病情持久不愈,气血郁滞,经脉失畅,化湿生痰,痰血瘀结而
致。根据其病机,选用小金丸治疗,取得较好疗效,值得推广。5 治疗乳腺囊性增生病[5]
将500例乳腺囊性增生病患者随机分为治疗组和对照组各250例,对照组单用三苯氧胺治疗,治疗组在对照组相同治疗的基础上加用小金丸治疗。结果:治疗组总有效率为9210%,对照组总有效率为6716%,两组有非常显著性差异(P <0101)。乳腺囊性增生病系内分泌障碍性增生病,一是体内女性激素代谢障碍,尤其是雌孕激素比例失调,使乳腺实质增生过度和复旧不全;二是部分乳腺实质成分中女性激素受体的质和量的异常,使乳房各部分增生程度参差不齐。三苯氧胺与此激素竞争受体,阻断过高的雌激素作用于乳腺组织,但部分患者临床效果甚微,或服药期间疗效较好,停药后复发。小金丸的药理实验证实对乳腺泡和导管增生有明显抑制作用,同时能抑制纤维母细胞摄取14-甘氨酸减少胶原纤维
合成,又能促进细胞吞噬胶原纤维及其断片,增强细胞溶酶体释放组织蛋白水解胶原纤维,从而消降纤维细胞的增生、粘连,疗效肯定,不良反应小,但疗程较长。中医学认为乳腺增生病主要是气机郁滞,痰瘀互结,冲任失调所致,治当理气化瘀散结,活血祛瘀为原则。小金丸方中麝香走窜通络,散结开壅,枫香脂调气血,土鳖消肿定痛,地龙通络,制草乌祛风湿,温经散寒,当归活血,香墨消肿化瘀,五灵脂、乳香、没药活血化瘀、消肿定痛。诸药合用有温通、活血、消壅、散结之效,可使气旺络通,痰散结消。配合三苯氧胺治疗乳腺增生病,标本兼治,故能取得较好疗效。6 治疗慢性盆腔炎包块[6]
将60例患者(疾湿疥阻兼脾肾两虚型)分为2组各30例,治疗组口服小金丸和血宝胶囊配合宫颈湿敷血竭粉治疗。对照组用西医抗炎治疗。治疗前后B 超测量盆腔包块的大小、检测雌激素水平、观察临床症状消失的情况。结果:总有效率治疗组86167%,对照组为63133%,2组比较,差异有显著性意义(P <0105);随访半年复发率,治疗组为23108%,对照组为63115%,2组比较,差异有非常显著性意义(P <0101);雌激素水平治疗前后比较及治疗后组间比较,差异均无显著性意义(P >0105)。慢性盆腔炎包快属中医学癥瘕范畴,多起于经行产后,胞脉胞络空虚,血室正开,痰湿之邪乘虚而入,蕴结胞宫;失治误治,余邪未净,迁延日久,病及血分,致
瘀积胞中,积聚成癥。小金丸功能散结消肿,化瘀止痛,原用于痰气凝滞所致的瘰疬、瘿瘤、乳岩、乳癖,用于此药治疗盆腔炎包块属异病同治,有异曲同工之妙。现代药理研究表明小金丸具有抗炎、消肿、抗肿瘤和镇痛作用。血宝胶囊具有益肾健脾、补阴培阳之效。血宝既可助小金丸化痰散结、活血消癥之力,又可防止小金丸攻邪太过损伤正气。血竭粉是伤科活血疗伤之圣药,取其破散癥积宿血之功。内服外用双管齐下,共奏化痰散结、化瘀消癥之功,使邪去而不伤正。本研究表明,用中成药扶正消癥法治疗慢性盆腔炎包块具有无创性、服用简便、疗效好,复发率低的优点。7 治疗结节性筋膜炎[7]
5例结节性筋膜炎患者,内服小金丸016g ,2次/d 。局部服用黄金膏(金黄散+凡士林)+四虎散(由生草乌、生半夏、生南星、狼毒组成)外敷,方法:根据肿块大小,先用金黄膏涂布于纱布上,再掺加四虎散,外面用单层纱布包裹,最后在药物表面撒少量蒸馏水,敷贴患处,每2d 换1次。结果5例均治愈。最短治愈时间26d ,最长治愈时间35d ,平均治愈时间3018d 。结节性筋膜炎又称为假肉瘤性筋膜炎,是一种发生于浅筋膜的良性增生性病变。小金丸具有消痰化坚、活血止痛、消结散毒的作用;金黄散清热、解毒、消肿、定痛;四虎散化痰散结止痛。内外治结合,共奏解毒化肿、化痰散结、活血止痛之效,故用于治疗本病能取得较满意的疗效。
参 考 文 献
[1] 秦树光,等.小金丸联合甲状腺素片治疗甲状腺肿的临床分析.
现代中西医结合杂志,2005,14(8):1018.
[2] 屈江宁.小金丸治疗良性前列腺增生80例.世界中医药,2008,
3(5):277.
[3] 马宝华,等.小金丸治疗带状疱疹后遗神经痛44例.中国中医
急诊,2003,12(5):473.
[4] 余勇.小金丸治疗聚合性痤疮24例.医药导报,2000,19
(3):263.
[5] 杨玉国,等.小金丸与三苯氧胺合用治疗乳腺囊性增生病250
例分析.实用中医药杂志,2005,21(5):261.
[6] 邱明英,等.小金丸为主治疗慢性盆腔炎包块的临床研究.新中
医,2008,40(4):55
[7] 吴亚旭.中药治疗结节性筋膜炎5例.江苏中医药,2005,26
(11):27.
间充质干细胞研究进展及其临床应用前景
李玲玲 李晶
=关键词> 骨髓间充质干细胞;多向分化;组织工程 作者单位:130021吉林省前卫医院(李玲玲);吉林省人民医院中西医结合科(李晶)
间充质干细胞(m esenchym al stem ce lls ,M SCs)通常是指
从骨髓或其他组织中分离到的在体外具有多向分化潜能的一类细胞。自F riedenste i n 等首次报道骨髓中有少量细胞在培养过程中能贴壁分化形成类似骨、软骨的集落后,人们对这些细胞产生了浓厚兴趣。随后从鼠、兔、犬、人等多种动物的骨髓中均分离到了这种贴壁细胞。它们具有多向分化潜能,
在体外不同诱导条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及神经细胞[1]。
与软骨细胞、骨髓基质细胞、胚胎干细胞等相比,M SCs 具有强大的增殖力、较强的多向分化潜能,而且具有取材方便、便于自体移植、便于外源基因转染及表达调控等诸多优点。最近,还发现M SCs 具有免疫调节功能[2]。因此,M SCs 是组织工程的一种新的理想种子细胞。目前,已知M SC s 是源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞,广泛存在于全身结缔组织和器官间质中[3]。本文就M SC s
研究目前现状及存在问题简要评述如下。
1M SC s的命名
由于M SC s来源及分化潜能的多样性,曾被命名为骨髓基质细胞(M arrow stroma l cells)、集落形成单位成纤维细胞(colony-for m i ng unit fi brob lasts,CFU-F s)、骨髓基质干细胞(bone m arro w strom a l ste m cells,B M SSC s)、基质前体细胞(strom al precursor cells,SPC s)、骨骼干细胞(s ke l e tal ste m ce lls,SSCs)、多潜能成体祖细胞(m ult-i potent adult progenitor ce lls,M APCs)等[4]。虽然这些术语均不能准确概括其发育起源和分化潜能,但间充质干细胞(M SCs)这一名称现已被大家普遍接受和使用。
国际细胞疗法学会(Internationa l Soc i e t y fo r Ce ll u lar Ther-apy,ISCT)建议学者们在下列情况下采用M SCs这一名称:一是在体外培养中必须具有贴壁性;二是为CD105、CD73、CD90抗原阳性,但缺乏造血系统抗原CD45、CD34及单核细胞、巨噬细胞和B细胞抗原;三是在标准的体外分化条件下,它们至少能分化形成成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞,且这种分化能用广为接受的染色程序加以证明[5]。因此,这三条原则是M SCs分离、培养、鉴定的基本原则。
2M SC s的分离培养
M SCs广为接受的来源是动物或人的胫骨、股骨处的骨髓。此外,还可从脂肪组织、骨外膜、滑膜、骨骼肌、表皮、血液、骨小梁、人脐带、肺、牙髓、牙周膜等处分离到M SCs,提示M SCs在体内的分布极其广泛。最近K ern等从三种不同组织中分离M SCs并在同样条件下培养,结果三种来源的M SCs在形态学及免疫表型方面均无差异,但细胞的分离纯度、增殖力及分化潜能有一定差异。其分离方法主要有密度梯度离心法、贴壁法、流式细胞术和免疫磁珠分离法等4种方法。流式细胞术和免疫磁珠分离法设备昂贵,操作复杂。国内目前常用P erco ll密度梯度离心法和贴壁法。与贴壁法相比,P erco ll 法所获M SC s纯度高,杂质细胞少,增殖力强,常表现为梭形星形的上皮样细胞形态。因此用密度梯度离心法分离M SC s 效果较好。
不同物种M SC s体外培养时所需的培养条件不尽相同。有人比较了A-M E M、DM E M-HG、D M EM-LG3种培养基对兔M SCs体外贴壁、增殖、分化的影响,认为A-M E M最适合于M SCs的体外培养和增殖。M SCs体外培养最常用的是含10%~20%胎牛血清的DM E M培养基。体外培养时,M SC s 呈成纤维细胞样形态,研究发现M SCs只有经高密度接种且培养数代后,才能表现出形态和表型的一致,但此时会丧失分化能力[6]。另外,在培养的早期阶段,尤其是低密度接种时,人间充质干细胞(h M SC s)的形态、表型和功能出现不一致性[7]。h M SCs具有极大的扩增潜能,表现出活跃的增殖能力并保持着向多种间充质细胞系分化的潜能。
3M SC s的表面特征
h M SC s表达多种不同细胞的表面蛋白,包括多数整合素、生长因子受体(bFGFR,PDG FR,EG FR,TGF B IR/II R)、趋化因子受体(某些白介素、CC及CX C受体)以及细胞粘附分子(VCAM-1,ICAM-1/2,ALCAM-1,L-se l ecti n,CD105,CD44)等[1-3]。h M SC s还产生大量的基质分子,包括纤连蛋白、I, III,I V型胶原、层粘连蛋白、透明质烷及蛋白聚糖等[8-9]。
研究发现h M SCs表达一组独特的趋化因子:3个CC受体(CCR1、CCR7、CCR9)、3个CX C受体(CXCR4、CXCR5、CXCR6)。HM SC s还分泌CCL2、CCL4、CCL5、CCL20、CXCL12、CXCL8等配体,当配体结合时,M APK和FAK激酶磷酸化[10]。迄今为止,对于M SCs的表面标志尚不确定。流式细胞术检测显示,M SC s的表面抗原具有非专一性,表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志;不表达造血细胞的表面标志,如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8和?、ò、ó型胶原及碱性磷酸酶等;也不表达与人类白细胞抗原(HLA)识别有关的共刺激分子B7-1、B7-2及主要组织相容性复合物ò类分子如HLA-DR抗原等,因此具有低免疫原性[11]。细胞周期研究发现,M SC s中有90%处于G0/G l期,说明M SCs具有高分化潜能。M SC s能分泌I L-6、IL-7、IL-8、IL-1、G-G SF、D SF、SCF等多种细胞因子,对支持造血和维持细胞生长分化十分重要[12]。
4M SCs的分化潜能
最近,L i n Song等[4]提出骨髓干细胞的这种转分化能力并非真正的转分化,它们所获得的表型改变是通过细胞融合而不是通过分化而来的。M SCs作为骨髓干细胞中重要的成员,具有高度的可塑性,可向多种细胞系分化。研究表明, M SCs在不同的体外条件下可诱导分化为骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞等,还可向神经细胞、上皮细胞、血管内皮细胞、心肌细胞等分化[5]。在体外一些因素的作用下,M SC s 可能会改变自身的基因表达,从而转分化为其他谱系的细胞。因此要了解M SCs的定向分化过程,找到其转分化的关键基因至关重要。另一种观点是M SCs之所以能多向分化是因为其本身可能存在能生成所有3个胚层细胞的多能成体祖细胞(MA PC s)。
411分化为中胚层起源的细胞研究发现M SCs经5-氮胞苷(5-azacyti d i ne)处理后可诱导分化为心肌细胞[13]。目前认为干细胞进入微环境后对分化信号的反应受周围正在进行分化的细胞影响,并对新的微环境中的调节信号做出反应,可称之为/环境诱导分化0。干细胞对环境信号的反应能力随时间而变化,反应强弱取决于细胞表面信号传递分子或转录因子的表达,是定向分化的决定因素。实验表明,环境诱导分化除可能与细胞接触有关外,还存在基因水平调控、细胞因子调控等。
目前对M SCs分化为成骨细胞和软骨细胞研究得比较深入。有多种方法用于向软骨的诱导分化,其中两种代表性培养方法的建立促进了M SCs向软骨分化的研究,它们分别是颗粒培养(pe llet cu lture)和串珠培养(a l g ina te bead cu lture)方法。后者曾广泛应用于新分离的耳廓软骨细胞的培养,能使离体的耳廓软骨细胞培养2周后合成与体内软骨基质相类似的基质,并能保持维持8周[14]。这种方法也能使已去分化的软骨细胞重新表达软骨细胞表型。然而仅这些条件尚不足以使M SCs形成软骨,尚需同时应用一定的生物诱导活性因子如胰岛素、转铁蛋白、转化生长因子B(TGF-B)等,其中TGF-B家族在诱导M SCs向软骨发育分化中起重要作用。研究表明,TG F-B能激活胚胎间充质干细胞以及骨膜细胞向软骨细胞发育分化,但该家族成员对软骨前体细胞及其他细胞的作用不完全相同。
412分化为跨胚层的细胞2000年W oodbury等在加有20%胎牛血清的DM E M基础体系中培养传代鼠M SCs,经1~ 10mmo l/L二巯基乙醇(B M E)预诱导24h后应用2%二甲基亚砜(D M SO)和200L m o l/L3,2-叔丁基-4-羟基茴香醚(B HA)诱导30m i n至6d。通过蛋白印迹和免疫细胞化学分析发现,诱导早期M SCs主要表达巢蛋白(nesti n),它是神经前体
干细胞表达的中间丝;随后神经元特异性烯醇化酶(N SE)、神经微丝蛋白(NF-M)、神经生长因子受体(trkA t)的表达逐渐增强,而nesti n表达迅速减少,6d后完全消失,表明M SCs逐渐分化为成熟的神经元样细胞,而且约80%左右的M SCs可诱导分化为神经样细胞[15]。目前已建立了体外诱导M SC s 分化为神经细胞的培养体系,以全反式维甲酸(RA)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)诱导7~14d 后,通过免疫荧光、RT-PCR检测,发现M SCs转化为神经元样细胞[16]。此后有多项研究分别用不同的诱导方法提高M SC s 向神经细胞分化的效率,并不断寻找其向不同类型神经细胞分化的调控。
5M SC s在组织工程修复中的应用
在将M SC s作为组织工程种子细胞及同种异体移植研究方面,细胞流式分析未分化M SCs的?类、ò类分子及共刺激分子B7-1、B7-2的表达,通过混合淋巴细胞反应检测同种异体间免疫排斥反应。在体外实验中,无论是同基因的还是异基因的,分化的还是未分化的M SC s都能强有力的抑制淋巴细胞的增殖反应,包括细胞和非特异性丝裂原刺激的T细胞增殖反应。在人和动物模型中的研究已证实M SC能够用于长期移植和进行体内分化。
利用M SCs进行组织工程研究的优点为:1取材方便,且对机体无损害。M SCs多取自骨髓,简单的骨髓穿刺即可获得;oM SC s取自自体,用其诱导而来的组织进行自体移植不存在组织配型及免疫排斥反应;?M SCs诱导分化的组织类型较多,理论上不仅可分化为来自中胚层的所有组织类型,而且还可分化为来自其他胚层的组织细胞。如果分化为骨、软骨和肌肉、肌腱等细胞,则可在骨科创伤性疾病中有重要的应用价值;分化为皮肤组织,则在烧伤植皮中有不可估量的应用前景;分化为神经细胞,可在神经系统疾病中有广泛的应用。511细胞治疗心脏的损伤再生近年来研究发现,通过冠状动脉或心肌局部注射导入缺血心肌部位的M SCs可分化为血管内皮细胞[13],从而促进心脏局部血管新生,达到改善心肌缺血的目的,为心肌细胞的新生和修复创造更好的条件。实验显示,将M SCs及经5-氮胞苷处理的M SCs注射到自体心肌疤痕组织内,8周后在所有移植M SC s的疤痕组织内均可看到有标记的移植M S C s发育成心肌样细胞,移植后心脏功能也有所提高,且可见疤痕组织内有新生血管形成。目前,关于M SCs对心肌细胞再生与修复的作用机制还不甚明确[14,15],对其在体内、外增殖和分化的分子机制了解还较少。以M SC s 作为心血管管疾病临床治疗的一个手段还需解决以下几个问题:1可用M SCs治疗的心血管疾病类型;o提出一种能同时促进心肌细胞再生和血管新生的治疗策略,因为这两者对心室的重构及心脏的修复均有重要意义;?注射的剂量、移植的途径、治疗的时机、M SCs在体内增殖与存活时间、如何提高M SCs的分化能力、由M SC s分化成的心肌细胞的功能与存活时间、以及治疗后的随访时间等问题都是必须解决的[16]。512用于软骨组织的修复M SCs通过体外诱导性培养能有效地产生软骨[17],但只能达到在形态及生化成分上类似透明软骨,不能实现与原有软骨相同的再生。现已证明,白细胞介素-1(i nte rleuki n-1,IL-1)是介导关节软骨破坏最重要的细胞因子,IL-1是炎症调节剂,是调节炎症的始动因素。早在70年代H ow ell等在体外培养巨噬细胞时发现其上清液能促进软骨的降解,并促进软骨细胞分泌金属基质蛋白酶。513用于肺损伤修复组织修复是骨髓基质干细胞移到损伤的组织后分化完成结构和功能的恢复。到达肺部可分化为?/ò型肺泡上皮细胞、成纤维细胞和支气管上皮细胞,但具体的分化的细胞数量还不清楚[18]。
514用于神经损伤的修复在M SC s的移植研究中,发现移植后大鼠功能改善明显,但分化的M SC s比例却非常小,因此考虑使临床显效的并非仅是分化后的M SC s,而更可能是通过营养因子、细胞因子及其他神经保护因子的产生,局部微环境的改变和内源性神经干细胞的分化等方面起到了神经修复和保护的作用[19]。因此如何调控M SCs移植后的迁移、整合,移植的微环境和M SCs的相互影响,如何使M SC s在移植后长期存活并有效发挥相应功能等,是在临床应用之前要解决的重要问题。
6目前应用存在的问题
M SCs的诸多优点使其具有重要的研究和应用前景,特别是在细胞治疗和基因治疗中有重要临床应用价值。但是仍有许多问题尚未解决,如分离M SC s的有效方法尚不稳定, M SCs特异性的表面标记尚不清楚,在体外扩增、定向分化的条件尚不成熟,而且M SC s的免疫调控、发育起源与等级、体内特性等等一系列问题还有待解决。如果这些问题都解决了,相信在不久的将来,M SC s在医学界会引起一场巨大的变革。
参考文献
[1]T aga m iM,Ich i nos e S,Ya m agal a K,et a.l Geneti c and ultrastru c-
tral de m on stration of strong reversi b ilit y i n hu m an m es en chy m al ste m
cells.C ellT i ss u e Res,2003,312(1):31-40.
[2]Zh ao LR,Duan WM,ReyesM,et a.l H u m an bon e m arro w ste m
cells exh i b i t neural pheno types and a m eli o rate neuro l og i cal def-i
c i ts after grafting i nto t h e i sche m i c b rai n of rats.E xp N eu ro,l
2002,174(1):11-20.
[3]D e BC,DellAF,Ty l zanow s k i P,et a.l Mu lti poten tm esenchy m al
ste m cell s f ro m adult hu m an s ynov i alm e m bran e.A rthritis Rheu m,
2001,44(8):1928-1942.
[4]L i n Song and Roc k y S Tuan.poten tialo fhu m an m esenchy m al ste m-
cells deri ved f rom bone m arro w.The FAS EB J ourna,l2004,18
(9):980-982.
[5]Good w i n H S,B ic kn ese AR,Ch ien S N,et a.l M u ltili neage d iffer-
en ti ati on activit y by cell s i solat ed from u m b ili cal cordb l ood:expres-
si on of bone,f a,t an d neu ralm arkers.B i ol B l ood M arro w Trans-
p l an,t2001,7(11):581-588.
[6]Barry FP,M urphy J M.M esenchy m al ste m cell s:C li n ical appli ca-
ti ons and b i ological characterizati on.Int J B i oche m C ell B i o,l
2004,36:568-584.
[7]M in guell JJ,E ri cesA,CongetP.M esenchy m al ste m cell s.Exp B-i
olM ed,2001,226:507-520.
[8]Roufos se CA,D irekze NC,Ott oWR,et a.l C ircu l ati ng m esenchy-
m al st e m cell s.In t J B ioch e m C ell B i o,l2004,36:585-597.
[9]M au ro K ra m pera,Annalisa Pasi n,i Antonell a R igo,et a.l H B-
EGF/HER-1si gnali ng i n bon em arrow m esenchym al ste m cell s:i n-
duci ng cell expansion and reversibly p reventi ng m u ltili neage d iffer-
en ti ati on.B l ood,2005,106:59-66.
[10]U rbanek K,Torella D,Shei kh F,et a.l M yocard i a l regenerati on
by acti vation of m ulti potent card i ac ste m cells i n ische m i c heart
f a il ure.Proc NatlA cad SciUS A,2005,102:8692-8697.
[11]W orsterAA,B ro w er Toland BD,Forti er LA,et a.l Chond rocyti c
d ifferenti ation of m esenchy m al st
e m cell s sequen ti all y exposed t o
tran sf ori ng grow th f actor -bet a1i n m onolayer and i nsu li n -li ke gro w th fact or -I i n a t h ree -di m en si onalm atri x .O rthop R es ,2001,19(4):738-749.
[12] Fu ku m ot o T ,Sperli ng J W ,San yal A ,et a.l Co m b i ned eff ects of
i n s u li n -li k e grow th fact or -1and transf or m i ng gro w t h fact or -2beta1on peri osteal m esenchy m al cells d u ri ng chondrogen esi s i n vitro .O steoart h ritisC artil age ,2003,11(1):55-64.
[13] P i ttenger M F ,M arti n B J .M esenchy m al st e m cell s and t h ei r poten -tial as card iac t herapeu ti cs .C i rc Res ,2004,95(1):9-20.
[14] To m a C,Pittenger MF,C ah ill KS ,et a.l H u m an m esenchy m al
ste m cell s d iff eren tiat e to a card i o m yocyte phenolcyte i n t h e ad u lt m uri n e h ear.t C ircu lati on 2002,05:93-98.
[15] Woodbury D ,S ch w arz E J ,Prockop D J ,et a.l A d u lt rat and hu -m an bone m arrow stro m al cell s d ifferenti ate i n t o neu rons .JN eu -
rosciR es ,2000,61(4):364-370.
[16] San c h ez -Ra m os J .S t e m cells fro m u m b ili cal cord b l ood .S e m i n
R eprod M ed ,2006,24(5):358-369.
[17] Mu ller P ,Beltra m iAP ,CesselliD ,et a.l M yocard i al regenerati on
by endogenous adu lt progenitor cells .JM o l C ell C ard i o,l 2005,39:377-387.
[18] Yas u s h iO s h i m a ,Nobuyosh iW at an abe ,Ken -ich iM ats uda ,et a.l
Behavi or of Tran s p lanted Bon eM arrow-deri ved GFP M esenchy m al Cells i n Osteochond ralDefect as a S i m ulati on ofAu tol ogous Trans -p l an tati on .JH istoch e m C yt oche m,2005,53:207-216.
[19] Fischer L ,Bo l and G ,Tuan RS .Wn -t 3A enhances bone m orpho -genetic protei n m ed i ated chondrogenesis of m uri ne m esenchy m al cells .J B ioche m,2002,277(34):30870-30878.
#卫生论坛#
护生对医疗废物管理知识了解程度的调查分析
黄珊珊 蔡雪华 陈碧珠
=摘要> 目的 调查护生对医疗废物管理知识的了解程度,提高其管理医疗废物的能力及安全防护措施,减少医疗废物对人民健康造成的危害。方法 用自制问卷对120名不同层次学历护生进行调查。结果 护生对医疗废物管理知识的掌握情况相对薄弱,本科、大专护生对医疗废物管理知识掌握程度明显高于中专护生。结论 了解护生对知识的了解掌握情况,针对问题做出相应的措施,加强医疗废物管理重要性的意识,减少对护生的职业暴露因素,提高其安全防范意识,避免医疗废物流失造成的危害。
=关键词> 护生;医疗废物管理;调查
=Abstract > Objecti ve Acquai ntance degree protecti ng a life on i nqu irym anagi ng kno w ledge t om edical treat ment good -for -not h i ng ,the ab ility and safety m i provi ng the person m anagi ng a good -for -not h i ng protectm eas -ure ,cut dow n the da m age thatm edical treat m en t good -for -nothi ng brings abou t to t he people health .M ethod W ith d ifferent to 120arrange m ent of ideas of sel-f restrai nt questi onnai re ,educati onal background protects a life m ak i ng an i nvestigati on .R esult Protect m echan i cally ,cond iti on i s relatively weak ,regular college course ,j un -ior coll ege protect a life tom edical treat m ent good -for -not h i ng m anageri al know -how grasp i ng to gras p degree to m ed ical treat m en t good -for -noth i ngm anageri al know -ho w overt op i ng techn ical secondary school obvi ousl y protec -ti ng a life .Concl usion The acquaintance kno w i ng t o protect a life t o know l edge gras ps condition ,specificall y for proble m does out correspondi ngm easure ,m ental consci ous ness rei nforci ng m ed ical treat m ent w astem anage -m ent si gnificance ,t he occupati on falling off to protecti ng a life reveals a factor ,m i prove whose safety keeping w atch m ental consci ousness ,avoi d t he damage thatm edical treat m ent good -for -noth i ng runni ng off bri ngs abou.t
=K ey words > Protects li ves ;M ed icalw astem anage m en ;t Investi gation 作者单位:362804福建医科大学附属第一医院闽南分院综合内科
医疗废物是一类特殊的医疗垃圾,它含有大量对人体有害的因子,具有很大的危害性[1]。随着人口和医疗机构的增加,医疗条件的改善,医疗废物的产生量也在逐年增加,预测每年以3%-6%的速度增长[2]。医疗废物中所含的致病菌及病毒是普通生活垃圾的几十倍甚至上千倍,如果处理不当,将对人体健康和生命构成巨大威胁,对环境造成危害。因此正确处置一次性医疗废物显得特别重要。实习护生由于环境生疏,经验不足,技术欠熟练以及来自于各方面的压力,缺乏相应的职业防护意识,工作中更容易受到伤害。了解实习护生
的医疗废物管理知识掌握现状,探讨其对策,对降低实习护生的职业性危害,保证护生健康具有重要的意义,同时也为我国护理专业的课程内容设置及完善医院管理模式提供依据。为增强护生自我防护意识,笔者通过对两家三级甲等医院护生进行医疗废物管理知识问卷调查,提出相应的防护对策。1 资料与方法
采用自制问卷调查泉州第一医院和福建医科大学附属第二医院的护生120名,其中本科生40人、大专生56人、中专24人,发出问卷120份,回收120份,回收率100%。2 问卷内容
211 一般情况 包括护生的性别、年龄、学历、获得医疗废物管理这方面知识的渠道、对获得这方面知识的需求情况。
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
间充质干细胞在医学中的应用文献综述 学院：生命科学学院 年级：2011 姓名：张胜男
前言:干细胞是具有增殖分化潜能的一种细胞,人体200多种细胞均起源于一个全能干细 胞---受精卵,出生后的机体生存也依赖于不同组织中的干细胞,进行自我更新和损伤修复.追溯到1895年人类第一次临床应用骨髓移植治疗肿瘤疾病,干细胞在临床上的应用已有100多年的历史,间充质干细胞是干细胞家族的重要成员.随着人类技术的发展,人类具备了从成体组织中提取间充质干细胞的能力,并可以在体外进行大量的细胞扩增培养,但是间充质干细胞临床试验研究所面临的基础理论、实验技术、行业法规，法律伦理等问题，使其在真正走向临床应用的道路还很艰难，这条路上还有多少障碍？还有多远？需要的不仅仅是生命科学领域研究人员的努力，也需要相关管理部门同行！ 正文： 1间充质干细胞 间充质干细胞英文缩写MSC，存在于多种组织中。 1.1间充质干细胞的发现过程 间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前, 我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，使用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。 2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。 鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞, 临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。 最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4~7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC 用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。 然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如扩增能力个体差异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要等。这些制约了自体间充质干细胞的使用。间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望, 对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。其中，胎盘和脐带来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。 1.2 间充质干细胞的生物学特性 间充质干细胞具有其独特的生物学特性
间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程 ４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防 １2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记 １6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控 展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 （1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控 除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多
?２２８?生国篮旦匡煎！Ｑ塑生！！旦笠！鲞筮丝塑￡！ｉ塑旦墼丛鲤：堕！！！Ｑ嫂：Ｙ丛：堡：些！：１２ 病情持久不愈，气血郁滞，经脉失畅，化湿生痰，痰血瘀结而致。根据其病机，选用小金丸治疗，取得较好疗效，值得推广。５治疗乳腺囊性增生病悼３ 将５００例乳腺囊性增生病患者随机分为治疗组和对照组各２５０例，对照组单用三苯氧胺治疗，治疗组在对照组相同治疗的基础上加用小金丸治疗。结果：治疗组总有效率为９２．０％，对照组总有效率为６７．６％，两组有非常显著性差异（Ｐ＜０．０１）。乳腺囊性增生病系内分泌障碍性增生病，一是体内女性激素代谢障碍，尤其是雌孕激素比例失调，使乳腺实质增生过度和复旧不全；二是部分乳腺实质成分中女性激素受体的质和量的异常，使乳房各部分增生程度参差不齐。三苯氧胺与此激素竞争受体，阻断过高的雌激素作用于乳腺组织，但部分患者临床效果甚微，或服药期间疗效较好，停药后复发。小金丸的药理实验证实对乳腺泡和导管增生有明显抑制作用，同时能抑制纤维母细胞摄取１４．甘氨酸减少胶原纤维合成，又能促进细胞吞噬胶原纤维及其断片，增强细胞溶酶体释放组织蛋白水解胶原纤维，从而消降纤维细胞的增生、粘连，疗效肯定，不良反应小，但疗程较长。中医学认为乳腺增生病主要是气机郁滞，痰瘀互结，冲任失调所致，治当理气化瘀散结，活血祛瘀为原则。小金丸方中麝香走窜通络，散结开壅，枫香脂调气血，土鳖消肿定痛，地龙通络，制草乌祛风湿，温经散寒，当归活血，香墨消肿化瘀，五灵脂、乳香、没药活血化瘀、消肿定痛。诸药合用有温通、活血、消壅、散结之效。可使气旺络通，痰散结消。配合三苯氧胺治疗乳腺增生病，标本兼治，故能取得较好疗效。 ６治疗慢性盆腔炎包块怕１ 将６０例患者（疾湿疥阻兼脾肾两虚型）分为２组各３０例，治疗组口服小金丸和血宝胶囊配合宫颈湿敷血竭粉治疗。对照组用西医抗炎治疗。治疗前后Ｂ超测量盆腔包块的大小、检测雌激素水平、观察临床症状消失的情况。结果：总有效率治疗组８６．６７％，对照组为６３．３３％，２组比较，差异有显著性意义（Ｐ＜０．０５）；随访半年复发率，治疗组为２３．０８％，对照组为６３．１５％，２组比较，差异有非常显著性意义（Ｐ＜０．０１）；雌激素水平治疗前后比较及治疗后组问比较，差异均无显著性意义（Ｐ＞０．０５）。慢性盆腔炎包快属中医学瘢瘕范畴，多起于经行产后，胞脉胞络空虚，血室正开，痰湿之邪乘虚而入，蕴结胞宫；失治误治，余邪未净，迁延１３久，病及血分，致瘀积胞中，积聚成瘾。小金丸功能散结消肿，化瘀止痛，原用于痰气凝滞所致的瘰疬、瘿瘤、乳岩、乳癖，用于此药治疗盆腔炎包块属异病同治，有异曲同工之妙。现代药理研究表明小金丸具有抗炎、消肿、抗肿瘤和镇痛作用。血宝胶囊具有益肾健脾、补阴培阳之效。血宝既可助小金丸化痰散结、活血消ｊ｝毂之力，又可防止小金丸攻邪太过损伤正气。廊竭粉是伤科活血疗伤之圣药，取其破散瘾积宿血之功。内服外用双管齐下，共奏化痰散结、化瘀消瘕之功，使邪去而不伤正。本研究表明，用中成药扶正消瘾法治疗慢性盆腔炎包块具有无创性、服用简便、疗效好，复发率低的优点。 ７治疗结节性筋膜炎ｏ¨ ５例结节性筋膜炎患者，内服小金丸０．６ｇ，２次／ｄ。局部服用黄金膏（金黄散＋凡士林）＋四虎散（由生草乌、生半夏、生南星、狼毒组成）外敷，方法：根据肿块大小，先用金黄膏涂布于纱布上，再掺加四虎散，外面用单层纱布包裹，最后在药物表面撒少量蒸馏水，敷贴患处，每２ｄ换１次。结果５例均治愈。最短治愈时间２６ｄ，最长治愈时间３５ｄ，平均治愈时间３０．８ｄ。结节性筋膜炎又称为假肉瘤性筋膜炎，是一种发生于浅筋膜的良性增生性病变。小金丸具有消痰化坚、活血止痛、消结散毒的作用；金黄散清热、解毒、消肿、定痛；四虎散化痰散结止痛。内外治结合，共奏解毒化肿、化痰散结、活血止痛之效，故用于治疗本病能取得较满意的疗效。 参考文献 ［１］秦树光，等．小金丸联合甲状腺素片治疗甲状腺肿的ｌ｜缶床分析．现代中西医结合杂志，２００５，１４（８）：１０１８． ［２］屈江宁．小金丸治疗良性前列腺增生８０例．世界中医药，２００８，３（５）：２７７． ［３］马宝华，等．小金丸治疗带状疱疹后遗神经痛４４例．中国中医急诊，２００３，１２（５）：４７３． ［４］余勇．小金丸治疗聚合性痤疮２４例．医药导报，２０００，１９（３）：２６３． ［５］杨玉国，等．小金丸与三苯氧胺合用治疗乳腺囊性增生病２５０例分析．实用中医药杂志，２００５，２１（５）：２６１． ［６］邱明英，等．小金丸为主治疗慢性盆腔炎包块的临床研究．新中医，２００８，４０（４）：５５ ［７］吴亚旭．中药治疗结节性筋膜炎５例．江苏中医药，２００５，２６（１１）：２７． 间充质干细胞研究进展及其临床应用前景李玲玲李晶 【关键词】骨髓间充质干细胞；多向分化；组织工程 间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）通常是指从骨髓或其他组织中分离到的在体外具有多向分化潜能的一类细胞。自Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ等首次报道骨髓中有少量细胞在培养过程中能贴壁分化形成类似骨、软骨的集落后，人们对这些细胞产生了浓厚兴趣。随后从鼠、兔、犬、人等多种动物的骨髓中均分离到了这种贴壁细胞。它们具有多向分化潜能， 作者单位：１３００２１吉林省前卫医院（李玲玲）；吉林省人民医院中西医结合科（李晶）在体外不同诱导条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及神经细胞…。 与软骨细胞、骨髓基质细胞、胚胎干细胞等相比，ＭＳＣｓ具有强大的增殖力、较强的多向分化潜能，而且具有取材方便、便于自体移植、便于外源基因转染及表达调控等诸多优点。最近。还发现ＭＳＣｓ具有免疫调节功能嵋ｏ。因此，ＭＳＣｓ是组织工程的一种新的理想种子细胞。目前，已知ＭＳＣｓ是源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中¨１。本文就ＭＳＣｓ 万方数据
脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略 脐带间充质干细胞（UCMSC ）具备药品的“工厂化、规模化、标准化”生产特点，是目前“成药”性最高的成体干细胞（ASC ）之一。UCMSC 还有广泛的生物效应，对各种损伤、退变和炎症性疾病的疗效明确，且具有免疫原性低、异体治疗无免疫排斥反应、临床应用的安全性高、无伦理限制等临床应用优势。UCMSC 的研究与应用受到了国内外研究者的广泛关注，已对其高效制备技术、体内生物学行为、临床疗效与机制及安全性进行了深入研究，解决了临床前关键技术和理论问题，进入了迈向临床验证的最后一公里，即将成为临床疾病治疗的新型“药物”和技术。但如何科学、合理、规范、循序渐进地推进UCMSC 向临床转化，是管理部门和研究者共同面临的问题。笔者在对UCMSC 进行系统性临床前研究的基础上，对UCMSC 治疗系统性损伤和自身免疫性疾病的临床技术及规范进行了探讨。 1 . UCMSC 治疗的临床适应证 UCMSC 制剂可在临床上用于涉及组织细胞损害（变性、坏死、缺失）、自身免疫和炎症反应引起的疾病的治疗，但在同种疾病的不同阶段、不同个体之间，疗效可能不尽相同，其原因在于UCMSC 来源、质量及临床实施方法的差异。根据UCMSC 的生物学特性及疾病治疗机制研究进展，UCMSC 的临床适应证主要有： （1）机械性创伤：包括武器、交通与意外伤害、自然灾害等导致的各种类型的组织器官损伤； （2）退变性疾病：如衰老、器官纤维化、骨质疏松、器官萎缩、动脉硬化等； （3）缺血性疾病：心脑血管意外、血管栓塞等； （4）中毒性疾病：如酒精、食物、药物、毒剂、环境等导致的肝、肾、神经中毒等； （5）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮，再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性肝病等； （6）炎症性疾病：慢性炎症、急性系统性炎症综合征等； （7）代谢性疾病：糖尿病、甲状腺功能异常、高血酯症、高血压等； （8）组织残缺性疾病：主要用于组织缺损的局部再生及人工组织构建与移植治疗。 总之，UCMSC 的适应范围很广，可通过多种机制发挥治疗作用，对并发多种疾病的患者有“一药治多病”的效应。
间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复 23. 移植细胞的基因修饰 1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞调控因子的制约。 （1）胞蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.doczj.com/doc/1011989153.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.doczj.com/doc/1011989153.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化
间充质干细胞移植治疗系统系性硬皮病 对一名安省的硬皮病（scleroderma）的患者来说，一个实验性的干细胞治疗方式为其健康状况带来180度的转变。安省圣托马斯（St. Thomas）的49岁居民慕斯卡特（Dan Muscat，图）于2014年患上系统性硬皮病，由于他皮肤胶原增生，导致他全身皮肤变硬变紧。作为一名珠宝商，他的工作也变得困难而痛苦。 他说：我的手卷成一团并且僵硬，我的脸上和脖子上的皮肤都变硬，我无法转动我的脖子，甚至不能转动身躯。步行超过20步几乎变得不可能。」他还失去了开车的能力，因为他的膝盖不能弯曲，无法踩到刹车或者油门。 之前没有任何治疗方法可以阻止这一疾病的发展。他的医生认为他只有几个月的活命时间。导致这种自身免疫性疾病原因不清楚，而疾病最终会袭击肺部和其他内脏。 慕斯卡特开始研究在加拿大、美国和欧洲进行的干细胞治疗测试。他通过加拿大干细胞基金会（Canadian Stem Cell Foundation）找到了艾金斯医生（Dr. Harry Atkins），艾金斯是渥太华医院（Ottawa Hospital）的干细胞治疗专家，他愿意为慕斯卡特治疗。 艾金斯表示，对于合适的病人来说，这一治疗方法确实对改善他们的生活质量有重要影
响。一旦免疫系统能够正常运作并且停止损伤皮肤，皮肤就会自愈。为硬皮病做干细胞移植在加拿大还是很新的事物。其他国家特别是在欧洲对此作出很多研究，而效果令人鼓舞。艾金斯医生曾经为其他自身免疫性疾病做过干细胞移植，例如多发性硬化病、僵硬人综合症、重症肌无力等。 慕斯卡特是加拿大首个运用在美国和欧洲得到测试的治疗方法的病例。该治疗方法从去年6月开始，医生们从慕斯卡特身上获取干细胞。然后使用强效的化疗药物，杀死导致他出现硬皮病的失效免疫系统。经过淨化的干细胞重新植入他身体内，目标是重新启动他的免疫系统，以便能够停止他的疾病。 慕斯卡特说，自从接受治疗以来，身体一天天好起来。他发现从6月以来，他的动作有所改善，紧绷情况已经消失。他逐渐可以恢复使用自己双手，现在又可以开始驾驶他心爱的赛车。 加拿大干细胞基金会的总裁兼首席执行官普莱斯（James Price）表示，对那些目前没有其他治疗方法的多种疾病患者来说，干细胞治疗能够给他们带来希望。普莱斯说，基金会的目标是能够在10年内令新的干细胞治疗方法得到运用。 该基金会指出，有证据显示，干细胞移植可以令其他严重自身免疫性疾病例如多发性硬化病、狼疮、类风湿关节炎等疾病的情况得到持续缓解。干细胞疗法现在也正在被研究用于治疗肌萎缩性侧索硬化、感染性休克、骨关节炎、糖尿病、黄斑变性等疾病。 在慕斯卡特的病情明显缓和之后，加拿大的其他干细胞治疗中心将会考虑为那些符合相关治疗条件的硬皮病患者提供这种治疗方法，为其他遭受这一疾病折磨的病人们带来希望。
骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提要:目的摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果以选用4～24ｈ贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ｍｌ的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4ｄ进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＭＳＣ),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道ＭＳＣ在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1材料与方法 1.1骨髓ＭＳＣ的分离从胸骨无菌抽取约1～2ｍｌ的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ｍｌ,混匀,1200ｒ/ｍｉｎ,离心10ｍｉｎ;弃上清,用0.01ｍｏｌ/Ｌ的ＰＢＳ(ｐＨ7.2)洗2～3次,1200ｒ/ｍｉｎ,各离心10ｍｉｎ;计数,以2×109/ｍｌ种入10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基,青霉素100Ｕ/ｍｌ、链霉素100μｇ/ｍｌ,37℃,5%ＣＯ2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01ｍｏｌ/ＬＰＢＳ(ｐＨ7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基。 1.2不同贴壁时间对ＭＳＣ增殖的影响选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72ｈ的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3不同浓度胎牛血清(ＦＢＳ)对ＭＳＣ生长的影响细胞按4×104/ｍｌ种入96孔培养板中,分别加入以下ＦＢＳ浓度的α ＭＥＭ培养基:0%、1%、 2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48ｈ后,加入20μｌＭＴＴ(5ｍｇ/ｍｌ二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4ｈ;尽量吸掉上清液,加入150μｌ二甲基亚砜,室温振荡10ｍｉｎ,ＨＴ7000ｐｌｕｓ多孔读数仪490ｎｍ处读取Ｄ490值,以培养液作空白对照。 1.4比较不同种植密度对ＭＳＣ生长的影响用含10%ＦＢＳ的α ＭＥＭ培养基;细胞按以下密度(×104/ｍｌ):0.3、0.6、1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48ｈ后,按上述方法测其Ｄ490值。 1.5培养细胞生长曲线细胞按0.5×104/ｍｌ种入24孔培养板,每孔培养液为1ｍｌ,每天取3孔测其Ｄ490值,连续测8ｄ,绘出培养细胞生长曲线。 1.6培养细胞分裂指数曲线按检测细胞生长曲线的细胞密度接种于放有小盖玻片的24孔培养板中,每24ｈ取出3块小玻片,连续8ｄ;用95%酒精固定,ＨＥ染色、封片。对每一时间组细胞进行计数,算出1000个细胞中分裂相细胞的百分比。 1.7ＭＳＣ的形态学观察在倒置显微镜下,直接观察第2、4、8代ＭＳＣ的活体形态;并分别用光镜及透射电镜观察其形态结构。 1.8统计学分析用哈佛统计软件,进行单因素方差分析及均数间的显著性差异检验,用Ｍｉｃｒｏｓｏ
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 间充质干细胞临床研究进展 间充质干细胞临床研究进展自 1867 年德国病理学家Cohnheim 在研究伤口愈合过程时，首次提出成纤维细胞可能来源于骨髓，即骨髓可能含有非造血干细胞的观点。 1869年，Goujon 发现自体红骨髓异位移植后具有成骨作用，也证实了骨髓具有成骨能力。 但直到 1976 年，Friedenstein 和 Petrakova 首先报道，通过帖壁培养的方法分离得到间充质干细胞（MSCs）。 1987 年，Friedenstein 等将骨髓放置在塑料培养皿中培养，发现骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，由于能分化为多种中胚层来源的间充质细胞，因此被称之为间充质干细胞。 1991 年 Caplan 把骨髓中具有黏附于塑料培养皿表面、在体外能高度扩增、并可多向分化的细胞群命名为骨髓间充质干细胞。 1999 年，Pittenger 等在《Science》（科学）杂志上发表文章，对从骨髓标本中分离得到 MSC，应用流式细胞分析术分析 MSC，结果表明分离的细胞群体表型单一，在体外不同分化条件诱导下，可以形成成骨细胞、成软骨细胞或脂肪细胞，而且克隆化得到的细胞具有类似的分化特性，这充分证明骨髓基质中的间充质干细胞是多能干细胞。 一系列的研究已经证明 MSC 可以分化为神经、心脏、肝脏、 1 / 4
1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1内源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。 （1）胞内蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。 （2）转录因子的调控 在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。比如在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4 是必需的。Oct4 是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4 等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4 缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES 细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。又如Tcf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是Wnt 信号通路的中间介质，当与 β-Catenin 形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。 2.2外源性调控 除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响。 （1）分泌因子 间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGFβ家族和Wnt 信号通路。比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。最近研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作用。GDNF 缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少，而GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积。Wnts 的作用机制是通过阻止β-Catenin 分解从而激活Tcf/Lef 介导的转录，促进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt 信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。 （2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用 有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。β-Catenin 就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。除此之外，穿膜蛋白Notch 及其配体Delta 或Jagged 也对干细胞分化有重要影响。在果蝇的感觉器官前
间充质干细胞药物开发策略 干细胞药物开发的目的是，从“一对一”的个体化干细胞临床应用转向“一对多”的临床治疗方案，为临床提供标准化的干细胞制品。药物的开发需要遵循常规药物开发的流程，包括：药学研究、非临床研究、临床试验申请、早期临床试验、确证性临床试验、新药申请和批准上市等过程。 1干细胞制剂开发要点概述 干细胞制剂药学研究，主要包括工艺开发与质量评价： ①干细胞库与工作细胞库建立： 供者筛查、组织采集，细胞分离、纯化、培养、保藏、鉴别、效力检测，以及生物学特性、遗传学稳定性研究，干细胞库技术标准及工作标准建立； ②干细胞制剂工艺开发与药学研究： 大规模细胞扩增、细胞制备工艺、剂型选择、包装选择、处方筛选、制剂冻存/复苏工艺，体外操作对干细胞生物学特性的影响，过程质量控制，干细胞药物放行标准建立； ③干细胞制剂冷链运输和稳定性研究： 产品冻存与复苏、冷链运输技术、临床快速检验、稳定性研究等，稳定性研究包括冻存条件下制剂影响因素试验、长期试验，模拟临床应用条件的试验等，通过这些实验获得的药品稳定性信息来确定药物的储存运输条件、包装以及有效期。 干细胞制剂开发原则 干细胞制剂开发过程服从GMP原则，但应充分考虑活的药物与传统药物区别： ①供者细胞的合理性及筛查； ②生产材料应考虑，供者细胞、生产过程细胞分类分级管理，生产用原材料的风险评估， 外源因子去除，限制动物及人来源材料，基因修饰/改造按高风险管控，辅料使用考虑必要性、安全性和合理性； ③制备工艺与过程控制应证明可行性与稳健性，生产工艺的设计（QbD）应避免细胞发生 非预期的或异常的变化，全过程监控、持续改进，用连续自动化、全封闭手段减少污染； ④强调过程控制与制品放行互补，高风险操作评估，细胞制剂与回输制剂转换验证； ⑤质量研究取代表批次及生产阶段细胞的特性、功能性、纯度和安全性等分析； ⑥质量控制基于过程理解，兼顾认知，逐步完善，确证性与商业化保持一致； ⑦临床质量核准，方法验证与药典适用性验证，快速微量方法相互验证； ⑧稳定性研究应采取连续工艺，适用包装密封性研究、冷冻储存适应性研究等，运输条件，
间充质干细胞培养方法 １、间充质干细胞MSC基本形态?2。干细胞应用与干细胞调控、?３、间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞ＭＳC培养得合适气体环境 ５、细胞培养板得选择 6. 如何选用细胞培养基? 7. 如何维持培养液p H?８。血清与干细胞得培养?9、胎牛血清(F B S ) 10.细胞得细菌、真菌污染及排除 就是否需要灭活? １１、细胞培养污染得预防 1４。胶原酶V １２、使用胰蛋白酶时加入 E ＤTA得目得就是什么?１3、胶原酶得种类与选型? S胰酶 １5、干细胞得种类与表面标记 18. 干细胞老化得表现与处16.间质干细胞培养原理概述?１7、间质干细胞成脂与成骨诱导分化? 理 20。冷冻保护剂作用与选择 1９、细胞传代消化过程指导? 21。细胞冻存指导 2２。干细胞冷冻与复苏 2３、移植细胞得基因修饰?１、间充质干细胞ＭＳC基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征,可分为贴附型生长细胞,常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。?间充质干细胞ＭSＣ基本形态:形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核,胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同得突起、可瞧到细胞成螺旋状生长。? 2、干细胞应用与干细胞调控?干细胞得调控就是指给出适当得因子条件,对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发展。? 2.1内源性调控?干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化,包括调节细胞不对称分裂得蛋白,控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 (1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得。细胞得结构蛋白,特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要、如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器,包含有许多调节蛋白,如膜收缩蛋白与细胞周期素Ａ。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位,从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?(2)转录因子得调控 在脊椎动物中,转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct4 就是必需得。Oct4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FGF－4 等生长因子,能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oc ｔ4 缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子(LI Ｆ)对培养得小鼠ES细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用,说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得、又如Tｃf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要、Tcf／Leｆ就是Wnｔ信号通路得中间介质,当与β－Ｃateｎin形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。 2.2外源性调控?除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(１)分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖,分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用,它们就是TＧＦβ家族与Ｗｎt 信号通路、比如TＧF 家族中至少