大致流程：
QIAamp Viral RNA Mini Kit利用了硅胶膜的选择吸附的特性，结合真空或分离柱处理，是同时纯化多个样品的理想选择。先将样品在高变性条件下裂解，灭活RNase，确保病毒RNA的完整性。调节buffer至QIAamp膜吸附RNA的最佳条件，将样品转入QIAamp Mini column。RNA与膜结合，而其他污染物则用两种不同的洗液分两步除去。用特殊的Rnase-free 缓冲液洗脱得到的高质量的RNA，可以直接进行下游实验，也可储存备用。纯化产物无蛋白质，核酸，其他杂质和抑制剂污染。无需酚/氯仿抽提或酒精沉淀，QIAamp膜就可以保证高纯，完整的RNA的极高回收率。所有缓冲液和试剂都保证是无Rnase污染的。
注意：
1.样品如果是冷冻保存的，要避免反复冻融。否则会导致蛋白质变性沉淀，降低病
毒效价，最终减少产量。此外，沉淀还会堵塞QIAamp膜。若产生了沉淀，可以
通过6800×g，离心3min，小心吸取上清进行实验。
2.在将样品放入QIAamp分离柱前，一定要将裂解液的条件调至病毒RNA的最佳
吸附条件。如果起始样品量较大，超过了140ul，那么最好分几次放入分离柱。
3.如果样品中存在细胞DNA，那么纯化过程中DNA会与病毒RNA一起提取出来。
为避免此现象的发生，推荐用无细胞液体提取病毒RNA。如果样品中含有细胞，
如脑脊液，骨髓，尿液等，应该先过滤，或者1500×g离心10分钟，然后取上
清。如果RNA，DNA一起分离了出来，洗脱液可以用Rnase-free的Dnase进行
消化，然后70℃，15min失活Dnase。
4.column可以吸附大于200核苷酸的RNA，产量取决于样品大小，样品保存和病毒
效价。流程推荐的起始样品量为140ul，不过280ul也是可以的。上柱前，小量
的样品要用PBS调节到140ul，而低效价的样品要先行浓缩到140ul。对大于140ul
的样品，上柱前所用的裂解液和试剂都应该相应增加，但用于洗涤步骤的缓冲液
AW1和AW2通常无需改变。如果起始样品量比较多，建议将裂解样品分多次进行
上柱。无需担心柱子会超载，纯化产物的质量也不会受影响。样品量超过560ul
时，最好先浓缩样品。
需准备的东西（分离柱法）：
无水酒精（96％～100％）；1.5ml离心管；灭菌，Rnase-free枪头，离心机（适用于1.5ml 和2ml离心管）。
试剂准备：
1.吸取310ul buffer A VE加入到装有310ug冷冻carrier RNA的管子中，配成1ug/ul
的溶液。充分溶解后，将其分成合适的等份，－20℃冻存。反复冻融不要多于3
次。
2.检查buffer AVL的沉淀情况，必要的话可置于80℃温育至沉淀溶解。按照表1
及公式计算一批样品所需的buffer AVL-carrier RNA混合物的体积（说明书15～
16页写的比较清楚，不再详述）。轻柔的颠倒混匀10次，不要涡旋，避免产生泡
沫。（Note：buffer AVL-carrier RNA应该现用现配，2～8℃可保存48小时。用
前，存放时产生的沉淀必须在80℃加热重新溶解。溶解次数要小于6次。80℃加热不能超过5min。）
n x 0.56 ml = y ml
y ml x 10 μl/ml = z μl
n = number of samples to be processed simultaneously
y = calculated volume of Buffer AVL
z = volume of carrier RNA–Buffer AVE to add to Buffer AVL
因此，carrier rna溶解在ave之后就大概5.6ul每管分装，或者10.2也可。之后冻存，由于其冻融不能超过3次。
3.buffer AW1在用前需按照瓶子上的说明，加入无水乙醇（96％～100％）稀释。
（＃52904 19ml AW1需加入25ml乙醇）说明书17页
4.buffer AW2在用前需按照瓶子上的说明，加入无水乙醇（96％～100％）稀释。
（＃52904 13ml AW1需加入30ml乙醇）说明书17页
柱子的使用（分离柱法）：
要避免交叉污染。
1.样品上柱时要小心，不要弄湿柱子的边缘。
2.在所有的移液步骤中注意要换枪头。
3.枪头主要不要碰到QIAamp膜。
4.斡旋后瞬时离心1.5离心管，将盖子上的液体甩下来
5.全程带手套，一旦手套接触到样品，立即更换手套。
6.放入离心机离心前要盖上column。
7.将column和收集管从离心里拿出后，将column放入新的收集管内。丢弃旧的收集
管及过滤物，并妥善处置。
8.每次只打开一个column，注意避免产生悬浮颗粒
离心：
1.收集管用1.5ml和2ml均可
2.column离心一般在6000×g（8000rpm）。全速离心也不会影响产量。裂解和第一次
洗涤时离心速度可以稍低，保证所有的溶液都经过膜。第二次洗涤时应该全速离心。
所有离心都可在室温下进行。
操作流程：
开始前：
1.使样品及buffer A VE达到室温。
2.检查buffer AW1和AW2是否按照说明配好
3.根据说明将溶于buffer A VE的carrier RNA加入到buffer AVL中
流程：
1.吸取560ul准备好的buffer A VL（含有carrier RNA）到1.5ml离心管中。（根据样品
的实际量按比例调整buffer A VL-carrier RNA）
2.将140ul血浆，血清，尿液，培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有buffer
A VL-carrier RNA的离心管中。斡旋15秒，混匀。（为保证裂解效率，一定要彻底
混匀，形成均一溶液。只溶解过一次的样品也仍然可用）
3.室温放置10min。（10分钟足够，延长时间不会增加产物质量。Buffer A VL可以使
潜在的污染和Rnase失活）
4.瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。
5.样品中加入560ul无水乙醇（96％～100％），斡旋15s充分混匀。然后瞬时离心，
将盖子上的液滴甩回管底。（只可以用乙醇，因为其他酒精会降低产量和纯度。不要用变性酒精，因为其中含有其他物质。如果样品量大于140ul，按比例增加乙醇的量。该步骤要充分混匀，形成均一溶液，以保证产量）
6.吸取630ul上步中的溶液小心的加入column（已装入到2ml离心管中）中，注意不
要碰到柱子的边缘。盖上盖子，6000×g（8000rpm）离心1min。将column放入新的2ml离心管中，弃去旧的收集管。（每一个column都要盖上，以防交叉污染。
8000rpm的速度是为了限制噪音，全速离心也是可以的，不会影响产物。如果溶液没有完全透过膜，可以更高的速度再次离心，直到溶液完全透过）
7.小心的打开column的盖子，重复第6步。（如果样品量超过了140ul，那么重复此
步骤，直到所有的裂解液都上柱）
8.小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW1。盖上盖子，8000rpm离心，1min。
将column放入新的2ml收集管（Kit提供）中，弃去旧的收集管。（即使样品量大于140ul，也无需增加buffer AW1的量）
9.小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW2。盖上盖子，全速离心（14000rpm），
3min。接着进行第11步，或者先进行第10步，以避免buffer AW2残留，然后再进行第11步。（buffer AW2残留会影响下游实验。有些离心机在减速时会发生振动，导致回流，使得buffer AW2接触到column。将column和收集管从离心机里拿出来时也可能会导致该现象产生，因此，最好先进行第10步）
10.推荐：将column放入新的2ml收集管（Kit中未提供）中，弃去旧的收集管，全速
离心1min。
11.将column放在1.5ml离心管（kit中未提供）中。弃去旧的收集管。小心的打开column，
加入60ul 室温的buffer A VE。盖上盖子，室温放置1min。8000rpm离心1min。（单次60ul buffer A VE可以洗脱膜上90％的病毒RNA。每次40ul buffer A VL，洗两次，可以将产物量提高10％。用小于30ul的buffer洗脱，将会降低产物量，也不会提高产物浓度。病毒RNA在－20℃或－70℃下可以稳定保存1年。）
样品浓缩：
针对病毒效价较低的样品进行，比较简单，请参阅第30页。
问题指导：
详细的问题指导可参考第32～35页，内容比较简单清晰，不再详述
注意事项：
要注意避免Rnase污染：
1.应用微生物学无菌技术。手和灰尘是最常见的Rnase污染源，所以操作过程一定
要带手套，勤换手套。尽可能的保证管子盖着。操作过程中，动作要迅速，以避免RNA降解。
2.过程中建议使用一次性管子。这些管子通常是无Rnase污染的，而且无需前处理
（例如Axygen的产品）
3.非一次性器材在用前一定要进行处理，以避免Rnase污染。塑料制品应该用0.1M
NaOH，1mM EDTA浸泡，然后用Rnase-free水浸泡。耐氯仿的制品也可以用氯仿浸泡。
4.玻璃器皿用前可以用去垢剂彻底浸泡，然后大于240℃烘箱烘4小时或更长（过
夜）。也可以用DEPC处理。用0.1％DEPC 于37℃浸泡过夜，然后高压灭菌或100℃，15min以去除DEPC。
5.电泳仪要用去垢剂（例如，0.5％ SDS）清洁，用水浸泡，用乙醇干燥，然后添
入3％ H2O2。室温放置10min，然后用Rnase-free 水浸泡。
6.水应该用0.1％的DEPC进行处理。除试剂盒中的试剂外，其他试剂也需DEPC处
理。加0.1％ DEPC到100ml需处理的溶液中，轻摇使DEPC溶入溶液中，或者将溶液于37℃烘12小时。高压灭菌15min除去残留DEPC。
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://https://www.doczj.com/doc/168365403.html, HighPure Plasmid Mini Kit 高纯质粒小量快速提取试剂盒 目录号：PL03 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存 50次 （PL0301） 100次 （PL0302） 200次 （PL0303） 平衡液室温5ml 10ml 20ml RNaseA（10mg/ml）-20℃150μl 250μl 500μl 溶液P1 4℃15 ml 25 ml 50 ml 溶液P2 室温15 ml 25 ml 50 ml 溶液P3 室温20 ml 35 ml 70 ml 去蛋白液PE 室温16ml 31.5 ml 63 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 漂洗液WB 室温15 ml 25ml 50ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温10ml 15ml 20ml 吸附柱AC 室温50个100个200个 收集管（2ml）室温50个100个200个 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml） 置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。 2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分 钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍：
本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 产品特点： 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附 量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2.独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌 株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。 3.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的 质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 注意事项 1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议 接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基，过夜培养14-16个小时，可提取出多达20μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步骤相同。 3. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。 4. 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知 道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。 5. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗 脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－
直锥提取罐机组 目录 一前言 (2) 二设备性能简介 (2) 三基本技术参数表 (2) 四设备工作原理 (3) 五安全试车要求说明 (3) 六使用操作说明 (5) 七维护保养注意事项 (6) 八随机附件 (7) 一前言： 本提取罐设备属一类压力容器，启用前必须报劳动部门皮批准后方能使用。安装时应装置与设备要求相符的安全阀、减压阀和压力表等，操作人员上岗前应进行培训，以保证设备与人生安全。认真学习国家劳动颁发的“压力容器安全技术监察规程”并遵照执行。 二设备性能简介： 提取罐是专门为中药厂煮提工段设计的生产设备。具备直接加热和间接加热两种方式。排渣门采用气动执行结构完成开启和锁紧。凡与药物接触之处均采用不锈钢制作，具有良好耐腐蚀能力，确保中药产品质量，而且寿命厂。
本设备可作为中药或其它植物类水和乙醇提取、蒸制、灭菌及残渣中的乙醇用。设备附有“冷凝器”、“油水分离器”、“除沫器”、“双联过滤器”。“油水分离器”主要针对醇提用来吊油操作。 本设备具有提取时间短、生产效率高、能耗少、升温时间快、排渣方便、应用范围广、操作简单、安全可靠等特点。 三基本技术数据表：
四设备工作原理： 本设备的整个提取过程是在密闭的循环系统内完成。可进行常压提取，无论是水提、醇提、吊油等方面的工艺要求，均由中药厂根据制药工艺要求自行拟定。在此只作一般水提（醇提）基本原理介绍。 1、加热方式：如属水提，水和中草药装入提取罐后，开始向罐内通蒸汽，进行直接加热，当温度达到规定值后，停止向罐内进蒸汽，改为向夹套进蒸汽，进行间接加热，以维持罐内温度在规定范围内；如属醇提，则全部产用向夹套通蒸汽的方式进行间接加热。 2、强制循环提取：在提取过程中，为了使药液提取温度达到平衡和提高提取效率，可以用泵对药液进行强制循环（但对含淀粉多的物料和粘性较大物料提取不适用）。强制循环即药液从罐体下部放液口放出，经管道过滤器过滤，再用泵送回上部罐体内。 3、回流提取：在提取过程中，提取罐内必然会产生大量蒸汽，这些蒸汽从排气口经冷凝器进行冷凝，再回流到提取罐内，如此循环，直至提取终止。 提取液的放出:提取完毕后，药液从罐体下部侧过滤放液口和排渣门上的放液口一起放出，经管道过滤器过滤，然后用泵将药液输送到储罐或浓缩工段进行浓缩。 五安全试车要求说明： 1、安置要求 （1）设备落位后，应用螺栓或点焊固定在平台上，要求四个支座全部落实均匀受力。 （2）工艺管道依靠药液重力流动段，应按先后顺序，留有一定的液位差，以免液体滞留管内。 （3）速换旋转管接头处的外接管道应予以支撑，使旋转接头能随排渣门盖一起转动，防止损坏排渣门出液连接软管。 （4）进液管口应装置液体流量计，以方便记录进液量。 （5）蒸汽管必须装置减压阀、安全阀和压力表等安全附件。 2、试车要求 在设备安装完毕进行投产之前，首先检查一下主罐排渣门上的汽缸、卡勾等运动部分是否灵活，关闭排渣门时，卡勾能否锁紧到位，橡胶密圈是否起到密封作用，检查主罐排渣门以及辅助设备和管道等连接处、密封处是否漏水或漏气，安全附件是否正常，只有在经过全面检查确认符合安全要求后，才能正式投水试罐。 3、提取罐排渣门的操作流程： （1）、正常工作时：
TQ多功能提取罐 说明书 三原博康机械有限公司 地址：三原三独路东段1公里 电话：029— 传真：029— 邮编：713800
TQ 多功能提取罐说明书 一、主要用途： 本设备主要用于中草药的提取，并能回收溶媒和提取芳香油。 二、结构及特点 多功能提取罐，除主体外，为了回收溶媒和提取芳香油的需要，根据用户需要并提出，备有冷凝器、冷却器、油水分离器、过滤器和搅拌器等附件。主罐体和附件凡与药物接触，均用SUS304 进口不锈钢制造，具有良好的耐腐蚀性，符合GMP制药标准。为了便于排渣，底部出渣门内装有不锈钢过滤网，出渣门的启动和紧闭锁有汽缸控制，汽缸所配压缩空气压力要求在~，才能保证动作的顺利进行，气路的控制本厂备有简易控制装置，也可根据用户要求进行配套设计。 三、设备原理 多功能提取罐的工作原理是单纯的煎煮过程，中草药浸泡在水中，采用蒸汽加热，加热一定时间后，将有效成 分提取出来。煎煮时间的长短，可根据不同的性能自行决 定。一次投料量由于中草药的形状和有效成分提取难易不 一，所以不能作统一规定，只能建议投料量不超过设备容 积的三分之二为宜，当提取芳香油时，二次蒸汽通过冷凝、冷却后，油水进入油水分离器，清油在分离器上不排出， 重油在下部提出，水通过溢流排放或回流（具体流程见管
口方位及安装示意图） 设备在工作状态时，上钩锁紧系统气路的阀门亦出于工作状态。为了更加安全可靠，出渣门用3~4个夹紧锁。 四、主要技术参数 五、设备安装 操作台一般现场加工制作，然后用吊装设备将操作台立起，用水平尺找平。在平台上依次将主罐体、冷凝器、冷却器吊装就位、校平（误差3/100），然后参照安装图装好阀门，连接正气、进水、进料、冷凝水、冷却水、二次蒸汽管道。
精品文档 。 1欢迎下载 E.Z.N.A.? 质粒小提试剂盒操作规程（英文版译文） （适用于No. D6942, D6943 & D6944） 1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的1-5ml 的LB 培 养基进行培养。37℃强力摇动（~300rpm ）孵育12-16h 。使用10-20ml 培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。强烈推荐使用endA 阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。此类菌株包括DH5α和JM109。 2. 将1.5-5.0ml 细菌室温10,000 x g 离心1min 。轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。 3. 加入250μl 的溶液I/Rnase A 重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。充分重悬沉 淀对于获得高质量的DNA 非常重要。 4. 加入250μl 溶液II ，倒置、转动试管数次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。 可能需要孵育2min 。不要用力混合，以免使染色体DNA 断裂，减低质粒的纯度。该步反应不要超过5min 。溶液II 不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。 5. 加入350μl 溶液III ，立即倒置试管数次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。为避免 形成局部沉淀，加入溶液III 后应立即、充分混匀溶液。 6. 室温≥10,000 x g 离心10分钟。白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。 7. 小心翼翼．．．． 的吸取上清液，加入装配在2ml 收集管中的小量纯化柱I 中。确保离心沉淀未受扰动，确保没有细胞碎片加入到柱子中。室温下10,000 x g 离心1分钟，使裂解液完全通过柱子。 8. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入500μl HB 缓冲液清洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完成通过柱子。该步操作需确保残余的蛋白质污染被去除，以保证获得高品质的DNA 以适合于下游的应用。 9. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液清 洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完全通过柱子，丢弃滤过液。 注意：DNA 清洗液的浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释（5倍稀释），如果DNA 清洗液稀 释液经过冷藏，则使用之前必须置于室温。 10. 可选步骤：重复清洗，加入另外的700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液。 11. 将空柱子≥13,000 x g 离心2min ，使柱子的基质干燥。此步骤为关键操作，不可 遗漏。 12. 将柱子放入干净的1.5ml 微量离心管中。将30-50μl （取决于终产物的期望浓度） 洗脱液或无菌去离子水直接加入柱子基质上，使之于室温下静置1-2min 。≥13,000 x g 离心1min 洗脱DNA 。可以进行二次洗脱，以收集残存的DNA 。 13. DNA 的产量和质量：分别在波长260nm 和280nm 处测定样品适当稀释液的吸光度。DNA 的浓度计算如下： DNA 浓度=A 260×50×（稀释倍数）μg/ml A 260/A 280的比率可以反映核酸的纯度。比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。或者，DNA 的产量（及质量）有时可以通过琼脂糖胶/溴乙锭电泳与已知浓度的DNA 样品相比较更好的予以确定。通常情况下洗脱的大部分DNA 是超螺旋单体形式，但也可能存在串联体形式。 张小强 翻译
方案编号：TS-71191-00 设备编码：3A016 项目负责人： 确认领导小组审查汇签：
1.主题内容 本方案规定了前处理车间TTQZV5-00多功能提取罐的确认范围、方法及标准。 2.适用范围 本方案适用于前处理车间TTQZV5-00多功能提取罐的确认。 3.实施确认人员及职责 4.简介 4.1.TTQZV5-00多功能提取罐是我公司前处理车间用于中药材药液提取用，该设备主罐体和附件与物 料接触部分均采用304不锈钢制造，下方开有出渣门，出渣门内装304不锈钢席型过滤网，出渣门的启闭和锁紧采用推拉式专利技术，具有由气缸控制、安全自锁的功能。为确保该设备符合GMP 要求，符合工艺要求，保证产品质量，特对该设备的性能指标进行确认。 4.2.设备基本情况
5.验证范围 本次验证为xx制药有限公司TTQZV5-00多功能提取罐的确认，确认内容包括：设计确认、安装确认、运行确认、性能确认。 ●设计确认（DQ）：考察设备的技术规格、技术参数和指标的适用性并参考设备使用说明书考察设备是 否满足公司生产需求及GMP要求，整个设备设计确认过程应严格执行《设备管理规程》。 ●安装确认（IQ）：对安装设备的外观检查；测试的步骤、文件、参考资料和合格标准，以证实设备的 安装确实是按照制造商的安装规范进行的，符合设备运行前提条件。 ●运行确认（OQ）：按设备操作规程操作正常运行通过记录及文件证实设备能正常平稳运行，各功能键 按钮灵敏、可靠。同时确认设备操作规程的适用性。 ●性能确认（PQ）：设备的性能确认是负载运行机器，是以符合相应的药典和《规范》要求所展开的， 它是从设计、制造到使用最重要的一个环节，具体确认过程与工艺验证同步进行。 ●供应商所提供的该设备证书类（出厂合格证、使用说明书）文件已在初次检查后存档由专人保管，此 次不再进行确认。 6.确认目的 根据《质量风险管理规程》、《确认与验证管理规程》、《确认与验证操作规程》、《设备及公用系统确认SOP》的要求，同时参考《TTQZV5-00多功能提取罐使用说明书》对设备的各项技术指标及性能进行确认，用以证明该设备的各项指标和性能均能满足日后生产和GMP的要求。 7.培训 确认方案起草人在方案批准后对本次确认相关人员进行培训，并记录在相关附件中。如果在确认中涉及到其他培训，培训记录的复印件附在验证报告中。 8.变更和偏差处理
大量全血基因组DNA提取试剂盒 目录号：DN04 DN0401 16次×10ml DN0402 32次×10ml DN0403 96次×10ml 适用范围： 适用于快速提取各种动物全血基因组DNA 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存16次×10ml 32次×10ml 96次×10ml 10x红细胞裂解液室温50 ml 100 ml 300 ml 细胞核裂解液室温180 ml 180×2 ml 250 m l×4 蛋白沉淀液室温55 ml 110 ml 330 ml DNA溶解液室温15 ml 30 ml 90 ml 本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。 储存事项: 1.环境温度低时细胞核裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 2.蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不 能完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 本试剂盒根据全血特点采用几个快速步骤提取基因组DNA。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA 溶解液。 产品特点： 1.从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂。 3.快速，简捷，单个样品操作一般可在1小时内完成。 4.结果稳定，产量高（典型的产量10ml全血可提取出150-500μg），OD260/OD280 典型的比值达 1.7～1.9，长度可达50kb-150kb，可直接用于构建文库、PCR、Southern-blot和各种酶切反应。 注意事项 1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到2,500 x g，并配备容纳50ml心 管转头的传统台式离心机。 2.用户需自备异丙醇和70％乙醇。 3.典型的产量10ml全血可提取出150-500μg基因组DNA（不同样品尤其疾病样品中 中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大）。 4.本试剂盒为溶液型，可以很容易的按照比例扩大或者缩小每次处理的全血量 （20μl-10ml），请联系我们索取其它处理量的操作手册。
直锥提取罐机组 TQ-0.5 目 录 一 前言..................................................................2 二 设备性能简介......................................................2 三 基本技术参数表...................................................2 四 设备工作原理......................................................3 五 安全试车要求说明................................................3 六 使用操作说明......................................................5 七 维护保养注意事项................................................6 八 随机附件 (7) 一 前言： 本提取罐设备属一类压力容器，启用前必须报劳动部门皮批准后方能使用。安装时应装 置与设备要求相符的安全阀、减压阀和压力表等，操作人员上岗前应进行培训，以保证设备与人生安全。认真学习国家劳动颁发的“压力容器安全技术监察规程”并遵照执行。 二 设备性能简介： 提取罐是专门为中药厂煮提工段设计的生产设备。具备直接加热和间接加热两种方式。 排渣门采用气动执行结构完成开启和锁紧。凡与药物接触之处均采用不锈钢制作，具有良好耐腐蚀能力，确保中药产品质量，而且寿命厂。 本设备可作为中药或其它植物类水和乙醇提取、蒸制、灭菌及残渣中的乙醇用。设备附有“冷凝器”、“油水分离器”、“除沫器”、“双联过滤器”。 “油水分离器”主要针对醇
高纯度质粒小提试剂盒 Pure Mini Plasmid Kit (目录号：HS0103) 产品包装 试剂盒成分 50 preps Buffer P1 15 ml Buffer P2 15 ml Buffer P3 20 ml Buffer PD 30 ml RNase A(10 mg/ml) 150 ul Buffer PW 60 ml Buffer EB 10 ml Spin Columns PA 50个 Collection Tubes (2 ml) 50个 （注意：使用前将全部RNase A 溶液加到Buffer P1中混合均匀，2 ~ 8℃保存） 保存条件 本试剂盒在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2 ~ 8℃。若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。单独包装的RNase A 在室温可稳定保存12个月。加入RNase A 后的Buffer P1应置于2 ~ 8℃保存，可稳定保存6个月。 产品简介 本试剂盒用于高纯度质粒DNA 的小量制备与纯化。菌体经碱裂解、高盐、低pH 处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心柱硅胶膜（Spin Columns PA ）吸附。通过去蛋白液（Buffer PD ）和漂洗液（Buffer PW ）的清洗可去除蛋白及其他杂质，在低盐、高pH 条件下洗脱，最后得到高纯度的质粒DNA 。 北京厚生博泰科技有限公司 Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.
使用本试剂盒可从1 ~ 5 ml过夜培养的菌液中纯化得到高达20 ug的高纯度质粒DNA，可在30 min之内完成提取任务。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、低敏感细胞株的转染等各种常规分子生物学操作。 产品特点 1. 快速：步骤少，操作简便，节约时间。 2. 简便：离心吸附柱不需要预平衡，漂洗液Buffer PW 和去蛋白液Buffer PD不需要另加乙醇，即开即用。 3. 纯度高：所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、低敏感细胞株的转染等各种常规分子生物学操作。 操作步骤 1. 取1 ~ 5 ml过夜培养的菌液，室温12,000 rpm离心1 min，尽量将上清去除干净。 （注意：根据菌液的浓度决定取液量，浓度高时取1 ml菌液离心即可，浓度低时可多收集一次） 2. 加入250 ul Buffer P1，用枪头充分吹打使菌体重悬均匀。 （注意：是否将RNase A溶液加到Buffer P1中并混合均匀；菌体沉淀是否悬浮充分，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低） 3. 加入250 ul Buffer P2，温和颠倒混匀6 ~ 8次，直到溶液变得清亮粘稠。 （注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA片段的污染，所用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加Buffer P2的用量，在后续的操作中Buffer P3的用量也要相应增加） 4. 加入350 ul Buffer P3，立即温和颠倒混匀6 ~ 8次，可见白色沉淀物产生，室温静置2 min，然后12,000 rpm离心3 ~ 5 min。 （注意：Buffer P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清） 5. 小心将上清液转移到离心吸附柱Spin Columns PA中，静置2 min，让质粒DNA与吸附柱中的硅胶膜充分结合。12,000 rpm离心0.5 ~ 1 min，弃收集管中的废液。 6. 向吸附柱中加入500 ul去蛋白液，12,000 rpm离心1 min，弃收集管中废液。 （注意：如果宿主菌是endA-，如DH5α若TOP10，此步骤可省略。如果宿主菌是endA+，如TG1、BL21、HB101、JM101等，此步骤不可省略，因这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒。如果提取低拷贝质粒
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目录 1．验证目的························································2．验证范围························································3．方案说明·······················································4．验证职责·······················································5．设备概述························································6．验证步骤························································予确认 安装确认 运行确认 性能确认 7．偏差处理 8．验证方案总结····················································9．再验证周期······················································ 附录 测试仪器校验证书复印件 验证立项申批表 安装确认记录 运行确认记录 性能确认记录 验证方案培训表
一、验证目的 通过对CTG-10型中药提取器进行予确认、安装确认、运行确认和性能确认，验证 设备的性能是否符合工艺要求，达到保证设备正常运转的目的，从而保证最终产品 的质量。 二、验证范围 本方案的范围提供了验证本设备的概要。本方案应表明： A．每一件已安装的设备符合工程设计和设备数据单规格。 B．本设备是根据设计说明书和生产厂家推荐意见安装的。 C．备品备件清单完备且准确，并且所有的操作、预防性维护等手册完备。 D．所有的安装测试报告完备并保存于设备历史档案中。 E．本系统符合现行的兽药GMP要求。 F．没有事先批准或有文件记录的变更管理程序不得进行任何整改。 G．所有与安全有关的内容已形成文件。 H．本设备在设计标准范围内操作。 I．本设备的操作、清洗和预防性维护SOP符合现行GMP的要求。 J．本设备操作人员以接受了相应的培训，且培训情况记录在案。 K．建立了记录册以记录设备的使用、清洗和维护情况。 L．本设备能够在接受标准范围内运行，本设备能够符合生产要求。 三、方案说明 A．尽可能详细地填写本方案中的所有表格。用墨水笔填写。完成表格的人员应签上姓名和日期。如果由一个以上的人填写，那么每一个人都应签上姓名和日期。 B．方案执行时可能会发现偏差。一旦这种情况发生，应将一份异常情况报告送交验证领导小组进行处理。 C．验证小组在测试结束后应作出一份现场活动的总结报告，该报告由公司质量部经 理批准。 四、验证职责 A．验证领导小组 负责验证工作的组织和协调。 负责验证数据及结果的审批。 负责验证报告的审批。
E.Z.N.A.?质粒小提试剂盒操作规程（英文版译文） （适用于No. D6942, D6943 & D6944） 1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的1-5ml的LB培养基进行培养。37℃强力摇动（~300rpm）孵育12-16h。使用10-20ml培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。强烈推荐使用endA阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。此类菌株包括DH5α和JM109。 2. 将1.5-5.0ml细菌室温10,000 x g离心1min。轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。 3. 加入250μl 的溶液I/Rnase A重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。充分重悬沉淀对于获得高质量的DNA非常重要。 4. 加入250μl溶液II，倒置、转动试管数次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。可能需要孵育2min。不要用力混合，以免使染色体DNA断裂，减低质粒的纯度。该步反应不要超过5min。溶液II不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。 5. 加入350μl溶液III，立即倒置试管数次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。为避免形成局部沉淀，加入溶液III后应立即、充分混匀溶液。 6. 室温≥10,000 x g离心10分钟。白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。 7. 小心翼翼 ．．．．的吸取上清液，加入装配在2ml收集管中的小量纯化柱I中。确保离心沉淀未受扰动，确保没有细胞碎片加入到柱子中。室温下10,000 x g离心1分钟，使裂解液完全通过柱子。 8. 丢弃滤过液，重新使用2ml收集管；加入500μl HB缓冲液清洗柱子，室温10,000 x g离心1分钟，使溶液完成通过柱子。该步操作需确保残余的蛋白质污染被去除，以保证获得高品质的DNA以适合于下游的应用。 9. 丢弃滤过液，重新使用2ml收集管；加入700μl用无水乙醇稀释的DNA清洗液清洗柱子，室温10,000 x g离心1分钟，使溶液完全通过柱子，丢弃滤过液。 注意：DNA清洗液的浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释（5倍稀释），如果DNA清洗液稀释液经过冷藏，则使用之前必须置于室温。 10. 可选步骤：重复清洗，加入另外的700μl用无水乙醇稀释的DNA清洗液。 11. 将空柱子≥13,000 x g离心2min，使柱子的基质干燥。此步骤为关键操作，不可遗漏。 12. 将柱子放入干净的1.5ml微量离心管中。将30-50μl（取决于终产物的期望浓度）洗脱液或无菌去离子水直接加入柱子基质上，使之于室温下静置1-2min。≥13,000 x g离心1min洗脱DNA。可以进行二次洗脱，以收集残存的DNA。 13. DNA的产量和质量：分别在波长260nm和280nm处测定样品适当稀释液的吸光度。DNA的浓度计算如下： DNA浓度=A260×50×（稀释倍数）μg/ml A260/A280的比率可以反映核酸的纯度。比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。或者，DNA的产量（及质量）有时可以通过琼脂糖胶/溴乙锭电泳与已知浓度的DNA样品相比较更好的予以确定。通常情况下洗脱的大部分DNA是超螺旋单体形式，但也可能存在串联体形式。 张小强翻译
提取罐验证方案审批表
目录 概述 验证目的 验证方法 验证小组成员及职责 培训 验证实施的时间进度 验证步骤： 1.预确认 2.安装确认 3.运行确认 4.性能确认 偏差情况处理 拟定验证周期 验证结果评定与结论 变更及超出允许范围的对应措施 记录
概述： 提取车间进行GMP改造。多功能式中药提取罐是XXXX、XXXX、XXXX生产的关键设备，为达到GMP要求和满足生产的需要，对多功能式中药提取罐是否符合生产工艺要求和GMP要求进行验证。其工作原理如下： 本机是采用煎煮方法，物料由加料口送入，然后通过管道加提取溶剂，给罐体加热一段时间，收集提取液放出药渣。 验证目的：通过一系列验证，确认设备的安装、运行及性能符合生产需要，并提供足够的数据和文件依据以证明提取罐能够达到质量标准。 验证方法: 主要通过调研确定设备购置的可行性；通过外观检查和核对的方法进行设备的安装确认；通过启动设备后、观察和测试设备的各项技术参数来进行设备的运行确认；通过模拟生产或实际试生产进行设备的性能确认。 验证小组成员及职责： 参加验证人员及职责： 培训： 在设备验证实施之前，要先进行验证方案培训并确认岗位操作人员已进行了
岗位培训。 验证方案培训安排如下： 授课人： 培训人员： 培训时间： 培训时应填写人员培训记录及培训确认记录（表一-1-2）。 验证实施的时间进度： 验证步骤： 1.预确认 设备购置的可行性研究，通过调研确定以下内容： 1.1待购设备的性能（技术指标、型号）适用性 1.2设备结构设计合理性 1.3供货厂家的可靠性 （表二预确认记录） 2.安装确认 2.1仪器仪表校验的确认：列出设备安装确认、运行确认、性能确认所使用的计量器具清单及设备附属计量器具和仪表等清单，确认是否校验及校正周期。（表三验证用仪器、仪表校验记录） 2.2技术资料的确认:确认随机带来的文件、图纸的种类及数量、使用说明书及确认保存的位置。 2.3 设备的确认:包括设备的生产厂家、出厂日期、型号规格及性能技术指标。 2.4设备安装确认：根据设备技术文件及图纸要求，检查设备的安装地点是
微量临床样品基因组DNA快速提取试剂盒 目录号：DN25 目录编号包装单位 DN2501 50次 适用范围： 适合于从微量血液、法医材料、干血点、药签等微量样品中分离纯化基因组DNA。 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存50次 裂解液ML 室温11 ml 结合液CB 室温15 ml 抑制物去除液IR 室温25 ml 漂洗液WB 室温15ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 Poly Carrier -20℃200 μl 洗脱缓冲液EB 室温10 ml 蛋白酶K粉（可选） 20mg/ml -20℃20 mg 吸附柱AC和收集管室温50套本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果储存事项：
1.结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分 钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。 2.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后， 加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存，－20℃保存。 3.避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖 紧盖子。仔细阅读注意事项4。 4. 产品介绍： 本试剂盒采用特制的进口DNA吸附柱和独特的缓冲液系统，特别适合于从微量血液、法医材料、干血点、药签、口香糖、尿液等微量样品中分离纯化基因组DNA。各种来源样品裂解消化处理后DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜（特别配备了Poly Carrier可以从体系中轻松捕获微量核酸），再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净的基因组DNA 从硅基质膜上洗脱。纯化后的DNA无杂质和PCR抑制剂，可直接适用于PCR分析。 产品特点： 1.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 2.节省时间，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。 3.配备了Poly Carrier用于充分收集特别微量DNA。 4.多次柱漂洗确保高纯度，提取的DNA 纯度高，质量稳定可靠，可适用于各种常规 操作，包括PCR、酶切、测序、Southern 杂交等。
湖北盛通药业有限公司 验证报告 验证项目名称：DTQ-HF5m3多功能提取罐验证报告 验证报告编号：VR-TQ-05-02 验证方案编号：VP-TQ-05-02 验证完成日期：2012年04月21日至2012年05月08日验证人员：刘五艮、汪鹏、胡小桂、张向阳 报告编制日期： 报告编制人： 报告审核人： 报告批准人：
目录 1.验证目的 2.验证人员： 3.验证方案的实施情况 4.验证内容 4.1安装确认 4.1.1安装确认所需文件资料 4.1.2确认设备安装符合设计规范，GMP要求。 4.2运行确认 4.3性能确认 5、验证结论 6、价与建议 7、再验证周期 8、验证的结果与批准 9、附件
1.验证目的 进行验证的目的是对DTQ-HF5m3的安装过程、安装条件进行检查，安装后进行试运行，以证明设备能够达到设计要求及规定的技术指标；在确认设备能够达到设计要求或规定的技术指标的前提下，进行模拟生产，证明该设备不仅能够满足生产操作需要，而且符合工艺要求。 2.验证人员 由刘五艮、汪鹏、胡小桂、张向阳组成验证小组，负责对本设备的验证。 3.验证方案的实施情况 验证小组严格按验证方案所规定内容负责对DTQ-HF5m3多功能提取罐进行验证，具体时间从2012月04月21日至2012年05月8日。 4.验证内容 4.1预确认： 设备设计与造型： 根据生产规模，我公司对多功能提取罐的各种技术参数及性能指标进行了解，我公司已有一台3m3多功能提取罐，此次新增一个5m3提取罐可以满足生产需求。根据设计方案，我公司与多个设备生产厂家进行了接触和了解，比较几个厂家在生产多功能提取罐方面的优势和缺点，以及价格和货后服务等诸多因素，我们认为温州华芳机械制造有限公司生产的多功能提取罐符合设计要求。我们于2011
1.加2g土壤到15mL Bead Tube中 2.加入0.25mLSR1和0.8mLSR2之后，加入2.5mL Bead Solution到Bead Tube 3.加入3.5mL酚：氯仿：异戊醇25:24:1到试管中，加盖后涡旋混合直到分层消失。 4.最大转速涡旋震荡15min 5.室温，2500g离心10min 6.取出后，小心地转移上层水相到干净的15mL收集管中，弃掉下层酚 7.加1.5mL SR3到水相中，然后涡旋混匀，4℃孵育10min 8.室温，2500g离心10min。转移上清到一个新的15mL收集管中 9.加入5mL SR4溶液到装有上清的收集管中，混匀，室温孵育30min 10.室温，2500g离心30min 11.倒掉上清，将收集管倒置在纸上5min 12.震荡SR5混合。加1mL SR5到15mL收集管中，并反复吹打使完全重悬。 13.为每一个RNA样品准备一个RNA Capture Column A．拿去15mL收集管的盖子，将RNA Capture Column放入15mL收集管中。 B．加2mL SR5到RNA Capture Column中，让其完全流尽。 14.从第12步加入RNA样品至RNA Capture Column中，然后让其在重力作用下流尽。收集 液体。 15.用1mLSR5清洗柱子。重力流尽，收集洗脱液。 16.转移柱子到新的收集管，加入SR6震荡混合，然后加入1mL SR6到RNA Capture Column 洗脱RNA到15mL收集管中，重力流尽。 17.转移洗脱的RNA到2.2mL收集管中，并且加入1mL SR4.颠倒至少一次混合，然后-20℃ 孵育最少10min 18.室温13000g离心15min浓缩RNA 19.倒掉上清并倒转收集管在纸上10min晾干 20.用100μL SR7溶液重悬RNA沉淀，去除其中的基因组
提取罐 （TQ-3.0） 使 用 说 明 书 江阴市江中设备制造有限公司
一、前言 本提取罐设备属一类压力容器，启用前必须报劳动部门批准后方能使用。安装时应装置与设备要求相符的安全阀、减压阀、和压力表等，操作工人上岗前应进行培训，以保证设备与人生安全。认真学习国家劳动部颁发的“压力容器安全技术监察规程，”并遵照执行。 二、设备性能简介 提取罐是专门为中药厂煮提工段设计的生产设备。具有直接加热和间接加热两种方式。排渣门产用气动执行机构完成开启和锁紧。凡与药物接触之处均采用不锈钢制作，具有良好的耐腐能力，确保中药产品质量，而且寿命长。 本设备可作为中草药或其他植物类水和乙醇提取、蒸制、灭菌及回收残渣中的乙醇用。设备附有“冷凝器”和“管道过滤器”，以配合主罐完成多功能操作。如配置“油水分离器”还可进行吊油操作。 本设备具有提取时间短、生产效率高、能耗少、升温时间快、排渣方便、应用范围广、操作简单、安全可靠等特点。
技术参数表
三、设备工作原理 本设备的整个提取过程是在密闭的循环系统内完成。可进行常压提取，无论是水提、醇提、吊油等方面的工艺要求，均由中药厂根据制药工艺要求自行拟定。在此只作一般水提（醇提）基本原理介绍。 1、加热方式：如属水提，水和中草药装入提取罐后，开始向罐内通蒸汽，进行直接加热，当温度达到规定值后，停止向罐内进蒸汽，改为向夹套进蒸汽，进行间接加热，以维持罐内温度在规定范围内；如属醇提，则全部产用向夹套通蒸汽的方式进行间接加热。 2、强制循环提取：在提取过程中，为了使药液提取温度达到平衡和提高提取效率，可以用泵对药液进行强制循环（但对含淀粉多的物料和粘性较大物料提取不适用）。强制循环即药液从罐体下部放液口放出，经管道过滤器过滤，再用泵送回上部罐体内。 3、回流提取：在提取过程中，提取罐内必然会产生大量蒸汽，这些蒸汽从排气口经冷凝器进行冷凝，再回流到提取罐内，如此循环，直至提取终止。 4、提取液的放出:提取完毕后，药液从罐体下部侧过滤放液口和排渣门上的放液口一起放出，经管道过滤器过滤，然后用泵将药液输送到储罐或浓缩工段进行浓缩。 四、安置试车要求说明 1、安置要求 （1）设备落位后，应用螺栓或点焊固定在平台上，要求四个支座全部落实均匀受力。
1.柱平衡步骤：向吸附柱CP4 中（吸附柱放入收集管中）加入500 μL的平衡液BL, 12000 rpm（~13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） 2.取5-15ml 过夜培养的菌液加入离心管中，12000 rpm (~13400g ）离心1 min，尽量吸 除上清。 注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。 3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μL溶液Pl （请先检查是否已加入RNaseA ) ，使 用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。 注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。质粒 4.向离心管中加入500μL溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。注意：温和 地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA 。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。 5.向离心管中加入700 μL溶液P3 ，立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时会出 现白色絮状沉淀。12000rpm ( ~13400g ）离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。 注意：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 6.将上一步收集的上清液分次加入过滤柱Cs （过滤柱放入收集管中）, 12000rpm （~13400g ）离心2 min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4 中（吸附柱放入收集管中）, （如果过滤柱中有残余的液体说明步骤5 吸取的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀．尽量地吸取上清）。 7.12000rpm (~13400g）离心l min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中。 8.向吸附柱CP4 中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm（~13400g）离心l min，倒掉收 集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中。 9.向吸附柱CP4 中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm （~13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中。注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。 10.向吸附柱CP4 中加入600μL漂洗液PW , 12000rpm（13400g）离心l min，倒掉收集管 中的废液。 11.将吸附柱CP4 重新放回收集管中置于12000rpm（~13400g ）离心2 min，目的是将吸 附柱中残余的漂洗液去除。 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4 开盖，置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 12.将吸附柱自科置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μL洗脱 缓冲液TB ，室温放置2 min，12000rpm（~13400g ）离心l min将质粒溶液收集到离心管中。 注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中．重复步骤 12 。洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH 值在 7.0-8.5 范围内（可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱 效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μL，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存