一原理
考马斯亮蓝 G — 250（GooMAssle BrIIIIAnT Blue G — 250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G— 250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。在一定蛋白质浓度范围内（1?100卩g）,蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋
白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G — 250结合在2Min左右的时间内达到平衡，完成
反应十分迅速，其结合物在室温下1H内保持稳定。该反应快速灵敏（灵敏度比Foiln -酚法
还高4倍）、易于操作、干扰物质少（考马斯亮蓝G — 250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大），可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋
白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。
二试剂配置
考马斯亮蓝 G-250100mg溶于50mI95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml的磷酸，作为母液保存，使用时用水稀释到 1000ml。滤纸过滤。试剂的最终浓度为0.01%考马斯亮蓝
G-250、质量浓度为0.085g/ml磷酸。贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。
三步骤
1破碎细菌提取蛋白液
大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超
声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。（30% Triton X-100 的配制
Triton X-100 28.2ml
0.1mol/L PBS（pH=7.3）或 0.05mol/l TBS（pH=7.4） 72.8ml
配制方法
取Triton X-100及PBS （或TBS）混合，置37C?40C水浴中2?3h,使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。通常将30%稀释到1%。）
目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部，约1cm （我一般是距底部
0.5mm ）。功 率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。 3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。
4*尝试超8s 停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好 停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。
链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？前处理一般就是配置成一定浓度的菌 悬液。 使用超声破碎时采用的具体条件是：
（1）取细菌的24 h 培养液于5 000 r/min 下离心5 min 收集菌体. （2）
用pH 7 . 5的Na2HP0 -NaH2P0缓冲液洗涤3次，再用该缓冲液将菌体配成 1 : 3的
菌悬液?置于40 mL 大塑料试管内. （3）
将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎 （功
率200 W , 1 /2”探头，破碎30 s ，间 ⑷破碎液于12 000 r/ min 下高速冷冻离心 30 min ，收集细胞碎片和上清夜. 超声破菌流程与上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或
pH8的Tris -
HCl ，洗涤一次就可以。另外，超声剂量随样品量、 菌体改变比较大，功率可以到400— 600w, 超5s,停5s,冰浴，要加终浓度1 mM 的PMSF 。为确定合适的超声强度和次数，有必要随 时镜检观察菌体是否完全破碎。
在做大肠杆菌超声时，采用的是 400W ，超5停5的方法，效果不错，但是用在链霉菌上， 似乎没什么效果。会不会就是由于细胞壁组成差异造成的呢， 因为大肠杆菌式属于革兰氏阴
性菌的。
再有镜检是检验破碎效果 ，但是细胞破碎程度和我需要的酶获得之间有正比关系吗？破碎 头，破碎30 s,间歇30 S”的条件好像是用于破碎链霉菌孢子的，
如果你需要的是胞
内酶， 细胞破碎程度和需要的酶获得之间基本上有正比关系。 破碎时间长 的确会影响到酶的活性。 这就需要在最佳的破碎时间和酶活性之间做出判断， 最直接的办法 实验中，破碎的是棒状杆菌（也是很难破壁的
G+菌），破碎时间控制在 30min 左右，酶活
较好。如果是基质菌丝的话，好可以考虑用溶菌酶处理一下.一般来讲这几种方法读可以的 一,液氮研磨 二，用french press 破碎 三，超声波破碎 四，溶菌酶处理预处理 超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它既是一种波动形式
，又是一种能量形式。超声对
细胞的作用主要有热效应， 空化效应和机械效应。 热效应是当超声在介质中传播时，
摩擦力
阻碍了由超声引起的分子震动，使部分能量转化为局部高热（ 42— 43C ）。空化效应是在超
声照射下，生物体内形成空泡，随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡。 另外，空
化泡破裂时产生瞬时高温（约
5000C ）、高压（可达500X 104Pa ）,可使水蒸气热
解离产生.OH 自由基和.H 原子，由.OH 自由基和.H 原子引起的氧化还原反应可导致多聚物 降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应，超声波在传播过程中 介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化， 引起细胞结构损伤。损伤作用的强弱与超声的
频率和强度密切相关。
化学裂解的方法，10g 酵母加1ml 的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂解效果不错 的 加尿素裂解液（尿素 8mol/L ，NaCl 0.5mol/L ，Tris 20mmol/L ，EDTA 20mmol/L ，2%SDS ，PH 值8.0）,据说效果可以。 毕氏酵母细胞破碎法在破碎遇到的问题是菌体浓度太低，
OD620nm
2*破3S 停10S,破个二三十次看看。
试着加大体积，强度最好不要超过 60%.
在4-6之间。细胞破碎仪的最低破碎体积为4ml左右，这样再稀释一倍，0D就到2-3啦，
我们怀疑破碎完溶出蛋白和酶活测定时会测不准。所以请教大家细胞破碎时最低的菌浓多少
为下限？我们的菌是一种棒杆菌。破碎后，你可将液体放入透析袋中浓缩。我们所做的方
法是按照1: 20的比例将离心后的菌体（e.coli）溶解于超声缓冲液（50mM磷酸pH 8.0） 300w
10s/10s破碎20分钟。做了镜检！基本全被破碎了！我做蛋白纯化的，做的包涵体。
实验中我们的菌体浓度相对独立，与培养液中的菌体od无关，不收其限制，便于操作者调
控。一般按每g湿菌体加5-10ml裂菌缓冲液。超声肯定会产热，所以一定要有降温装置，除非你需要得成分耐高温。
（基本原理
超声波细胞粉碎机是利用超声波在液体中的分散效应，使液体产生空化的作用，从而使液体中的固体颗粒或细胞组织破碎。超声波细胞粉碎机由超声波发生器和换能器二大部分组
成。超声波发生器将市电转变成18-21KHZ交变电能供给换能器。锆钛酸钡压电振子是换能
器的心脏，它随交变电压以18-21KHZ频率作伸缩弹性形变，换能器随之作纵向机械振动。
振动波通过浸入在生物溶液中的钛合金变幅杆产生空化效应，激发介质里的生物微粒剧烈振动。
主要用途
超声波粉碎机能用于粉碎动物细胞、植物细胞、细菌、牙孢或组织。分散稀土和各类无机矿物粉。超声波粉碎机是加速化学、生物学、物理学的反应速度和加速液体脱气的理想装置。
超声波粉碎机能配制近乎微米的百分之一大小的乳胶体；匀化“难混溶”的混合液；聚合一
些物质，析出另一些物质。
总之，超声波粉碎机能实现提取、粉碎、乳化、匀化、悬浮液、变异、气悬体、加速脱溶、晶化及在电子显微镜下配制各种生物样本之多种功能） 2考马斯亮蓝测定
吸取样品提取液1.0ml（样品提取见LoWry法），放入具塞试管中（每个样品设置两个重复），加入5ml考马斯亮蓝 G — 250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，记录吸光值, 并通过标准曲线查得蛋白质含量。一般被测样品的A595nm值在0.1 — 0. 5之间，所以上述
样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测 A595nm值，
注意事项：
1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。
3结果计算
样品中蛋白质的含量（Mg/g）=C X VTV1 X FW X 1000 （2-2）
式中C:查标准曲线值（卩g）; VT：提取液总体积（Ml）;
FW:样品鲜重（g）; V1 :测定时加样量（Ml）。
实验五考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 一、实验目的 1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法 2.熟练分光光度计的使用和操作方法。 二、实验原理 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。 离心机的使用说明： 1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。 3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。 分光光度计的使用说明： 1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。 2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=。 3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。 4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。 5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。 三、试剂与器材： 1. 试剂： （1）％NaCl：9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。 （2）标准蛋白质：称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。 （3）染液：考马斯亮蓝G-250 ，溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85％(W
一原理 考马斯亮蓝 G — 250（GooMAssle BrIIIIAnT Blue G — 250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G— 250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。在一定蛋白质浓度范围内（1?100卩g）,蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋 白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G — 250结合在2Min左右的时间内达到平衡，完成 反应十分迅速，其结合物在室温下1H内保持稳定。该反应快速灵敏（灵敏度比Foiln -酚法 还高4倍）、易于操作、干扰物质少（考马斯亮蓝G — 250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大），可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋 白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。 考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。 二试剂配置 考马斯亮蓝 G-250100mg溶于50mI95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml的磷酸，作为母液保存，使用时用水稀释到 1000ml。滤纸过滤。试剂的最终浓度为0.01%考马斯亮蓝 G-250、质量浓度为0.085g/ml磷酸。贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。 三步骤 1破碎细菌提取蛋白液 大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超 声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。（30% Triton X-100 的配制 Triton X-100 28.2ml 0.1mol/L PBS（pH=7.3）或 0.05mol/l TBS（pH=7.4） 72.8ml 配制方法 取Triton X-100及PBS （或TBS）混合，置37C?40C水浴中2?3h,使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。通常将30%稀释到1%。） 目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。 1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部，约1cm （我一般是距底部
实验报告 学院：第二临床医学院专业：临床医学年级：2013级班级：1班姓名：学号：日期：2014,3,8 得分：实验课程：生物化学实验 实验名称：蛋白质的定量测定（五）——考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 【实验目的】 掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。 【实验原理】 考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595n处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。 【试剂与器材】 试剂： 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml 的磷酸，用蒸馏水稀释到1000ml。 标准蛋白质溶液：结晶牛血清清蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量，然后根据该蛋白的纯度用0.15mol/LNacl配制成1.0mg/ml蛋白溶液。
器材： 试管和试管架 722型分光光度计 吸量管 移液枪 【实验步骤】 一、制作标准曲线 各管混匀后，静置3min，以0号管为空白管调零，在595nm波长下分别测定各管溶液的吸光度值（A595）. 以A595值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 二、待测蛋白质浓度测定 测定方法同上，1ml待测蛋白质家5ml考马斯亮蓝试剂，。用上述0号管调零，测出血清的A595值。 【实验结果】
考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、原理 考马斯亮蓝G-25(Coomassie G-250是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在 465nm 处有最大吸收值。考马斯亮蓝 G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质一考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收入max的位置发生红移，在 595nm 处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在 595nm 处的光吸收远高于考马斯亮蓝在 465nm 处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在 1ug 左右。 二、操作步骤 1. 标准曲线测定法 分别取六只试管，其中一只加入 1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为 100ug/ml 牛血清清蛋白标准液，补充水到 1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min,在紫外 -可见分光光度计 595nm 处测定吸光值。以 A595 吸光值为纵坐标,牛血清清蛋白的 ug 数量为横坐标绘制标准曲线。具体操作见下表。
蛋白质标准曲线测定加样 在标准蛋白质测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平 行管。 3?试剂配置 a. 牛血清清蛋白标准液结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光系数 是6.6来计算其百分含量。然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为 100 ug/ml的蛋白溶液。 b. 考马斯亮兰G— 250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250,溶于 50ml 95%的乙醇后，再加入100ml 85%的磷酸，用水稀释至1升
考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量 原理： 考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（1-1000μg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。其结合物在室温下1h内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 材料、仪器设备及试剂 1、材料 小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料 2、仪器设备 分光光度计、研钵、烧杯、移液管 3、试剂 （1）标准蛋白质溶液：100μg·Ml-1牛血清白蛋白：称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。 方法： 1、标准曲线的绘制 取6支具塞试管，按表加入试剂。混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝 G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水量（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100 2、样品测定 （1）样品提取：取鲜样0.5g，加入2ml蒸馏水研磨，磨成匀浆后用6ml蒸馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。 （2）吸取样品提取液0.1ml，放入具塞试管中（每个样品重复2次），加入5ml 考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。 （3）结果计算（单位mg/g）样品中蛋白质含量=（C·VT）/(1000 VS·WF) 式中：C—查的标准曲线值（μg）
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法 [实验目的] 学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法 [实验原理] （蓝色）变为氨基酸芳香族 碱性 染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ??→?+ - [器材与试剂] 器材 722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂 1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。 2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。 [实验方法] 标准方法 1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。 3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) = ） 测定时提取液体积（）样品重（） 提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ??/μ SDS 干扰实验 1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。 [实验数据与结果分析] （一）标准方法的数据和图 表1 考马斯亮蓝标准法实验表格
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 （一）、试剂： 1、考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2、标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度计使用及原理（）。 2、移液管使用（）。 （三）、标准曲线制作： 1、 2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、
40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。 1）、利用标准曲线查出回归方程。 2）、用公式计算回归方程。 3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四）、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。 （五）、注意事项： 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。
实验七考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量 一、试验目的 1. 学习分光光度计的原理及操作 2.学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度 二、基本原理 1. 根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法或分光 光度法。该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。该法所使用的光谱范围包括可见光和紫外光，即包括波长在200 - 800 nm之间的光。 2.分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光 光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。 3.紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样 品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即200nm-400nm。可见光区为400nm -800nm。 4.考马斯亮蓝G250法 原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm改变为595nm,该蛋白－染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定1μg /mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要2分钟，颜色在1小时内稳定。 操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定 三、试剂 1. 标准蛋白质溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白溶液 2. 考马斯亮蓝G250蛋白染色剂： 四、操作步骤 1.标准曲线的绘制： 取6只试管，分别加入浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml的标准蛋白质溶液0.1ml，然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm 测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。 2.样品测定： 样品液0.1mL , 然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm 测定吸光值。从标准曲线中查出相应的浓度。 五、试验结果
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的 一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮 蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。 实验原理 考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质― 染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质 测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方 法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收 峰(lmax)的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通 过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主 要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 考马斯亮蓝染色法的突出优点是： (1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高 的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 (2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分 钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可 以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而 完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 (3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、 糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮 蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。 试剂与器材 一、试剂
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 一、实验目的 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和方法。学习分光光度计的原理及使用方法。 二、实验原理 三、实验步骤 试剂 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋 白质溶 液/ml 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 样品0.1 样品0.1 相当于 蛋白质 含量/微 克0.00 20 40 60 80 100 未知未知 蒸馏水 /ml 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 0 考马斯 亮蓝染 液/ml 3 3 3 3 3 3 3 3 1、打开分光光度计，预热30min。 2、取8支洁净的干燥试管，按上表进行编号，0~5号用于标准曲线的绘制，6号、7号用于 样品溶液的测定。 3、取微量注射器，用蒸馏水清洗3次，再用标准蛋白质溶液润洗2次。按上表在0~5号试 管中加入标准蛋白质溶液，然后用蒸馏水洗3次，再按上表在0~5号试管中加入相应含量的蒸馏水。 4、微量注射器用样品润洗2次，抽取100微克的样品加入到6号试管，再抽取100微克加 到7号试管。用蒸馏水清洗微量注射器。 5、取5ml的移液管，用蒸馏水清洗3次，用考马斯亮蓝染液润洗2次。在0~7号试管中各 加入3.0ml的考马斯亮蓝染液。振荡试管，混合均匀。 6、待其充分反应（约2分钟）后，用分光光度计分别测它的吸光值。 7、用0~5号的数据。以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 8、由样品液的吸光值查标准曲线求出蛋白质含量。 四、实验结果与分析 试管编号0 1 2 3 4 5 6 7 A595 0 0.383 0.603 0.871 1.093 1.189 0.876 0.83 6 样品溶液吸光值=（0.876+0.836）/2=0.856 查标准曲线得样品液的蛋白质含量为66.0微克
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的具体方法及步骤 蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。 实验原理 考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝染色法的突出优点是： (1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 (2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在
1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 (3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。 试剂与器材 一、试剂 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。 二、标准和待测蛋白质溶液 1. 标准蛋白质溶液
考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量 实验目的： 学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。 实验原理： 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 新鲜绿豆芽 2．主要仪器 （1）分析天平、台式天平 （2）刻度吸管 （3）具塞试管、试管架 （4）研钵 （5）离心机、离心管 （6）烧杯、量筒 （7）微量取样器 （8）分光光度计 3．试剂 （1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。 （2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 （3）乙醇 （4）磷酸（85％） 四、操作步骤 1．标准曲线制作 （1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 专业班级：制药工程3班小组成员：李梦娴李敏林晓丝 一、实验目的 1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理 2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤 二、实验原理 1、根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250是比色法和色素法相结合的复合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当和蛋白质结合后呈青蓝色。在一定范围内，也就是蛋白质含量在0~1000ug范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度和蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。 2、考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。 三、仪器和试剂 1、仪器：分析天平；铁架台；大漏斗；洗瓶；烧杯100m l× 2、50m l×1；吸管10ml×2、5ml×1；胶头滴管；移液枪；离心管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml×3；洗耳球×2；玻璃棒；记号笔。 2、试剂： （1）蒸馏水。 （2）标准蛋白质溶液：用移液枪吸取1ml浓度为1mg/ml标准蛋白质溶液，溶于蒸馏水并定容至10ml，制成0.1mg/ml的原液。 （3）考马斯亮蓝G-250(0.01%)染液:称取0.01g考马斯亮蓝 G-250,溶于5ml 90%乙醇中，加入85%（m/v)的磷酸10ml,最后用蒸
馏水定容至100ml（此溶液不宜久存，在常温中可放置1~2个月）； 将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存。 （4）样品液：用移液枪取1ml纯牛奶液体（经调查，市场上大部分纯牛奶中蛋白质的含量大致为每100ml中2.5~3.5g），用蒸馏 水稍做稀释，然后转移至一号100ml的容量瓶中并定容至100ml;用 10ml的吸量管吸取10ml一号容量瓶中的液体于二号100ml的容量 瓶中，最后用蒸馏水定容至100ml，此时二号容量瓶中为待测样品液。 四、操作步骤 1、0~100μg/ml标准曲线的制作： 取8支离心管，编号后，按下表加入试剂，盖塞后，将各试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，以管一为空白对照，在 595nm 下比色测定。以标准蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度为 纵坐标，绘出标准曲线。 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白质标准液 （ml） 蒸馏水（ml） 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝染 5 5 5 5 5 5 5 5 液 0 10 20 30 40 60 80 100 蛋白质含量 （μg）
蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法 （实验报告） 实验日期：2015年4月28日实验温度：室温 实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：*** 班级：2013级生物技术1班姓名：** 学号：******** I. 实验目的 1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法； 2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。 II. 实验原理 考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。 考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长465nm，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长595nm，在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达平衡，复合物在室温下1h内保持稳定。蛋白质—考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。 III. 实验试剂与仪器 1.实验试剂
(1) 100μg/mL标准蛋白质溶液 5mg酪蛋白溶于50mL 的0.1mol/L氢氧化钠溶液。 (2)考马斯亮蓝G-250试剂 50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL，蒸馏水定容至500mL。 (3)正常人血浆。 2.实验器材 可见分光光度计，100μL微量移液器16支，5mL刻度吸管8支，中试管。 IV. 实验操作步骤 1.绘制标准曲线取中试管8支，按下表加入各种试剂 混匀，室温放置5min后即可比色。以“0”号管为空白，记录于下表，绘制标准曲线。 标准曲线绘制数据表
012345样1样2标准蛋白μg 数 020********* A59500.51 70.80 5 0.94 1 1.15 7 1.19 2 1.46 5 1.44 2.样品测定中试管2支分别加未知浓度蛋白质（或人正常血浆）0.4mL，各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀，室温放置5min，以“0”号管为空白比色，以所测A595于标准曲线查蛋白质含量。 V. 实验结果分析 结果分析：实验未能达到预期的一条直线，原因可能为：①血浆样本放置时间太久，蛋白质变性；②实验比色杯由于使用后未及时擦洗，导致比色误差（原因小）；③人为操作不当，导致误差。
生物化学实验报告——蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法 蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法（实验报告） 实验日期：2015年4月28日实验温度：室温 实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：*** 班级：2013级生物技术1班姓名：** 学号：******** I.实验目的 1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法； 2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。 II.实验原理 考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。 考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长465nm，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长595nm，在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达平衡，复合物在室温下1h内保持稳定。蛋白质—考马斯亮蓝
G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。 III.实验试剂与仪器 1.实验试剂 - 1 - 生物化学实验报告——蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法 (1) 100μg/mL标准蛋白质溶液5mg酪蛋白溶于50mL 的0.1mol/L氢氧化钠溶液。 (2)考马斯亮蓝G-250试剂50mg考马斯亮蓝G-250溶于 25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL，蒸馏水定容至500mL。 (3)正常人血浆。 2.实验器材 可见分光光度计，100μL 微量移液器16支，5mL刻度吸管8支，中试管。 IV.实验操作步骤
支，按下表加入各种试剂8 取中试管 1.绘制标准曲线号管为空白，”“0室温放置混匀，5min后即可比色。以 记录于下表，绘制标准曲线。标准曲线绘制数据表 - 2 - :考马斯亮蓝染色法生物化学实验报告——蛋白质浓度测定 A 0 0.517 0.805 0.941 1.157 1.192 1.465 1.440 595 2.样品测定中试管2支分别加未知浓度蛋白质（或人正常血浆）0.4mL，各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀，室温放置5min，以“0”号管为空白比色，以所测A于标准曲 595线查蛋白质含量。 V.实验结果分析 结果分析：实验未能达到预期的一条直线，原因可能为：①血浆样本放置时间太久，蛋白质变性；②实验比色杯由于
作业指导书 标题：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的检验方法 修改记录
1．目的 1.学习一种蛋白质染色测定的方法 2.掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法 2．适用范围 组织中的蛋白质测定。 3．职责 3.1 检测人员按照本作业指导书进行该项试验，作好试验记录。 3.2 审核人员负责试验的审核，保证试验的准确性和科学性。 3.3 科室负责人负责监督试验指导书的执行。 4．正文 4.1 试验原理 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm 处比色测定。2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01—1.0 mg 蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
4.2 材料、试剂与器具 （一）试剂 1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。 2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。 3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml （二）器具 1、试管及试管架 2、移液管（1ml,5ml） 3、可见光分光光度计 4.3 试验操作步骤 （一）标准曲线的制作 1、取7只试管，按下表加入试剂 2、将试管摇匀，放置20分钟。 3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。 4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 （二）样品测定 1、取一只试管加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ML，蒸馏水0.8ML，考马斯亮蓝5ML。
实验考马斯亮蓝测蛋 白质含量
实验7 考马斯亮蓝考G-250染色法测定蛋白质含量 一、目的 1、学习一种蛋白质染色测定的方法 2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法 二、原理 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成蓝色的蛋白质染料复合物，在595nm处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质染料符合物在595nm处的吸光度与蛋白质杭亮成正比，因此可用于蛋白质含量测定。 反应2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。 三、材料、试剂与器具 （一）试剂
1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。棕色瓶保存，该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。 2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。 3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml （二）器具 1、试管及试管架 2、移液管（1ml,5ml） 3、可见光分光光度计 四、操作步骤 （一）标准曲线的制作 1、取7支试管，按下表加入试剂 2、将试管摇匀，放置20分钟。 3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。 4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。（二）样品的测定 1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml. 2、将试管摇匀，放置20分钟。 3、比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。
实验7考马斯亮蓝考 G-250染色法测定蛋白质含量 一、目的 1、学习一种蛋白质染色测定的方法 2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法 二、原理 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 考马斯亮蓝 G-250在酸性溶液中为棕红色，其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成蓝色的蛋白质染料复合物，在595nm处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围 内，蛋白质染料符合物在595nm处的吸光度与蛋白质杭亮成正比，因此可用于蛋白质含量测定。 反应2— 5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01 —1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速， 消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙 酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力 强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。 三、材料、试剂与器具 （一）试剂 1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，力廿100ml 85%磷酸，加水稀释至 1升。棕色瓶保存，该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。 2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。 3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10— 30mg/ml （二）器具 1、试管及试管架 2、移液管（1ml,5ml） 3、可见光分光光度计 四、操作步骤 （一）标准曲线的制作 1、取7支试管，按下表加入试剂 2、将试管摇匀，放置 20分钟。 3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。 4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 （二）样品的测定 1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂 5ml. 2、将试管摇匀，放置 20分钟。 3、比色测定吸光值 A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。 五、注意事项 1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不致影响测定 2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始，力争1hr内完成，否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。 六、实验报告 绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析。
标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白 质含量 标准曲线制作一考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出 所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Foli n-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一标准曲线制作 （一）、试剂： 1、考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G —250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V） 考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V ）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2、标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度 同0.15mol/LNaCI配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。 （三）、标准曲线制作： 1、 2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、
40 ugx 50 ug、60 ug）,在坐标轴上绘制标准曲线。 1）、利用标准曲线査出回归方程。 2）、用公式计算回归方程。 3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=aXX（）+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四）、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1 操作，测出样品的A595E，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A595nm值在0?1一0?05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。 （五）、注意事项： 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。
实验7 考马斯亮蓝考G-250染色法测定蛋白质含量 一、目的 1、学习一种蛋白质染色测定的方法 2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法 二、原理 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成蓝色的蛋白质染料复合物，在595nm处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质染料符合物在595nm 处的吸光度与蛋白质杭亮成正比，因此可用于蛋白质含量测定。 反应2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。 三、材料、试剂与器具 （一）试剂 1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。棕色瓶保存，该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。 2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。 3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml （二）器具 1、试管及试管架 2、移液管（1ml,5ml） 3、可见光分光光度计 四、操作步骤 （一）标准曲线的制作 3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。 4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 （二）样品的测定 1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml. 2、将试管摇匀，放置20分钟。 3、比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。 五、注意事项 1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不致影响测定 2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始，力争1hr内完成，否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。 六、实验报告 绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析。 七、思考题