，醇，甘 对照品牌：HP-5，DB-5，BP-5，CP-SIL 8CB， 油三酸酯，喹啉，卤素化合物，香料，农药，酯，Ultra-2, ,RTx-5,AT-5 镇痛药，除草剂等。 类似固定相：SE-54，SE-52，OV-73 使用温度： -60℃-320℃ PTE-5，PTE-5QTM型弱极性柱
应用范围：烷基苯，多环芳烃，醇，酚，酮，脂肪(MS专用柱,键合,5%苯基,95%甲基聚硅氧烷) 酸酯，苯二甲酸酯，硝基芳烃，芳胺，烷基胺，联 对照品牌：HP-5 MS，DB-5 MS, DB-5.625，XTI-5， 苯胺，卤代烃，多氯联苯，，糖类衍生物，维生素衍BPX625，半挥发污染物分析柱（US EPA方法525， 生物，有机酸，镇痛药，农药，抗组胺药，溶剂，625.5，625） 生物碱，防腐剂，香料等。 类似固定相：SE-54,SE-52 使用温度：-60℃-320℃ 应用范围：多氯联苯，胺，有机磷，有机氯农药，SUPELCOWAX 10型极性柱 含氯除草剂，酚，苯胺，香料等。 (键合,聚乙二醇二万) 对照品牌：HP-Wax，DB-Wax，BP-20，CP-Wax 52CB，SPB-1701型中等极性柱 HP-INNO Wax,AT-Wax (键合, 14%氰丙基,86%二甲基聚硅氧烷) 类似固定相：PEG-20M, CARBOWAX-20M,使用温 对照品牌：HP-1701，DB-1701，RTx-1701，AT-1701，度：35℃-280℃ BP-10，CPSil19CB 应用范围：低沸点芳烃，醇，酮，酸，酯，醛，醚， 类似固定相：OV-1701,SP-2250 使用温度：室温-280 乙二醇，丙二醇，甘油，吡啶，胺，亚硝胺，卤代 ℃ 烃，胆汁酸衍生物，冰片，薄荷，精油，香料，酒，
COSMOSIL高效液相色谱柱使用说明书 一. 序言 非常感谢您购买我们的COSMOSIL色谱柱。为了保证色谱柱能够发挥最高性能和保持更长的寿命，我们建议您在使用前仔细阅读本说明书。 COSMOSIL色谱柱由不锈钢制成，其内部填料以超纯多孔球状硅胶为基质。我们的COSMOSIL系列覆盖了几乎所有的正反相色谱的一般应用和特殊应用，此外还具有分析目的和制备目的的色谱柱。请联系我们的经销商或直接联系Nacalai Tesque咨询最适合您的色谱柱。 二. 使用注意 1. 避免冲击和震动。 2. 按照标签上标明的方向连接色谱柱。 3. 将色谱柱连接到检测器之前，先使用20~30ml流动相通过色谱柱。 4. 请使用完全脱气的流动相。气泡会导致检测噪音并且会加速色谱柱的恶化。 5. 请使用HPLC级溶剂。 6. 包装盒内的检验报告书中记载了色谱柱出厂时的内部溶剂成分。给流动相中添加缓冲液 时，请确认检验报告书中的成分表以避免色谱柱内产生沉淀。 7. 请将流动相的pH值范围保持在2~7.5之内。缓冲液浓度范围通常为0.005~0.02M。使用 流动相前先将流动相通过孔径0.5μm以下的薄膜滤器。使用三氟乙酸时，请将浓度保持在0.1%以下。 8. 请将压力保持在200kgf/cm2以下。在使用高粘度流动相时需要特别注意。 9. 使用完反相色谱柱后，请先用不含酸或盐的溶剂清洗色谱柱，再用乙腈或甲醇清洗色谱 柱，紧栓保存。 10. 使用完正相色谱柱后，请将色谱柱内部的溶剂置换为无卤素非极性溶剂（如正己烷或正 庚烷），紧栓保存。 11. 注入样品前请务必过滤样品。另外，将样品注入到流动相内时，请注意不要产生沉淀。 12. 拆下色谱柱的端螺帽或端部滤片会造成色谱柱性能的大幅下降。 13. 不要将螺帽拧的太紧。 14. 使用制备柱时，请先使用分析柱确定样品的分离状态。注意：可能会有保留时间长于目 标物质或无紫外吸收的杂质存在。
正相、反相和极性胶联柱使用手册 分类:质量检验 2007.3.22 22:20 作者：LAI | 评论：0 | 阅读：146 正相、反相和极性胶联柱使用手册Chrompack HPLC Normal-,Reversed phase and Polar bonded columns 注意: 此色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（pH>7.0）或酸性溶剂（pH<2.0）会导致柱子损坏。在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。未正确地使用不能享受保修待遇。 1．简介 此柱填充的是反相或者极性胶联型态的硅胶基质材料的硅胶。硅胶形态的柱子用于正相（非水）条件。反相（C8，C18，ODS，RP-8和RP-18）通常用于反相条件（水相）。极性胶联型（APS，diol，CN和NH2）依照应用目的，可以用于正相和反相条件。建议不要将一个相同的柱子用于差别非常大的条件下，这是因为柱子在特定的条件下，固定相的性质会发生变化，所以在其他的条件下，会影响柱效。也不建议将硅胶柱用在反相条件下或者将方向柱用在正相条件下，这是因为这种过程会发生重复性差的问题（每一次注射之间和柱与柱之间的比较）。 2．色谱柱老化 在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。 A．在反相条件下老化 要老化这类柱子，首先要使用乙腈或者甲醇淋洗，然后你选用的洗脱液进行平衡。在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。 如果流动相中使用了添加物（例如缓冲液或离子对试剂），建议使用正确比例的但不含此添加物的流动相进行缓冲冲洗。缓冲冲洗应当首先以低流速进行，最后再使用正常流速。 B．在正相条件下老化 柱效可能会受水与固定相的键合的严重影响。柱子的干燥（激活）或润湿（失活）可能是需要的。使用的溶剂可能是水饱和的或者是无水的。干燥柱子可以使用无水的二氯甲烷。 C．对于极性键合柱的特殊说明 由于这些柱子可以用于反相或者正相条件，在进行老化以前，一定要首先检查你要使用的淋洗溶剂或洗脱液是否可以与封装在柱子里的溶剂相混溶。如果这些溶剂不能混溶，必须先使用一个合适的缓冲溶剂进行冲洗。 3．洗脱液 注意第节和第2节。一定不要使用pH低于2或者高于7的缓冲液，这是由于它们会改变固定相的性质。极性键合柱最好使用在3到5 之间。在使用以前，洗脱液要进行脱气，以及使用0.5微米的滤膜过滤，以免发生检测和泵送问题。
色谱柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 1、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓(如前所述)。 2、应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 3、一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 4、选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 5、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右。 6、保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要
拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置或更长时间。 7、色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出 1-2mm高度(注意把被污染填料取净)再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱(5-30mm)，可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2-9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。 8、新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会
色谱柱管理规程 1.目的 本文件规定了色谱柱的采购、接收、使用、保养和保存，以确保色谱柱达到合理应用和规范应 用的管理规范。 2.适用范围 本文件适用于本公司色谱分析用色谱柱的管理。 3.责任 3.1.本文件由质量部QC负责起草，质量部部长审核，生产技术副总经理批准。 3.2.质量部QC负责实施。 3.3.QC主管负责监督检查。 4.内容 4.1.色谱柱的采购 QC根据检验需要提出购买申请，注明柱子固定性类型、购买数量、规格、用途等，QC主管审核批准。由供应部从定点供应商处购买。 4.2.接收 4.2.1.编号、登记 对于新购进的色谱柱必须造册编号登记，贴上标签,注明编号。编号用阿拉伯数字表示，以此类推不重复使用。 填写色谱柱登记表，内容包括:生产公司、品名、型号规格、编号、购进时间、启用时间、固定 相类型、单价等。 4.3.存放 色谱柱分类存放。不同的色谱柱按柱子当时柱效不同放入不同的盒中，并标注不同状态以便区分避免混淆。色谱柱按照不同的柱效分为三类，使用良好；需要保养；停止使用。 保养前放入“需要保养”的盒中； 保养后并能提高柱效达到检验要求的放入“使用良好”的盒中； 保养后不能提高柱效并影响检验结果的放入“停止使用”的盒子中。 4.4.使用与保养 每启用一根色谱柱,在色谱柱标签上填写启用日期，放入“使用良好”的色谱柱盒中。 对于不同的样品可使用不同的色谱柱，也可使用同一根色谱柱，但必须确保色谱柱类型、柱效符 合要求。 对于一些使用频率少的柱子,因为放置时间长,容易干柱影响柱效, 每根柱子每三个月保养一次, .
每一次做好保养记录。 频繁使用的柱子，因为使用时间长，造成柱效降低或柱压增高等不利于检验结果的现象时，也要 对柱子作出相应的保养处理，并做好保养记录。 4.5.使用后清洗 色谱柱每次使用后要对柱子进行冲洗。冲洗分为两个方法：方法一（流动相为简单的有机相与水 混合的）用50%的甲醇冲洗15-30分钟，最后用纯甲醇冲洗15-30min；方法二（流动相中含磷酸或盐类或缓冲液的）先用重蒸馏水冲洗15min，然后用50%的甲醇冲洗15-30min，最后用纯甲醇冲洗15-30min。色谱柱的使用和冲洗方法都体现在高效液相色谱仪使用记录里面。 4.6.色谱柱的保存 4.6.1.气相色谱柱 对于暂不使用的色谱柱，应小心存放，可用硅橡胶块、帽或其他方式将两端封闭，置于盒中。 4.6.2.液相色谱相 首先色谱柱必须清洗干净后才能贮存,柱子不能贮存于水或水性溶剂中,否则会引起微生物的滋生。反相色谱柱可以贮存于甲醇或乙腈中，正相色谱柱可以贮存于经脱水处理后的正已烷中， 离子交换柱可以贮存于含5%甲醇或含0.05%叠氮化钠的水中，并将色谱柱两端密封，以免干燥，室温保存。 4.7.色谱柱的保养方法 应按所附说明书的要求对色谱柱进行保养。不同的色谱柱采用不同的保养方法。对于较昂贵的液相色谱柱,可以在柱前加一保护柱(预柱),防止样品中杂质污染分析柱,对于制备柱,因其进样量大,使用保护柱尤为重要。 4.8.报废 对于柱效完全不符合要求的色谱柱或由于其他原因已不能使用的色谱柱，经QC主管批准后，做好停用记录,不能随意丢弃,存放与“停止使用”的盒子中。每年集中清理一次，废弃处理。 5．记录 色谱柱的相关记录由QC整理,QA收集归档保存三年. 6.相关记录 R-SMP07047-01色谱柱登记记录 R-SMP07047-02色谱柱保养记录 R-SMP07047-03色谱柱停止使用记录 .
一.安装、启用和维护中重点注意事项 色谱柱既是液相色谱仪的最核心部件，价格相对昂贵，请牢记它是高档仪器中的高档部件，给它以足够的尊重和关怀。如避免强烈的碰撞和震动，尽管色谱柱从1米高的实验台掉落到水泥地上不至于100%会损坏，但50%的可能损坏你也承受不起。另外不要让柱床变干，避免在严寒环境受冻等。 1. 柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配 色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多。上图表明柱连接的6种不同方式（数字单位是英寸），如果两者类型不匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。接头比柱头深度长，不易拧紧而漏液；接头比柱头深度短，柱头内留有空隙而产生死体积，使谱带展宽和峰拖尾。
2. 溶剂的匹配转换 色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂，如果和流动相不匹配，使用前需进行转换。特别是流动相含缓冲盐时，如保存溶剂是纯有机相或有机相比例高，直接将新柱接入使用，会导致缓冲盐在柱内结晶析出，最严重会将新柱永久不可逆地损坏。正相柱保存溶剂一般为正己烷，如果要转换成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，转换中间需用二氯甲烷或乙酸乙酯过渡。 3. 新柱使用前的平衡和老化 厂家出厂检验时一般都已进行过平衡，但色谱柱到最终用户时间不一，用户正式测定前最好对色谱柱再次平衡。最好的平衡兼老化一起进行的方法是运行几次完整的分析程序（包括进样），直到观察到峰形、保留时间和峰面积稳定为止。所谓“老化”是借用了气相的术语，目的是达到分析物在色谱柱以及整个液相系统流路中的吸附饱和。对某些特定的待测物，如分子量大于1000的，因扩散速度慢，老化时间相应要长，可采取大浓度进样或在同一个洗脱周期内连续进样多针的方式加快老化。 4. pH使用范围 一般认为硅胶基质柱子的pH使用范围是2-8，这是很粗略的。硅胶类型、使用温度、硅胶表面所键合的固定相类型以及缓冲盐的不同，对此均有影响。硅胶比孔容小、键合密度大的填料pH耐受范围要大
正相色谱 液-液色谱有正相和反相之分。如果采用极性固定相和相对非极性流动相，就称为正相；如果采用相对非极性固定相和极性流动相，则称为反相。由于极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相液-液色谱系统一般可用于分离极性化合物。相反，反相液-液色谱系统一般可用于分离非极性或弱极性化合物。正相色谱的流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出；反相色谱的流出顺序正好相反。另外，其他有些色谱如柱色谱也有正反相之分。 正反相色谱区别： 色谱柱的安装： 1、首先应确认柱和仪器的接头以及管路是否匹配。为减少死体积，进样阀、柱子、检测器之间的连接管路内径尽可能使用内径较小的管线，同时控制进样器、色谱柱和检测器之间连接管线的长度。安装色谱柱之前，确认流路系统中的溶剂是否正常。对分析较复杂的样品建议安装保护柱。 2、为了使色谱柱与仪器系统达最佳的连接效果，应尽量使用与色谱柱接口相匹配的螺帽和锥形接头，如原来的接头长期匹配其他类型的色谱柱，建议在连接新色谱柱前应检查匹配情况，避免造成色谱柱的损坏或因色谱柱不匹配造成的漏液。 3、使用PEEK 材料的通用接头，只需用手拧紧不需要特定扳手，使用压力为5000psi；使用温度不得超过100℃。 流动相平衡： 1、在进行样品检测前，至少使用20倍柱体积流动相使色谱柱充分平衡。流动相一定要使用色谱级别的溶剂。如使用水相的缓冲液应当天配制以保持新鲜避免细菌产生。 2、流动相使用前需用微孔滤膜过滤,消除流动相中颗粒对色谱系统和色谱柱的损坏。缓冲液与其他流动相混合后应重新过滤避免溶解度变化造成产生新的沉淀。不应使用纯水作为流动相冲洗C18色谱柱，以免柱性能损坏（添加5％的有机溶剂冲洗色谱柱，同时可以达到对缓冲盐清洗的作用。还可以使色谱柱更容易平衡）。 3、流动相需脱气后使用，可避免因气泡导致的泵和检测器的工作不正常。如果测试时使用的流动相与色谱柱保存使用的流动相有较大区别，应该使用过度分布的形式进行平衡。避免由于流动相的突然变化造成柱压增加过大或流动相缓冲盐结晶造成对色谱柱和仪器系统的损坏。正相色谱柱比反相色谱柱需要更长的平衡时间。 样品制备与操作： 1、样品应当尽可能溶解在能与流动相相互溶的溶剂中。除特殊指明外，如使用强溶剂溶解样品柱子的分辨率将可能降低。
液相色谱仪正相与反相区别在液相色谱仪分析中，根据流动相和固定相相对极性的不同，可分为正相色谱和反相色谱。所谓正相色谱是指固定相极性大于流动相极性的情况，反之，固定相的极性小于流动相的极性，则称为反相色谱。 正相色谱与反相色谱的区别是什么呢？由于极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相色谱系统一般适用于分离极性化合物，极性小的组分先流出。相反，反相色谱系统一般适用于分离非极性或弱极性化合物，极性大的组分先流出。因此在应用上，正相色谱用于分离极性较大的物质，如蛋白质、生物碱等。反相色谱多用于分离极性较小的物质，在流动相的选择上，反相色谱的优势更大，在实际工作中反相色谱的应用更为广泛。 正相色谱用的固定相通常为硅胶，以及其他具有极性官能团，如胺基团和氰基团的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性弱的组份最先被冲洗出色谱柱。 反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18、C8、C4、C6H5等。 反相液相色谱柱效高、分离能力强、保留机理清楚，是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种，对于生物大分子、蛋白质及酶的分离分析，反相液相色谱正受到越来越多的关注．反相色谱法是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式．反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离．在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、异丙醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作流动相．普通的反相色谱固定相和孔径大于300?的硅胶键合烷基固定相应用较为普遍，聚合物基质的反相色谱固定相也有较多应用． 在分析实验中需将反相色谱切换正相色谱的方法如下： 1、先将色谱柱用相应的溶剂冲洗干净，然后将色谱柱拆下来密封保存。用双通将进样器与检测器连接； 2、将贮液瓶内装入300ml的二次蒸馏水，将流速渐次提高到2.0ml/min冲洗系统1.5h。注意观察泵压； 3、将流速渐次降到0ml/min，把二次蒸馏水更换为甲醇，将流速渐次提高到2.0ml/min冲洗系统1h； 4、用同样的方法将甲醇更换为异丙醇、四氢呋喃，各冲系统1h； 5、最后将四氢呋喃更换为预先配制好的流动相冲系统1h，同时将柱塞杆清洗系统内的10%异丙醇更换为流动相，保持50-60滴/min的速度清洗柱塞杆。再将双通更换为正相色谱柱，待液相色谱仪色谱柱平衡好以后就可分析样品了。
YMC HPLC COLUMN USER'S MANUAL YMC-Pack SIL YMC-Pack SIL-06使用说明书 YMC-Pack Diol-NP 1.前言 非常感谢您这次选用YMC公司的高效液相色谱柱YMC-Pack SIL系列。 本公司在YMC-Pack SIL系列的制造过程中进行了严格的质量管理，保证能为客户提供最高品质的产品。为了使供给您的色谱柱最大地发挥其性能并能够长时间地被正确使用，请认真阅读本产品的使用说明书。 2．色谱柱的连接型号 在色谱柱标签上所记载的号码后面的（）内有标记符号表示。 W：waters 的互换连接样式 3．出厂时柱内的保存溶剂 在产品盒内的附件COLUMN INSPECTION REPORT（检测报告）中有标示。在进行流动相的置换时请注意溶剂的混合性。如果色谱柱需要长期保存的话请置换为此溶剂。 4．流动相（洗脱液） ?一般来说使用非水性溶剂，正己烷，氯仿等是基本的溶剂。如需缩短极性成分的洗脱时间，请添加适量的异丙醇，乙酸乙脂等。 ?在流动相中可添加使用水、醋酸、蚁酸等，但考虑到分离的重现性，我们推荐每个样品最好有其专用柱。 ?使用时请按照色谱柱标签上的箭头方向来进行通液操作。 ?流动相的pH值通常请调在2.0到7.5之间。 5.色谱柱的清洗及保存（一般方法） ?如推断色谱柱有极性物质吸附时，请使用异丙醇进行充分的清洗。 ?如使用的流动相中含有酸或碱时，请把流动相置换成不含酸碱的溶剂后，再封入有机溶剂或正己烷/异丙醇等来进行保存。 6. 其他的使用环境 ?柱压在柱长150mm以下为20MPa左右，250mm是25MPa左右是为其上限基准值。但内径为10mm以上的色谱柱的压力以10MPa左右为其压力上限基准。 ?反复进行样品注入后，柱压可能会升高。如果发生这种情况，请使用YMC Duo-filter对样品进行预处理过滤。 另外对于易造成筛板堵塞的样品请使用预柱过滤网（XRPRCS02）来进行处理。 ?色谱柱的使用温度上限为50℃，但是，由于流动相的pH值等因素会影响到色谱柱的寿命，所以通常情况下请在20℃~ 40℃范围内使用。 ●如果产品出现破损，或与所订购产品不符时，请立即联系经销商。YMC上海代表处：上海市长宁区仙霞路319号 远东国际广场A 栋2404 - 2405 T eL：021 – 62351388 (UM070625AC)
亲水作用（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。本文简介了HILIC的起源、定义、分离特点；比较了HILIC和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术的特点，并对其使用中的进行了总结。 1. HILIC的概念 亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。2. HILIC的分离机制 HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。 影响保留的主要因素 普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。 影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显着增加样品的保留因子。在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂。一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显着的亲水作用。如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。 Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid. 4. HILIC与RP-HPLC的比较 传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。 HILIC正好可以解决这些问题，它提供了一种与传统RPLC互补的保留方式，能够使在RPLC 上保留较弱或没有保留的物质在HILIC柱上提供合适的保留，如图2所示： Figure 2: Chromatograms comparing the retention of allantoin on Atlantis HILIC Silica and Atlantis dC18 columns. (a) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis dC18; mobile phase: 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows no retention (k =0) of allantoin. (b) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis HILIC Silica; mobile phase: 95:5 (v/v) acetonitrile–water containing 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows retention (k =1) of allantoin. 另外，HILIC柱上的洗脱顺序与RPLC柱上的正好相反，极性较小的物质先出峰，极性较大的物质后出峰。如图3所示：