第1章引言
生化技术重要理论
蛋白质提取分离技术
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
1．蛋白质的分离纯化
1.1蛋白质（包括酶）的提取
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
1.1.1水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
(1) pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
(2) 盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
1.1.2有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
1.2 蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
1.2 .1. 根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1.2.1.1蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
1.2.1.2 等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
1.2.1.3低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
1.2.2 根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1.2.2.1 透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的膜截留不同分子量的蛋白质。
1.2.2.2 凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
1.2.3根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1.2.3.1电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
1.2.3.2 离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。
1.2.4 根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
1.3细胞的破碎
1.3.1 高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
1.3.2玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
1.3.3超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。
1.3.4反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
1.3.5 化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
1.4浓缩、干燥及保存
1.4.1 样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：
燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然
后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。
1.4.3贮存
生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点：
1.4.3.1.样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。
1.4.3.
2.一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
1.4.3.3.贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。
2.柱层析技术
2.1概述
柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同蛋白组分逐一分离。
根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离蛋白质的经典层析技术。
在利用柱层析技术分离提取蛋白质的过程中，主要有以下几个方面的流程。
2.1.1 柱层析操作方法的选择
目前，柱色谱分离的操作方式，主要包括常压分离、减压分离和加压分离3种模式。常压分离是最简单的分离模式方便、简单，但是洗脱时间长。减压分离尽管能节省填料的使用量，但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发，并且有时在柱子外面会有水汽凝结，以及有些易分解的化合物也难以得到，而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。加压分离可以加快淋洗剂的流动速度，缩短样品的洗脱时间，是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗液更快洗脱。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵等。
2.1.2 柱子规格的选择
市场上有各种规格的柱层析分离柱。柱子长了，相应的塔板数就高，分离就好。目前市场上的柱子，其径高比一般在1: 5～10范围，在实际使用时，填料量一般是样品量的30～40倍，具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。如果所需组分和杂质的分离度较大，就可以减少填料量，使用内径相对较小的柱子(如2 cm × 20 cm的柱子) ;如果Rf相差不到0.1，就要加大柱子，增加填料量，比如用3 cm内径的柱子。
2.1.3 装柱
柱层析色谱柱的填装主要有湿法和干法两种，湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂，否则会被淋洗剂带到淋洗液中，可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。干法和湿法装柱没什么实质性差别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该有适度的紧密(太密了淋洗剂流速太慢) ，并且一定要均匀，不然样品就会从一侧斜着流动。同时柱中不能有大气泡，大多数情况下有些小气泡没太大的影响，因为只要加压气泡就可消失。但是柱子更忌讳的是开裂，开裂会影响分离效果，甚至报废。
2.1.4 溶剂的选择
选择一个合适的溶剂系统是柱层析分离的关键。在选用柱层析洗脱剂时首先要考虑三个方面的因素:溶解性( Solubil2ity)、亲合性(Affinity)和分离度(Res oluti on)。溶剂应选择价廉、安全、环保的，可以考虑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷价格较高，乙醚很易挥发，二氯甲烷和甲醇与硅胶的吸附是一个放热过程，易使柱子产生气泡。其他的溶剂用的相对较少，要依不同需要选择。另外值得一提的是，由于我们进行的是痕量分析，淋洗剂的纯度必须关注，一般使用农药残留级或HPLC级的，如果是分析纯的必须进行精制。同时溶剂在过柱后最好回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费。
2.1.5 上样
用少量的溶剂溶解样品加样，加完后将底端的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶解样品的溶剂和样品层有一段距离(2～4 cm) ，再加压，这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。很多样品在上柱前粘性较大，上样后在柱上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为填料对样品的吸附饱和所致。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂(比如DMF，DMSO等)又不能上柱，这样就必须用干法上柱了。
2.1.6 淋洗液的收集和浓缩
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出，这时可以采用氧化铝作固定相。柱层析后的淋洗液，由于使用了较多的溶剂，必须进行浓缩，如果待测物具有一定的挥发性，最好使用常压挥发溶剂，否则易导致检测结果偏低。
2.2 离子交换层析
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
2.2.1. 预处理及装柱：对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。
2.2.2. 加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。
洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH 的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1＝A2时为线性梯度，当A1＞A2时为凹形梯度，A1＞A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。
2.2.
3. 洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
2.2.4. 离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl 淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些产品建立用0.02％叠氮钠。
2.2.5. 离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。
2.3 凝胶过滤
凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。
2.3.1. 凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
2.3.2. 柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
2.3.3. 凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将
湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
2.3.4. 加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2.样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。
2.3.5. 凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。
如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。
2.3.6. 凝胶层析的应用
2.3.6.1脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
2.3.6.2 用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
2.3.6.3 测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的的分子量。
2.3.6.4 高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液
3.电泳技术
电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。在生物学中，主要是指带电荷的蛋白质或核酸分子在电场中移动的现象。
3.1 电泳的分类：
目前所采用的电泳方法，大致可分为3类：显微电泳，自由界面电泳和区带电泳。区带电泳应用最为广泛，可分为以下几种类型：
3.1.1按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为：
3.1.1.1滤纸为支持物的纸电泳
3.1.1.2 粉末电泳：如纤维素粉，淀粉，玻璃粉电泳
3.1.1.3 凝胶电泳：如琼脂，琼脂糖，硅胶，淀粉胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.1.1.4 缘线电泳：如尼龙丝，人造丝电泳
3.1.2 按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：
3.1.3 平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式
3.1.4垂直板电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳
3.1.5 柱状(管状)电泳:：聚丙烯酰胺凝胶可灌入适当的电泳管中做成管状电泳
3.1.3 按pH的连续性不同，区带电泳可分为：
3.1.3.1 连续pH电泳：如纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳
3.1.3.2非连续pH电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳
3.2 电泳所需的仪器
电泳所需的仪器有：电泳槽和电泳仪。
3.2.1. 电泳槽
电泳槽是电泳系统的核心部分，根据电泳的原理，电泳支持物都是放在两个缓冲液之间，电场通过电泳支持物连接两个缓冲液，不同电泳采用不同的电泳槽.常用的电泳槽有圆盘电泳槽、垂直板电泳槽、水平电泳槽。
3.2.2 电泳仪
要使荷电的生物大分子在电场中泳动，必须加电场，且电泳的分辨率和电泳速度与电泳时的电参数密切相关。不同的电泳技术需要不同的电压，电流和功率范围，所以选择电源主要根据电泳技术的需要。.
3.3电泳技术的应用
3.3.1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质纯度的鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳同时具有电荷效应和分子筛效应，可以将分子大小相同而带不同数量电荷的物质分离开，并且还可以将带相同数量电荷而分子大小不同的物质分离开。其分辨率远远高于一般层析方法和电泳方法，可以检出10-9～10-12g的样品，且重复性好,没有电渗作用。
3.3.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白质分子量。其原理是带大量电荷的SDS结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷/质比。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功，此法测定时间短，分辨率高，所需样品量极少(1～100μg)，但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质，某些蛋白质不易与SDS结合如木瓜蛋白酶，核糖核酸酶等，此时测定结果就不准确。
3.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于蛋白质定量。电泳后的凝胶经凝胶扫描仪扫描，从而给出定量的结果。凝胶扫描仪主要用于对样品单向电泳后的区带和双向电泳后的斑点进行扫描。
3.3.4 琼脂或琼脂糖凝胶免疫电泳可用于①检查蛋白质制剂的纯度；②分析蛋白质混合物的组分；③研究抗血清制剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体；④检验两种抗原是否相同。
3.4 电泳后结果检测
对于不同的目的，应采用不同的检测方法。用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法。
3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
作用：用于蛋白质与寡糖核苷酸的分离。
作用原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它具有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS 结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
第2章实验准备
2.1引言
本实验需用到的试剂，所以根据其需要及要求进行相关实验试剂配制准备。
2.2仪器及材料
2.2.1仪器：柱层析系统（层析柱，恒流泵，紫外监测仪，部分收集器），Sigma高速冷冻离心机，722s 分光光度计，透析袋，水浴锅，电泳仪，电泳槽，紫外凝胶成像系统。
2.2.2材料：新鲜鸡蛋。
2.2.3试剂：（1）弱酸性阳离子交换树脂；（2）磷酸氢二钠；（3）磷酸二氢钠；（4）氯化钠；（5）硫酸铵；（6）氢氧化钠；（7）甘油；（8）盐酸；（9）葡聚糖凝胶G-50；（10）溶壁微球菌干粉；（11）考马斯亮蓝G-250；（12）95%乙醇；（13）85%磷酸；（14）牛血清清蛋白(BSA)；（15）脲；（16）丙烯酰胺（Acr）；（17）甲叉双丙烯酰胺（Bis）；（18）四甲基乙二胺（TEMED）；（19）甘氨酸(Gly)；（20）过硫酸铵（AP）；（21）考马斯亮蓝R-250；(22)三羟甲基氨基甲烷（Tris）；（23）2-β-巯基乙醇；（24）十二烷基磺酸钠（SDS）；（25）溴酚蓝；（26）冰醋酸；（27）标准蛋白：SDS-低相对分子质量标准蛋白.
2.3方法
(1) 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；【配置成5*500ml，临用前稀释】
(2) 2mol/L NaOH；200ml
(3) 2mol/L HCl；200ml
(4) 含50%甘油的0.1mol/L 磷酸盐缓冲液，pH 7.0；200ml
(5) 含0.05mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml
(6) 含0.5 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml
(7) 含0.1 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】
(8) 测活缓冲液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；
(9) 底物溶液Ⅰ：40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中；【公用，临用前配置】
(10) 考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷
酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤；【公用】
(11) 标准蛋白质溶液：用0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液；（100ml）
(12) 底物溶液Ⅱ：300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中；【公用，临用前配置】
(13) 10mol/L 脲，测活缓冲液配制；【50ml】
(14) 30%胶贮液：每100mL中含丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g；【100ml公用】
(15) 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8；【100ml公用】
(16) 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8；【100ml公用】
(17) 10%（W/V）过硫酸铵；【现用现配】
(18) SDS电泳缓冲液：25mmol/L Tris，0.192mol/L Gly，0.1%（W/V）SDS；【500ml】
(19) 10%（W/V）SDS；【10ml】
(20) 染色液：0.2g考马斯亮蓝R-250，42mL工业酒精，10mL冰醋酸，加蒸馏水至100mL；【50ml】
(21) 脱色液：5mL冰醋酸，45mL工业酒精，50mL蒸馏水；【100ml】
(22) 保存液：7%冰醋酸；(现用现配)
(23) 2×上样缓冲液：【公用，10ml】
0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 2mL
甘油2mL
SDS 0.4g
0.1%溴酚蓝0.5mL
2-β-巯基乙醇0.5mL
蒸馏水 2.5mL
第3章酶的提取
3.1引言
离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交
换程度不同而进行分离纯化的。离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。本实验分离溶菌酶采用732型弱酸性阳离子交换树脂。
盐析，中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶。当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶解中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO42-和NH4+）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之失水，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析是若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。溶菌酶在32%硫酸铵盐浓度下的沉淀最多，最适宜作为盐析液浓度。经盐析得到的沉淀为溶菌酶的粗制品。
3.2内容及步骤
（一）样品的制备：
新鲜鸡蛋两个个，破蛋壳取出蛋清，加入蛋清体积1.5倍的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0），搅拌均匀，并调pH7.0（NaOH调pH），然后用八层纱布过滤，留取上清液，量取体积并记录，留0.4mL 上清液（定为Ⅰ步骤样品）并加入0.4mL甘油-20℃冻存备用。
（二）阳离子交换层析
1.阳离子交换柱的再生：50g阳离子交换树脂用2mol/L NaOH浸泡30min，水洗至中性，再用2mol/L 盐酸浸泡30min，水洗至中性。
2.平衡：在烧杯中将再生好的阳离子交换树脂用0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0平衡。
3.吸附：在已平衡好的阳离子交换树脂中加入蛋清样品，搅拌吸附1h（玻璃棒搅拌）。
4.洗涤：倒去其余上清液，树脂用100mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤3遍。
5.装柱：将树脂搅拌均匀装入离子交换柱，再用300mL 含0.05mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤杂蛋白。（装柱前，先检查层析柱是否干净，保证所有接头密闭、管道通畅；装柱时，流速不超过3mL/min，全过程绝对不能出现流干现象）。
6.洗脱：用300mL含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH
7.0以3mL/min的流速进行洗脱，合并光吸收高峰管，量取体积并记录，留0.4mL上清液并加入0.4mL甘油，-20℃冻存备用（定为Ⅱ步骤样品）
洗脱层析结果图：
（三）硫酸铵沉淀
每100mL上清液中缓慢加入35g硫酸铵固体，溶解后静置30min，10000rpm离心10min，沉淀用0.5mL左右含0.1mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0溶解，留0.05mL上清液并加入0.05mL甘油，-20℃冻存备用（定为Ⅲ步骤样品）。
第4章酶的纯化
4.1引言
凝胶层析又称分子筛过滤，是一种物理的分离纯化手段，它是依据样品中各组分间分子大小的差异设计的。凝胶层析的填料溶胀后是具有立体网状结构的球形惰性凝胶颗粒，颗粒的表面和内部形成很多孔穴，且孔穴直径较一致。若样品中各组分的分子大小不同，样品进入凝胶层析柱后，各个组分向凝胶颗粒的孔穴内扩散，能否进入孔穴内部取决于孔穴的大小和组分分子的大小。比孔穴孔径大的分子不能进入孔穴内部，完全被排阻在孔穴之外，只能沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，随流动相向下流动，它们在柱内迁移的路径短，停留时间短，保留值小，所以迁移率最快，
首先从柱中流出；一般可选用Sephadex G-25和Sephadex G-50型号的凝胶，对于实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离（分级分离），一般选用排阻限度略大与样品中最高分子量物质的凝胶。凝胶层析中一般样品体积不大于凝胶总床体积的5%-10%。样品浓度和分配系数无关，故样品浓度可以提高，但样品与洗脱液的相对浓度不得超过1.5-2。
4.2方法
1.分子筛层析
(1)溶胀：取葡聚糖凝胶G-50 3g，加60mL蒸馏水沸水浴中煮沸2h，充分溶胀后的凝胶以倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，如此反复洗涤2～3次，最后加入等体积含0.1mol/L NaCl的pH7.0磷酸缓冲液备用。
(2)装柱：将凝胶悬浮液搅拌均匀后一次连续性倾入柱中，控制流速≦15mL/h，自然沉降（注意：绝对不能出现“流干”现象，不能有气泡和分层，胶面一定要平整）。
(3)平衡：用含0.1mol/L NaCl的pH7.0磷酸缓冲液平衡两个柱体积，控制流速≦15mL/h。
(4)上样：将溶解后的硫酸铵沉淀样品10000rpm离心3min后上样，当样品进入胶面后，再用平衡缓冲液约0.5mL洗管壁和胶面3次（注意：绝对不能出现“流干”现象和破坏胶面的平整性。）。
(5).洗脱：用含0.1mol/L NaCl的pH7.0磷酸缓冲液洗脱，控制流速≦15mL/h，自动部分收集器收集，2mL/管，紫外监测仪检测洗脱峰或比色法测定洗脱峰。合并光吸收及酶活高峰管。
2.透析浓缩
用含50%甘油的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0透析浓缩4h，-20℃分装保存备用（定为Ⅳ步骤样品）。
洗脱层析结果图：
第5章酶活力、蛋白浓度测定
5.1引言
酶活力是指酶催化一定的化学反应的能力。规定1个酶活单位（IU）是指在特定的条件下，在1分钟内能够转化1微摩尔底物的酶量或是转化底物中1微摩尔有关基团的酶量。酶活力的测定方法有终止法测定酶活力和连续法测定酶活力。
本实验即运用连续记录其吸光度变化的连续法测定酶活力。
棕红色的染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，形成蓝色复合物，最大吸光度值由465变为595nm，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白和染料的结合符合比尔定律，通过测定595nm处的吸光度值的增加量可对蛋白质浓度进行定量测定。
溶菌酶是一种N-乙酰胞壁质肽聚糖水解酶，可以催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，使细菌溶解。本实验以溶壁微球菌为底物，通过测量细菌悬液浊度的变化来测定溶菌酶的活性。
5.2仪器及试剂
仪器：722s分光光度计
试剂：测活缓冲液；底物溶液Ⅰ；考马斯亮蓝G-250试剂；准蛋白质溶液.
5.3方法：
5.3.1.蛋白浓度的测定
(1)标准曲线的制定
绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
(2)测定未知样品蛋白质浓度
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计
算出未知样品的蛋白浓度（mg/ml）。
5.3.2酶活力测定
5.4实验结果
活力单位（U ）：酶在室温，pH6.2条件下，A595nm 每分钟降低0.001为一个活力单位U 。
比活力=活力单位/mg 蛋白 b kx y += 001.0k U =
%100x 第一次总活性每次总活性回收率=
第一次比活性每次比活性
纯化倍数=
根据测得结果，计算出各步数据填入下表：
第6章 酶促动力学（Km 测定、酶的抑制）
6.1引言
酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km 值等于酶促反应速度为最大速度的一半时所对应的底物浓度，其数值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特性常数。不同酶的Km 值不同，同一种酶在与不同的底物反应时，其Km 值也不同。Km 反映了酶和底物亲和能力的强弱程度。大多数纯酶的Km 值在0.01-100mmol/L 之间。
酶的活力可以被某些物质激活或抑制，凡能降低酶的活性甚至使酶失活的物质，称为酶的抑制剂，酶的活力抑制有可逆抑制和不可逆抑制两种。而可逆的抑制又包括有竞争性抑制和非竞争性抑制等类型，在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质发生改变，如Km 、Vm 等。通过实验的方法，可以确定出抑制类型。
6.2仪器及试剂
仪器：722s 分光光度计
试剂：测活缓冲液；底物溶液Ⅱ；抑制剂。
6.3方法
1.底物浓度的影响（Km 值的测定）
以1/[S]对1/[V]作图。
][][S Km S Vm V +=
Vm S Vm Km V 1][11+= Km 1=0.578，
Vm 1=0.5197
2.脲的抑制 取6个试管，按下表加样;
以1/[S]对1/[V]作图，与底物影响之双倒数图对照比较，推出抑制类型。
Km
2=1.071 Vm
2
=0.0789
6.4 结论
1.列出Km值测定的实验数据，并用双倒数法作图，推导计算出结果。
2.列出脲抑制的实验数据，在求Km值的双倒数图上，画出其曲线，得出抑制类型。
Km1 < Km2 Vm1 > Vm2
由此分析知：此抑制类型为混合非竞争性抑制
第7章SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测酶相对
分子量及纯度鉴定
7.1引言
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
SDS－PAGE 是在要走电泳的样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质－SDS复合物上带有大量的负电荷，消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率），并对各自分子量的对数（log Mr）作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率），通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要
的。
仪器和材料
仪器：电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统
试剂：30%胶贮液；1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8；0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8；10%过硫酸铵；SDS电泳缓冲液；10%SDS；染色液；脱色液；保存液；2×上样缓冲液。
7.2方法
1.配制15%的分离胶
(1)用胶框封好玻璃板后架好胶板。
(2)按如下比例配好分离胶，混合后立即加入到电泳槽两玻璃板之间到上口约2cm止，再加约1ml蒸馏水水封，聚合后将水吸干。
混合后立即加到分离胶上，加入梳子。聚合后装好电泳缓冲液后小心拔出梳子。
3.样品制备
样品与2×上样缓冲液1:1混匀，并在100℃水浴中保温3-5min，取出待用。
4.上样、电泳
将样品和标准蛋白加到样品孔中，加样量每孔10uL，加好后开始电泳，先恒压80V，样品进入分离胶后恒压120V，直到溴酚蓝走至距前沿1cm为止。
5.染色
电泳完毕，剥胶前先将凝胶在前沿处作一标记区别正反面后再将凝胶浸泡于染色液中染色2h.
6.脱色
用脱色液脱至区带清晰为止。
7.3 .结果
条带依次是四号样、三号样、标样、二号样、一号样。
7.4结论
染料距离8.3cm 样品迁移2.8cm 根据上图公式得酶的相对分子量为13.89KDa.
体育保健学实验指导 实验一人体一日需热量测定 一、实验目的 通过本实验使学生学会运用活动观察计算的基本方法，学会运用对人体一日需热量进行测定的基本方法。 二、实验原理 应用由直接或间接测热法所取得的人体各项热能消耗的数据，计算其实际活动的热能消耗，详细观察记录人体一天(24h)中，各项活动的内容和时间(以min计)，然后归类相加，将全天各项活动的热能消耗量相加，再乘以体重或体表面积，即得出人体一天活动的热能消耗量。在此基础上再加上l 0％的食物特殊动力作用所消耗的热能，就是人体一天的需热量。 三、实验器材 人体各项活动热能消耗数据表格资料，计算工具。 四、实验步骤 （一）查找各项活动或动作的单位热能消耗值(KJ/m2/min、Kcal/m2/min)。（1 Kcal=4.184 KJ）（二）记录人体一天身体各项活动内容的名称及其所占用的时间，计算各项活动或动作的热能消耗值，登记在实验报告的相应栏目内。 （三）合计1日（1440 min）单位体表面积消耗的热量D (KJ/m2、Kcal/m2)。 （四）计算人的体表面积（m2）=0.0061身高(cm)+0.0128体重(kg)-0.1529。 （五）计算身体1日内各项活动的耗热总和E（也可用其它方法计算，如体重）。 E =D×体表面积 （六）计算受试者食物特殊动力作用耗热量H H＝E.×l0％ （七）受试者身体一日需热量S(KJ/d、 Kcal/d) S＝E十H 一般情况下，成年人每天的基础代谢需求量在1500 Kcal以上。成年男子每千克体重1小时的基础代谢为4185 KJ，或每一平方米体表面积1小时的基础代谢为167 KJ。女性比男性约低5%，老年人比成年人约低10%。基础代谢可有10%—15%的波动。 五、注意事项 （一）记录一昼夜活动内容时间应计满24h(1440 min)。 （二）记录中对查表查不到的活动项目，在选靠近似活动项目时，选靠应恰当，合理。（三）影响计算结果准确性的非计算性问题：如查表中，看错行或串行，其活动的耗热 量与活动项目不对应；抄录数据时，计错数字中小数点的位置，都会造成计算结果有较 大出入，特别要注意热能单位的换算。 六、实验作业要求 按步骤完成实验，记录、计算并完成实验报告。 实验二体质测试与健康检查 一、实验目的 通过本实验的设计与测量，学会对人体形态结构、生理功能、心理因素的基本评价指标的测定，学会如何初步评价体质与健康。通过本实验的设计与测量，学会采用常规指标对人体运动过程中的机能反应进行监控和评价。 二、实验原理
心肺功能 1，心肺功能是人体心脏泵血及肺部吸入氧气的能力，而两者的能力又直接影响全身器官及肌肉的活动，故此十分重要。 2，心肺运动试验(Cardiopulmonary Exercise Testing,CPX)是目前国际上普遍使用的衡量人体呼吸和循环机能水平的肺功能检查之一，它可用于功能性运动容量的评价、疾病的诊断及判断治疗。 台阶测试 男台阶高度为30cm，女台阶高度是25cm，根据男女身高的不同，台阶还可做适当的调整。测试可按下列步骤进行： 1，测试时找一个同伴，他将帮助你保持适当的踏跳节奏。节奏为每分钟踏30次（上下），共3分钟，你可以让同伴用节拍器或声音提示你。因此，你需要2秒钟上、下各踏一次（也就是说，把节拍器设置为每分钟60拍，每响一下踏一次）。在测试时你应左右腿轮换做，每次上下台阶后上体和双腿必须伸直，不能屈膝。 2，测试后，你应立即坐下，并测量运动后1分钟至1分30秒、2分钟至2分30秒、3分钟至3分30秒等3个恢复期的心率。 你的同伴帮助你计时，并记录运动后心跳次数。测试的准确性在于你必须每分钟踏完30次，这样运动后恢复期内的心跳频率测量才是有效的。自评量表2-3可以记录你运动后心跳频率的次数和心肺功能适应情况。评定指数计算公式如下： 评定指数=登台阶运动持续时间（S）×100/2×（恢复期3次心率之和）。 例如一位男性评定指数为52.5次，他的心肺功能适应能力属于较差（即2分）。 三分钟台阶测试的评定指数 适应能力等级男女 1分（差） 45.0～48.5 44.6～48.5 2分（较差） 48.6～53.5 48.6～53.2 3分（一般） 53.6～62.4 53.3～62.4 4分（较强） 62.5～70.8 62.5～70.2 5分（强）＞70.9 ＞70.3 如何评价心肺功能适应 当完成了心肺功能适应测试后，你应对自己的测试结果作出评价，并确立提高自己心肺功能适应的目标。与同年龄段的其他人相比，如果你的心肺功能适应能力被列在“1分”或“2分”等级中，说明你目前的心肺功能适应水平低于平均水平，属于差或较差；如果你被列在“4分”等级中，那么你的心肺功能适应水平就高于同性别、同年龄段人的平均水平，属于较强；“5分”等级是指你的心肺功能适应水平位于同年龄组前15%的人，属于强者。然而，不管你目前心肺功能适应状况如何，你应坚持有规律的身体锻炼来提高自己这方面的适应能力。
微机原理与接口技术实验报告 班级：自动化（铁道信号） 姓名： ***** 学号： 1121**** 授课教师：福恩
目录 1.实验一 (3) 2. 实验二 (8) 3.实验三 (13) 4.实验四 (22) 5.实验五 (26) 6.实验六 (33) 7.参考文献 (38)
实验一交通灯控制实验 一.实验目的 通过应用接口技术设计十字路口、复杂路口交通灯控制系统，学会应用“微机原理与接口技术”课程所学的X86汇编语言和接口技术掌握可编程并行接口芯片的硬件设计、软件编程，实现十字路口交通灯的模拟控制并思考计算机如何应用在各种控制系统中。 （1）掌握利用X86汇编语言技巧 （2）掌握X86微处理器与可编程并行接口芯片8255A硬件电路设计 （3）熟悉模拟交通灯控制的实现方法并思考如何应用在实际中。 二.实验容 设计一个交通控制系统，该控制系统工作后，交通灯按照如下规律变化： （1）南北路口的绿灯、东西路口的红灯同时亮3秒左右。 （2）南北路口的黄灯闪烁若干次，同时东西路口的红灯继续亮。 （3）南北路口的红、东西路口的绿灯同时亮3秒。 （4）南北路口的红灯继续亮、同时东西路口的黄灯亮闪烁若干次。 （5）返回（1）依次循环。 三．实验电路 如下图，L7、L6、L5作为南北路口的交通灯与PC7、PC6、PC5相连，L2、L1、L0作为东西路口的交通灯与PC2、PC1、PC0相连。编程使六个灯按交通灯变化规律燃灭。 8255动态分配地址: 控制寄存器：0EC0BH A口地址： 0EC08H C口地址： 0EC0AH
红黄绿红黄绿 图1-1 交通灯实验电路图四．程序流程图 五．源程序 CODE SEGMENT ASSUME CS:CODE ;********************************** 工作状态控制字设置 START: MOV DX,0EC0BH ;写控制端口，地址0EC0BH MOV AL,10010000B ;C口方式0输出 OUT DX,AL
一、实验目的与要求 1．掌握测试不同废水的色度、浊度、COD、电导、pH等水质指标的分析方法。 2．增强对污染物综合分析能力。 3．根据废水水质选择所用的混凝剂、吸附剂类型；根据实验结果计算出所选混凝剂、吸附剂对废水的去除效率。 4．对废水的进一步治理提出可行性治理方案。 二、实验内容 1．根据高锰酸钾法测定废水的COD，利用pH酸度计，光电浊度计，色带，色度计分别测定pH值、浊度、色度，并预习实验内容，进行实验准备。 2．按照自己所取锅炉排污水、洗衣废水或其他废水的水质特点，自己设计实验方案。 3．针对某一废水，实验比较后确定自己认为合适的处理流程。确定每种处理流程最佳投药量、pH值、搅拌速度及其他操作条件。给出治理结果。 4．处理结果达不到排放标准或回用标准的提出进一步治理方案。 三、实验原理 由于胶粒带电，将极性水分子吸引到它的周围形成一层水化膜，水化膜同样能阻止胶粒间相互接触。因此胶体微粒不能相互聚结而长期保持稳定的分散状态。投加混凝剂能提供大量的正离子，可以压缩双电层，降低ζ电位，静电斥力减少，水化作用减弱；混凝剂水解后形成的高分子物质或直接加入水中的高分子物质一般具有链状结构，在胶粒与胶粒之间起吸附架桥作用，也有沉淀捕作用。这样投加了混凝剂之后，胶体颗粒脱稳后相互聚结，逐渐变成大的絮凝体后沉淀。 活性炭吸附就是利用活性炭的固体表面对水中一种或多种物质的吸附作用，以达到净化水质的目的。活性炭的吸附作用产生于两个方面，一是由于活性炭内部分子在各个方向都受着同等大小的力而在表面的分子则受到不平衡的力，这就是其他分子吸附于其表面上，此为物理吸附；另一个是由于活性炭与被吸附物质之间的化学作用，此为化学吸附。活性炭的吸附是上述两种吸附综合作用的结果。 离子交换或臭氧氧化属于深度净化，可以有效降低废水中的含盐量、COD、色度等。强酸H交换器失效后，必须用强酸进行再生，可以用HCl，也可以用H2SO4。相对来说，由于HCl再生时不会有沉淀物析出，所以操作比较简单。再生浓度一般为2%~4%，再生流速一般为5m/h左右。强碱OH交换树脂再生液浓度一般为1%~3%，流速≤5m/h。GB1 45— 9水汽质量标准规定一级复床出水水质为：电导率≤5?S/cm。混床出水残留的含盐量在1.0mg/L以下，电导率在0.2S/cm以下，残留的SiO2在20?g/L以下，pH值接近中性。
工程流体力学 实验报告 学院：交通运输工程学院 班级：交通设备1206 姓名：邱瑞玢 学号：1104120907
雷诺数测定实验 【实验目的】 1. 观察水的层流和紊流的形态及特征； 2. 学习测量和计算流体的雷诺数和临界雷诺数。 【实验原理】 雷诺数是流体惯性力 L υ ρ2 与黏性力 L v 2 μ的比值，它是一个无因次化的量。 R e =μρVl =l l V l V 22 )/(2 μρ 雷诺说较小时，粘滞力对流场的影响大于惯性力，流场中流速的扰动会因粘滞力而衰减，流体流动稳定，为层流；反之，若雷诺数较大时，惯性力对流场的影响大于粘滞力，流体流动较不稳定，流速的微小变化容易发展、增强，形成紊乱、不规则的紊流流场。 【实验内容】 1. 缓慢调节水量控制阀，观察透明水管中红色水流线的变化。观察水的层流态、紊流态的 特征。 2. 找出层流和紊流转换临界点，在临界点测量水的流速，往复测量三次。 3. 根据测量数据计算出水的临界雷诺数。 【实验现象】 1. 当水流流速较低时，水管中水流处于层流状态，示踪剂（红色墨水）呈线状，无分散； 2. 逐渐开大控制阀，水流速度加大，呈线状流动的红色墨水开始出现波动，逐渐散开，这 时水流处于过渡状态； 3. 再开大控制阀，水流速度继续增大，红色墨水消失，此时水流处于紊流状态。
层流状态 紊流状态 【实验结果】 项目组别时间（s）水量（mL) 流量（mL/s) 流量均值120120060220110055320125062.51306002023070023.33 30720 24 从层流到紊流 从紊流到层流59.1 22.4 实验中，水流束的特征长度l=D=3CM,流速由公式D 2 π4q v V = 求得，得到 V1=0.032m/s,V2=0.084m/s ，而水在标准大气压，室温时的动力粘度 s p 10 000.1a -3 ×?=μ，则雷诺数 R e1 =μ ρVD =960 R e2 =μ ρVD =2520 【结果分析】 查阅资料可知一般管道雷诺数Re ＜2000为层流状态，Re ＞4000为紊流状态，Re ＝2000～4000为过渡状态。而本次实验所测得的紊流状态下的雷诺数比理论值小，产生误差的原因为： 1. 偶然误差：观察出现偏差，将水流处于由层流向紊流的过渡状态当作紊流状态，从而测 得的水流速度偏小，造成所计算的雷诺数偏小。 2. 系统误差：示踪剂（红色墨水）很容易在水中扩散，当处于过渡状态时，由于水流开始 产生搅动，从而将红色墨水打散，扩散在水中，造成水流已处于紊流状态的假象，导致
台阶试验指数 台阶试验指数是反映人体心血管系统机能状况的重要指数。台阶试验指数值越大，则反映心血管系统的机能水平越高，反之亦然。不过具体情况还要视被测人的身高、体重和肺活量而定。 经常参加有氧代谢运动，可以提高心血管系统的机能水平，其表现为在完成台阶试验定量负荷工作时脉搏搏动次数下降，在试验结束后脉搏的搏动次数恢复到安静状态所用的时间缩短，台阶试验指数增高。 有氧代谢运动是指运动时人体需氧量和摄氧量达到动态平衡的运动。做有氧运动时，休内不产生乳酸堆积，心率和呼吸保持在稳定的状态，因而持续运动时间长，安全性高，脂肪消耗多，有利于改善心血管系统的功能。 台阶测验：男生使用高40厘米台阶（或凳子），女生采用高35厘米的台阶（或凳子）做踏台上下运动。测验前测定安静时的脉搏，然后受试者做轻度的准备活动，主要是活动下肢关节。上下台阶（或凳子）的频率是30次／分，节拍器的节律为120次／分。 受试者按节拍器的节律完成试验，被测试者从预备姿势开始，分四步完成动作。 第一步，被测试者一只脚踏在台阶 第二步，踏台腿伸直成台上站立 第三步，先踏台的脚下先下地 第四步，还原成预备姿势 用2秒上下一次的速度（按节拍器的节律来做）连续做3分钟，做完后立刻坐在椅子上测量运动结束后的1分钟至1分半钟、2分钟至2分半钟、3分钟至3分半钟的3次脉搏数。并用下列公式求得评定指数，计算结果包含有小数的，对小数点后的1位进行四舍五入取整进行评分。 评定指数＝〔踏台上下运动的持续时间（秒）*100〕/〔2*（3次测定脉搏的和）〕 大学男生各测试项目评分标准中，台阶试验67以上优秀、53-65良好、46-52及格、45以下不及格 大学女生各测试项目评分标准中，台阶试验60以上优秀、49-59良好、42-48及格、41以下不及格 注意事项 心血管疾病患者，不得进行此项测试.
单片机原理及其接口技术实验指导书 实验1 Keil C51的使用（汇编语言） 一.实验目的： 初步掌握Keil C51（汇编语言）和ZY15MCU12BD型综合单片机实验箱的操作和使用，能够输入和运行简单的程序。 二.实验设备： ZY15MCU12BD型综合单片机实验箱一台、具有一个RS232串行口并安装Keil C51的计算机一台。 三.实验原理及环境： 在计算机上已安装Keil C51软件。这个软件既可以与硬件（ZY15MCU12BD型综合单片机实验箱）连接，在硬件（单片机）上运行程序；也可以不与硬件连接，仅在计算机上以虚拟仿真的方法运行程序。如果程序有对硬件的驱动，就需要与硬件连接；如果没有硬件动作，仅有软件操作，就可以使用虚拟仿真。 四：实验内容： 1.掌握软件的开发过程： 1）建立一个工程项目选择芯片确定选项。 2）加入C 源文件或汇编源文件。 3）用项目管理器生成各种应用文件。 4）检查并修改源文件中的错误。 5）编译连接通过后进行软件模拟仿真。 6）编译连接通过后进行硬件仿真。 2.按以上步骤实现在P1.0输出一个频率为1Hz的方波。 3.在2的基础上，实现同时在P1.0和P1.1上各输出一个频率同为1Hz但电平状态相反的方波。 五：程序清单： ORG 0000H AGAIN：CPL P1.0 MOV R0，#10 ;延时0.5秒 LOOP1：MOV R1，#100 LOOP2：MOV R2，#250 DJNZ R2，$ DJNZ R1，LOOP2 DJNZ R0，LOOP1 SJMP AGAIN END 六：实验步骤： 1.建立一个工程项目选择芯片确定选项 如图1-1所示：①Project→②New Project→③输入工程名test→④保存工程文件（鼠标点击保存按钮）
湖南科技大学测控技术与仪器专业专业综合实验报告 姓名 学号 成绩 湖南科技大学机电工程学院 二0—三年 ^一月 ^一日目录 一、液压泵站综合控制实验 3 （一）实验目的 3 （二）实验内容 3 二、液压实验台PLC控制实验 4 （一）实验目的 4 （二）实验内容 4 —振动测试与故障诊断综合实验（ 一） 一）实验目的 5 二）实验内容 5 四．振动测试与故障诊断综合实验（二）（一）实验目的 6 （二）实验内容 6 五．基于虚拟仪器的自动控制原理综合实验（一）实验目的7 （二）实验内容7 六．基于虚拟仪器的传感器综合实验8 （一）实验目的8 （二）实验内容8 七．地震仪器综合设计9 （一）实验目的9 （二）实验内容9 八．电法仪器综合设计10 （一）实验目的10 （二）实验内容10 九、实验心得11 一、液压泵站综合控制实验 （一）实验目的 了解液压控制的装置，熟悉PLC编程，并且了解 置的原理并且用于实践生活中去。（二）实验内容 此实验是液压的测量实验用PLC处理器控制来实现，液压PLC综合控制实验室是我公 司根据高校机电一体化对气、电、液控制的教学大纲要求，在我公司专利产品YY-18透明 液压传动演示系统的基础上，综合了我公司气动PLC与液压PLC控制实验设备的优点，采 用了开放型综合实验台结构，广泛征求专家教授与老师的意见，经不断创新改进研制而成的。是目前集气动控制技术、液压传动控制技术以及PLC可编程序控制器控制技术于一体 的理想的综合性实验设备。实验时，它们可以相互辅成，交叉控制。可以让学生直观、感性地对比、了解气、电、液各自具有的特点、特色、及优缺点等。 信号采集电路原理设计： （1）前置放大电路要求有阻抗匹配设计（前置放大器采用集成运放OP07、 采用电压负反馈设计、增益为10、50 两档手动设计） （2）主放大器采用级联组合程控放大、增益动态范围为10 至1500 倍之内。 （增益程档位要求有30 至40 梯度之内，具体每档增益值不做具体要求但要求梯度 增益呈线性） （3）主放大器末端输出值（Up-p）设计为5v，如有溢出则在设计说明中明。 PLC控制在工业领域的发展。理解液压装
体质测量 一、判断题 【√】1.需要研究的同质对象的全体称为总体。 【×】2.代表样本特征的统计指标称为参数。【统计量】 【√】3.代表总体特征的统计指标称为参数。 【×】4.标准差是反映数据资料集中趋势的指标。【统计P26】 【√】5.标准差决定正态分布的形态。 【√】6.在一定条件下可能发生可能不发生的现象称为随机现象。 【√】7.正态分布曲线以x=μ为对称轴，左右对称。 【√】8.正态分布曲线与，轴之间的面积为1。不同形态的正态分布曲线下的面积都为l。【√】9.变量间的影响和制约关系，可分为函数关系和相关关系。 【√】10.相关关系是变量间最常见的关系形式。 【×】11.变量间相关系数越大，表示相关关系越密切。【-1——+1】 【√】12.变异系数CV可以用于单位不同的两组数据离散程度的比较。 【×】13.使用百分位数量表的前提条件是资料应服从正态分布。 【√】14.评价量表是将实测数据（原始成绩）换算成分数的规则。 【×】15.实测数据（原始成绩）换算成分数的规则。称为测量量表。 【×】16.测量的实测值（X）、被测量的真值（T）和测量误差（E） 三者之间的关系是 T=X+E 【X=T+E】 【×】17.被测真值是只包含了很小的测量误差的测量值。 【×】18.离差法的基准值是中位数。 【√】19.标准分量表常用于多指标的综合评价。 【×】20.可靠性是表示测量结果的准确性程度的指标。 【×】21.有效性可以分为两种，即内容有效性和结构有效性。 【√】22.积差相关法可用于估价测量方法的可靠性和客观性。 【√】23.身高、体重的测量，-般在上午10时进行为宜。 【×】24.身体形态测量，受试者-律取直立姿势。 【×】25.测量肢体的长度和围度，测量者一般应站在受试者的左侧面。 【×】26.在未提出特定测量要求时，测I试者一般测量受试者的左侧肢体。 【√】27.肌肉和骨器的发达程度与脂肪积蓄程度是判定体型的主要依据。 【×】28.体育领域中，身体成分的测量主要是对人体脂肪成分的测量。 【×】29.上肢长是指手臂自然下垂时，肩峰点至挠骨点之间的直线距离。 【×】30.下肢长A在下肢长中是最长。 【×】31.下肢长A是指股骨大转子到地面的垂直距离。 【√】32.“小腿长+足高”是指大小腿屈曲90度时，腔骨点至凳面之间的垂直距离。【√】33.力量型运动员瘦体重的增加表明力量增强。 【√】34.循环机能的三态反应测量，是指在相对安静状态、定量负荷状态和最大负荷状态下的机能反应测量 【√】35.定量负荷试验，是目前普遍使用的测量评价心血管耐力的最有效方法。【×】36.哈佛台阶试验指数越小越好。 【√】37.最大摄氧量是测定有氧耐力的重要指标。 【√】38.克兰普顿测量可以测量心血管机能。 【×】39.侧跳是反映感觉机能的测量方法。【灵敏 p203】 【√】40.30秒30次蹲起是一种测量心脏机能的简易方法。
分子生物学综合试验报告
综合实验Ⅰ.Southern杂交 （质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、 地高辛标记的Southern杂交） 一.实验目的 1.学习Southern杂交的原理及操作方法。 2.学习碱裂解法提取质粒的原理。 3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。 4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 二.实验原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。 PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。 地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 三．实验准备 1.实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基 2.实验试剂： Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M
实验二哈佛台阶试验 【目的】 通过本实验，使学生掌握哈佛台阶实验的测验和评价方法。 【原理】 一般情况下，心率随运动负荷的增加而逐渐增加。当停止运动后，心率恢复到安静水平需要一段时间。恢复时间的长短与身体机能有很大的关系，机能良好则运动后心率恢复快，哈佛指数就大。 【器材】 台阶(50m和42m高)、秒表、听诊器、节拍器等。 【方法与步骤】 一、受试者上下台阶 受试者以每分钟30次的频率上下一定高度的台阶(男子50cm，女子42cm)，持续运动5min。如果中途有连续20s不能跟上节奏，则令其停止运动，并记录运动时间。 二、测运动后第2、3、5min前30s的心率 三、计算指数有两种方法 完全形式哈佛台阶指数： 哈佛指数=t/ (f1+f2+f3) x 1/2x100 简单哈佛台阶指数： 哈佛指数=t/ (f1 x 5.5) x 100 其中，t为上下台阶时间（秒S）；f1、f2、f3分别为恢复期第2、3、|5min
前30s心率。 四、评定 指数越大表示机能越好（表10-1）。 表10-1 哈佛台阶试验心血管机能评定 【注意事项】 一、心脏功能不良者，不宜进行该试验。 二、测试当天不宜进行剧烈运动。 三、正式测试前，可让受试者练习几次登台阶，以适应节奏。 四、一上一下为登台阶一次（双脚4步为一次） 五、登台阶时，身体和和两膝关节要充分伸直，双脚可轮流上台阶，但不 许跳跃，下台阶时不可用足尖站立。运动完成后让受试者坐在邻近的椅子上。
实验报告 实验二哈佛(Harvard)台阶试验 姓名＿＿＿＿＿年级＿班＿＿年＿月＿日 考核成绩及评语： 教师签名＿＿ ＿＿年＿月＿日
计算机组成原理与接口技术 课程设计实验报告 学院：计算机科学与工程 专业：计算机科学与技术 班级：计科二班 学号： 姓名： 指导老师： 评分： 2016年12月28日
实验一验证74LS181运算和逻辑功能 1、实验目的 （1）掌握算术逻辑单元（ALU）的工作原理； （2）熟悉简单运算器的数据传送通路； （3）画出逻辑电路图及布出美观整齐的接线图； （4）验证4位运算功能发生器(74LS181)组合功能。 2、实验原理 ALU能进行多种算术运算和逻辑运算。4位ALU-74LS181能进行16种算术运算和逻辑运算。 74ls181芯片介绍： 该芯片总共由22个引脚，其中包括8个数据 输入端（~A0、~A1、~A2、~A3，~B0、~B1、~B2、 ~B3，其中八个输入端中A3和B3是高位），这八 个都是低电平有效。还包括S0、S1、S2、S3这四 个控制端，这四个控制端主要控制两个四位输入 数据的运算，例如加、减、与、或。CN端处理进 入芯片前进位值，M控制芯片的运算方式，包括 算术运算和逻辑运算。F0、F1、F2、F3是四个二 进制输出端，以一个四位二进制形式输出运算的 结果。CN4记录运算后的进位。
3、实验内容 实验电路图：
4、总结及心得体会 本实验通过一个设计一个简单的运算器，使我熟悉了Multisim软件的一些基本操作方法，并掌握了一些简单的电路设计与分析的能力，并对我做下一个运算器的实验有一定的帮助。因为是之前实验课做过的实验，再次做起来过程比较流畅，没有遇到什么大的问题，实验的测试结果与预期的一致。 该芯片总共由22个引脚，其中包括8个数据输入端（~A0、~A1、~A2、~A3，~B0、~B1、~B2、~B3，其中八个输入端中A3和B3是高位），这八个都是低电平有效。还包括S0、S1、S2、S3这四个控制端，这四个控制端主要控制两个四位输入数据的运算，例如加、减、与、或。CN端处理进入芯片前进位值，M控制芯片的运算方式，包括算术运算和逻辑运算。F0、F1、F2、F3是四个二进制输出端，以一个四位二进制形式输出运算的结果。CN4记录运算后的进位。其中AEQB、~P和~G这三个端口与本实验无关，所以这里不做额外介绍。
广州大学化学化工学院 本科学生综合性实验报告 实验课程基础合成实验A1 实验项目磺胺药物的合成 专业化学教育班级1班学号1105100065 姓名彭兰真 指导教师及职称陈国术刘天穗 开课学期2012 至2013 学年二学期 2013年5月30日
磺胺药物的合成研究 姓名：彭兰真 指导老师：陈国术、刘天穗 单位：化学化工学院11化师 摘要：对氨基苯磺酰胺（又称磺胺），是医药磺胺药物的中间体，也是除草剂磺草灵的中间体。磺胺是磺胺药物中结构最简单的具有抗菌活性的化合物。本实 验项目以硝基苯为原料，经还原、乙酰化、氯磺酰化和氨解、水解等常规反应，合成了一系列的中间体和磺胺。通过熔点的测定、红外光谱（IR）来鉴定其化学结构和纯度。 关键词：对氨基苯磺酰胺对甲基苯磺酸抗菌活性红外光谱（IR）Abstract：Para amino benzene sulfonamide (also called SN), is a pharmaceutical sulfonamide drug intermediates,is also the sulfonated grass herbicides of intermediates.Sulfonamide is the simplest of sulfonamide structure that has the antibacterial activity of the compounds.This experiment compound a series of intermediates and sulfanilamide by nitrobenzene as raw materials, via reduction, acylation, sulfonyl chloride conventional reactions such as acylation, hydrolysis and ammonia solution. To identify the chemical structure and purity by melting point determination, IR spectrum (IR). Keywords：p-anilinesulfonamide 4-Toluene sulfonic acid antibacterial activity IR
新疆农业大学机械交通学院 实习（实验）报告纸 班级：机制072 学号： 073731234 姓名：唐伟 课程名称：微机原理及接口技术实习（实验）名称: DEBUG软件的使用 实验时间: 6.22 指导教师签字：成绩： —、实验目的 1．学习DEBUG软件的基本使用方法。 2．掌握8088／8086的寻址方式。 3．掌握数据传送、算术运算逻辑运算等类指令的基本操作。 二、实验内容与步骤 实验内容： 修改并调试以下程序，使之完成30000H开始的内存单元中存入31个先自然递增然后有自然递减的数据（00H~0F~00H）的功能。程序从CS:0100H开始存放。调试完成后程序命名为PCS.EXE并存盘。 实验步骤： （1）用A命令输入程序； （2）用反汇编U命令显示程序及目标码； 存盘程序命令为PCS1.EXE；
三、思考题 1．EXE文件程序的第一条可执行指令的IP等于多少? 答：EXE文件程序的第一条可执行指令的IP等于0010 。 2．在DEBUG环境下显示的程序和数字是什么形式?标号又是什么形式? 答: DEBUG把所有数据都作为字节序列处理。因此它可以读任何类型的文件。DEB UG可以识别两种数据: 十六进制数据和ASCⅡ码字符。它的显示格式是各个字节的十六进制值以及值在32与126之间的字节的相应ASCⅡ码字符。DEBUG总是用四位十六进制数表示地址。用两位数表示十六进制数据。不支持标号。 3．试述本次实验中你学会的DEBUG命令？ 答：本次试验我学会了汇编命令（A命令）、．反汇编命令(U命令)、显示当前环境和寄存器内容（R命令、以十六进制和ASCII码形式显示内存单元内容（D命令）
湖南科技大学测控技术和仪器专业 专业综合实验报告 班级 09测控三班 姓名 学号 指导老师付国红王启明 成绩 湖南科技大学机电工程学院 二〇一三年一月五日 目录 一、液压泵站综合控制实验 (3) （一）实验目的 (3) （二）实验内容 (3) 二、液压实验台PLC控制实验 (4) （一）实验目的 (4) （二）实验内容 (4) 三、物探仪器综合设计（①地震超前探测仪）................................. .... . (5) （一）实验目的 (5) （二）实验内容 (5) 四、物探仪器综合设计（②电法勘探仪器）............................ ........... .. (6) （一）实验目的 (6)
（二）实验内容 (6) 五、实验心得................................................................................... ..... .. (7) 一、液压泵站综合控制实验 （一）实验目的 了解液压控制的装置，熟悉PLC编程，并且了解PLC控制在工业领域的发展。理解液压装置的原理并且用于实践生活中去。 （二）实验内容 此实验是液压的测量实验用PLC处理器控制来实现，液压PLC综合控制实验室是我公司根据高校机电一体化对气、电、液控制的教学大纲要求，在我公司专利产品YY-18透明液压传动演示系统的基础上，综合了我公司气动PLC和液压PLC控制实验设备的优点，采用了开放型综合实验台结构，广泛征求专家教授和老师的意见，经不断创新改进研制而成的。是目前集气动控制技术、液压传动控制技术以及PLC可编程序控制器控制技术于一体的理想的综合性实验设备。实验时，它们可以相互辅成，交叉控制。可以让学生直观、感性地对比、了解气、电、液各自具有的特点、特色、及优缺点等。信号采集电路原理设计： (1) 前置放大电路要求有阻抗匹配设计(前置放大器采用集成运放OP07、 采用电压负反馈设计、增益为10、50两档手动设计) (2) 主放大器采用级联组合程控放大、增益动态范围为10至1500倍之内。 （增益程档位要求有30至40梯度之内，具体每档增益值不做具体要求 但要求梯度增益呈线性） (3) 主放大器末端输出值(Up-p)设计为5v，如有溢出则在设计说明中明。 (4) 调理电路中要有工频滤波器设计。 液压实验元件均为透明有机材料制成，透明直观。便于了解掌握几十种常用液压元件的结构、性能及用途。掌握几十种基本实验回路的工作过程及原理。实验时，组装实验回路快捷、方便。同时，配备独立的继电器控制单元进行电气控制，简单实用。通过和PLC比较，，可以加深对PLC可编程序控制器的了解及掌握。 本实验系统采用专用独立液压实验泵站，配直流电机无级调速系统，而且电机速度控制系统内部具有安全限速功能，可以对输出的最高速度进行限制。同时配有数字式高精度转速表，实时测量泵电机组的转速。并且配有油路压力调定功能，可以调定输出压力油的安全工作压力。泵站配有多路压力油输出及回油，可同时对多路液压回路进行供油回油。并采用闭锁式快速接头，以利于快速接通或封闭油路。实现油箱、油泵、直流
第四节 身体锻炼效果的自我评价 【教学目标】能够对身体锻炼效果进行客观、准确的自我评价。 一、对照评定法 对照评定法是把锻炼前后能够反映体质状况的内容与项目进行对比，观察身体锻炼对促进人体健康、增强体质效果的评定方法。要求锻炼者在每一阶段锻炼开始前，先测定本人体质指标作为评定的基础数据，在每一阶段结束后，重新进行一次测定，同测得的前期数据对照，进行评定。 下面介绍几种利用生理指数进行评定的方法。 （一）体重身高指数（又称“克托来指数”） 计算公式为：评价指数=体重（克）÷身高（厘米） 计算出的结果是无单位的绝对值。 评定标准：男子360，女子350为正常。若男子超过450、女子超过420为肥胖；低于300则为瘦弱。 （二）肺活量指数 计算公式为：评价指数=肺活量（毫升）÷体重（千克） 评定标准：男子为60，女子为50。若低于此标准的为呼吸功能较差。 （三）身高、胸围和体重指数 计算公式为：评价指数=身高（厘米）-〔体重（千克）+安静时的胸围（厘米）〕 评定标准：当指数为0～10时为健壮，指数为11～20时为发育良好，指数为26～35时为发育较弱，指数为35以上者为很差 。 （四）台阶试验指数（哈佛台阶试验指数） 计算公式为： 台阶运动持续时间（秒） 2×恢复期三次脉搏之和 评定标准：当指数为90以上为优，指数为80～90为良好，指数为65～79为中上，指数为55～64为中下，55以下为差。 此指数是检查评定心血管功能的指数。指数越大，说明心血管机能水平越高。哈佛台阶试验是一个反映心血管耐力的定量负荷试验。 测试方法：被测者以每分钟30次的频率上下台阶（男子台阶高45厘米，女子台阶高35厘米，连续做5分钟）。要求上下台阶腰伸直，左右腿交换上，若是测试者中途不支，即所持续的时间（以秒计），做完运动后的2、3、4分钟测其前30秒的脉搏，然后按公式计算其评定指数。 二、综合评定法 它是全面检查与评定体质状况和锻炼效果的一种方法。采用综合评定法评定锻炼效果时，主要从身体形态、机能、身体素质、精神状态、食欲、睡眠、对自然环境的适应能力、健康状况、克服疲劳的能力、思维活动、心理承受能力等多方面进行综合性评价。一般需要定量和定性分析相结合。如形态发育水平、心肺功能、呼吸系统机能、身体素质等可以用客观标准进行定量分析，但其他的内容只能用主观感觉和经验来判断、分析和评价。 ×100 评价指数 =
微机汇编程序及接口技术实验报告 汇编程序实验： 一、实验目的 1、熟悉汇编程序调试过程 2、掌握算术运算指令运用 3、掌握分支程序的编程和调试方法 二、实验设备 80X86微型计算机 三、实验内容 1、编程并调试显示“Hello Word!”字符串的汇编程序 TITLE HELLO DA TA SEGMENT STR DB'Hello World!$' DA TA ENDS CODE SEGMENT ASSUME DS:DATA,CS:CODE START:MOV AX,DATA MOV DS,AX MOV DX,OFFSET STR MOV AH,9H INT 21H MOV AH,4CH INT 21H CODE ENDS END START
2、A、B、C、D、W是互不相等的在数据段中定义的16位有符号数，并假设加减运算不产生溢出。编写一个完整段定义的汇编语言程序，计算W=(A+B)×（C—D）。 title asmprogram1_1 DA TA SEGMENT A DW 1H B DW 3H C DW 4H D DW 2H W DW 2 DUP(?) DA TA ENDS ; CODE SEGMENT ASSUME DS:DATA,CS:CODE START:MOV AX,DATA MOV DS,AX MOV AX,A ADD AX,B MOV BX,C SUB BX,D IMUL BX MOV W,AX MOV W+2,DX MOV AH,4CH INT 21H CODE ENDS END START
3、设X、Y为在数据段中定义的有符号字变量。编写一个完整段定义的汇编语言程序（包含必要的伪指令，给出必要的注释）完成以下操作：若0 HCNA实验手册 组名：一班一组 班级：网络安全一班 目录 实验一：HCNA 综合实验 (2) 实验目的： (2) 技术原理： (3) 实验拓扑： (3) 操作步骤： (4) 要求一: 内部客户端A属于VLAN 10，内部客户端B属于VLAN 20； (4) 要求二：内部三台交换机之间的双链路使用以太通道将链路聚合； (6) 要求三：内部三台交换机使用GVRP协议同步VLAN数据，内部三层交换机为SERVER角色； (9) 要求五: 边界两台路由器实现网关冗余，要求默认流量从边界路由器A向外传输；10要求六：内部路由使用OSPF协 (10) 要求七：分别映射两台WEB服务器的TCP 80端口至两台边界路由器的外部端口； (11) 要求八：不允许内部客户端A访问WEB服务器A；不允许内部客户端B访问WEB服务器的TCP 80端口。 (12) 基本配置九：ip地址的配置和一些vlan (13) 步骤七：测试 (15) 注意事项 (16) 实验：HCNA 综合实验 实验目的： 1 掌握hcna所学的所有技术的原理 2 掌握HCNA所学的所有技术的命令配置 1所使用的技术: vlan acl 三层技术 nat gvrp vrrp stp ip 技术原理： 1 vlan :虚拟局域网 2 acl：访问控制列表 3 三层技术：实验vlan间互通 4 nat :网络地址转换 5 gvrp：vlan 注册技术 6 vrrp : 虚拟路由冗余协议 7 stp :生成树 8 ip : 网际协议: 实验拓扑： 操作步骤： 要求一: 内部客户端A属于VLAN 10，内部客户端B属于VLAN 20； 1.内部客户端A属于VLAN 10 二层交换机 Sys SYSname 2SWA 1.2SWA 创建vlan vlan batch 10 interface Ethernet0/0/5 port link-type access port default vlan 10 interface Eth-Trunk1 port link-type trunk port trunk allow-pass vlan 2 to 4094 #实验报告hcna综合实验
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