细胞培养实验技术大全
第一章细胞培养的基本原理与技术
现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
第一节体外培养的概念
一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。
细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化
1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
第二节细胞培养的一般过程
一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。
二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则
直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。
原代培养一般有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。
四、冻存及复苏（可参阅后面有关章节）为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
五、常用仪器设备无菌室,超净工作台,三重纯水蒸馏器,抽气泵,压力蒸气消毒器,电热恒温培养箱,培养器具，CO2培养箱,恒温水浴锅,倒置显微镜,离心机,无菌过滤器,洗刷装置,细胞计数板和电子细胞技术仪等等。
第三节细胞培养的无菌环境
一、无菌室
无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。
无菌室的消毒和防污染：为保持无菌状态，经常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。
此外，还应注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间；等。
二、超净工作台
工作原理：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。
超净台的使用与保养：超净台的平均风速保持在0.32-0.48米/秒为宜，过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净台内紫外灯照射10－30分钟，然后让超净台预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台。
第四节常用培养器皿及清洗消毒
细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。
一、清洗离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残
留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。
（一）玻璃器皿的清洗一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤。
1、浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。
2、刷洗:将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。
3、浸酸:浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。放取器皿要小心。
4、冲洗:刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。
（二）橡胶制品清洗
新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。
（三）塑料制品的清洗
塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。
清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。
（四）包装:对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。
二、消毒和灭菌微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因
（一）物理消毒法
1、紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。
紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2米的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3小时，期间可间隔30分钟。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5米照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米，照射时间30分钟为宜。
紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。
2、高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。
不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它
具有条件简单、使用方便等特点。
3、高温干热消毒：干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90－120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。
干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。
烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。
4、过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。
（二）化学消毒：新洁而灭，其0.1％水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。
（三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。
可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。
第二章细胞培养液
现代生物技术均通过细胞作为载体来进行，无论是基因治疗、干细胞、克隆技术都在细胞内进行的。细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。
随着动物细胞大规模培养技术的迅速发展，作为细胞培养领域中最基本的原料－细胞培养基的用量也迅速增加，被广泛应用于细胞生物学科和医学研究的各个领域，如疫苗生产（人用疫苗如乙脑、狂犬、甲肝、乙肝、出血热、麻疹等，兽用疫苗如口蹄、马立克、伪狂犬等），基因药物生产（如EPO、TPA等），临床用单抗（如抗人肝癌单抗、抗人肺单抗、WT3）等。第一节水与平衡盐溶液
1、培养用水:体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。培养用水中如果含有一些杂质，即使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，甚至导致细胞死亡。用金属蒸馏器制备的蒸馏水，可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。最好用龙头瓶贮存，存放时间一般不应超过2周。
2、缓冲溶液、生理盐水、平衡盐溶液：稍后介绍。
第二节细胞培养基的基本要求
体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。
一、营养成分维持细胞生长的营养条件一般包括以下几个方面：
1、氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸。此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、
一磷酸酰苷所需要的基本物质。体外培养的各种培养基内都含有必需氨基酸。
2、单糖：培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。
体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。
3、维生素：主要扮演辅酶、辅基的角色，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。
4、无机离子与微量元素：细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。
二、促生长因子及激素已证实：各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。
三、渗透压细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg, 可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320mOsm/kg 左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260－320mOsm/kg的范围都适宜。
四、pH 气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体丰要是氧和二氧化碳。氧参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。一些细胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时，一般置细胞于95％空气加5％二氧化碳的混合气体环境中培养。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养基的pH有直接关系。动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，pH值约在7．2~7．4℃在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变
酸，PH值发生变化。由于NaHCO3容易分解为二氧化碳，很不稳定，致使缓冲系统难以精
确地控制。故这一缓冲系统适合密闭培养。HEPES结合碳酸氢钠使用，可提供更有效的缓冲体系，主要是防止pH值迅速变动，但最大缺点是在开放培养或观察时难以维持正常的pH
值。造成pH波动主要是代谢产生的CO2，在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。为解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO3-CO2缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2浓度（5％），与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。
五、无毒、无污染体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。
第三节天然细胞培养基
天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。
一、血清(serum)细胞培养的发展，培养基的质量又是关键，而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的，所以血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。保证血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。
1、血清种类:目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。
牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。
2、血清的主要成分:血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展，但仍存在一些问题。主要是：
第一:血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困难；
第二:血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制；
第三:不能排除血清中含有易变物质，这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。
3、血清主要作用：
提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。
提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。
提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。
提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。
对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重
要作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。
4、细胞培养中使用血清的缺点
血清成分复杂，虽含许多对细胞有利成分，也含有对细胞有害的成分，使血清有几个明显的缺点：
对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进
某些细胞的生长（成纤维细胞）同时抑制另一类细胞生长（表皮细胞）。
血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。
动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。
取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。
血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。
大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。
5、血清的质量标准:血清质量高低取决于两方面因素：一是取材对象，二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内，取材过程应严格按照操作规程执行，制备出的血清要经过严格的质量鉴定。WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求：
牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。
有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。
证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。
血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。
无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无细菌噬菌体污染。
对细胞有良好的支持繁殖作用。
我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。
血清质量的鉴定一般包括以下几个方面：
理化性质：如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（应小于20g/L)、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。
微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测，支原体是一种很小的微生物，可通过孔径22u的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响实验结果。检测支原体的方法很多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。
促生长效果：这是血清重要的特性之一，应当以培养的细胞来检测。有两种方法：克隆形成率、贴瓶率测定法和连续传代培养法。
(1)克隆形成率测定：一般以悬浮生长的细胞为培养对象，按有限稀释法做克隆化培养，将不同批号的血清配制成不同浓度的培养基，细胞也稀释成不同浓度，接种到96孔板，每孔200ul，培养一定时间，统计有克隆生长的孔，计算出百分比，再与对照的标准血清相比较，就可看出不同批号血清间的区别。比较低的浓度，更能观察出血清质量间的细微差别。(2)贴瓶率测定：是以贴壁细胞为培养对象，将细胞稀释至低密度，接种至平皿，每皿200或100个细胞，以不同浓度的血清培养基培养，培养一定时间后弃培养基，染色后统计集落数，计算出集落数占接种细胞数的百分比，同样再与标准血清比较，判断血清质量高低。
(3)连续传代培养法：是将细胞培养于3个一定体积的培养瓶中，待测血清配制为5％浓度，一般于第七天收集细胞，计数，取平均值，中间可以更换一次培养基。连续测试三个周期以
上，观察细胞生长状况，并将每次的计数结果与标准血清的测试结果比较。
对于使用者，判断血清质量先从外观入手。好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。如发现血清浑浊、不透明、含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质变性；若血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象；如果摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。如果要进一步了解血清的质量，则应连续培养某些细胞，观察细胞生长状况。
6、血清的使用与储存:正确的使用及保存血清，才能使血清发挥应有的作用。
使用前处理：大部分血清在使用前必须灭活处理，即56℃30分钟。灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，如生长因子，因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养，这样做的前提是确认血清中不含补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。
储存条件：血清一般储存于－20℃，同时应避免反复冻融。购买大包装的血清后，首先要灭活处理，然后分装成小包装，储存于－20℃，使用前融化。融化时最好现置于4℃。融化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快使用。
使用浓度：自从有了合成培养基，血清就是作为一种添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为5－20％，最常用是10％。过多血清容易使培养中的细胞发生变化，特别是一些二倍体的无限细胞系，迅速生长之后容易发生恶性转化。采购血清时，最好先从供应商处索取样品进行试验，选定一批后就要保留足够使用6个月至1年的量，直至用另一批经过预先试验的样品代替。
二、胚胎浸出液
胚胎浸出液(embryonic extract)是早期动物细胞培养中应用的天然培养基，现已很少使用。
三、水解乳蛋白水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，含有丰富的氨基酸，是常用的天然培养基，可用于许多细胞和原代细胞的培养。
第四节合成细胞培养基
合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。它有一定的配方，是一种理想的培养基。目前合成培养基多达10多余种，有的培养基仍在不断进行改良。早期组织培养是利用天然培养基，目前合成培养基已经成为一种标准化的商品，从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基，并且还在不断发展。合成培养基的出现极大的促进了组织培养技术的普及发展。
一、基本组分基本培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。
无机盐：CaCl2KCl MgSO4NaCl NaHCO3NaH2PO4。对调节细胞渗透压、某些酶的活性及
溶液的酸碱度都是必须的。
氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，对细胞的培养特别重要，能促进各种
氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷
酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中最好单独配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培养液中。
维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞
大鼠骨骼肌细胞培养 骨骼肌是一种横纹肌，通常是通过肌腱固定到骨骼上，其伸缩可以带动骨骼的移动，促进机体运动。 肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维，每一肌原纤维都有相间排列的粗肌丝及细肌丝。肌纤维收缩并不是肌纤维中肌丝本身的缩短或卷曲，而是细肌丝在粗肌丝之间滑行的结果，肌丝滑行使肌节长度缩短，肌原纤维缩短表现为肌纤维收缩。 体外培养大鼠骨骼肌细胞，为临床肌肉损伤的治疗提供理论依据. 一、实验前准备 实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。 按照含0.2%的XI胶原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的胶原酶进行配制消化液，用0.22微米的PES微孔滤膜进行过滤除菌，置于50毫升离心管中，可直接用于组织消化。瓶口消毒后室温待用。 取出无菌培养皿，分别作好标记，吸取适量PBS置于相应标记的培养皿中。 无菌条件下，准备好各种大小的眼科剪刀、止血钳、眼科镊子和手术刀。将断颈处死后浸泡于体积分数为 75%乙醇的SD大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。 二、骨骼肌提取 眼科剪刀剪开大鼠后肢皮肤，暴露腿部肌肉，用手术刀小心割取后肢大腿肌肉，同样方法分离另一后肢大腿肌肉。小心剪取表面无附着膜和脂肪组织的肌肉，置于装有PBS的无菌培养皿中。 吸取适量消化液于相应标记的培养皿中。 将剪取的骨骼肌在无菌PBS浸泡清洗，去除脂肪组织后放置于含消化液的培养皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌组织，成1平方毫米不规则碎片。 轻轻摇匀，室温静置消化30分钟 收集组织悬液于50毫升离心管中，用消化液反复冲洗培养皿，直至将全部组织块收集到离心管内。 轻轻吹打混匀组织块悬浮液。
细胞培养实验指导陈轶霞刘俊林
实验报告书写要求： 1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。 2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。 3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况） 实验一细胞培养实验室介绍及使用卫生要求 【目的与要求】 1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局 2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求 【基本原理】 细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。 【内容与方法】 1．通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况 2.使用卫生要求。 （1）实验室的消毒 实验室日常采用紫外灯消毒；按实验室的卫生管理要求对实验室洁净区按周期进行熏蒸消毒；在培养期间发生严重污染时要进行熏蒸消毒。 （2）培养工作开始操作前将所有培养用的物品经专用物流通道通过传递窗放进培养室，开紫外灯消毒30min，关紫外灯后方进入操作。配有空气净化系统的洁净室在风机开启至少30min后才能达到相应的洁净度级别。 （3）操作者进入培养室时要遵守的程序 a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。 b: 换穿无菌室专用鞋，进入更衣室，外衣挂到指定的衣柜里，用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂进行消毒，戴帽子（不露头发）、口罩（应包住胡须），穿已消毒的洁净服，进入缓冲室。再用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂消毒，在其滞留3min后进入培养室。 （4）开超净工作台10min，期间用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭操作台面后可开始具体的操作，同时点燃酒精灯用于临时性的火焰消毒。 （5）实验完毕，关闭超净工作台，及时清理实验用品，废物从通往物流通道的传递窗中传出。工作台面用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭消毒后方可出培养室。 （6）出培养室时，将工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔离鞋柜里，跨过隔离鞋柜，将用过的一次性帽子、口罩、鞋套等放到指定的废物桶，出实验室前用肥皂洗手，关闭空气净化系统，开紫外灯30min。 注：(不写实验报告)
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
植物生理学实验指导 Prepared on 24 November 2020
植物生理学实验指导
目录
植物材料的采集、处理与保存 植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料（如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等）和人工培养、选育的植物材料（如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等）两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料（如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等）和干材料（小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等）两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。 植物材料的采集和处理，是植物生理研究测定中的重要环节。在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对于如何正确地采集和处理样品却不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。因此，必须对样品的采集、处理与保存给予足够的重视。 一、原始样品及平均样品的采取、处理 植物生理研究测定结果的可靠性（或准确性），首先取决于试材对总体的代表性，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。所以，样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。目前，随着研究技术的不断发展，应该不断提高采样技术的水平。 在作物苗期的许多生理测定项目中都需要采集整株的试材样品，在作物中后期的一些生理测定项目中，如作物群体物质生产的研究，也需要采集整株的试材样品，有时虽然是测定植株的部分器官，但为了维持器官的正常生理状态，也需要进行整株采样。 除研究作物群体物质生产外，对于作物生理过程的研究来说，许多生理指标测定中的整株采样，也只是对地上部分的采样，没有必要连根采样，当然对根系的研究测定例外。采样时间因研究目的而不同，如按生育时期或某一特殊需要的时间进行。除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株应是能代表试验小区正常生育无损伤的健康植株。
细胞复苏 细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。 一、实验前准备 实验开始前，将无菌培养瓶，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。然后，采用通风机通风3min。以75%酒精擦拭操作台和双手。准备好冰盒。 将离心机调节至800rpm，5min。水浴箱调节至37度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。 消毒双手和超净台。取约10ml细胞完全培养基放于15ml离心管中。 实验前备冰盒，快速由液氮中取出冻存的细胞，置于冰盒内。然后迅速将冻存管投入到已经预热到37度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。 二、制备细胞悬液 以无菌枪头吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO的浓度，减轻细胞损伤。以封口膜封好管口。 配平离心：采用天平配平两端，800rpm，室温离心5min。 三、细胞计数 采用罗氏CASY-DT快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。加入10ml CASY-ton至以标记viable的管子中，加入100ul细胞悬液，颠倒混匀三次，可进行细胞计数。可见每毫升悬液中有活细胞2乘10的5次方. 四、细胞培养 离心后，吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。根据计数结果，向离心管内的细胞沉淀加入10ml细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液，吹打过程中尽量不要产生气泡。
细胞划痕 细胞划痕实验是指将细胞培养在培养皿或平板上，待细胞融合后用枪头或其他硬物在中央区域画一条线，这条线内的细胞被机械力去除掉了，然后将细胞继续培养，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况，来判断细胞的迁移能力。其意义在于：价格低廉，操作简单，还有很重要的一点在于细胞外围环境简单、单纯，容易控制，是肿瘤细胞最基本的研究方法。 一、实验前准备 实验开始前，将离心管、吸管筒、移液枪、枪头，直尺等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。然后，采用通风机通风3min。 取出无菌6孔板，用黑色记号笔在6孔板底部，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过3条线。每条黑线的上下缘与划痕交叉点作为观察点，这样一方面便于观察另一方面可以一次取多个观察点，最终可以获得多个数据。 画好横线后，在板上分别做好标记。 取下试剂瓶和离心管上的封口膜，且将每个试剂瓶和离心管拧松，方便后续试验的操作。 二、细胞准备 取出处于对数生长期的健康细胞，吸掉原来的培养液，用无菌PBS清洗细胞。加入1ml 胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入完全培养基终止消化。收集细胞悬液于15ml离心管中，800rpm/min室温离心5min。用罗氏CASY快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数，弃去上清，加入培养基重悬细胞。，以每孔1~4×105细胞的密度接种到6孔培养板上，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养一天。具体数量因细胞种类不同而不同，掌握为过夜能铺满。 三、直线划痕 取出铺满六孔板的细胞，用200ul枪头垂直于细胞表面，由孔一端划向另一端。尽量垂直于背面的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。此时可在培养皿的表面清晰看到细胞表面呈#字形划痕。
附件-4 综合设计性实验项目指导 一、实验项目名称：动物细胞原代培养及活力检测 二、实验目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程中无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的观察方法及细胞活力的测定方法，为细胞工程中的胚胎移植、细胞融合与单克隆抗体制备等技术奠定重要的技术基础。 三、实验原理 用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。这种培养过程是把组织或器官从动物体取出，分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断的生长和繁殖。 原代培养是建立各种细胞系的第一步。利用原代培养技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究。原代培养科分为组织培养法和消化法两种。 台盼蓝染色法检测细胞活力的原理:台盼蓝是检测死、活细胞最常用的生物染色试剂之一。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，由于膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。 四、实验材料： 1.新生兔 2.大剪子、弯头眼科剪、小镊子、平皿、细胞培养瓶、烧杯、酒精灯、移液枪、超净工作台、细胞计数板、0.22μm细菌过滤器、移液枪、枪尖、PE手套、一次性无菌橡胶手套、脱脂棉、无水乙醇、台盼蓝、15ml离心管 3. DMEM培养基、血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶 五、实验仪器：二氧化碳培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、离心机、显微镜 六、实验步骤（方案）：（如需要学生设计，也要提交一参考方案供论证评审）（一）DMEM培养基的配制 1. 将DMEM培养基干粉用800ml超纯水溶解，加入3.7gNaHCO3，搅拌溶解，加入双抗（100IU/ml），调整pH为7.0，定容至1L，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，分装，并用封口膜封口，4℃保存备用。
细胞传代 传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释，分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。本实验以传代大鼠骨髓充间质干细胞为例进行细胞传代技术的介绍。 一、传代前准备 实验开始前，将无菌培养瓶、15ml离心管、移液管、枪头等放入无菌超净工作台，紫外线照射30min，以进行工作台的消毒。 倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。 二、胰蛋白酶/EDTA消化 从培养箱中取出待传代的细胞，75%酒精进行瓶口消毒，吸掉培养细胞的旧培养基。PBS 缓冲液洗去残留的旧培养基,重复洗两次。 弃去PBS,按每25平方厘米1ml消化液比例加入消化液，消化液中EDTA浓度视不同细胞而定，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，可提高EDTA浓度的方法，本实验采用0.25%胰蛋白酶加0.1%EDTA的消化液证明可以很好地消化，并不会损伤细胞。放入显微镜下观察，待所有细胞变圆后立即拿入超净台内，加入6ml细胞完全培养基终止消化。消化时间为1-5分钟，具体依细胞而异。 采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有细胞悬液放入一干净的15ml离心管内。每分钟800转，室温离心5min。 三、制备细胞悬液及培养 吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。 向离心管内的细胞沉淀加入适量完全培养基。吹打混匀，吹打过程中尽量不要产生气泡。显微镜下观察细胞分散情况，避免出现细胞成团情况，确定为单细胞悬液方可进行下一步操作。本实验以1:2的比例进行分瓶，通常骨髓充间质干细胞一般以1：3传代，传到第3代时，骨髓干细胞的纯度可达95%以上。将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱内继续培养。
《现代生物学技术》实验指导手册 适用专业：保护区15 北京林业大学生物科学与技术学院
实验课程要求 （１）实验课前，请仔细预习实验，提前准备好实验中的相关知识如实验原理、实验仪器试剂、实验流程，做到心中 有数，实验前检查预习情况。 （２）实验课上，遵守各实验室的具体规定，注意人身安全和仪器的安全使用，严格按任课老师和试验老师的指导进 行实验。 （３）实验课上请带写有北京林业大学实验报告纸（统一A4格式大小纸张），在实验过程中有间隙时间可以用于实 验报告的完成。 （４）需要使用显微镜的实验，请按照学号使用，并填写使用记录。用毕请擦拭干净，低倍物镜或者空镜头对准通光 孔，降下物台，关闭计算机，盖好防尘罩。
实验一培养基配制及灭菌 一、实验目的 1、学习诱导烟草叶片愈伤组织和植株再生培养基的配置方法 2、学习培养基高压灭菌法 二、实验原理 相对高的生长素浓度有利于细胞增殖和不定根的分化，而相对高的细胞分裂浓度有利于不定芽的分化，生长素浓度与细胞分裂素浓度相当有利于愈伤组织的诱导。通过改变激素的种类和浓度，有效地调节培养组织的器官化。 三、实验用具及药品 1、仪器与器械：超净工作台、高压灭菌锅、光照培养箱、烧杯、三角瓶、培养皿、镊子、剪刀。 2、材料与试剂：烟草叶片、NAA储液0.05 mg/mL、6-BA储液0.05 mg/mL、MS基本培养基粉末、肌醇、蔗糖、琼脂。 四、实验方法及步骤 1、取少量的蒸馏水加入烧杯中。 2、按母液顺序和规定量，用移液管取母液，依次放入烧杯中。 3、细胞分裂素6-BA和生长素NAA等根据具体而定。愈伤诱导培养基吸取6-BA 0.5mg 和NAA 0.5mg，放入烧杯中。不定芽诱导培养基吸取6-BA 1.0 mg 和NAA 0.1 mg，放入烧杯中。 4、称取肌醇0.1g 、蔗糖30g，放入烧杯中。 5、定容至1000 mL。 6、用1M的NaOH调pH至6.3后，倒入三角瓶中。 7、称取琼脂7g，放入三角瓶。 8、用封口膜包扎瓶口，放入高压灭菌锅中，在121℃下灭菌15min。 9、灭菌后的培养基倒入平皿中，parafilm封板。
实验一动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化 以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化 等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、 遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。 体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何 物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分 重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。 三、实验材料、用品
实验一动物细胞的传代培养 一、实验目的 1．熟悉细胞培养过程中的无菌操作技术。 2．了解细胞传代培养的基本方法和主要操作步骤 二、实验原理 细胞培养(cell culture)是指从机体内取出某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。细胞的体外培养在细胞生物学和医学研究领域有着极为广泛的用途，这一技术已成为研究细胞生理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细胞工程等课题的一项不可缺少的手段。细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供大量的生物性状相同的细胞作为研究对象，便于人们在体外利用各种不同的方法从不同的角度研究细胞生命活动的规律。另外，利用细胞培养技术还可使人们较为方便地研究各种物理、化学和生物因素对细胞结构和功能的影响。 细胞培养可分为原代培养和传代培养2种情况。所谓原代培养(primary culture)是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。而传代培养(subculture)是指当原代培养的细胞增殖到一定密度后，将其从原培养容器中取出，以1：2或其他比例转移到另一个或几个容器中所进行的再培养。传代培养可简称传代。在体外培养过程中，要使细胞能正常地生长、繁殖，需经常对其进行传代。传代的累积次数就是细胞的代数。
在从事细胞培养工作时常常会接触到细胞系(cell line)和细胞株 (cell strain)这两个容易混淆的概念。一般认为，细胞系指通过原代培养 并经传代后所形成的细胞群体，由于细胞系来源于原代培养，而原代培养物 中所含的细胞种类较多，故一个细胞系往往由多个生物学性状不同的细胞群 体所组成，而细胞株是利用单细胞分离培养法或克隆形成法从原代培养物或 细胞系中选择出的细胞群体，一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或标记 并可持续存在。 细胞培养是一种程序复杂、条件较多且要求严格的实验性工作。由于细 胞在体外的生长、繁殖会受到温度、营养物质、酸碱度、渗透压及微生物等 多种因素的显着影响，故细胞培养工作的各个环节如培养器皿清洗消毒、营 养液配制和除菌、pH值调整、温度调节等操作都有严格的要求和规定，特 别要注意无菌操作，这是细胞体外培养成败的关键。 三、实验材料 人肝癌细胞株HepG2 四、实验器材 CO 恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、倒置相差显微镜、电热高2 压蒸汽消毒锅、细胞培养瓶、培养皿、吸管、除菌滤器、小烧杯、100mL玻 璃试剂瓶、橡皮瓶塞、酒精灯、记号笔。
本科学生实验报告 学号 学院生命科学学院专业、班级 实验课程名称细胞生物学实验 指导教师及职称王莎莎 开课时间2013 至2014 学年第一学期 填报时间2013年10月13 日
师大学教务处编印
传代时只须把培养的悬浮细胞做适度稀释或把培养细胞经简单的离心处理后再加入适量的培养液即可培养。因此，细胞在从原代到传代的转变过程中遭受的机械损伤和化学损伤的可能性较少，损伤程度也较轻，相对而言，传代的成功率较高。 流程： 每小组先用一个培养瓶配制50ml 每人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内 然后向细胞培养瓶内接种10ul的结肠腺癌320细胞株培养株原液 放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖 根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置 4、死活细胞的鉴别 （1）.细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。 （2）.许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞，却能渗入死的细胞，使其着色，以次来区别死活细胞。 流程：制片 计数
4、实验方法步骤及注意事项： Ⅰ、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌） （一）清洗 (1).新玻璃器皿的清洗 先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。 (2).使用过的玻璃器皿的清洗 A、立即进入清水，避免干涸难洗； B、用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥； C、浸酸性洗液过夜； D、从洗液捞出自来水冲洗10~15次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗10次，倒置烘干； E、包装（牛皮纸或不透水纸）； F、高压（15磅20min)或干热（160度2h)灭菌； G、备用 （二）胶塞处理 （1）新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸10~20min。 （2）自来水清洗10次 （3）用1%稀盐酸浸泡30min。
实验一常用单细胞藻类的形态观察 一、实验目的： 观察并识别作为饵料生物的代表性单细胞藻类的种类，为后继单细胞藻类的分离和培养做准备。 二、实验器材： 1、藻种 绿藻门： Chlorophyta 小球藻Chlorella sp. 盐藻Dunaliella sp. 青岛大扁藻Platymonas helgolandica var. tsingtaoensis 亚心形扁藻Platymonas subcodiformis 微绿球藻Nannochloropsis oculata 硅藻门： Bacillariophyta 三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum 小新月菱形藻Nitzschia closterium f. minutissima 中肋骨条藻Skeletonema costatum 牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri xx门： Chrysophyta
xxPavlova viridis 球等鞭金藻Isochrysis galbana 湛江等鞭金藻Isochrysis zhanjiangensis xx门： Cyanophyta 钝顶螺旋藻Spirulina platensis xx门： Xanthophyta 异胶藻Heterogloeasp. 2、实验器材 光学显微镜，载玻片，盖玻片，胶头滴管，鲁哥氏碘液，甲醛溶液，滴瓶，无菌水，擦镜纸，吸水纸 三、操作步骤及要求： 用胶头滴管吸取液体培养的各种藻类样品，滴到载玻片上（若藻种浓度大用无菌水稀释），用显微镜（低倍和高倍）观察细胞的形态大小，色素分布，运动方式，然后用碘液或甲醛固定样品，观察细胞的鞭毛着生情况（长度、数量），细胞的内部结构等。 四、结果与讨论： 1、描绘5种藻类形态、构造图，描述各种藻类的特征颜色。运动性的藻类，描述其细胞游动方式。 2、用甲醛固定样品与用碘液固定样品，在观察细胞结构上有何不同的效果？ 实验二饵料生物个体及筛网xx大小的测量
细胞培养实验报告 一、试验准备 1、试验目的 学习细胞培养，熟悉细胞培养的操作。 2、细胞种类 人体成纤维细胞——HDF，第21代 3、实验人员 朱宏历、俞鸿飞（指导）、董溪溪（指导） 4、参照方法 刘苹《细胞培养技术》2015版PPT 5、试验设备 细胞房、离心机、超净台、4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱、液氮罐、冻存架、带CCD摄像功能的倒置显微镜、程序降温盒、倒置显微镜（细胞房内）、1-1000ul 移液器、恒温水浴锅、电动大容量移液器、二氧化碳培养箱、酒精灯、打火机、细号记号笔、酒精消毒剂喷洒器、定时报警器。 6、试验耗材 75%酒精消毒剂、分析纯异丙醇、50ml离心管（无菌分装用）、15ml离心管、2ml 移液器吸嘴、5ml巴氏吸管、一次性培养瓶、10ml一次性塑料移液管、1.5ml冻存管、口罩、鞋套、医用帽（或连体洁净工作服）、灭菌乳胶手套（无粉） 7、试验用培养液 全培养液：90%DMEM（基础培养液）+ 10%FBS（胎牛血清） 冻存液：90%FBS（胎牛血清）+ 10%DMSO（二甲基亚砜） 消化液：Trypsin - EDTA（胰蛋白酶0.25% - EDTA 0.2%消化液） 二、试验步骤 前一天从-20℃冰箱中取出已冻存的FBS及DMEM置于4℃冰箱之中。 DAY1——细胞复苏 1. 酒精喷洒操作台面，取出大容量电动移液器、1个10ml一次性移液管、1把5ml巴氏吸管，1盒2ml移液器吸嘴,1个15ml离心管，2个50ml离心管，1个培养瓶用酒精喷洒消毒后置于操作台面右侧。
1. 分装培养液 点燃酒精灯，取出大容量电动移液器和10ml一次性移液管，另准备2个50ml 离心管，离心管开盖过火后，以9：1的比例，从FBS离心管中吸5ml至离心管，再吸45mlDMEM培养液至离心管。共准备2管备用。完成后，将原DMEM培养液重新置于-20℃冰箱中冻存。 2. 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存架，搁于罐口，待液氮流尽后置地。取出HDF细胞冻存管置于37℃恒温水浴锅内解冻约1分钟，观察无冰结晶存在后，立即进细胞房，取15ml离心管过火开盖，取2ml全培养液置于离心管中，再将冻存管过火开盖，吸出细胞冻存液后置于15ml离心管内，而后全部过火盒盖。 离心管置于离心机内，离心机设定1000转，1分钟。离心完成后取出，重新酒精喷洒消毒后置于超净台内，过火开盖，用5ml巴氏吸管吸去上清液后，换根巴氏吸管加约2ml全培养液，并不断吹吸制成细胞悬液。 3. 细胞培养 将培养瓶过火开盖，取10ml全培养液置于培养瓶中，再将15ml离心管内细胞悬液吸至培养瓶中，过火盒盖。并前后摇晃30秒，左后摇晃30秒。将其置于二氧化碳培养箱中，二氧化碳浓度设定为5%，温度设定37℃，观察纯水托盘中是否有水。全培养液的离心管置于4℃冰箱。
细胞培养实验指导 陈轶霞刘俊林 实验报告书写要求： 1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。 2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。 3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况） 实验一细胞培养实验室介绍及使用卫生要求 【目的与要求】 1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局 2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求 【基本原理】 细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。 【内容与方法】 1．通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况 2.使用卫生要求。 （1）实验室的消毒 实验室日常采用紫外灯消毒；按实验室的卫生管理要求对实验室洁净区按周期进行熏蒸消毒；在培养期间发生严重污染时要进行熏蒸消毒。 （2）培养工作开始操作前将所有培养用的物品经专用物流通道通过传递窗放进培养室，开紫外灯消毒30min，关紫外灯后方进入操作。配有空气净化系统的洁净室在风机开启至少30min后才能达到相应的洁净度级别。 （3）操作者进入培养室时要遵守的程序 a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。 b: 换穿无菌室专用鞋，进入更衣室，外衣挂到指定的衣柜里，用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂进行消毒，戴帽子（不露头发）、口罩（应包住胡须），穿已消毒的洁净服，进入缓冲室。再用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂消毒，在其滞留3min后进入培养室。 （4）开超净工作台10min，期间用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭操作台面后可开始具体的操作，同时点燃酒精灯用于临时性的火焰消毒。 （5）实验完毕，关闭超净工作台，及时清理实验用品，废物从通往物流通道的传递窗中传出。工作台面用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭消毒后方可出培养室。 （6）出培养室时，将工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔离鞋柜里，跨过隔离鞋柜，将用过的一次性帽子、口罩、鞋套等放到指定的废物桶，出实验室前用肥皂洗手，关闭空气净化
细胞培养实验室操作准则 任何首次准备开展细胞实验的人员必须首先认真阅读以下准则，然后在已经熟练掌握细胞培养操作技术人员的指导下开始进行细胞实验，并在以后的实验过 程中严格遵守各项准则。 一、细胞实验准备 1.进入细胞房前要换鞋，穿无菌服（干净实验工作服），戴手套，接触细胞前喷75%酒精消毒手套。 2.将所需实验用品：培养基（完全培养基、空白培养基）、胰酶（含ETTA）、枪头（1ml、200ul、10ul)、离心管，预先放置到超净工作台，打开紫外照射30min 后开始细胞实验。 3.观察细胞前，用75%酒精纱布擦拭显微镜镜头及台面，进行消毒后方可开始观察细胞。 4.观察细胞主要包括：细胞数量（汇合度）、形态、分布情况（是否均匀）、有无漂浮的死细胞和污染等，观察完及时放回培养箱。（如图，汇合度约90%，分布均匀） 5.每次开始细胞实验前，需关闭紫外照射，打开超净台风机及灯。用含75%酒精的纱布擦拭超净工作台。超净台内物品放置情况：左侧（各式枪头，及可常温放置的试剂如PBS等），右侧（5ml枪头及镊子），废弃瓶位于右上角，尽可能远离操作区域，正前方为枪和酒精灯，培养基及胰酶放置左侧便于取用。 6.超净台在使用前后，都需用含75%酒精的纱布擦拭台面至纱布上看不到明显脏物为止，每天操作后废液缸需清洗用紫外照射，此外，从外面拿进超净台的东西都要喷75%酒精消毒。 7、每周四需更换培养箱中高压过的超纯水，每周五对超净台（包括风机）、细胞培养房卫生进行打扫，每月对培养箱进行消毒清洗，确保细胞不受污染。
8、检查培养箱的CO2含量是否正常，如出现异常及时联系细胞平台相关负责人。 9、5mL枪头清洗高压的流程:(1)用洗洁精将枪头超声一遍（2）更换干净的自来水超声清洗3遍（3）用超纯水超声清洗1遍（4）将枪头捞出后再用超纯水荡洗3遍（5）放入烘干箱烘干（6）装在铁盒中，注意枪头放置顺序一致，放入高压锅，选择橡胶类（7）高压后放入烘干箱烘干后方可拿入细胞房使用 1ml、200ul、10ul装入枪盒后放入高压锅高压烘干后方可拿入细胞房使用 二、细胞传代 1.细胞传代前要观察细胞，细胞汇合度达到80%-90%时可以进行传代。图片 2.以25cm2培养瓶为例：打开培养瓶瓶盖，将盖子地面朝下放在超净台台面上，然后将培养瓶倾斜，用量程5ml的枪将旧培养基吸走，然后用量程1ml枪加1ml 空白培养基轻轻摇匀清洗，用5ml枪将清洗的培养基吸走。注：75cm2加3ml空白培养基清洗 3.加入胰酶（含EDTA）500ul；然后轻轻摇晃培养瓶，注意让所有细胞都要接触到胰酶，放入37度培养箱消化。注：75㎡大瓶加1500ul胰酶、6孔板加300ul 胰酶、12孔板加200ul胰酶 4.消化时间长短根据不同细胞有不同选择，镜下观察大部分细胞变圆，见大部分细胞脱落即可终止消化。 5.25cm2培养瓶加入2ml完全培养基终止消化。注：75cm2培养瓶加5ml完全培养基终止消化、6孔板加1.5ml完全培养基终止消化、12孔板加1ml完全培养基终止消化。 6.用5ml枪头轻轻吹打细胞后，观察底部大部分细胞已脱落，然后倾斜培养瓶，将细胞混悬液转移到15ml离心管，800r/min条件下离心3min。 7.离心时，准备新的培养瓶，标记好细胞的名称、日期、代数。 8.离心结束后，弃上清液。缓缓沿壁加入5ml新鲜的完全培养基，计数（方法参见后面）。 9.重悬细胞，用量程5ml枪，枪打到第一档，深入管底部，轻轻吸取离心管底部的整个沉淀的细胞团和培养基，然后沿管壁缓慢匀速打下，枪头随着液面的的上升而逐渐上提，这样可避免产生气泡。按此方法反复几次，待细胞混匀后，吸取细胞混悬液，加入新培养瓶，按所需比例进行传代即可。
三维细胞培养—— 提供更真实的体外生物模型
细胞2D培养与3D 培养的本质差异 细胞特征2D 培养3D 培养形态片状、平板、单层生长球状或聚集状的自然结构 增殖速度比活体内细胞更快因3D模型和细胞不同，可能比 2D培养的更快或更慢 在培养基/药物中的 暴露程度细胞均匀暴露于培养基中的营养物/ 生长因子/药物 营养物/生长因子/药物可能无法 充分浸润到中心区域的细胞 基因/蛋白表达比体内细胞相比，基因和蛋白表达 水平都有所差异更接近体内细胞的状态。干细胞能更好地维持干性，也更容易被诱导分化 药物敏感性细胞对药物更敏感，药物似乎更有 效果细胞对药物更耐受，结果能更有效地指导体内药物治疗
3D与2D培养的干细胞生物学特性对比 3D培养的干细胞与2D培养的干细胞相比 ●细胞活力更强 ●能更好地维持干性 ●更容易被定向诱导分化 参考文献：Ling Guo, et al. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. J. Cell. Mol. Med. 2014,18,(10):2009-2019
产品介绍 3D与2D培养的肿瘤细胞药敏性对比 ●药物种类：阿霉素 ●细胞类型：MCF-7 ●结果：3D培养的肿瘤细胞IC50（达到50%死亡 率时所需的药物浓度）是2D培养细胞的100倍 3D培养的细胞与体内真正的3D肿瘤组织有更强的生物学相关性，因此更能预测临床结果。 对于大多数抗肿瘤药物，3D培养的细胞的药敏性要低于2D培养的细胞。 用传统的2D培养细胞筛选出来的药物，通过动物实验后，能通过三期临床实验的只有10%。 而最终被证明有效的只有5%。造成了极大的实验成本浪费。
《细胞生物学》实验指导书 适用专业：生物科学、生物技术 实验目录 实验一植物原生质体的分离与融合 (1) 实验二动物细胞原代培养 (3) 实验三细胞传代培养 (4) 实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察 (5) 实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测 (7) 实验六环境因素诱变染色体改组的观察 (9) 实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)
实验一植物原生质体的分离与融合 实验项目类型：综合性 所属课程名称：《细胞生物学》 实验计划学时：7学时 一、实验目的 1.掌握原生质体分离的原理与技术； 2.了解细胞融合的基本原理及应用； 3.初步掌握PEG融合法和电融合法。 二、实验原理 植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞。原生质体可以从培养的单细 胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得。但一般认为从叶肉组织分离原生质体是 理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致。原生质 体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得。原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似。但原生质体由于除去了细胞壁，所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定。常用的渗透压稳定剂包括甘露 醇、山梨醇、蔗糖等。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。 2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合。细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇（PEG）法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组，然后由于表面张力作用，形成一个球形细胞。
原生质体分离融合和培养的意义： 1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路。植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前 景。它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之 一。 2.原生质体可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物 全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。 3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 三、实验仪器与材料 1.材料：油菜叶子、白菜花 2.溶液或试剂：（1）洗涤液：甘露醇0.7mol/L，CaCl2·2H2O 3.5mmol/L, KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6)，高压灭菌； （2）混合酶液：1.5％纤维素酶，1％果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6)。 （3）50%PEG （4）高pH高钙稀释液： （5）20%蔗糖溶液 （6）DPD培养基： 3.仪器或其他用具：超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镊子、解 剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移 液管、培养皿、酒精灯等。