2009年第3期
试验研究
麦麸
棉柏玉米粉蛋白质含量15～20％
35～40％
8～12％
不同氮源对柠檬酸发酵的影响
石河子长运生化有限责任公司（832000）夏胜洁
摘要本研究立足于以玉米粉为原料，利用黑曲霉生产柠檬酸，对添加不同的氮源进行研究，以提高糖酸转化率和缩短发酵周期为目的。
关键词
氮源；糖酸转化率；发酵周期；周期
中图分类号：Q 946.81+8.6
文献标识码：B
文章编号：1008-0899（2009）06-0001-02
在正常生产情况下，柠檬酸在黑曲霉细胞内不会积累，而且柠檬酸是黑曲霉的良好碳源。柠檬酸积累是菌体代谢失调的结果。柠檬酸发酵需要的条件：磷酸盐浓度低；氮源用NH 4+盐；PH 值低（低于2.0）；溶氧量高。
黑曲霉柠檬酸生产菌的PFK 酶是酵解途径中第一个调节酶，也是决定EM P 途径代谢流量的最重要的关键酶。此酶受正常的生理浓度范围的柠檬酸和ATP 的抑制，为AM P 、Pi 、NH 4+所激活，NH 4+还能有效地解除柠檬酸和ATP 对PFK 酶的抑制。NH 4+在细胞内的生理浓度水平下，PFK ，酶对柠檬酸不敏感，考察柠檬酸发酵时，PFK 酶的这些效应物在细胞内的浓度表明，NH 4+浓度与柠檬酸生产率有密切的关系，并且显示在锰缺乏和充足条件下显著差别，可以认为，锰的效应是通过铵离子浓度升高而减弱了柠檬酸对PFK 酶的抑制［1］
。能作为氮源的原料很多在考虑氮源用量时，应考虑原料中的含氮量和培养基的碳氮比以控制霉菌的长势。氮源不足长菌弱，发酵期延长，且易染杂菌。而氮源过足则曲霉长势过旺，产酸率显著下降。
从生长角度看，黑曲霉可以利用很多无机和有机氮源，尤其偏好于无机氮源，并且在发酵柠檬酸中途添加NH 4+盐也有优越性［2］。从NH 4+的代谢调节作用考虑，NH 4+在发酵过程中，尤其在产酸阶段不应受限［3］。
国内玉米粉发酵生产柠檬酸工艺也在不断的探索不断的完善，工艺已日趋成熟。国内各柠檬酸厂由于地域的不同在柠檬酸发酵中添加的氮源也不同，究竟哪种氮源最适合黑曲霉柠檬酸发酵，达到柠檬酸生产的最好经济效益，可以提高糖酸转化率和缩短发酵周期。针对添加不同的氮源对柠檬酸生产的影响进行了研究。
氮源分有机氮源和无机氮源，本文分别选取具有代表性的有机氮源麦麸、棉柏、玉米液化液，和无机氮源硫酸铵、硫酸氢铵，将其加入柠檬酸发酵的生产培养基内，研究这些氮
源是否能促进产酸。针对以上问题分别作了500ml 摇瓶实验和5m 3小试验罐实验。1
500ml 摇瓶实验材料和方法1.1实验材料
菌种：黑曲霉，Co827。
分离：斜面、培养基。5°BX 土豆汁（加蔗糖）+琼脂粉20g/l PH 自然。
玉米粉，α-淀粉酶，麦麸、棉柏，硫酸铵、硫酸氢铵氨1.2实验仪器
500ml 三角瓶、150ml 三角瓶、250ml 三角瓶、100ml 定容瓶、500ml 定容瓶、2000ml 烧杯、玻璃棒、50ml 碱式滴定管。1.3实验设备
不锈钢电热恒温水浴锅，
DZ 型恒速无级调速搅拌器，GB4027.1-83手提式压力蒸汽消毒器，P270型普通摇床，XSP-2C 显微镜。1.3实验方法
玉米清夜的制备。采用间接液化法，将本厂自磨玉米粉与洁净水按17％～20％浓度在2000ml 烧杯内调浆，将2000ml 烧杯放入水浴锅内升温，升温到玉米淀粉将糊化温度时，按比例加入α-淀粉酶。当碘试合格后将2000ml 烧杯从水浴锅内取出，留小部分液化液待用，将剩余液化液的清夜与玉米渣分离，留玉米清夜备用。
摇瓶培养基的制备。将玉米清液分别和麦麸、棉柏、液化液、
硫酸铵、硫酸氢铵按合适碳氮比添加每瓶摇瓶装量50ml （麦麸、棉柏、玉米粉的蛋白质含量如附表1），分装入洁净的500ml 三角瓶，并用干净四层纱布封口并扎上牛皮纸，在蒸汽灭菌锅内灭菌，121℃30分钟，冷却待用。测定摇瓶培养基的总糖和还原糖、蛋白质含量。1.4实验步骤
表11--
石河子科技
接种。将灭过菌的500ml三角瓶在无菌室内接入黑曲霉菌种。
摇瓶培养。将接种后的摇瓶称重M1，上摇床，摇床转速300r/min，温度37℃，培养时间72小时。
摇瓶测量。培养时间达到后，下摇床称摇瓶重量M2，置片做镜检，测定酸度，按下列方法求得的酸度为实际产酸。
实际产酸（％）＝（50-失重）×测量酸度/50×100％
失重（以g计）=M1-M2
2分析测定
2.1总糖的测定方法
先用7.5ml分析纯浓H2SO4将所需样品水解为葡萄糖后，再用费林氏滴定法测定。
2.2还原糖的测定方法
费林氏滴定法。
2.3蛋白质的测定方法
凯氏定氮法。2.4酸度测定
发酵液1ml所消耗的0.1429mol的NaOH的毫升数即为酸度。
35M3试验罐实验
3.1实验方法
将大生产上直接液化法生成的玉米液化液经过过滤加入5m3实验罐中，加入氮源，按合适的碳氮比调整到所需要的浓度。采用实消121℃灭菌30分钟，实消完毕后，降温至38℃。在无菌条件下接种，一级发酵。5m3实验罐为二挡搅拌，转速为180转/分钟，7.5千瓦电机。
3.2分析测定
总糖、还原糖、蛋白质、酸度的测定同摇瓶测定方法。
4试验结果
4.1摇瓶试验结果（表2）
4.25M3试验罐试验结果（表3）
表中总糖、产酸、转化率、周期均为平均值。
麦麸棉柏液化液硫酸铵硫酸氢铵总糖（％）15.2014.815.4015.1215.20还原糖（％） 6.4 6.27.0 6.7 6.6
酸度（％）14.314.114.213.813.5表2
麦麸棉柏液化液硫酸铵硫酸氢铵总糖（％）14.514.314.8014.0014.12酸度（％）13.5013.8013.4012.6012.80转化率（％）93.1096.5090.5490.0090.56周期（小时）6861656260表3
5结论及讨论
由实验结果可以得结论：糖酸转化率高,周期相对短的是加棉柏的，其次是加麦麸的，剩余三种结果相对较差。以棉柏为氮源黑曲霉菌球形态较均匀，且紧密。以麦麸为氮源的黑曲霉菌球形态相对较松散，有时菌球形态较不均匀。用液化液、硫酸铵、硫酸氢铵为氮源时，菌球形态有时会很不均匀，且菌球过于紧实，从而不利于黑曲霉产酸率。此实验还存在不足，因为此实验中的上罐实验为一级发酵实验，而与大生产也存在一定的差距。一级发酵和大生产的碳氮比是有一定的差距，对于大生产此结论还不成熟，而且对于原料也存在一定的地域差异，每个地域的原料如玉米因各地种植季节，日照时间，以及土壤的差别都影响着玉米内各种微量元素的含量。而麦麸、棉柏、硫酸铵、硫酸氢铵则由于各地生产加工工艺的不同而其内的微量元素的含量也不相同。
参考文献
［1］金其荣等.《有机酸发酵工艺学》.北京：中国轻工业出版社，1995
［2］Shephard，M.W.：U S Pat ent,3083144(1963年)
［3］R?hr,M.et al：In"B iot echnology",(R ehm＆R eed ed.) V ol.3:419～454(1983年)
2 --
2009年第3期 试验研究 麦麸 棉柏玉米粉蛋白质含量15～20％ 35～40％ 8～12％ 不同氮源对柠檬酸发酵的影响 石河子长运生化有限责任公司（832000）夏胜洁 摘要本研究立足于以玉米粉为原料，利用黑曲霉生产柠檬酸，对添加不同的氮源进行研究，以提高糖酸转化率和缩短发酵周期为目的。 关键词 氮源；糖酸转化率；发酵周期；周期 中图分类号：Q 946.81+8.6 文献标识码：B 文章编号：1008-0899（2009）06-0001-02 在正常生产情况下，柠檬酸在黑曲霉细胞内不会积累，而且柠檬酸是黑曲霉的良好碳源。柠檬酸积累是菌体代谢失调的结果。柠檬酸发酵需要的条件：磷酸盐浓度低；氮源用NH 4+盐；PH 值低（低于2.0）；溶氧量高。 黑曲霉柠檬酸生产菌的PFK 酶是酵解途径中第一个调节酶，也是决定EM P 途径代谢流量的最重要的关键酶。此酶受正常的生理浓度范围的柠檬酸和ATP 的抑制，为AM P 、Pi 、NH 4+所激活，NH 4+还能有效地解除柠檬酸和ATP 对PFK 酶的抑制。NH 4+在细胞内的生理浓度水平下，PFK ，酶对柠檬酸不敏感，考察柠檬酸发酵时，PFK 酶的这些效应物在细胞内的浓度表明，NH 4+浓度与柠檬酸生产率有密切的关系，并且显示在锰缺乏和充足条件下显著差别，可以认为，锰的效应是通过铵离子浓度升高而减弱了柠檬酸对PFK 酶的抑制［1］ 。能作为氮源的原料很多在考虑氮源用量时，应考虑原料中的含氮量和培养基的碳氮比以控制霉菌的长势。氮源不足长菌弱，发酵期延长，且易染杂菌。而氮源过足则曲霉长势过旺，产酸率显著下降。 从生长角度看，黑曲霉可以利用很多无机和有机氮源，尤其偏好于无机氮源，并且在发酵柠檬酸中途添加NH 4+盐也有优越性［2］。从NH 4+的代谢调节作用考虑，NH 4+在发酵过程中，尤其在产酸阶段不应受限［3］。 国内玉米粉发酵生产柠檬酸工艺也在不断的探索不断的完善，工艺已日趋成熟。国内各柠檬酸厂由于地域的不同在柠檬酸发酵中添加的氮源也不同，究竟哪种氮源最适合黑曲霉柠檬酸发酵，达到柠檬酸生产的最好经济效益，可以提高糖酸转化率和缩短发酵周期。针对添加不同的氮源对柠檬酸生产的影响进行了研究。 氮源分有机氮源和无机氮源，本文分别选取具有代表性的有机氮源麦麸、棉柏、玉米液化液，和无机氮源硫酸铵、硫酸氢铵，将其加入柠檬酸发酵的生产培养基内，研究这些氮 源是否能促进产酸。针对以上问题分别作了500ml 摇瓶实验和5m 3小试验罐实验。1 500ml 摇瓶实验材料和方法1.1实验材料 菌种：黑曲霉，Co827。 分离：斜面、培养基。5°BX 土豆汁（加蔗糖）+琼脂粉20g/l PH 自然。 玉米粉，α-淀粉酶，麦麸、棉柏，硫酸铵、硫酸氢铵氨1.2实验仪器 500ml 三角瓶、150ml 三角瓶、250ml 三角瓶、100ml 定容瓶、500ml 定容瓶、2000ml 烧杯、玻璃棒、50ml 碱式滴定管。1.3实验设备 不锈钢电热恒温水浴锅， DZ 型恒速无级调速搅拌器，GB4027.1-83手提式压力蒸汽消毒器，P270型普通摇床，XSP-2C 显微镜。1.3实验方法 玉米清夜的制备。采用间接液化法，将本厂自磨玉米粉与洁净水按17％～20％浓度在2000ml 烧杯内调浆，将2000ml 烧杯放入水浴锅内升温，升温到玉米淀粉将糊化温度时，按比例加入α-淀粉酶。当碘试合格后将2000ml 烧杯从水浴锅内取出，留小部分液化液待用，将剩余液化液的清夜与玉米渣分离，留玉米清夜备用。 摇瓶培养基的制备。将玉米清液分别和麦麸、棉柏、液化液、 硫酸铵、硫酸氢铵按合适碳氮比添加每瓶摇瓶装量50ml （麦麸、棉柏、玉米粉的蛋白质含量如附表1），分装入洁净的500ml 三角瓶，并用干净四层纱布封口并扎上牛皮纸，在蒸汽灭菌锅内灭菌，121℃30分钟，冷却待用。测定摇瓶培养基的总糖和还原糖、蛋白质含量。1.4实验步骤 表11--
柠檬酸及生产工艺 一.柠檬酸的简介 1. 柠檬酸的理化性质 柠檬酸（Citric acid），又称枸椽酸，是一种三元羧酸,其学名为3-羟基-3-羧基戊二酸，分子式C6H8O7(无水物)，在自然界中存在于柠檬、柑桔、梅、子、梨、桃、无花果等水果中。柠檬酸具有无毒，无色，无臭特性，一般为半透明结晶或白色粉末，易溶于水、乙醇、乙腈、乙醚等[1]，不溶于苯，微溶于氯仿。相对密度1.542g/cm3，熔点153℃(失水)。柠檬酸结晶形态因结晶条件不同而不同，有无水柠檬酸，也有含结晶水的柠檬酸。在干燥空气中微有风化性，在潮湿空气中有潮解性，175℃以上分解放出水及二氧化碳。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H＋可以电离；水溶液呈酸性，加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 2. 柠檬酸的用途 柠檬酸具有令人愉悦的酸味，入口爽快，无后酸味，安全无毒，被广泛用作食品和饮料的酸味剂；能与二价或三价的阳离子形成络合物，被用作金属加工的鳌合剂和洗净剂（起软化水作用的洗净力补充剂）；还能衍生形成许多衍生物，可用作有机化学工业的原料。因此被广泛用于食品饮料、医药化工、清洗与化装品、有机材料等领域，是目前世界需求量最大的一种有机酸[2]，到目前还没有一种可以取代柠檬酸的酸味剂。 二.生产技术 柠檬酸的生产方法共可分为 3 种: 水果提取法,化学合成法, 生物发酵法三种[17]，目前以发酵法生产柠檬酸为主[18]。发酵法又分为固体发酵法和液体深
层发酵法。固态发酵能耗小但劳动力大，占地面积大，不适合大规模的生产应用。深层通风发酵法采用不锈钢罐体，机械搅拌通风，微生物在液体相中分布均匀，发酵时不生成孢子，全部菌体细胞用于代柠檬酸，发酵速度高，实现了机械化或自动化操作，利于大规模生产。 三.生物发酵法制取柠檬酸 1.本工艺选择的原料及生产方法 本次生产工艺设计以薯干为原料，采用直接粉碎、调浆、液化，进行好气液体深层发酵，钙盐法提取，最后结晶、干燥得到柠檬酸 2.工艺流程 接收糖浆后，根据糖浆组成作适当的处理或配制，配成发酵原料，进行连续杀菌并冷却后，进入发酵罐，加入菌种和净化压缩空气后进行发酵；发酵液经升温、过滤处理后，进入中和罐，用中和处理；再经过过滤洗涤，得到柠檬酸钙固体，送入酸解罐，再添加酸解，并加入活性炭进行脱色；然后，通过带式过滤机过滤、酸解过滤，除去及废炭；酸解过滤液经离子交换处理后，进行蒸发、浓缩，再进行结晶；结晶后，用离心机进行固液分离，对得到的湿柠檬酸晶体进行干燥与筛选，最后得到成品柠檬酸。
柠檬酸研究概况 [摘要]：全文介绍了柠檬酸的性能，发展概况，生产过程及方式，影响因素等。对现工业化运行的柠檬酸主要生产工艺的技术特点进行了具体的分析，阐述了国内外研究开发的现状与发展趋势。 [关键词]：柠檬酸；发酵；发酵影响因子 引言 柠檬酸(也称构椽酸)是重要的有机酸, 是柠檬、袖子、柑橘、葡萄等水果天然酸味的主要成分。天然柠檬酸在自然界中分布很广，天然的柠檬酸存在于植物如柠檬、柑橘、菠萝等果实和动物的骨骼、肌肉、血液中。 1 柠檬酸的性质 柠檬酸结构式： 化学名称：2-羟基-1,2,3-三羧基丙烷 英文名称2：2-hydroxy-1,2,3-propanetricarboxylic acid CAS No.：77-92-9 EINECS号：201-069-1[1] 柠檬酸分子式：C6H8O7 1.1柠檬酸的物理性质 在室温下，柠檬酸为无色半透明晶体或白色颗粒或白色结晶性粉末，无臭、味极酸，在潮湿的空气中微有潮解性。它可以以无水合物或者一水合物的形式存在：柠檬酸从热水中结晶时，生成无水合物；在冷水中结晶则生成一水合物。加热到78 °C时一水合物会分解得到无水合物。在15摄氏度时，柠檬酸也可在无水乙醇中溶解。 1.2柠檬酸的化学性质 从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质。加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 天然柠檬酸在自然界中分布很广，天然的柠檬酸存在于植物如柠檬、柑橘、菠萝等果实和动物的骨骼、肌肉、血液中。人工合成的柠檬酸是用砂糖、糖蜜、淀粉、葡萄等含糖物质发酵而制得的，可分为无水和水合物两种。 柠檬酸是世界上以生物化学方法生产量最大的有机酸, 酸味柔和爽快, 人口即达到最高酸感, 后味延续时间较短，柠檬酸钠则是柠檬酸的钠盐, 水解后生成起主要作用的柠檬酸，所以柠檬酸(钠) 是重要的食品添加剂, 广泛用于食品工业, 可调节食品酸度, 增强食品感，在我国允许果酱、饮料、
铵态氮与硝态氮的差异 铵态氮肥：氮肥中氮素的形态是氨( NH3)或铵离子(NH4+)。 例如液态氨、氨水、硫酸铵、氯化铵、碳酸氢铵等。 硝态氮肥：氮肥中氮素的形态是硝酸根(NO3-)。如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙。硝、铵态氮肥：氮肥中含有铵离子和硝酸离子两种形态的氮。如硝酸铵、硝酸铵钙、硫硝酸铵。酰胺态氮肥：主要有尿素植物可以大量吸收的氮，是铵态氮和硝态氮，也可吸收少量有机态氮，如尿素和结构比较简单的氨基酸。铵态氮是还原态，为阳离子；硝态氮是氧化态，为阴离子。它们所带的电荷不用，在土壤中的行为以及对植物的营养特点也不一样。不能简单地说哪种形态好，哪种形态不好。它们的好坏与施用条件和作物种类等有关。铵态氮在带阴离子的土壤胶体中容易被吸附，而硝态氮则不能被吸附，具有更大的移动性。硝态氮被植物吸收后，要经过硝酸还原酶和亚硝酸还原酶还原成铵态氮后，才能进一步合成氨基酸。不同作物施用两种形态氮的反应往往不一。水稻施用铵态氮的效果比硝态氮好。因为水稻幼苗根中缺少硝酸还原酶，对硝态氮不能很好利用。除水稻本身原因外，水田中施用硝态氮易于流失，而且在淹水条件下的反硝化作用也是氮素损失的原因。因此，在水稻田施用硝态氮肥，有资料认为其肥效只有铵态氮肥的60%—70%。而与此相反的是烟草和蔬菜，它们是喜硝态氮的作物。硝态氮肥极易溶解，在土壤中活动性大，能迅速提供作物氮素营养，同时，又易于流失，肥效较短。这种特性符合烟草的要求，叶片要生长快，在适当时候又能落黄“成熟”。而且硝态氮有利于烟草体内形成柠檬酸、苹果酸等有机酸，烤出的烟叶品质好，燃烧性好。蔬菜施用硝态氮产量高，如硝态氮低于肥料全氮的50%，产量明显下降。因此，生产烟草、蔬菜专用肥时，氮肥中要有一定比例的硝态氮。但由于在土壤水分、温度、通气条件适宜时，铵态氮可经硝化作用，氧化成硝态氮。所以，烟草、蔬菜也不是绝对不能施用含铵态氮的肥料。另外，施用硫酸铵等生理酸性肥料作物生长不好，往往不是由于铵态氮肥不宜，而是由于生理酸性造成的。尿素施入土壤后一般要经过脲酶水解，转化成铵态氮肥，才能被植物大量吸收利用。
生物工程设备课程设计 年产30000吨柠檬酸发酵设计学院：化工与材料学院 专业：姓名：指导老师： 生物工程 学号： 职称：高级工程师 中国·珠海 二○一五年十一月
北京理工大学珠海学院课程设计 诚信承诺书 本人郑重承诺：我所呈交的课程设计《年产30000吨柠檬酸发酵设计》是在指导教师的指导下，独立开展研究取得的成果，文中引用他人的观点和材料，均在文后按顺序列出其参考文献，设计使用的数据真实可靠。 承诺人签名： 日期：年月日
北京理工大学珠海学院12级生化工程设备课程设计 任务书 题目：年产30000吨柠檬酸发酵设计 专业学院：化工与材料学院 专业：生物工程 学生姓名： 指导教师：
一、主要研究内容： 1、设备所担负的工艺操作任务和工作性质，工作参数的确定。 2、容积的计算，主要尺寸的确定，传热方式的选择及传热面积的确定。 3、动力消耗、设备结构的工艺设计。 二、主要任务及目标： 1、工艺设计和计算 根据选定的方案和规定的任务进行物料衡算，热量衡算，主体设备工艺尺寸计算和简单的机械设计计算，汇总工艺计算结果。主要包括： （1）工艺设计 ①设备结构及主要尺寸的确定（D，H，H L ，V，V L ，Di等） ②通风量的计算 ③搅拌功率计算及电机选择 ④传热面积及冷却水用量的计算 （2）设备设计 ①壁厚设计（包括筒体、封头和夹套） ②搅拌器及搅拌轴的设计 ③局部尺寸的确定（包括挡板、人孔及进出口接管等） ④冷却装置的设计(包括冷却面积、列管规格、总长及布置等) 2、设计说明书的编制 设计说明书应包括设计任务书，目录、前言、设计方案论述，工艺设计和计算，设计结果汇总、符号说明，设计结果的自我总结评价和参考资料等。 3、绘制设备图一张 设备图绘制，应标明设备的主要结构与尺寸。 指导教师签字：年月日 工作小组组长签字：年月日
什么是碳源、氮源？ 碳源 碳源是微生物生长一类营养物，是含碳化合物。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸及有机酸酯和小分子醇。根据微生物所能产生的酶系不同，不同的微生物可利用不同的碳源。 碳源对微生物生长代谢的作用主要为提供细胞的碳架，提供细胞生命活动所需的能量，提供合成产物的碳架。 氮源 作为构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素化合物的材料。把从外界吸入的氮素化合物或氮气，称为该生物的氮源。能把氮气作为氮源的只限于固氮菌、某些放线菌和藻类等。高等植物和霉菌以及一部分细菌，仅能以无机氮素化合物为氮源。动物和一部分细菌，不用有机氮化合物作为氮源就不能生长。 作为植物的氮源最重要的是无机化合物的硝酸盐和氨盐。硝酸盐一般需还原成氨盐后才能进入有机体中，但由于生物的性质和环境条件的不同，作为氮源来说，有时氨盐适宜，有时硝酸盐适宜。如浓度适宜，亚硝酸盐、羟胺等也可作为氮源。作为氮源的有机化合物有氨基酸、酰胺和胺等。特殊的细菌，也有时需要以极其特殊的氮素化合物作为唯一的氮源来进行培养。 碳源和氮源的合理性 合理的碳源和氮源，直接影响作物的生长，碳源含量高，作物生长受到抑制，根系生长比较快，茎叶收到缓慢，可能直接降低作物的茎秆高度等。氮源含量，作物发生旺长，叶片茎秆生长有劲，可能提高作物之身的高。碳源和氮源合理，作物生长平稳，根系和果实、叶片都处在健康状态。 碳氮比一般在25:1比较合理，因此，合理补充土壤中的碳源、氮源比较关键，部分碳源由作物腐烂的茎叶和根系来补充，氮源由植物吸收空气的中的氮作物补充。但是，碳源来源不稳定，根据作物的收货的目的，碳源一般比较缺乏，补充碳源可以选择标美力克肥业有限公司“碳神奇”作为碳源补充剂，提高土壤中碳源的含量，增加土壤团粒结构。
不同光强对作物生长影响的研究综述 时向东,文志强,刘艳芳,王卫武 (河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地,河南郑州450002) 摘要 综述了不同光强对作物的形态学、光合作用、内源激素、矿质营养、叶片结构和化学成分的影响。 关键词 光强;形态学;内源激素;矿质营养;叶片结构;化学成分 中图分类号 Q945.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2006)17-4216-03 Research on the Effect of Different Lig ht Stresses on C ro p Grow th SHI X iang do ng et al (Nati on al Cen ter of Physiol ogy and B io che mistry of Tobacco Cultivation,Henan Agricultu re Universi ty,Zhengzhou,Henan 450002) Abstract It was s um marized that m orphologic,p hotosynthesis,end ogenous horm one mineral nutrien t,structure of leaf and che mistry in gredien t were ef fected by the di fferen t light stresses in crop growth. Key w ords Light stress;Morphologic;Photos yn thesis;End ogenous hormone;Mineral nu trient;Structu re of leaf;Chemis try i ngredient 在作物的生命活动中,光是重要的影响因子之一,目前在作物上已有广泛的研究,范围涉及到生长发育、形态建成、生理代谢、产量和品质等方面。尤其是近些年来,一些经济作物需要遮阴条件才能满足市场对品质的要求,这变相促进了光强对作物生命活动的研究,并且取得了显著的经济效益,同时也可以为叶片喷施和育种提供一些依据。 1 不同光强对作物形态特征的影响 作物的根系、叶片和茎秆等外观形态特征对遮阴的响应十分敏感,国际上自20世纪40年代以来,不同学者通过人工遮阴就不同光强对作物生长发育的影响进行了大量的研究,尽管所用的材料和控制的条件不同,但得出来许多相似或相同的结论:适度遮阴对作物的营养生长有很大的促进作用,表现为生长加快、根冠比增加、根系发达、枝大叶茂、茎秆变粗、叶绿素含量和生物学产量增加[1-5]。另外,不同作物叶表面特征对遮阴的响应差别较大,如北京丁香在全光照条件下叶片表面基本无毛,而在遮阴条件下则有短微毛。 2 不同光强对作物光合作用的影响 光强影响作物的光饱和点(LSP)和光补偿点(LCP)。随着光强的增加,作物的光饱和点和光补偿点都有所下降,下降幅度因作物种类的不同而有所差别。Thimijan等[6]研究指出:烟草的光饱和点大概在600mmol/m2P AR,光强减弱,光饱和点下降。曹珂等[2]在遮阴对桃幼树光合特性影响的研究中指出:在中度遮阴下,朝晖光补偿点下降24.37%,在重度遮阴条件下,其光补偿点下降59.79%。 光强影响作物的光合速率。光饱和点以下,光合速率随光强的增加而增加,增加的幅度受温度、CO2浓度、相对速度等因素的影响。另有报道指出:光强对光合速率的影响在品种间差异较大[7],如水稻是适应广幅光强的品种,在强、弱光条件下,其光合速率下降的幅度均较少。采利尼克尔[8]经过研究发现:在一定幅度的光照条件下,作物的干物质积累即净光合速率相对稳定,他认为这种干物质积累的稳定性乃是光-光合作用曲线不稳定性的结果,并且首先表现在遮阳情况下光合曲线弯曲部分的光合强度提高。眭晓蕾等[9]在弱 基金项目 国家烟草专卖局 优质雪茄外包皮烟开发及应用研究项目(110200201012)。 作者简介 时向东(1966-),男,河南南阳人,博士,副研究员,从事烟草栽培生理及烟草发育生物学研究。 收稿日期 2006 05 29光对甜椒不同品种光合特性影响的研究中指出:作物在弱光下,光合速率降低,呼吸速率也降低,但干物质积累能保持相对稳定。 近些年研究表明:作物对外界高、低光强适应是依靠调节光合酶和光系统组分实现的。 2.1 RUBP羧化酶 R UB PCa se初始活性与光合速率密切相关,在很多情况下是光合过程中一个重要的限速因子。随光强减弱,单位叶面积可溶性蛋白的含量降低,R UBP羧化酶的活性急剧下降,并且其活性下降的速率远远大于可溶性蛋白的降解速率。Ha tc h[10]观察玉米C2循环中几个酶对不同光强的反应时发现RUBP羧化酶活性却不受光强的影响。在高光强下,烯醇式磷酸丙酮酸脱氢酶及磷酸激酶的活性提高了5~10倍,磷酸甘油醛脱氢酶、腺苷激酶、焦磷酸酶的活性变化不大,仅比对照提高2倍。 2.2 光组分的调节 光组分的调节主要反映在叶片的荧光部分,叶片低温荧光光谱686和740nm附近有2个主要发射峰,相对荧光产量分别用F686和F740表示,而F686/F740比值可以反映激发能在光系统之间的分配情况。眭晓蕾[9]在弱光对不同品种甜椒光合特性影响的研究中指出:随着光强减弱,甜椒的F686/F740比值先下降后上升,分析原因,这可能与弱光下PSII的捕光色素蛋白复合体含量增加,扩大了PSI I的光吸收截面有关。戈巧英等[11]研究认为:作物对弱光的适应性是以消耗更多结构物质用于扩大光能接受面积,增加光系统组分的含量,增加原初光能转化效率等方式获得。 在不同的光强下,蛋白质含量存在着显著差别,其中所含的捕光蛋白L HCP含量和D1蛋白含量也存在着差别,这是限定作物光合传递电子速率的内在因素。 3 不同光强对作物内源激素的影响 光强能影响IA A的运输方向,引起IA A的不对称分布。最近研究表明,I AA含量和IA A运输系统对于遮阳作物的伸长生长起重要作用。光敏素调控茎的伸长是通过调节I AA 水平而起作用的[12]。富含远红光成分的光能使I AA运输方向改变,I AA运输方向的改变是通过特定的I AA载体蛋白或IA A载体蛋白调控因子的激活而实现的。遮阳条件下苗下胚轴I AA横向运输增加,致使在维管系统中运输减少,因而运到根的I AA减少,侧根形成的少,主根生长慢。I AA分布的改变也抑制子叶的生长和叶片的扩展[13]。赤霉素主要对 安徽农业科学,Jou rnal of Anh ui Agri.S ci.2006,34(17):4216-4218 责任编辑 孙红忠 责任校对 孙红忠
综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取 （一）柠檬酸发酵 一、实验原理 柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羧生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。但就柠檬酸产生菌而言，由于其顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式： 2 C6H12O6 + 3 O2→2 C6H8O7 + 4 H2O 国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。 二、实验器材 （一）材料 1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等 （二）主要仪器设备 1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等 三、操作步骤 1．种子培养基制备： 马铃薯培养基配方:(1000ml) 马铃薯（去皮）200g 葡萄糖（或蔗糖）20g 琼脂15~25g 水1000ml 自然pH 2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。 3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。 4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，7水合硫酸镁0.025%。 5. 上罐灭菌（操作同实验一） 5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、200r/min条件下发酵4天。 6.分别在0，24，48，72，96小时测定一下参数。 四、实验结果 1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。 2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。 3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。 总反应式：2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O 180 192 理论转化率=192/180=106.7%
目录 摘要.................................................................................................................................................. I Abstract ......................................................................................................................................... III 目录................................................................................................................................................ V 1.前言. (1) 1.1赤潮的发生及其危害 (1) 1.2海洋环境中的氮组成及营养盐结构特征 (3) 1.2.1 海洋环境中氮的来源、组成和分布 (5) 1.2.2 海洋环境中营养盐结构的变化趋势 (6) 1.3藻细胞对不同氮源的利用能力 (5) 1.3.1氮对海洋浮游植物的影响 (5) 1.3.2 浮游植物对无机氮的吸收和利用 (6) 1.3.3 浮游植物对有机氮的吸收和利用 (7) 1.4本研究内容、目的与意义 (9) 2典型海域氮营养盐结构特征 (10) 2.1 样品的采集与分析 (11) 2.1.1 采样点的设置 (11) 2.1.2 样品的采集 (14) 2.1.3 理化因子的测定 (15) 2.1.4 营养盐的测定 (15) 2.1.5 尿素的测定 (15) 2.1.6 统计与数据分析 (16) 2.2 结果与分析 (16) 2.2.1 大亚湾 (16) 2.2.2 桂山岛 (28) 2.2.3 广海湾 (33) 2.3讨论 (39) 2.4小结 (41)
柠檬酸液态发酵及提取工艺综述 摘要:发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。国内目前有很多人研究了MgCl2、普鲁兰酶、植酸钠、磷浓度、菌种、木薯原料、纤维素糖化液、玉米粉淀粉混合原料、接种量和碳氮比、溶解氧、发酵罐搅拌系统、尿素、乙醇等添加剂、初始含糖量、温度、pH、发酵时间等等对黑曲霉发酵产酸的影响，从而改良提取工艺。 关键词：柠檬酸液态发酵提取工艺 一、前言 柠檬酸(citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2-hydroxy propane-1，2，3-triearboxylic acid)是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。分子式：C6H8O7（相对分子质量：192.13），无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大；从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。 二、柠檬酸液态发酵 1、柠檬酸发酵机理 柠檬酸循环(citric acid cycle)又称三羧酸循环[5］(tricarboxylic acid cycle)，克雷
柠檬酸生产工艺介绍 摘要：柠檬酸应用广泛，在食品、医药等方面都占有重要位置。制取所用材料价格低廉，条件要求适中，且采用的深层发酵法具有普遍、经济的特点。 关键词：柠檬酸发酵 1.柠檬酸简介 柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸。柠檬酸是无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，无臭，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有后涩味。柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，它在植物体内常与酒石酸、苹果酸、草酸等有机酸共存，在动物组织中柠檬酸以游离状态或以金属盐的形式存在。商品柠檬酸主要有一水化合物和无水物。 柠檬酸用途极其广泛，在食品工业广泛用于酸味剂、增溶剂、抗氧化剂、缓冲剂、除腥脱臭剂等。在其他工业中，可作金属净化剂、去垢剂、分散剂、电镀缓冲剂和配位剂、胶粘剂，并可用于治理工业废气、废水、回收金属等。在药物中可产生泡腾，使药物中活性配料迅速溶解并提高味觉能力。 制取柠檬酸可以从水果中提取、化学合成法和生物发酵。其中发酵是最常用和最有经济价值的方法。 2.柠檬酸发酵菌种及原材料。 2.1菌种及原材料 柠檬酸发酵工艺中，具有工业生产价值的微生物有黑曲霉、棒曲霉、文氏曲霉、芬曲霉、丁烯二酸曲霉、橘青霉、解脂假丝酵母等，其中黑曲霉和文氏曲霉在深层液态发酵生产柠檬酸最具有商品竞争优势。 凡能通过微生物代谢而产生柠檬酸的物质，都可以作为柠檬酸的发酵原料。如乙醇、木质素、纤维素、淀粉、蔗糖、乳糖、正烷烃和脂肪等。黑曲霉生产菌可以在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜等多种培养基中生长、产酸，而且产量在微生物中最高。 2.2黑曲霉 在米曲汁或麦芽汁培养基上菌丝白色，不是绒球状，凸起。边缘整齐，菌落较小，带皱折。在麦芽汁培养基上生长4d成熟的孢子呈黑褐色。在察氏培养基上生长较慢，菌落边缘整齐，分生孢子梗短，分生孢子着生较密。菌丝顶端着生稀疏的大型的黑褐色孢子德，成熟后呈开花状而崩裂。分生孢子是串珠状着生，黑褐色，表面粗糙且有明显的刺状突起，4.7-5.2μm，成熟后遇振动易散落。黑曲霉具有多种活力较强的酶系，能利用淀粉质物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。所以黑曲霉可以边生长、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。 3.设备 发酵生产过程中主要的设备有发酵罐、种母罐、抽滤桶、脱色柱、结晶锅、浓缩锅等。 其中发酵罐是用来对微生物进行发酵之用，罐中有搅拌浆，罐身有传感器，用来控制发酵中各条件的变化。种母罐用来串培养种母醪。抽虑桶采用真空和加压过滤，用于固液分离。 4.柠檬酸深层液态发酵工艺 4.1工艺流程：培菌--发酵--中和--酸解--浓缩结晶 原料粉碎培养基制备实罐液化原始菌种环境空气 实罐灭菌试管斜面过滤 麸取菌种空气机
柠檬酸的发酵生产及应用
柠檬酸的发酵生产及应用 摘要：主要讲述柠檬酸的性质及其在各个方面的应用，应用价值和它的发酵生产过程，以及现在在我国的发展和未来趋势。 关键词：性质生产微生物三羧酸循环 柠檬酸是一种重要的有机酸，又名枸橼酸，无色晶体，常含一分子结晶水，无臭，有很强的酸味，易溶于水。其钙盐在冷水中比热水中易溶解，此性质常用来鉴定和分离柠檬酸。结晶时控制适宜的温度可获得无水柠檬酸。在工业，食品业，化妆业等具有极多的用途。1784年C.W.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸。他是通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州、意大利和西印度群岛。 1柠檬酸的物化性质及应用 1.1物理性质 在室温下，柠檬酸为无色半透明晶体或白色颗粒或白色结晶性粉末，无臭、味极酸，在潮湿的空气中微有潮解性。它可以以无水合物或者一水合物的形式存在：柠檬酸从热水中结晶时，生成无水合物；在冷水中结晶则生成一水合物。加热到78 °C时一水合物会分解得到无水合物。在15摄氏度时，柠檬酸也可在无水乙醇中溶解。柠檬酸结晶形态因结晶条件不同而不同，有无水柠檬酸C6H8O7也有含结晶水的柠檬酸2C6H8O7.H2O、C6H8O7.H2O或C6H8O7.2H2O。 1.2 化学性质 从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质。加热至175 °C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 1.3 主要用途 1.3.1 用于食品工业 因为柠檬酸有温和爽快的酸味，普遍用于各种饮料、汽水、葡萄酒、糖果、点心、饼干、
黑曲霉发酵生产柠檬酸 柠檬酸（citric acid ）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 807·H 2O,相对分子质量为210.14。另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8O 7，相对分子质量192.13。柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles 公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。 能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger ）、文氏曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。 本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。 5.3.1 柠檬酸发酵 1、 实验目的 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。 2、实验原理 黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP ）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO 2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A ，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的ɑ-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄型”,代谢流汇集于柠檬酸处,使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为: O H O H C O O H C 27862612625.1+→+ 柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。 3、实验装置材料与流程 （1） 实验装置与材料 ① 实验装置 旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min ）。 ② 菌种 黑曲霉（Asp.niger ）柠檬酸生产菌株Co8-27。 ③ 材料 麸皮、马铃薯 、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。 ④ 器皿 15mL 试管、100mL 三角瓶、2000mL 烧杯、500mL 三角瓶、离心管若干。 ⑤ 试剂 0.1429mol/L NaOH 、1%酚酞试剂、斐林甲、乙溶液、0.01%标准葡萄糖溶液。 （2） 试剂
实验五黑曲霉发酵生产柠檬酸 柠檬酸(citric acid)又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2一hydroxy propane-1，2，3一triearboxylic acid)。商品柠檬酸 有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 8 O 7 ·H 2 O，相对分子 质量为210.14。另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8 O 7 ，相对分子质量 192.13。柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、 医药、化工、化妆品、清洗(洗涤)、建筑等工业部门。其中食品和饮料业占56％，清洗(洗涤剂)业占20％，医药和化妆品占11％，其他工业占13％。 1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。．1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。 能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。最具商业竞争优势的是采用黑曲霉、文氏曲霉和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。 本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体(摇瓶)发酵产生柠檬酸。柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性炭脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP－98版标准的无水或一水柠檬酸。 一、实验目的 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及中间分析方法。 二、实验原理 黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）和HMP途径转变为丙酮酸； 丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO 2 ，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的α－酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为： C 6H 12 O 6 +1.5O 2 C 6 H 8 O 7 +2H 2 O 柠檬酸理论得率为106.7％，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7％。
我国发酵工业的发展现状和发展趋势 陆光兴 （山东农业大学生命科学学院生物工程 08级一班） 摘要：发酵工业是指人们利用微生物的发酵作用，运用一些技术手段控制发酵过程，大规模生产发酵产品的一门传统工业。至今，我国已形成了一个品种繁多，门类较齐全，具有相当规模的独立工业体系，在国民经济中占有重要地位，其产品应用覆盖医药、卫生、轻工、化工、农业、能源、环保等诸多行业，某些产品如味精、柠檬酸年总产量已跃居世界首位。【1】关键词：我国发酵工业现状趋势问题意见 很早以前，人们就利用发酵技术来生产产品，直到近代才发现发酵是由微生物引起的。发酵工业自20世纪60年代以来迅猛发展，所涵盖的产品也从原来的抗生素、食品等几个方面渗透到人民生活的各方面如医药、保健、农业、环境、能源、材料等。发酵工业是一种以高科技含量为特征的新型工业，近年来特别是20世纪90年代以来，行业的迅速发展已经使其在食品工业中占有重要地位。发酵工业的迅速发展不仅带动了相关行业的发展，而且对节约粮食、增加食品花色品种、提高产品质量及改善环境等，发挥了重要作用。【2】 1.我国发酵发展的历史 我国传统发酵历史悠久，在《黄帝内经素向》、《汤液醪醴论》里，已有酿酒的记载。白酒的起源，当在元朝以前，尚待考证。酱油的酿造，当始自周朝。在汉武帝时代开始有了葡萄酒，距今已有两千多年的历史。 然而数千年来由于科学技术进步缓慢，各种微生物工业也未能充分发展。由于历史的原因，我国直到20世纪中期才建立了一系列新的微生物工业。改革开放促进了社会经济和科学技术的迅速发展，发酵工业这门新兴产业得到了重视，自“六五计划“开始，在中央和地方的科技发展计划中占了一定份额，经过几个五年计划的科技攻关，产、学、研的技术力量紧密结合，获得了一批重大科研成果，不仅使原有的传统工艺得到技术改造，还发展了一批具有现代生物技术特征的新产品，使发酵工业进入了一个新的发展阶段。【3】 2.我国发酵工业的现状 我国生物化工行业经过长期发展，已有一定基础。特别是改革开放以后，生物化工的发展进入了一个崭新的阶段。目前生物化工产品也涉及医药、保健、农药、食品与饲料、有机酸等各个方面。 “十五”期间我国发酵工业产值比“九五”末增长58.5%，产品产量增长102%，出口创汇增长67.5%。进入“十一五”以来，在国家产业政策的指导下，随着科技创新和技术进步的推进，科技推广应用和产业化步伐的加快，发酵产业产品空间进一步拓展、产业链不断延伸，发展前景更加广阔。据协会统计，2000~2008年发酵产业产品产量从260万吨增长到1300万吨左右，年均增长率达到22.4%，2008年主要产品出口额约34亿美元，同比增长36.6%，显示出强大的活力。味精、柠檬酸、山梨醇的产量均居世界第一，淀粉糖的产量在美国之后，居世界第二位。产品结构方面，以味精为代表的老一代发酵产品在行业中的比重逐步下降，其发展速度保持在年均增长12.0%，2008年占全部发酵产品产量的14.2%；而淀粉糖（醇）则异军突起，2000年~2008年年均增长达到33.6%，其在整个发酵产品中的比例也逐年增高，2008年占全部发酵产品产量的54.3%。目前淀粉糖（醇）已不再简单地被看做是食糖市场的一个有效补充，它的一些产品特性决定了其在改善人民生活质量、提高生活水平方面发挥出更加突出的作用。这使得它的消费领域不断扩大，消费数量迅速增长，从而为推动食品工业的发展和促进以生物科技带动农业产业化发展作出了重要贡献。【4】 我国发酵工业的巨大发展不仅在于产量的巨大提升，更在于发酵技术和发酵工艺的巨大进步。当前发酵技术进步主要表现为1．技术经济指标有明显提高；2．工艺技术有重大改
柠檬酸发酵 【实验目的】 1. 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。 2. 了解并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况； 【实验原理】黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化生成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。 【实验用品】1. 实验主要仪器摇床；离心机；超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；分析天平；蒸发器；分光光度计；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡液(A 液：1％结晶紫95％酒精溶液：B 液：1％草酸铵溶液。取A液20mL，B 液80mL混合，静置48 小时后使用 2. 材料菌种黑曲霉 【方法步骤】1.柠檬酸发酵菌种培养基1升（蔗糖合成培养基：蔗糖140g， NH4NO3 2g， KH2PO4 2g， MgO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g， MnSO4.4H2O 0.02g，麦芽汁20ml，用水定溶至1000ml）分装、灭菌。 1.4 接种活化的黑曲霉孢子（约0.5%）接种入培养基中，在33-36℃，200-300r/min的摇床中20h左右，培养后菌体浓度应达60万～150万/ml，菌丝球为致密形的，菌球直径不应超过0.1mm，菌丝短，且粗壮，分支少，瘤状，部分膨胀为优。注：进行下一步操作前应用显微镜检测菌球的生长状况，若菌丝细长则说明黑曲霉已经提前进入柠檬酸发酵时期，会导致后期的柠檬酸产量降低。 发酵过程检测 2.4.1 还原糖、柠檬酸的检测发酵0、24、48、72h分别各取下两瓶检测还原糖（残糖）、柠檬酸含量，以观察发酵过程中黑曲霉的耗糖与柠檬酸的生成速率；2.4.2 pH 值的检测每隔12 小时检查pH 值。 2.4.3 黑曲霉菌丝形态的观察每隔12 小时镜检黑曲霉菌丝的形态变化。 【检测方法】1、黑曲霉镜检直接取一滴发酵液于载玻片上，用盖玻片密封后镜检。2、pH 的跟踪测定：pH 试纸。3、还原糖（残糖）的测定糖度计。