2012年12月1日第12期No．12 1 Dec． 2012 中医学报 CHINA JOURNAL OF CHINESE MEDICINE 第27卷总第175期Vol．27 Serial No．175 *基金项目：北京中医药大学自主课题(编号:2011－JYBZZ － XS077) 通络救脑注射液对阿尔茨海默病模型大鼠学习 记忆及氧化应激反应的影响 * Effects of Tongluo Jiunao Injection on learning and memory and oxidative stress response for Alzheimer's Disease Rat Models 刘洋Liu Yang 1，李澎涛Li Pengtao 2，刘希伟Liu Xiwei 1，南一楠Nan Yinan 1，都文渊Du Wenyuan 1 1．北京中医药大学基础医学院中西医结合基础(病理)，北京110029 Integration of Traditional Chinese Medicine and Western Medicine Subject (Pathology )in Basic Medical College of Beijing University of Traditional Chinese Medicine ， Beijing ，China 1100292．北京中医药大学东直门医院，北京100700 Dongzhimen Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine ，Beijing ，China 100700 摘要：目的:探讨通络救脑注射液(Tong Luo Jiu Nao injection ， TLJN )对阿尔茨海默病(Alzheimer ’s Disease ，AD )模型大鼠的防治作用及其抗氧化机制。方法:采用脑内定位注射β淀粉样蛋白(βamyloid1-42)建立AD 大鼠模型，在模型建立成功的同时给予TLJN 治疗。采用Morris 水迷宫进行AD 大鼠的行为学检测，用化学比色法检测大脑皮质丙二醛(MDA )的含量。结果:与正常组比较，AD 模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P ＜0．01)，目标象限停留时间明显缩短(P ＜0．01);TLJN 治疗组大鼠逃避潜伏期明显缩短(P ＜0．05)，目标象限停留时间明显增加(P ＜0．05)。AD 模型组大鼠脑皮质中MDA 含量增加(P ＜0.01);TLJN 治疗组，脑皮质MDA 含量显著减少(P ＜0．01)。结论:TLJN 具有改善学习记忆能力，对抗大鼠神经系统的退行性病变有一定的作用，可能通过抑制AD 模型大鼠脑皮质MDA 产生发挥其保护作用。 Abstract :Objective :To explore the preventive and therapeutic effect and anti-oxidation mechanism of Tong Luo Jiu Nao injection (TLJN )in Alzheimer's Disease (AD )rat models．Methods :The AD rat model was established by injecting β-amyloid1-42into the rat brain ，and successful model rats were given TLJN injection treatment at the same time．The behavioral changes of the AD rats were test-ed with Morris water maze．Chemical colorimetry was used to measure malondialdehyde (MDA )content in the cerebral cortex．Results :Compared with the control group ，the escape latent period of AD rats was significantly longer (P ＜0．01)，retention time of the target quadrant significantly obviously reduced (P ＜0．01);After TLJN treatment ，the escape latent period of AD rats was significantly shorter (P ＜0．05)，and retention time of the target quadrant was significantly increased (P ＜0．05)．In AD model group ，the MDA content in cerebral cortex was increased significantly (P ＜0．01);while after TLJN treatment ，the MDA content in cerebral cortex was decreased obviously (P ＜0．01)．Conclusions :TLJN treatment has certain effects on improving learning and memory ability of AD rats and resisting retrogression of rats nervous system ，and plays protective role in AD rats possibly via inhibiting the production of MDA．关键词：阿尔茨海默病;通络救脑注射液;Morris 水迷宫;学习记忆;氧化应激反应;大鼠 Key words :Alzheimer's Disease (AD );Tongluo Jiunao injection ;Morris water maze ;learning-memory ;oxidative stress response ;rat 中图分类号CLC number ：R285．5 文献标识码Document code ：A 文章编号Article ID ：1674－8999（2012）12－1614－03阿尔茨海默病（Alzheimer ’ s Disease ，AD ）是一种继心血管病、癌症、脑卒中后严重威胁人类健康的高发性神经退变性疾病。但目前临床上对于AD 的病因和发病机制尚不完全清楚， 对于其治疗仍旧是一个世界性的难题。近些年来，对于AD 的发病机制研究方面取得了很多进展，主要集中在遗传因素、环境因素、免疫-炎性机制、氧化应激和细胞凋亡等方面，而氧化应激在AD 中的作用越来越受到研究者的重视。结合本研究团队多年体内外实验研究， 发现AD 的中医病机关键为“毒损脑络”［1-2］ 。因此，本实验采用大鼠双侧海 马注射A β1-42这一致毒片段以模拟“毒损脑络”病证，观察“毒损脑络”病证下AD 大鼠学习记忆变化情况及氧化应激反应的改变，采用针对该中医病机关键具有解毒通络作用的中药复方通络救脑注射液进行干预， 通过Morris 水迷宫行为学检测方法观察药物干预后大鼠学习记忆的改善情况及通络救脑注射液的作用机制，为通络救脑注射液的临床应用提供体外实验依据。 1 材料与方法 1．1 动物分组 清洁级雄性SD 大鼠32只，体质量（250?20）g ，购自北 京维通利华实验动物中心。随机分成正常对照组（正常组）、 A β海马注射组（模型组）、A β海马注射+通络救脑注· 4161·
儿茶素药理作用研究（综述） 摘要：本文对茶叶中的一种植物化学物——儿茶素的来源、化学成分、理化性质与药理作用进行较为综合详细的描述。陈述了茶多酚具有明显的清除体内自由基、抗癌、抗炎、抑菌、抗突变、抗衰老及改善肝功能等生物活性。最近人们也意识到了儿茶素对于人体健康的巨大作用，带动着中国古老的茶饮料也风靡起来，而儿茶素的研究也有了可观的成果。本文将对以上内容进行一个综述，总结发现茶儿茶素是一类有开发利用价值的药物。 关键词：儿茶素、抗氧化、茶多酚、抗肿瘤、清除自由基 喝茶在我国已有数千年历史,而茶叶的药理作用也早在几千年前就被中国人所发现研究并利用了。早在明朝李时珍就在《本草纲目》中记载说:“茶苦而寒,最能降火,火为百病之因,火降则百病清也”。茶由古代的药到后来的饮料,现在又回归到药,是现代生物技术和现代医学科技的成果。现代科学研究发现, 茶叶中的生理活性物质主要为茶多酚。茶多酚又叫茶单宁, 茶鞣质, 是茶叶中酚类及其衍生物的总称, 是从绿茶中提取出来的最主要、最精华、对人体最有益的成分，约占茶叶干物质总质量的25%, 茶多酚主要由儿茶素类、黄酮类、花青素和酚酸四类物质组成, 而儿茶素类的含量占茶多酚的60%~80%左右，占绿茶干物质的12%~24%，可以说儿茶素是茶多酚中的主要活性成分。儿茶素中的主要成分有由表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素（GC）、儿茶素（C）、表没食子儿茶素（EGC）和表儿茶素（EC），其中EGCG、ECG为酯型儿茶素，EGC、GC、EC 和C 为非酯型儿茶素。在药理作用上，儿茶素具有优异的抗氧化性能和显著的清除自由基能力以及抗肿瘤、抗基因突变、抗菌消炎、抗动脉粥样硬化等多种生物学功能。目前儿茶素已经开拓到了化妆品、医药、精细化学品、保健品等各个领域。尤其是作为主要存在于茶叶中的EGCG, 现已被列为一种潜在的抗癌药物在中美等国被研究。而本文将对儿茶素的来源、理化性质、萃取方法和药理作用进行综述。 一、儿茶素的来源及含量 儿茶素(catechin)最初由儿茶得名，是茶叶多酚类物质的主要成分, 约占茶多酚的80%,是一种黄烷醇型黄酮化合物。由于加工炮制方法不同, 绿茶的化学组成成分与鲜茶相近似,而红茶、乌龙茶等的茶儿茶素含量有所下降。儿茶素类化合物在植物中广泛分布,其中以豆科(如儿茶、鸭皂树)、茜草科(如儿茶钩藤)、蔷薇科(如委陵菜、山樱桃、鹅绒委陵菜、单子山楂)、蓼科( 如大黄、拳参、蓄) 、山茶科(如山茶)、七叶树科(如红七叶树、加洲七叶树)为多，此外在其他科属中也有分布, 如银杏科的银杏、夹竹桃科的罗布麻、胡颓子科的沙枣、麻黄科的麻黄、棕榈科的槟榔、翅子藤科的五层龙、杜鹃花科的越橘、楝科的日本苦楝、樟科的红楠、金丝桃科的贯叶金丝桃、金缕梅科的美洲金缕梅、罗汉松科的竹柏,以及榆科的美洲榆、牛儿科的老鹳草、景天科血红茶子等。另外,绿茶中也含有丰富的儿茶素类化合物且具有多种药理活性。儿茶素类化合物虽存在广泛,但含量却分布不均,而且随着品种、产地及药用部位的不同而存在着显著的差异。如在以儿茶素、表儿茶素、儿茶鞣酸(catechu-tannic acid)为主要成分的儿茶中,2个常用药用品种：豆科儿茶和茜草科儿茶钩藤相比较,前者心材中儿茶鞣酸的含量最高可达50%, 而在后者的叶和根茎中儿茶鞣酸最高只有24%,前者不同产地的6个样品中儿茶素的均量为16.05%,表儿茶素的均量为10. 80%；而后者另6个样品中儿茶素的均量可达25.03%,表儿茶素的均量却仅为2.47%。此外大黄的3种来源药材:唐古特大黄、掌叶大黄、药用大黄中儿茶素的含量分别为0.21%, 0.07%, 0.79%;还有不同绿茶品种中表儿茶素的含量:白叶单丛茶为0.2669%,国宾茶为0.2130%,而大叶奇
阿尔茨海默病动物模型研究进展 发表时间：2019-09-23T09:21:11.433Z 来源：《医药前沿》2019年22期作者：朱恒延郭燕君（通讯作者） [导读] 阿尔茨海默病动物模型是研究人类阿尔茨海默病发病机制和寻求治疗方法的重要工具。 (嘉兴学院医学院浙江嘉兴 314001) 【摘要】阿尔茨海默病动物模型是研究人类阿尔茨海默病发病机制和寻求治疗方法的重要工具。本文在总结近年来最新研究成果的基础上系统阐述阿尔茨海默病研究中常用的动物模型，为AD的生物性特征和预防研究提供帮助。 【关键词】阿尔茨海默病; 动物模型; 研究进展 【中图分类号】R745 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）22-0010-02 Research progress of animal models of Alzheimer's disease Zhu Hengyan,Guo Yanjun (communications author) Medical College of Jiaxing University, Jiaxing, Zhejiang 314001, China 【Abstract】Animal model of Alzheimer's disease is an important tool for studying the pathogenesis of human alzheimer's disease and seeking for treatment. On the basis of summarizing the latest research achievements in recent years, this paper systematically describes the animal models commonly used in Alzheimer's disease research, providing help for the biological characteristics and prevention of AD. 【Key words】Alzheimer's disease; Animal model; Research progress 阿尔茨海默病是以进行性记忆缺失和痴呆为特征的神经退行性疾病。65岁前发病称早老性家族性痴呆；65岁后发病称迟发的老年性痴呆。典型病理变化为细胞外由β淀粉样蛋白(Amyloid-β，Aβ)形成的老年斑块，过度磷酸化的tau蛋白组成的神经元纤维缠结［1］。AD分为早发的家族性AD(Familial AD，FAD)和迟发的散发性 AD(Sporadic AD,SAD)。SAD发病机制主要与遗传和环境有关。胰岛素通路和能量代谢障碍、糖尿病，脑外伤，神经炎症反应以及Apo Eε4等位基因等都是AD的危险因素［2］。目前尚无有效安全的治疗AD的方法及药物。科学家们一直试图建立与AD发病机制接近的灵长类动物模型。本文着重探讨与AD相关的转基因动物模型和灵长类动物模型的现状及特点作一综述。 1.AD相关的转基因模型的特点 研究证实多数 FAD患者是由PSEN1突变所致［3］，PSEN1第4～12外显子之间是主要基因突变位点，近年来，研究者们建立了几种AD PSEN1基因突变的转基因模型，包括PSEN1(A246E)[4]、PSEN1(M146L)[4]、PSEN1(M146V)[4]、PSEN1(P264L)[4]、 PSEN1(P117L)[4]、PSEN1-YAC[4]等。研究者们发现携带人PSEN1突变的转基因AD小鼠不能模拟出FAD的典型特征，因此转入人PSEN1基因突变的同时加入PSEN2其他突变基因，用这种方法成功建立了十多种转基因AD小鼠，而且十多种AD转基因小鼠都能能表现出FAD部分神经病理学特征和行为学上的改变。目前AD转基因小鼠是研究阿尔茨海默病发病机理和治疗方面经典的动物模型，但是已知的这些PSEN1转基因模型小鼠同时不能模拟FAD的全部神经行为学和病理学特征。灵长类动物由于在生理结构和生物化学方面与人类高度相似。因此急需建立一种灵长类非人动物模型，探索这种模型是否能够更好的模拟FAD的多种神经行为学及病理学的特征。 2.FAD灵长类非人动物模型研究现状 近十几年来，随着转基因技术进步和灵长类动物转基因技术的发展，使得建立灵长类非人阿尔茨海默病转基因模型成为可能[5]。由于从发病机制上看FAD是由APP或PSEN1、PSEN2突变所致，专家们尝试将结合其他突变基因(PSEN2、APP和 MAPT) 和PSEN1突变来建立FAD转基因灵长类非人动物模型。上述方法在理论上能够模拟出FAD的发病原因和疾病特征，而且可以通过遗传保种，在建立模型动物群体方面表现出优势。但是灵长类非人阿尔茨海默病转基因动物模型面临严峻的问题：（1）转入AD致病基因的灵长类非人转基因动物通常需十几年才呈现AD特征性的神经病理学和行为学改变，灵长类动物模型效率低、成本高，尚未见成功模型报道；（2）短期难以开展对转基因的个体开展临床病理鉴定和行为学的评价。PSEN1在灵长类动物中非常保守。有关非人灵长类动物中AD基因突变是否与人类相似方面的研究较少。John J．Ely发现一只黑猩猩PSEN1突变[5]，其PSEN1突变的特征未知；与其他年龄及性别相匹配的未突变PSEN1黑猩猩相比，其是否出现神经退行性病理改变和行为学变化均不知道；其子代是否有PSEN1基因突变、行为学及病理变化是否出现等还没有报道。 目前AD尚未研制出安全有效的药物和方法，迫切需要能模拟AD经典病理变化的理想动物模型，以前建立在啮齿类的动物模型各有优缺点，不能全面体现AD的病例神经行为学方面的全部改变。目前被大家所认可的转基因动物模型也有待完善。利用基因筛选和基因修饰分子生物学技术建立AD灵长类非人动物模型意义重大，对于进一步明确发病机理，AD药物的治疗、开发和筛选，早期诊断有重要的应用价值和前景。 【参考文献】 [1] Grundke-Iqbal I,Iqbal K,Tung YC,et.al.Abnormal phosphorylation of the microtubule associated protein tau(tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology.Proc Natl Acad Sci U S A 83(13):4913-4917. [2] Iqbal K,Grundke-Iqbal I.Alzheimer's disease,a multifactorial disorder seeking multitherapies.Alzheimers Dement 6(5):420-424. [3] Ballard C,Gauthier S,Corbett A,et al.Alzheimer’s disease[J].Lancet 2011,377(9770):1019-1031． [4] Wen P H,Shao X,Shao Z,et al.Overexpression of wild type but not an FAD mutant presenilin-1 promotes neurogenesis in the hippocampus of adult mice[J].Neurobiol Dis,2002,10(1):8-19． [5] Chan A W.Progress and prospects for genetic modification of nonhuman primate models in biomedical research[J].ILAR J,2013,54(2):211-223． [6] Joseph M.Erwin P RH J.One Gerontology:Advancing Understanding of Aging through Studies of Great Apes and Other Primates[M].Aging in Nonhuman Primates，Erwin Jm H P,Basel:Interdiscipl Top Gerontol,Karger,2002:31,1-21. 基金项目：浙江省科技计划项目(2017C37173);嘉兴学院南湖学院重点SRT资助项目(NH85178445)；2016年度浙江省教育技术研究规划课题(JB039)
\篇二：缺氧 缺氧动物模型复制及中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧地影响 【摘要】目地：本实验学习复制乏氧性缺氧和血液性缺氧地动物模型方法，观察缺氧过程中呼吸地反应及血液色泽和全身一般情况地变化，并了解温度和中枢神经系统机能状态对缺氧耐受地影响以及对照实验和控制实验条件重要性.方法：通过复制缺氧动物模型，观察不同类型缺氧过程中呼吸、黏膜和血液色泽地变化.通过测定耗氧量和小鼠地存活时间来观察中枢神经系统机能抑制和低温对缺氧地影响.结果：中枢神经系统功能抑制和低温对动物耐受缺氧地影响与对照组相比，存活时间和总耗氧率有显著性差异；复制不同原因造成地不同缺氧类型小鼠都表现出了不同地呼吸频率和存活时间地变化.结论：给小鼠注射氯丙嗪、冰浴降温可显著降低总耗氧率，延长其存活时间（）.中毒、亚硝酸盐可显著缩短小鼠存活时间，降低呼吸频率.美兰可以缓解亚硝酸盐对小鼠地作用，已定程度延长小鼠存活时间，延缓呼吸频率地下降. 【关键词】缺氧氯丙嗪总耗氧率亚硝酸盐美兰存活时间 当供应组织地氧不足，或组织利用氧障碍时，机体地机能和代谢可发生异常变化，这种病理过程称为缺氧.根据缺氧地原因不同可将缺氧分为低张性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧和组织中毒性缺氧四种类型，不同类型地缺氧，机体地代偿适应性反应和症状表现有所不同. 1.材料和方法 1.实验动物：小白鼠（雌性）. 药品：氯丙嗪() 、钠石灰（ )，亚硝酸钠（ ) 、亚甲基蓝(美蓝）（，）、％ ( ) 、( ). 器材：、广口瓶和测耗氧装置. 方法 中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧地影响 取只性别相同体重相近地小鼠，准确称取体重，并随机分为生理盐水组和氯丙嗪组.氯丙嗪组按体重腹腔注射％氯丙嗪，随即安放在冰浴地纱布上 ，使呼吸频率降至次；生理盐水组按体重腹腔注射生理盐水，室温放置－，作为对照.之后将只小鼠分别放入地广口瓶内，连接好测耗氧装置.如右图. 不同原因造成地缺氧 取只性别相同体重相近地小鼠随机分为乏氧性缺氧组和一氧化碳中毒组.乏氧性缺氧组小鼠放入含有钠石灰地密闭瓶中；一氧化碳中毒组小鼠放入密闭瓶，注入气体. 另取只性别相同体重相近地小鼠随机分为亚硝酸纳组和亚硝酸纳治疗组.亚硝酸纳组小鼠腹腔注射亚硝酸纳，并随即腹腔注射生理盐水；亚硝酸纳治疗组小鼠腹腔注射亚硝酸纳后即刻腹腔注射亚甲基蓝 . 2.观察项目 2.1.中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧地影响 记录下小鼠地体重（）.从密闭测耗氧装置开始记时到小鼠死亡，分别观察氯丙嗪组和生理盐水组小鼠地存活时间（）、总耗氧量（）.按以下公式计算出总耗氧率[（·）]： [（·）] （）÷（）÷（） 2.2.不同原因造成地缺氧 乏氧性缺氧组和一氧化碳中毒组：处理前分别测出两鼠地正常呼吸频率（次）.待塞紧瓶塞开始记时后，每隔测一次呼吸频率（次），并观察两鼠地行为以及耳、尾、口唇等地颜色变化，直至小鼠死亡.记录死亡时间. 亚硝酸纳组和亚硝酸纳治疗组：处理前分别测出两鼠地正常呼吸频率（次）.待注射药品后，每隔测一次呼吸频率（次），并观察两鼠地行为以及耳、尾、口唇等地颜色变化，直至小鼠死亡.记录死亡时间. 将只鼠分别解剖取出小块肝脏组织置于滤纸上观察颜色地不同. 3.实验结果 中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧地影响氯丙嗪组小鼠体重与生理盐水组小鼠体重 无显著性差异（）；氯丙嗪组小鼠地耗氧量为± ，生理盐水组小鼠地耗氧量为± ，两者无
儿茶素与表儿茶素稳定性考察 Studies onconstancy of epicatechin and catechin PAN JIyang GONG Weihong ZHANG Xiaohua* (School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine , Beijing 100102) 【】Objective TO determine the catechin, epicatechin stability。Methods Colouration by vaniuin-hydroehloric acid , UV method ，The test wavelength was 500nm.Result In3 hoursepicatechin0.239，s0.003，RSD% 1.122.Conclusions The constancyofepicatechin was better than catechin. 随着药物化学及制剂产品质量研究的快速发展，儿茶素，表儿茶素作为标准品被广泛采用。用HPLC法测定的条件主要有以下几种： 1十八烷基硅烷键合硅胶柱(大连依利特,4 6mm×250mm,5μm);0.04mol?L-1枸椽酸溶液 N,N二甲基甲酰胺四氢呋喃(45∶8∶2)为流动相;检测波长为280nm;柱温35℃;流速10mL?min-1。儿茶素对照品、原儿茶素对照品[1] 。 2 色谱柱:PurospherstarRP-C18色谱柱(4 6mm×250mm,5μm,德国Merck公司);流动相V(乙腈)∶V(高纯水)∶V(磷酸)=10∶89 1∶0 9;检测波长278nm;流速1mL/min; 柱温25℃;儿茶素对照品[2]
阿尔茨海默病模型小鼠凋亡相关蛋白的表达 王晓映1 刘鹏朱华徐艳峰马春梅代小伟刘颖秦川（中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心，北京100021） 〔摘 要〕目的 探讨阿尔茨海默病（AD ）凋亡相关蛋白的表达情况。方法 取3月龄和6月龄APPswe /PS ΔE9小鼠脑组织，利用Western 印 迹的方法检测APPswe /PS ΔE9小鼠和对照小鼠脑组织中bcl-2、caspase-9以及caspase-3的表达情况。结果与同月龄的对照小鼠相比，APPswe / PS ΔE9转基因小鼠中，bcl-2表达水平明显降低，而caspase-9和caspase-3表达水平明显升高。结论凋亡相关蛋白的异常表达可能在AD 的发生发 展过程中起到一定作用。 〔关键词〕阿尔茨海默病；bcl-2；APPswe /PS ΔE9小鼠〔中图分类号〕R749 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1005-9202（2012）07-1446-02；doi ：10.3969/j.issn.1005- 9202.2012.07.0561山东大学第二医院病理科 通讯作者：秦 川（1959-），女，教授，博士生导师，主要从事神经系统退行性病变研究。 第一作者：王晓映（1981-），女，医师，医学博士，主要从事神经系统退行 性病变研究。 阿尔茨海默病（AD ）是一种神经系统退行性疾病，是导致老年人痴呆的主要原因，其特征性的病理改变是在大脑皮质和海马区域出现老年斑和神经原纤维缠结。目前， AD 的发病机制仍然不明确， 一些研究发现，凋亡的异常可能在AD 的发生发展过程中起到重要作用。本实验以APPswe /PS ΔE9模型小鼠作为研究对象，探讨AD 中凋亡相关蛋白的表达情况。1材料与方法 1.1 APPswe /PS ΔE9转基因小鼠的建立 APPswe /PS ΔE9转 基因小鼠由中国医学科学院实验动物研究所构建并提供〔1〕 。 APPswe 转基因编码一段人鼠嵌合的蛋白，其中APP 的胞外和胞内区域为鼠源性序列，而A β结构域为人源性序列并包含瑞士突变K594N /M595L 。PS ΔE9转基因编码人源性E9外显子缺失的PS1。转基因小鼠在出生9 14d 用剪趾法标记，收集剪下的组织及鼠尾，用碱裂解法提取基因组DNA ，PCR 分别检测APPswe 及PS ΔE9基因的表达。APP 基因PCR 产物长344kb ，PS 基因PCR 产物长608kb 。1.2 Western 印迹法检测bcl-2、caspase-9以及活化caspase-3的表达 将小鼠脱颈处死后，迅速取出其脑组织，用生理盐水 洗去血液， 立即置于RIPA 蛋白裂解液中，提取总蛋白。蛋白浓度用BCA 法进行测定。蛋白上样量为40μg ，利用12%的SDS-PAGE 胶进行分离，然后将其转移至NC 膜（Millipore ）上，室温下封闭1h ，与bcl-2（Abcam ）、capase-9（Millipore ）及caspase-3（Abcam ）抗体进行杂交，4?过夜，用TBST 洗膜3次，与辣根酶标记的羊抗兔IgG 和GAPDH 进行杂交，室温下孵育1h ，TBST 洗膜3次，然后进行化学发光。1.3 统计学分析 运用SPSS11.0统计软件。用t 检验对 Western 印迹的结果进行统计学分析。 2结果 2.1 APPswe /PS ΔE9转基因小鼠鼠尾DNA 鉴定结果 裂解鼠 尾后提取DNA ，分别用针对APP ，PS1的引物进行扩增，筛选鉴定阳性小鼠， 部分检测结果见图1 。1、2、3泳道分别为阴性对照、空白对照和阳性对照，4、8和10为阴性小鼠， 5、6、7和9为阳性小鼠图1APPswe /PS ΔE9转基因小鼠鼠尾DNA PCR 鉴定结果 1，2，3，4分别代表3月龄模型鼠、3月龄对照鼠、6月龄模型鼠和6月龄对照鼠；图3同 图2APPswe /PS ΔE9转基因小鼠和对照小鼠脑组织中bcl- 2蛋白表达情况2.2 APPswe /PS ΔE9转基因小鼠和对照小鼠脑组织中bcl-2 蛋白的表达情况 利用Western 印迹的方法分别检测了3月龄 和6月龄小鼠脑组织中bcl-2蛋白的表达情况，并将检测结果进行半定量分析。由图2可以看出，与同月龄的野生型对照小鼠相比， APPswe /PS ΔE9转基因小鼠中，bcl-2表达水平明显降
邹盛勤，姜 琼．ＲP －HPLC 测定茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的含量［ J ］．江苏农业科学，2014，42（7）：322－324．ＲP －HPLC 测定茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的含量 邹盛勤，姜 琼 （宜春学院化学与生物工程学院/江西省天然药物活性成分研究重点实验室，江西宜春336000） 摘要：建立了测定茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的反相高效液相色谱分析方法（reverse phase high －per-formance liquid chromatography ，ＲP －HPLC ）。样品经超声提取后，利用Kromasil C18色谱柱分离，流动相为乙腈?水?磷酸（90mL ?10mL ?0．1mL ），流速0．8mL /min ，检测波长278nm ，柱温30?。没食子酸进样量在0．066 1．650μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系（r =0．9999），平均回收率为97．1%，ＲSD 为1．1%（n =6）；儿茶素进样量在0．240 6．000μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系（r =0．9996），平均回收率为97．5%， ＲSD 为1．5%（n =6）；表儿茶素进样量在0．252 6．300μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系（r =0．9997）， 平均回收率为96．9%，ＲSD 为1.2%（n =6）。试验结果表明，建立的方法操作简便、数据精确，可用于茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的含量 测定。 关键词：茶叶；没食子酸；儿茶素；表儿茶素；ＲP －HPLC 中图分类号：TS272．7文献标志码：A 文章编号：1002－1302（2014）07－0322－02 收稿日期：2013－10－28 作者简介：邹盛勤（1970—），男，江西奉新人，硕士，教授，从事天然产物活性成分的提取与分析研究。E －mail ：zsqycxy@163．com 。通信作者：姜 琼，男，湖北潜江人，硕士，讲师，从事天然产物开发与 研究。E －mail ：qqj2000@163．com 。 茶叶为山茶科山茶属植物茶（Camellia sinensis ）的芽叶。 茶叶一名始载于《名医别录》，“世医治暑病，以茶叶饮为首 药”［1］ 。茶叶全草可作药用，性微温，具有发汗解暑、行水散 湿、温胃调中、利水消肿的功效［2］。我国拥有丰富的茶叶资源和数千年的茶文化历史。茶叶中具有多种活性成分，如茶 多酚、茶多糖、茶皂素、可可碱、咖啡碱、挥发油、氨基酸等，其中多酚类化合物主要由没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯等30多种化学物 质组成［3］ ，具有调血脂、降血糖、抗肿瘤、抗衰老、美容减肥等药理作用 ［3－5］ 。茶多酚的定量方法主要有高效液相色谱法和 毛细管电泳法等［6－9］ 。茶叶化学成分的研究报道较多，但同 时测定茶叶样品中没食子酸、儿茶素和表儿茶素含量的方法尚未见报道。本试验建立反相高效液相色谱法（reverse phase high －performance liquid chromatography ，ＲP －HPLC ）同时测定浙产茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的含量，旨在为茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的定量分析及其药效基础物质的研究提供依据。1材料与方法 1．1 材料与仪器没食子酸、表儿茶素和儿茶素对照品（中国药品生物制 品检定所，批号为：110831－200302、110877－200916、110831－200911），乙腈（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司），水为超 纯水，其余试剂均为分析纯。084龙井、龙井、白茶、越剑茶和浙农113茶叶品种均购自浙江省，经鉴定为茶（C．sinensis ）的芽叶。 Waters 高效液相色谱仪（515泵，2996光电二极管阵列检 测器，Empower 中文色谱工作站，美国）；ＲO －MB －10D 高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂）；CP225D 电子分析天平（德国Sartourius 公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；SK2510HP 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，功率：250W ，频率：59kHz ）。1．2溶液配制 1．2．1 对照品溶液分别精确称取1．32、4．80、5．04mg 没食子酸、儿茶素和表儿茶素对照品，置于20mL 容量瓶中，加适量甲醇溶解后，稀释至刻度，摇匀后配制成含0．066mg /mL 没食子酸、 0．240mg /mL 儿茶素和0．252mg /mL 表儿茶素的对照品混合溶液。 1．2．2样品溶液茶叶样品于恒温干燥箱中80?下干燥6h ，高速粉碎机粉碎。分别精确称取2g 各茶叶样品粉末，分别置于50mL 具塞锥形瓶中，分别加入50mL 95%乙醇后称重；超声提取45min ，冷却后用甲醇补足损失重量，摇匀后用0．45μm 滤膜过滤，取过滤液作为样品溶液。1．3检测波长的选择 对照品溶液采用光电二极管阵列检测器在190 400nm 波长范围内进行紫外扫描，选择合适的检测波长。1．4 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18柱（4．6mm ?250mm ， 5μm ）；流动相为乙腈?水?磷酸（90mL ?10mL ?0．1mL ）；流速 0．8mL /min ；检测波长278nm ；柱温为30?。1．5 精密度试验 分别精确吸取10μL 含没食子酸、儿茶素和表儿茶素的 对照品混合溶液，平行进样5次，以峰面积计算色谱系统精密度。 1．6重现性试验 取5份茶叶样品，每份约2g ，按“1．2．2项”中样品溶液 制备方法制备样品溶液。精确吸取样品溶液各10μL ，分别进样，测定其峰面积积分值，用外标法计算含量。 — 223—江苏农业科学2014年第42卷第7期
中国民族民间医药临床研究?１８?ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｔｈｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＥｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｙＣｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ 阿尔茨海默症动物模型的研究进展及其评价 张洁１龙颖１胡昔奇１曹萍１郑尧帆１李先辉２ （１．吉首大学医学院０６级临床ｌ班，湖南，吉首，４１６０００；２．吉首大学医学院生理教研室，湖南，吉首，４１６０００） 【摘要】随着世界人口的老龄化。阿尔茨海默症已成为严重威胁老人健康的明大疾病之一。研究并建立可靠的ＡＤ动物模型对ｊ：探明阿尔茨海默症的病因、发病机制及防治药物的研究与开发均具有重要意义。本文对ＡＤ动物模型的研究进展及 其评价作一简要综述。 【关键词】阿尔茨海默症；动物模型 【中图分类号】Ｒ７４１．０４【文献标识码】Ａ【文章编号Ｊ１００７—８５１７（２００９）１０－００１８一０３ ＡｄｖａｎｃｅｓａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｎｒｅｓｅａｒｃｈｏｆＡｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒｂｄｉｓｅａｓｅ ＺＨＡＮＧＪｉｅｌＬＯＮＧ¨矿ＨＵＸｌｑｉｌＣＡＯＰｉｎ９１ＺＨＲＥＮＧ玩吧向ｎ１ｕＸｉａｎｈｕｉ２ （１．ＭｅｄｉｃｉｎｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ－ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｃｌａｓｓ１ｇｒａｄｅ２００６ｏｆＪｉｓｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＪｉｓｈｏｕＨｕｎａｎ。４１６０００，Ｃｈｉｎａ； ２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆＪｉｓｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｄｉｃｉｎｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ。ＪｉｓｈｏｕＨｕｎａｎ－４１６０００。Ｃｈｉｎａ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｗｉｔｈｔｈｅａｇｉｎｇｏｆｗｏｄｄ§ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ§ｄｉｓｅａｓｅｈａｓｌ№ａｃｏｍｅｏｎｅｏｆｔｈｅｆｏｕｒ８ｅｒｉｏｕｔ；ｄｉｓｅａｓｅｓｗｈｉｃｈｔｈｒｅａｔｔＯｔｈｅｈｅａｌｔｈｏｆｔｈｅｅｌｄｅｒｌｙ．ＩｔｉｓｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｔＯｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈａｒｅｌｉａｂｌｅａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｆｏｒＡＤｉｎｐｒｏｖｉｎｇＡｌｚｈｅｉｍｅｒ§ｄｉｓｅａｓｅｅｔｉｏｌｏ－舒－ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｏｆｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｄｒｕｇｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ａｎａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｏｆＡＤｒｅｓｅａｗｈａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎａｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ；ａｎｉｍａｌｍｏｄａｌ 阿尔茨海默症（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是发生在老年期或老年前期的一种中枢神经系统慢性渐进性退行性疾病，以脑细胞内神经纤维缠结（ｎｅｒｖｅｆｉｂｅｒｔａｎｇｌｅｓ，ＮＦＴｒ）和细胞外老年斑（ｓｅｎｉｌｅｐｌａｑｕｅｓ，ＳＰ）以及大量神经元丢失为主要神经病理特征…。由于阿尔茨海默症（ＡＤ）的发病机制至今不明，因此研究并建立可靠的ＡＤ动物模型对于探明阿尔茨海默症的病阒、发病机制及防治药物的开发与研究具有重要的意义。虽然完全理想的ＡＤ动物模型目前尚不存在，但随着神经牛物学和分子生物学的进步，许多ＡＤ动物模型相继被制作，并在研究中得到广泛的应用，这些模型为理解ＡＤ的病理机制和实验新的药物发挥了重要作用。 １损伤模型 １．１前脑胆碱能系统损害模型前脑胆碱能系统损害模型是建立在ＡＤ胆碱功能障碍假说的基础上。前脑胆碱能系统与学习记忆和认知功能有着密切的联系，因此前脑胆碱能系统的损害导致ＡＤ患者的学习记忆和认识功能的损害旧Ｊ。１．１．１乙酰胆碱Ｍ受体阻断剂所致的动物模型给大鼠腹腔注射胆碱能拮抗剂（如东筐菪碱、樟柳碱等），可阻断大脑皮层中的乙酰胆碱受体的结合位点，从而引起胆碱能系统功能障碍。该类药能特异性阻滞信息由第一级向第二级的传递过程从而干扰了获得新近信息（近期记忆）的能力¨Ｊ。评价：乙酰胆碱Ｍ受体阻断剂动物模型可造成认知障碍，但缺乏ＡＤ特殊病理生理所必需的特征，且主要是可逆性阻断突触后的乙酰胆碱Ｍ受体，而ＡＤ是一种进行性不可逆的神经性疾病，突触后乙酰月Ｈ碱Ｍ受体并无明显减少，因此，只是模拟了ＡＤ的部分特征。同时，应注意乙酰胆碱Ｍ受体阻断剂东茛菪碱慢性给药对大鼠学习记忆能力有一定损害，但对长时记忆和海马神经元结构无明显影响Ｈ－。 １．１．２兴奋性毒素所致的动物模型使用兴奋性神经毒素氨基酸，如红藻氨酸（ＫＡ）、鹅膏罩氨酸（ＩＢＯ）、使君子氨酸（ＱＵＩＳ）、Ｎ一甲基一Ｄ一天门冬氨酸（ＮＭＤＡ）等注入大鼠Ｍｅｙｎｅｒｔ可造成动物一系列类似ＡＤ的行为改变。兴奋性神经毒素氨基酸有强烈的神经毒性作用，通过与神经元胞体或树突上的ＮＭＤＡ受体结合，使神经元中毒损伤而溃变。兴奋性神经毒素氨基酸可使大脑皮层和海马Ｍ受体结合量下降，突触数量减少，胆碱能的标志酶含量下降，学习记忆能力减退。评价：该模型模拟了与学习记忆有关的胆碱能神经系统损害的信息，但无神经炎斑块及ＮＦｒｒ的组织病理学改变且神经毒氨基酸对乙酰胆碱系统的损伤可逆转。同时应注意兴奋性神经毒素氨基酸对非胆碱能神经元也有影响。 １．１．３选择性胆碱能神经毒素所致的动物模型向大鼠脑室注射特异性的胆碱毒１一乙基一１一（２一羟乙基）一氯化氮丙啶（ＡＦ６４Ａ），大鼠会出现胆碱能系统和记忆功能损害。ＡＦ６４Ａ，１一乙基一１一（２一羟乙基）一氯化氮丙啶是一种胆碱能神经元特异性的突触前损伤神经毒素。其结构与胆碱相似，能选择性地作用于高亲和力胆碱转运（ＨＡＣｈＴ）系统，同时在其体内积聚部位产牛毒素作用。评价：该模型可以模拟大脑皮层、海马等脑区胆碱能神经系统损害和记忆认知行为的改变，但不能形成ＡＢ沉积、ＮＦＴｓ等组织病理学改变№Ｊ。１．１．４免疫毒素所致的动物模型向大鼠脑内Ｍｅｙｎｅｒｔ注射免疫毒素１９２１ｌｇＧ—Ｓａｐｏｒｉｎ（由低亲和性神经牛长因子（ＮＧＦ）受体的单克隆抗体ＩｇＧ与同样带有ＮＧＦ受体的细胞 ?基金项目：吉首大学大学生研究性学习与创新性实验项目（教通［２００８］２２号）万方数据
缺氧的类型及影响缺氧耐受性的因素 高伟飞 （浙江中医药大学滨江学院10级临床专业临滨1班4组20102090114） 一、实验目的： 1.观察原因和条件在疾病发生发展中的作用 2.复制几种类型缺氧的模型，观察血液颜色的特点，分析其机制 根据大纲要求： 掌握概念：缺氧、低张性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧和组织性缺氧，紫绀、肠源性紫绀。 熟悉并理解原因和条件在疾病发生发展中的作用。 熟悉反映血氧情况的一些指标(氧分压、氧含量、氧容量、氧饱和度，动静脉血氧含量差)。 掌握各型缺氧发生的原因及主要发病机制，掌握各型缺氧的特征（血氧变化的特点和皮肤黏膜颜色变化）。 二、实验原理： 当组织供应组织的氧不足，或组织利用氧障碍时，机体的机能和代谢可发生异常变化，这种病理过程称为缺氧。不同类型的缺氧，其机体的代偿适应性反应和症状也不同。根据缺氧原因不同可将缺氧分为乏氧性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧和组织中毒性缺氧四种类型。 影响机体对缺氧耐受性的因素很多，如年龄、机体的代谢、功能状况以及锻炼适应等。本实验才缺氧的不同环节入手观察呼吸变化及皮肤黏膜的颜色改变。实验通过动物的不同代谢状况、中枢神经系统功能和动物所处环境温度，观察动物的缺氧耐受性。 三、实验对象：小鼠 四、实验材料：电子秤、注射器、钠石灰、广口瓶、测耗氧量装置、剪刀、镊子、滤纸；生理盐水、美兰亚硝酸钠、氯丙嗪、冰块、量筒等 五、实验方法： 1、取2只小鼠，注射及处理： 1号：亚硝酸钠及美兰0.2ml ，左下腹注射 2号：亚硝酸钠及生理盐水各0.2ml ，左下腹注射 注射完，观察，2号小鼠立即死亡，1号小鼠仍存活；然后处死解剖，剪下一片肝脏组
原花青素药理作用研究进展 刘福成1黄美玲2 湖南省肿瘤医院1常德市红十字会中心医院2 原花青素（Oligomeic proantho cyanidins opc）是一种有特殊结构的生物类黄酮，在结构上是由不同数量的儿茶素（catechiu）或表儿茶素（epicaJlechin）结合而成，最简单的原花青素是儿茶素，或表儿茶素，或儿茶素和表儿茶素形成的二聚体，或三聚体，四聚体，直至十聚体等。按聚合度的大小，通常將2～5聚体称为低聚体。（简称opc），將五聚体以上的称为高聚体（PPc）法国学者马斯魁勒在20世纪70年代首次从葡萄籽中提取并证实其独特的抗氧化活性。 原花青素（Pvocyanidins、pc）过去是对一大类多酚类化合物的总称，曾统归于缩合鞣质或黄烷醇类，随着分离鉴定技术的提高和研究的深入，而將其纳为原花青素。原花青素主要分布在葡萄，银杏，大黄，山楂，花旗松，海岸松，白桦树，野草莓，板栗壳，荷叶，莲蓬，油菜子，黑土豆木樾桔和甘薯等植物中，而葡萄籽和荷叶中的提取物中原花青素的含量最高。在西方的飮食中，它占人们摄入酮类中的一大部份，它对人体健康很有帮助，在营养学中巳备受关注，Gavcia等巳证明，口服二聚体原花青素很快吸收，并在体内甲基化，在血浆和肝脏中发挥激素样效应，是最佳的生物活性物质。 原花青素一般为红棕色粉末，气微清香，味涩，济于水和大多有机溶剂。原花青素是一种新型高效的抗氧化剂，是目前发现的最强的自由基清除剂，具有非常强的体内活性，opc 的抗自由基氧化能力可达维生素E的50倍，维生素c的20倍，且吸收速度完全，吸收20分钟即可达到最高的血液浓度，代谢半衰期为7小时之久。且服用无不良付作用。 OPC还具有保护心脑血管抗肿瘤等多种生物活性。 原花青素抗氧化性与化学结构有关 OPC是由于B环上具有相邻二酚羟基广泛的电子非定域化，使得相应的氧化形式另外获得稳定状态。另外，在其高分子结构中，几个与O原子邻位的二羟酚基使得原花青素充分与金属离子Fe+++、Cu++、Al++及蛋白结合，络合作用的贡献在于阻止催化自由基反应的金属离子的活性。黄烷间的连接类型(C4与C6结合，C4与C8结合)对原花青素捕获自由基抗氧化有很大影响。在水溶液中的构象不同，影响它们的亲水性，而影响它们与水相和脂质相中过氧化氢的相互作用。在二聚体中因两个单体的构象或键结合位置不同，可派生多种异构体。已分离鉴定的8种结构形成，分别命名为B1～B8。其中B1～B4是由C4～C8键合，B5～B8由C4→C6键合。Faria等通过鉴测耗氧量和测量共轭双烯的形成，评价原花青素单体，直至五聚体的抗氧化能力。认为二聚体的作用最强，均能增加氧化作用的诱导时间来保护细胞膜对过氧化氢自由基的损害。但随结构复杂性增加，空间位阻现象存在，抗氧化作用降低。Silva等③报导，原花青素结构与抗氧化能力，显示随着由单体构成的二聚体，三聚体的聚合度增加，抗氧化能力也增加，可能是自由羟基和氢原子数量增加提高了水相中抗氧化剂的功能，当然随聚合度增加化合物对脂质相的分配系数也增加。 原花青素抗氧化性的药理作用 清除自由基作用。（美）哈曼（Harman）1955年提出自由基导至衰老约理论。认为人代谢过程中产生大量自由基。这些氧化基团能使蛋白质DNA损伤，细胞寿命缩短。原花青素具有很强的抗氧化活性，是一种很好的氧自由基清除剂。Bagchi等④⑤用小鼠进行体内实验，用葡萄籽提取物原花青素，VC，VE琥珀酸盐（VES），β-葫萝卜素对TPA(12-O-teradecanoylphorpol-13-acetat-12-O-十四烷酸佛波醇-B-醋酸盐)诱导的肝，脑组织脂质过氧化的保护作用进行比较，发现在100㎎/kgBW剂量下原花青素，VC，VES，β-