2 附子研究概况
附子为亚门毛茛科(Ranunculaceae)植物乌头(AconitumcarmichaeliDebx．)侧根(子根)的加工品，其性大热、辛、甘，归心、肾，生品极毒。中医认为附子具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛、逐风通痹、温阳行水等功效。附子始载于《神农本草经》，主风寒咳逆邪气，温中，金疮，破症坚积聚，血瘕，寒湿，拘挛膝痛，不能行步[1]。
2.1 附子化学成分研究
国内外学者对附子化学成分的研究表明，附子的化学成分分为生物碱类物质、脂类物质和多糖类物质三大类。其中生物碱类物质为其主要成分，包括脂溶性生物碱：乌头碱（aconitine），中乌头碱（新乌头碱mesaconitine），次乌头碱（下乌头碱、海帕乌头碱hypaconitine），塔拉乌头胺（talatisamine），和乌胺（higeramine）棍掌碱氯化物（coryneine chloride）[2]，异飞燕草碱（isodelphinine），苯甲酰中乌头碱（benzoyl mesaconitine），新乌宁碱（neoline），北乌头碱（beiwutine），多根乌头碱（karakoline），去氧乌头碱（deoxyaconitine），准葛尔乌头碱（songorine）；水溶性生物碱：江油乌头碱（jiangyouaconitine），新江油乌头碱（neojiangyouaconitine）、尿嘧啶(Uracil)[3]、附子亭碱（fuzitine）、消旋去甲基衡州乌药碱（demethylcoclaurine）[4]、、附子宁碱（fuziline）、去甲猪毛菜碱（salsolinol）[5]等。其中双酯型生物碱乌头碱（aconitine），中乌头碱（mesaconitine），次乌头碱（hypaconitine）为其主要成分，约占0.4%-0.8%，易溶于氯仿、苯、无水乙醇和乙醚，难溶于水，微溶于石油醚，既是附子的药效成分，又是毒性成分。三者易水解成为毒性较小的单酯型生物碱：苯甲酰乌头碱（乌头次碱Benzoylaconine)、苯甲酰中乌头碱(Banzoylmesaconine)、苯甲酰次乌头碱(Benzoylhypaconine)[6]。其毒性仅为双酯型生物碱的1/1000。单酯型生物碱如果进一步水解则变为毒性更小或无毒的醇胺类生物碱：乌头胺(乌头原碱Aconine)、中乌头胺(Mesaconine)、次乌头胺(Hypaco-nine)。其毒性仅为乌头碱的1/2000左右[7]。此外，附子还含有棉子油、蓖麻油、附子脂酸等脂类物质和乌头多糖。
2.2附子主要药理作用
2.2.1 对心血管系统的作用
研究表明，附子对心血管系统的用主要体现在以下几个方面。首先是强心作用，附子的强心机理是附子中的强心成分致β受体兴奋，释放儿茶酚产生强心作用。已经被证明的具有强心作用的成分有去甲乌药碱、去甲猪毛菜碱、氯化甲基多巴胺、尿嘧啶以及附子苷，其中去甲乌药碱活性很强，对体内心脏、离体心脏和功能衰竭的心脏均有较强的强心作用，在稀释至10-9时仍表现出强心作用。秦永刚[8]等用离体蛙心，对不同蒸煮时间的附子进行了强心作用及心脏毒性的初步
实验观察，实验结果表明，蒸煮8h、10h、12h的附子具有强的正性肌力作用，且心脏毒性显著降低。张志仁[9]等的研究表明附子炮制前后有效部位对正常及心衰大鼠血流动力学作用趋势一致，且对心衰大鼠血流动力学作用较正常大鼠血流动力学作用显著。第二是抗心肌缺血缺氧的作用。附子中的生物碱具有扩张冠状血管和四肢血管的作用，可抗急性心肌缺血及常压下缺氧[10]。第三是增强心率、对抗缓慢型心律失常。附子中水溶性成分能对抗乌头类生物碱所诱发的心律失常，但是对多巴因、三氯甲烷所引起的心律失常无效，具有特异性。附子注射液可对抗垂体后叶素所致的各种不同类型的心律失常[11]。第四是对血压的影响。附子中的水溶性成分对血压的影响具有双重性，去甲乌药碱可以降血压，而氯化甲基多巴胺和去甲猪毛菜碱具有升压的作用。第五是抗休克作用。附子煎剂及复方可减缓血压下降、心率减慢等，能显著延长休克动物生存时间[12]。
2.2.2 抗炎镇痛作用
大鼠足踝肿胀实验证明，附子具有显著的抗炎和对外周性疼痛的镇痛作用。其抗炎镇痛机理，学术界的看法不一，除了已经被证明的具有较好抗炎作用的乌头类生物碱[13]和一些水溶性的成分外，还有一部分学者认为附子的抗炎镇痛与垂体-肾上腺皮质系统有关[14]。因此，附子的抗炎及镇痛的作用机理和有效活性成分有待进一步研究探讨[15]。
2.2.3 免疫系统作用
附子对免疫系统的作用表现为增强脾细胞的增值反应，增强巨噬细胞表面Ia抗原表达，增强红细胞免疫复合物(RBC—IC)花环形成率，产生抗体，提高免疫能力。马健[16]等研究发现乌头碱可增强巨噬细胞表面Ia抗原表达，提高抗原能力，从而增强机体免疫应答反应。此外，阮期平[17]等研究还发现附子中有两种糖复合物，同样具有抗癌、抗衰老和增强免疫机能的作用。
2.2.4抗肿瘤作用
附子具有很好的抗肿瘤作用，其抗肿瘤成分为多糖类成分，抗肿瘤机制为增强机体细胞的免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡，调节癌基因的表达。多位专家对此进行了研究，彭文珍[18]等研究发现附子多糖对HL-60有诱导分化作用。
2.2.5 其他作用
除上述介绍的药理作用外，附子还具有抗衰老、抗肾上腺素[19]、兴奋离体肠管自发性收缩、降糖等作用。张涛[20]等研究结果表明，附子能提高老年大鼠血清总抗氧化能力及抗氧化酶活性，降低自由基代谢产物的含量，提高机体抗自由基能力，减少脂质过氧化，改善细胞膜的流动性，从而保证细胞膜的完整和功能，起到延缓衰老的作用。附子多糖可以通过提高对葡萄糖的利用，但不提高胰岛素水平的方式起到降糖的作用。
2.3 乌头碱的毒性及中毒机制
附子的主要成分为双酯型的生物碱，包括乌头碱、次乌头碱、新乌头碱，它们既是附子的活性药效成分又是毒性成分。中毒剂量为0.2mg，服用剂量为2～4mg时即可致死。乌头碱的毒性主要作用于神经系统、消化系统、心血管系统和呼吸系统。对于神经系统，乌头碱能够对各种神经末梢和中枢系统产生一个先兴奋后再抑制的过程，并对心肌直接作用，进而造成呼吸中枢麻痹，中枢性血压下降，甚至引起室癫而死亡。对于心血管系统，乌头碱对心脏的损害最严重，临床表现为心悸、胸闷、血压下降、心率失常、心率减慢或过速，严重甚至发生心跳骤停、急性心源性脑缺血综合症等[21]。对于消化系统，乌头碱对胃肠迷走神经的兴奋作用可引起流涎、吞咽困难、恶心、频繁呕吐、胃部灼热、腹痛、腹泻、肠鸣音亢进，严重者可导致呕吐咖啡色样液及解鲜血样粪便，里急后重，酷似痢疾等表现[22]。对于呼吸系统，乌头碱的毒性可导致呼吸困难、呼吸麻痹甚至休克死亡。
2.4 附子有效成分的检测
附子化学成分复杂，其中药效表现最为明显的当属生物碱类成分，然而其剧毒性也是有目共睹的。附子的药效大小可以用总生物碱的含量来衡量，但不能以此来衡量附子的毒性大小。因为总生物碱包含多种类型的生物碱，各类型生物碱之间毒性差异极大，其中以双酯型生物碱的毒性最大，其他如单酯型、氨醇型生物碱的毒性很小。因此当以双酯型生物碱的含量作为毒性指标。附子中有效成分的检测方法主要有以下几种：
2.4.1总生物碱的检测
附子总生物碱的测定有两种常用方法，其一为药典方法，即中和滴定法，分为直接滴定法和回滴定法，直接滴定法的滴定终点不明显，不易判断；回滴定法灵敏度低，误差大。其二为酸性染料比色法，该法的原理是在酸性染料的作用下，生物碱类药物和氢离子结合而成的阳离子与酸性染料中的阴离子定量的结合成有色离子，经有机溶剂的提取后，在一定波长下测其吸收值，经数据处理后可得总生物碱的含量。该法灵敏度高，样品用量少，专属性好，但是对实验条件的要求严格，对实验条件十分敏感，稍作改变即会对结果产生较大影响，因此最好能找出一种更好的替代方法[23]。
2.4.2 双酯型生物碱与单酯型生物碱的检测
单一成分的酯型生物碱的含量测定方法主要有3种：第一为薄层色谱法，在一定的波长下用紫外或是可见光照射薄层板，在薄层板上对紫外或可见光有吸收的物质就会产生相应的斑点，对其进行扫描，扫描得到的图谱和积分值可用做药材的质量检查。该法可同时分析多个样品，展开剂用量少、选择多，样品处理简单。范时根[24]等以环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(10:5:1)为展开剂，改良碘化铋钾试剂喷雾，样品波长500nm，参比波长600nm，测定附子中的乌头碱含量，效果良
好。第二为高效毛细管电泳法，该法具有分离时间短、杂质干扰少、使用有机溶剂少、操作简便等优点，已被香港工业署组织的中药质量控制实验室用作有毒中药材的质量管理控制，是一种很有应用前景的分析方法[25]。第三为高效液相色谱法法(HPLC)，该法是现代中药检测中应用最多的方法，该法检测准确、灵敏度高、分离效果好、线性范围广，且能够同时检测几种生物碱含量。近年来，运用HPLC 法对附子中的生物碱进行检测的研究报道较多，方法不尽相同。如刘岚等[26]选用Kromasil C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，以甲醇-水-氯仿-三乙胺(70:30:1:0.15)为流动相同时检测成药中4种乌头类生物碱含量。贾金艳[27]等采用Welchrom-C18(5μm, 4.6mm×250mm)色谱柱，以甲醇-水-三乙胺(75:25:0.033)为流动相检测了附子中新乌头碱的含量，实验结果表明该法稳定可行,准确性好。侯大斌[28]等采用Zorbax extend-C18(150mm×4.6mm,5.0μm)色谱柱，乙腈—0. 1%乙二胺为流动相进行梯度洗脱，时间程序为0→15→30→35→60 min，乙腈体积分数相应为35%→50%→75%→35%→35%，对附子不同组织中的生物碱含量进行了测定与比较。
2.5附子炮制工艺研究概况
附子因其出色的临床效果为医家首肯，然而又因其毒性，让人敬而远之，为了安全考虑，临床上必须使用经过炮制的制附子。附子的炮制历史悠久，古人从汉代即开始对附子进行加工炮制，随着时代的发展，附子的炮制方法不断得到改进，到现在已经发展出多种工艺十分成熟的炮制方法，既有对传统炮制方法的改进又有现代创新的新炮制工艺。现从传统炮制工艺和现代炮制工艺两方面进行说明。
2.5.1 传统炮制工艺
传统的附子炮制工艺以减毒为主要目的，以此来保证用药的安全性，现在临床上使用最多的主要有以下几种：
盐附子：选择大小均匀的泥附子，洗净，于食用胆巴水溶液中浸泡过夜，然后加食盐，再浸泡，每日取出晒晾，并逐步延长晒晾时间，直至附子表面出现大量结晶盐粒（盐霜）、体质变硬为止，即得盐附子。
淡附片：取盐附子，清水浸漂，每日换水2～3次，至盐分漂尽，与甘草、黑豆加水煮至透心，切开后口尝无麻舌感时，取出，除去甘草，黑豆，切薄片，晒干。每 100kg盐附子，用甘草 5kg、黑豆10kg。即得淡附片。
黑顺片：取泥附子，洗净，于食用胆巴水溶液中浸泡数日，连同浸液煮至透心，捞出，水漂，切片（厚约0.5cm），再用水浸漂，用调色液将附片染成浓茶色后取出，蒸至出现油面、光泽，烘至半干，再晒干或继续烘干，即得。
白附片：选择大小均匀的泥附子，洗净并浸入食用胆巴的水溶液中，数日后，连同浸液煮至透心，捞出，剥皮，切片（厚约0.3cm），用水浸漂，取出，蒸透，
晒干，即得。
2.5.2 现代炮制工艺
传统的炮制方法因为过分强调安全性，以减毒为目标，导致有效活性成分流失，在降毒的同时药效大打折扣，并且整个过程费时费力，劳动强度大，度难以把握。有文献报道附子在炮制过程中，胆巴水泡损失31.6％生物碱，漂片损失33.6％生物碱，水解损失16.19％生物碱，生物碱减少量达81.39％”[29]。因此，在保证药效的前提下，有必要将传统炮制方法与现代科学结合，对炮制工艺进行创新。
高压蒸煮法：将洗净的附子经胆巴水浸，清水漂后切片， 110℃及68.65KPa 下蒸30min，干燥即得。该法降低了生物碱的毒性，减少了活性成分的流失，节省了时间，提高了效率。
微波炮制法：将制好的淡附片，再蒸制10～20min，晾干或烘干后，用微波进行辐射干燥，制得最终含水量在10%以下的附片。微波炮制法生产效率高，成本低，火候易控制，制得的附子毒性低，药效好。研究结果显示，将生附子制成微波附子后，水溶物和石油醚溶出物比例明显增大，而以毒性双酯型乌头碱为主的乙醚溶出物含量相对变化不大，这说明微波炮制使药物质地疏松，有效成分溶出率增大，同时破坏了毒性成分[30]。
附子颗粒：将附子通过水提醇沉的方式进行提取，将提取液浓缩，然后进行喷雾干燥制成附子颗粒。该法在保持药效的同时还表现出了增效特性，提高了附子的价值，是一种高效、稳定、可控的中药附子新型颗粒制剂[31]。
由此可见，尽管附子的炮制在传统基础上已有所创新，但是过程依然复杂，不易把握尺度，即使是制附子入药一般也要求煎煮较长时间以保证用药的安全，而煎煮时间过长则会影响疗效，给临床应用带来诸多不便。因此，应该寻求一种全新的炮制方法使附子的达到减毒增效的作用。
3 中药生物转化研究
长久以来，中药以其独特的入药方式、作用方式以及卓越的疗效为中华名族做出了巨大的贡献，特别是在一些疑难杂症上，中药往往更能切中要害，带来突出疗效。然而，我国的中草药在国际天然药物中却无法大放异彩，而且近年来，在国内也有发展变缓的趋势。究其原因主要是现代中药研究技术的相对落后，科技含量低，西方医药管理部门不认可直接以中药或中药复方为药，以及中医理论与现代科学技术脱节。因此，如何寻找一条新的途径或引入一种新的理论，使传统的中药与现代科学技术相结合，是我国中药现代化的重要课题。中药生物转化技术就是将中药与现代生物技术、生物工程技术和酶工程技术相结合所发展起来的一种新的中药炮制方法，已被列为国家科技部“十五发展规划”中的重要项目之一[32]。
生物转化是指利用酶或有机体(细胞、细胞器)作为催化剂实现化学转化的过程,又称生物催化,是生物体系(包括细菌、真菌、植物组织、动物组织培养系或生物体系的酶制剂)对外源性底物进行结构性修饰所发生的化学反应[33]。
中药生物转化是指将优选的一种或几种菌种，加入经预处理的中药（粉碎或提取液），利用微生物的生长活动产生的酶或有机体(细胞、细胞器)作为催化剂，实现对外源性底物的结构性修饰，最后经药化和药理实验对转化前后进行分析比较的过程，可以说是一种全新的中药炮制方式。
3.1 中药生物转化的历史
在我国悠久的中医中药发展史上，中药的生物转化其实并不陌生，早在千年前，我国就开始了用生物转化的方法制药，直到今天临床上仍有在应用的生物转化(制品)中药，比如六神曲、半夏曲、淡豆豉、豆黄等,它们均为固态发酵，且都在天然条件下进行。中药生物转化技术改变了传统的煎、煮、蒸、熬、浸等炮制工艺，而通过微生物的生长代谢和生命活动产生代谢产物的方式，使中药的药效提高或药性发生改变，以达到提高中药药效、改变药性、降低毒副作用等目的[34]。如中药淡豆豉，若以桑叶、青蒿生物转化，药性偏于寒凉，多用于治疗风热感冒或热病胸中烦闷；若以麻黄、紫苏生物转化，则药性偏于辛温，多用于治疗风寒感冒头痛[35]。但是由于传统的中药生物转化都是利用自然界的菌种，在天然条件下进行，存在菌种不纯、菌种有限、易染菌、针对性不强、难以有目的地定向的改变药物性质的问题，所以中药的生物转化发展缓慢。
3.2 中药生物转化的研究现状
中药的生物转化研究起步较晚，始于20世纪80年代。在天然药物化学研究领域，人们在不断寻找新的中药活性结构的同时，也不断对已知的中药活性化合物进行结构优化和改造，以期获得疗效强，毒副作用小的新型产物[37]。
现代研究表明，微生物菌群具有氧化、酯化、甲基化、羟基化、还原化等多种生物转化能力[38]。研究初期主要研究真菌类自身生物转化产生次生代谢产物，多为单一生物转化，如灵芝菌丝体、冬虫夏草菌丝体生物转化等[39]。随着研究的深入与发展，中药生物转化菌种由真菌类生物转化转向细菌、霉菌、酵母菌等生物转化，单一菌种向多菌种混合生物转化发展，生物转化方式也分为了固态发酵、液态生物转化和药用真菌双向固态发酵。生物转化技术还可以应用于体外模型进行药物代谢的研究。目前有关天然产物研究报道较多的是人体肠内菌群对天然产物的转化作用。
目前国外关于中药生物转化的报道较少，一些研究者对中药中单一有效成分的转化研究较为深入，得到了一些新化合物，部分化合物的活性超过了母体化合物。日本的纳豆胶囊是国外中药生物转化研究的典型，采用枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis Natto）生物转化大豆，可以提取纯化一种具有溶栓活性的纳
豆激酶（nattokinase）,该酶可以延长血栓形成时间，提高血栓再通率，减少肺内血栓的形成，且起效快、药效长。Suzukia[40]等研究发现，纳豆激酶能显著的降低血浆优球蛋白的溶解时间，降低血浆纤维蛋白原的含量，增加纤维蛋白裂解产物的含量。
3.3 中药生物转化的作用机理
生物转化是指利用酶或有机体(细胞、细胞器)作为催化剂实现化学转化的过程,又称生物催化,是生物体系(包括细菌、真菌、植物组织、动物组织培养系或生物体系的酶制剂)对外源性底物进行结构性修饰所发生的化学反应[41]。中药生物转化机理比较复杂，主要是利用不同微生物种群间的协同效应，依靠微生物生长代谢产生的代谢产物对中药进行生物转化以产生新的药效或提高药效。
一般说来，微生物生物转化在常温常压条件下进行，因此在此条件下的中药生物转化能够最大限度地保护中药中活性成，尤其是热敏感的芳香类挥发油、维生素等活性成分。微生物在生物转化时，中药中的物质成分可能对微生物的生长和代谢有促进或抑制作用，产生新的代谢反应，从而改变代谢途径，产生新的未知成分或改变已知成分的含量。同时微生物的分解作用也可能分解中药中的有毒成分，降低药物的毒副作用。
微生物分解中药成分主要依靠微生物代谢所产生的酶，不同种类的微生物以其独有的代谢方式产生不同种类和不同功效的酶。微生物代谢产生的酶主要有纤维素酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶等多种胞内酶类和胞外酶类。此外微生物在新陈代谢中还会产生丰富的次生代谢产物。
3.4 中药生物转化的优势
通过微生物生物转化来炮制中药,可以比一般的物理或化学的炮制手段更大地增强或调整药性,从而提高中药疗效,降低中药毒副作用,扩大中药适应症[42]。现代研究表明，作为一种新的中药炮制方法，较之中药的其他炮制方法，中药生物转化具有很多优势，具体有以下几点。
3.4.1 提高药效
通过中药的生物转化来提高药效的方式主要有两种。一种是提高中药有效成分的提取率，因为微生物在生物转化过程中会分泌纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等多种胞外酶，这些酶能使细胞破裂，细胞间隙增加，使中药的有效成分更易向胞外扩散，从而提高提取率。盾叶薯采用预生物转化的方式可以明显提高其有效成分盾叶薯苷元的含量。另一种是提高有效成分的吸收和利用，中药中不能被人体利用的大分子有效成分经生物转化后分子量小的活性物质，更易被人体吸收利用。
3.4.2产生新物质
在中药生物转化的过程中，微生物会产生多种酶和多种代谢物质能够将中药
中的某些成分分解转化成其他物质；同时在生物转化过程中，中药中的某些成分会对微生物的生长产生促进或抑制作用，甚至会改变自身的代谢方式，中药中的某些物质会被酯化、氧化、甲基化、异构化等转化形成新物质。这种形成新物质的化学变化较之简单的化学反应具有反应选择性强、反应条件温和、副产物少、不造成环境污染和后处理简单等优点[43]。如李国红[44]用枯草芽孢杆菌对三七须根进行生物转化，得到了5个新的成分。
3.4.3减毒增效
研究表明，在中药生物转化过程中，微生物可能将中药中的有毒物质分解或异构化，从而降低药材本身的毒性，有的甚至会增加药效。利用微生物生物转化的这一优点，对某些有毒性的中药的炮制就显得特别有意义。如乌头类药材，其药效成分亦为毒性成分，若能找到一种能将毒性成分进行结构修成异构体或结构类似物，毒性减小但作用效果不变的微生物，对乌头类药材进行生物转化，将会对乌头类药材的炮制开辟一片新的天地。如喜树碱虽然能够很好的抑制肿瘤活性但又具有严重的胃肠毒性，在抑制骨髓功能的时候引发出血性的膀胱炎。朱关平[41]采用无毒黄曲霉菌株将有毒的喜树碱经生物转化成了10-羟基喜树碱，10-羟基喜树碱为喜树碱的结构类似物，药效与喜树碱相似但毒副作用很小，且转化率达到了50%以上。
3.4.4保护活性成分免遭破坏
微生物生长通常是温和的常温、常压下进行，中药的有效成分在此条件下能够免遭破坏，尤其是一些对热较敏感的芳香类挥发油、维生素等活性成分能够更好的得到保护[45]。
3.4.5节省药源和能源
中药经生物转化后能够提高含量，提高药效，因而较之其他用药方式，可以减少中药用量，同时由于中药转化都是在温和的条件下进行，对动力的要求不高，所以能够节约能源。
3.4.6提高中药现代化水平
通过微生物生物转化有针对性的处理中药的特定成分，将对中药炮制技术与生物技术相结合，提高中药现代化水平，可以实现产业开发。
3.5中药生物转化的方法步骤
无论是单味中药还是复方中药，实质上都是一个由多种成分组成的混合物，中药生物转化的目的就是将其中一种或几种特定有效成分试图通过微生物的作用转化成其他新的物质或是提高目标物质的含量，然后对新物质进行药理试验，并最终应用于临床，实现生物转化与中医中药理论的现代化结合。通常中药的生物转化分为以下几个步骤：
3.5.1中药材的选择和前处理
在选择用以生物转化的药材是应选择药物成分明确、药效明显的单味药材或是中药复方，并对中药材进行前处理（粉碎或提取）。李国红等用枯草芽孢杆菌对50种中药进行生物转化,检测生物转化产物与原料对结核分支杆菌和榛色青霉的抗菌活性，部分中药的生物转化产物抗菌活性增加，部分中药的生物转化产物抗菌活性降低，部分中药的则活性没有变化[46]。
3.5.2筛选菌种
不同中药中有效成分不同，能利用这些有效成分的微生物种类各不相同。真菌由于能分解纤维素酶、淀粉酶、蛋白质酶等功能强大的酶类，对天然培养基的分解能力较强，故而在前期的研究中是中药生物转化的主要功能菌；随着研究的深入，细菌以生长繁殖速度快、针对性强、有较强的综合转化能力等优点受到广泛关注，特别是利用人体肠道中的有益菌群对中药进行转化已然成为当前中药生物转化研究的热点。杨秀伟等利用肠道细菌对苷类、黄酮类、香豆素类等中药活性成分进行生物转化[47]。
3.5.3最佳生物转化工艺
结合当前中药生物转化的研究，影响中药生物转化的主要因素是生物转化工艺。在整个生物转化过程中，微生物种类、培养基成分、培养条件（PH、温度、水分、时间、氧气）等都会对微生物的生长，微生物对培养基的利用，甚至是生物转化产物的组成比例造成影响，因此在生物转化时应该对其最佳生物转化条件进行研究，确定最佳生物转化工艺。过去由于科技水平和生产技术的限制，中药生物转化的条件难以控制，尤其是温度和湿度的控制只能凭经验,因此影响了中药生物转化质量的稳定性。随着科技的发展，现在无论是实验室还是生产上已经可以进行精确的控制，因而大大的提升了中药生物转化的质量和稳定性。如杨红亚等利用正交试验设计法，优化薏苡仁生物转化条件，并对其进行抗肿瘤活性研究，探讨其最佳转化条件[48]。药理实验
药理实验是检验中药生物转化效果好坏的重要保障，能更加明确微生物的性质和生物转化过程。通过药理实验将药材原料与生物转化产物进行对比研究，对药材生物转化前后有效成分、药理药效及毒性进行对比，达到筛选微生物和寻找天然产物替代物的目的。药理实验分为体外实验和体内实验，体外实验常用于大量筛选，体内实验常用于针对性较强的成分，体内实验较之体外实验省时、省力、成本低。何晨等利用芽孢杆菌生物转化炮制中药红花,药理学研究表明生物转化后可提高纤溶酶活性、抗凝作用,增强溶血栓药效[49]。
3.6 生物转化技术在中药炮制中的应用展望
中药生物转化作为一种新的中药炮制方法，不仅具有提高药效、减毒增效、节约能源药源等优点，更重要的是它可以为中药的深入发展和多元化研究提供方向。通过中药的生物转化提高中药的有效成分，可以实现产业开发；利用微生物
对某些天然活性成分的结构改造与修饰，产生新物质的特点，可以用于开发新型天然药物及大量稀有天然药物，寻找和开发新的高效低毒药物或其替代物，特别是在中药新药开发方面，利用生物转化技术可以扩大中药的治疗范围、进行剂型改进、创制新药，同时与高效快速药物筛选手段结合，不仅能为中药新药研究开发注入新的活力并带来革命性的变革，还对开发具有自主知识产权的新药、形成具有中国特色的生物转化研究体系具有重要意义，这已经被证明是最行之有效的开发新药的途径之一，具有广阔的发展前景。
然而，复杂的中药材与复杂的生物转化技术的结合必然更复杂，必须要找到一个合适的切入点，才能更好的把握中药生物转化技术的发展方向，可以说，中药的生物转化的发展方向将会影响到中药未来的发展。因此，对于今后中药生物转化的发展方向可以从以下几个方面进行研究。第一，对用于生物转化的菌种应进行广泛筛选，除了肠道有益菌群以外，也可以尝试利用毒菌生物转化中药，有时候可能会产生意想不到的效果。如毒蝇鹅膏菌含有神经毒素,能引起人的精神幻觉,在欧美还有食毒蝇菌的嗜好。采用这类毒菌生物转化相应的戒毒中药,有可能对开发戒毒类药物有所帮助。第二，微生物的生长条件是中药生物转化的关键，必须完善中药生物转化技术及设备，以便能更好的控制生物转化条件；第三，研究复合微生物协同生物转化技术；第四，应用现代分析技术,建立快速灵敏的分析检测方法；第五，对生物转化中药及组方进行药理研究，建立有效的筛选模型；第六，将中医理论与现代技术相结合，建立新的中医理论。
4 中药指纹图谱研究
众所周知，中华民族的中医历史源远流长，中药更是整个民族的瑰宝。在中医传统理论中，中药体现的是某一复方中多味药材配伍、相生相克所表现出来的物质群的整体效果。复方中的各味药材，在煎煮、炮制等过程中会发生某些反应产生一些原药材所不存在的物质，正是这些物质有的时候产生了对人体有益的整体疗效。所以作为中医防病治病的物质载体，中药原料药材质量的的好坏会直接影响到中医临床疗效和安全。同时某些名贵中药材物以稀为贵，使得一些不法商人铤而走险，以次充好，做假冒伪劣产品，这些伪劣产品仅靠外观鉴别难以辨识，给人民、给社会带来了极大的损失。因此，必须对原料药材、饮片、半成品甚至成品进行质量控制。
目前，我国现行的质量控制体系对中药的质量控制内容包括外观鉴别、性状检查以及有效成分的含量测定[50]。
外观鉴别和性状检查方面，主要靠肉眼观察以及简单的理化检查，对外观相似和成分相近的种属，其局限性不言而喻。有效成分的含量测定方面，主要是通过测定中药中1~2个具有代表性的有效成分来进行定性和定量的分析，以控制中药原料或饮片的质量。然而这就与中药成分多样性，发挥药效时多成分、多靶点
协同作用的特性不吻合。所以无论是外观鉴别、性状检查还是含量测定，都存在专属性不强的弱点，具有很大的局限性，并不能完全的表达中药的整体特征，较难科学全面的对药材或饮片等进行评价。所以在这种环境之下，中药指纹图谱质量控制技术也就应运而生。
中药指纹图谱质量控制技术是指通过将药材中所含的多种代表性成分进行分离并给出相应数据和信息，然后形成具有专属性的物质群的指纹图谱，再与其它图谱进行比较和相似度分析来完成从整体性角度的评价和质量控制。它借用了法医学中指纹鉴定的概念，将作为对照的药材或提取物所表达出来的整体特征作为“指纹”，通过综合的、可量化的鉴定手段，将供试品与“指纹”进行相似度的比较，以达到鉴别真伪、评价原料药材或中成药批次间质量是否统一、稳定的目的。具有专属性的物质群所表现出的指纹图谱具有相同（似）性，即体现了中药指纹图谱的“整体性”和“模糊性”。所以中药指纹图谱是指中药原料药材、饮片、半成品、成品等经过适当的处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱[51]。其基本属性是“整体性”和“模糊性”[52]。中药指纹图谱能够全面反映中药材中所含化学成分的种类与数量，具有专属性强、稳定性和重现性好等优点[53]并且可以依据指纹图谱信息特征，采用模糊数学的处理方法科学地、恰当地评价中药材和中成药的质量[54]。同时它也具有一定的局限性，比如至今没有一个完整的专家系统或是数据库以供大家查阅，指纹图谱相关信息不系统，给大家带来了极大的困扰，且目前常用的色谱技术只能对生物碱、挥发油、皂苷等大部分中药有效成分进行检测，对一些大分子物质如蛋白质、多糖等就难以进行检测，所以指纹图谱难以成为常规的分析方法[55]。
指纹图谱常用的方法有：色谱法，包括薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)；光谱法，包括紫外光谱法（UV）和红外光谱法(IR)；核磁共振法(NMR)；联用技术，包括气质联用（GC-MS）、液质联用(LC-MS)、核磁共振氢谱（IH-NMR）和LC-DAD（二极管阵列）-MS；其中色谱法为主流方法。下面对这些方法的优缺点进行一个简单的比较，见表1.1。
表1.1 中药指纹图谱方法比较
Table1.1 The Research Method of TCM FP 方法特点
色谱法HPLC
柱效高、灵敏度高、分离速度快、分析时间短、应用范
围广，可配以不同流动相及检测器,可分析绝大多数的有
机化合物
GC
快速高效、分析时间少、样品用量少，对于富含挥发油
类中药材的鉴别是首选方法
TLC
快速、经济、操作简单、应用范围广、重现性好、结果
直观，可以提供彩色图像
光谱法
IR
操作简便、分析迅速、专一性强、不破坏药品、安全，
近红外法（NIRS）更适合现场和在线检测、
UV
灵敏度高、精密度好、操作简便、样品用量少，凡是对
紫外有吸收的物质均可检测
NMR
主要用于新药的开发，鉴定结构，可与多重设备仪器联
用
AAS
主要用于测定中药中锌、铜、铁、铬等微量元素的含量、
简便、灵敏、准确
XRD
各组分对X线照射而产生的衍射效应的叠加，样品用量
少、前处理简单、操作方便、图谱信息量大、指纹性强
联用法
LC-MS
GC-MS
IH-NMR
LC-DAD-MS
常与其他检测方式联用；可以进行药材或药物的分析、
结构鉴定，灵敏、精确、样品用量少
5 创新点
5.1 有利于中药炮制方法现代化的研究
在传统中药炮制中，通过煎、煮、熬、炼、蒸、浸的传统工艺，改变药物的药性，降低药物的毒副作用，使药效提高。生物转化的方法在中药的炮制中也常有用到，它就是以微生物生物转化的方法改变药物的性质。将炮制理论与现代生物转化技术相结合，以中药的毒性成分作为生化反应的底物，进而降低毒性成分的毒性，增加药物的功效，有利于中药炮制方法现代化的研究。
5.2 有利于中药炮制理论的继承与发展
中药炮制理论是中药理论的重要组成部分，以生物转化技术进行附子的减毒增效为突破口，可加快中药炮制对中药药性改变的深入研究，这不但可以证实中
药炮制理论的合理性和实用性，而且有助于对中药炮制理论进行科学的整理，使中药炮制理论更易被传承，有利于中药炮制理论的发展。
5.3 有利于提高临床用药的安全性
附子含有剧毒化学成分双酯类生物碱毒性，炮制或用药不当可引起严重的不良反应，甚至导致死亡。通过合理炮制有利于降低毒副作用，能有效提高临床用药的安全性，提高临床用药的疗效。生物转化的方法通过温和的生物生化代谢反应将药物结构进行修饰和改造，使药物具有更强的特异性和选择性，能挖掘出药物的的潜在作用。
第二章附子中3种双酯型生物碱含量测定方法的建立
生附子为毛茛科植物乌头（A conitum carm ichaeli Debx.）的子根（侧根），制附子为其加工炮制品，主产地为四川，湖北、湖南亦有。附子性味辛、甘、大热，归心、脾、肾经，有剧毒，具有回阳救逆、补火助阳、逐风寒湿邪的功效。附子的主要化学成分是乌头类生物碱，可分为单酯类、双酯类和胺基醇类生物碱三类。其中双酯型生物碱包括乌头碱、次乌头碱、新乌头碱，它们含量高毒性大既是附子的药效成分又是毒性成分。
本实验以乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品为对照，采用高效液相色谱建立一种可以同时测定附子中乌头碱、次乌头碱和新乌头碱含量的测定方法，并对该法进行方法学验证。
1材料与试剂
1.1 材料
生附子产自四川省江油市，清水洗净，切片，约2cm厚，60℃烘干，打碎，过40目筛，备用。
1.2 试药
乌头碱对照（110797-200404）中国药品生物制品鉴定所
次乌头碱对照（110798-200404）中国药品生物制品鉴定所
新乌头碱对照（110799-200404）中国药品生物制品鉴定所
甲醇、乙腈色谱纯成都科龙试剂厂
乙酸铵色谱纯成都科龙试剂厂
氨水分析纯成都科龙试剂厂
异丙醇分析纯成都科龙试剂厂
乙酸乙酯分析纯成都科龙试剂厂
盐酸分析纯成都科龙试剂厂
乙醇分析纯成都科龙试剂厂
三蒸水自制
1.3 仪器
LC-20高效液相色谱仪日本岛津
Diamonsil C18柱5um(200*4.6mm)
T-50型溶剂过滤器天津市津腾实验设备有限公司
JJ1004小型超声波清洗机东莞市嘉劲机械有限公司
水相、有机相0.45 μm微孔滤膜天津市津腾实验设备有限公司
0.45 μm微孔滤头天津市津腾实验设备有限公
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HH-S数显恒温水浴锅江苏省金坛市医疗仪器厂
2方法
2.1 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18柱5μm(200*4.6mm)；
流动相：乙腈-0.4mol/L乙酸铵溶液（氨试液调PH=8.0）；梯度洗脱，洗脱程序见表2.1。
检测波长：240nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃
表2.1 梯度洗脱程序
Table2.1 Gradient eluation program
时间（min）
流动相组成
乙腈A（%）醋酸铵溶液B（%）
0.00-13.00 15 85
13.00-14.00 24 76
17.00-68.00 40 60
2.1.1 检测波长的确定
将乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的对照品溶液于200～800nm下进行全波长扫描，以确定其最佳检测波长。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取乌头碱、次乌头碱及新乌头碱对照品，置于25ml容量瓶中，加甲醇-0.05%盐酸（体积比）溶液溶解，摇匀，定容至刻度，制得乌头碱对照品为0.34mg/ml，次乌头碱0.52mg/ml，新乌头碱0.6mg/ml。
分别精密吸取上述对照品溶液，乌头碱对照品1ml、次乌头碱0.5ml，新乌头碱0.5ml置于10ml容量瓶，加甲醇-0.05%盐酸（体积比）溶液定容，制得混合标准品，其浓度为乌头碱0.17mg/ml，次乌头碱0.13mg/ml，新乌头碱0.15mg/ml。
2.3供试品溶液的制备
2.3.1提取方式考察
2.3.1.1 超声提取法
取附子粉末4.0g（过40目筛），精密称定，置具塞100ml锥形瓶中，加氨试液（即25%的氨溶液）4ml,浸润30min，精密加入乙酸乙酯-异丙醇（1:1）混合液100ml，摇匀，称定重量，超声60min，放冷称量，用上述混合试剂补足失重，摇匀，滤过，精密称取滤液50ml，40℃下减压回收溶剂至干，用0.05%盐酸-甲醇（体积比）溶解残渣，过滤，定容至10ml作为供试品1。分别吸取混合对照品和该供试品各10μl，按上述色谱条件进行测定，记录峰面积。
2.3.1.2 回流提取法
称取生附子粉（过40目筛）4.05g，置于锥形瓶中，加7倍量95%的乙醇回流提取3次，每次1h，合并滤液，定容至80ml，在35℃下减压回收乙醇，用0.05%盐酸-甲醇溶解残渣，过滤，定容至10ml作为供试品2。分别吸取混合对照品和该供试品各10μl，按上述色谱条件进行测定，记录峰面积。
2.3.1.3 水提醇沉法
称取生附子粉（过40目筛）30.105g，加10倍量水煮5h，合并滤液定容300ml，冷却，80%乙醇醇沉得滤液550ml，在35℃下减压回收乙醇，用0.05%盐酸-甲醇溶解残渣，过滤，定容至50ml作为供试品3。分别吸取混合对照品和该供试品各10μl，按上述色谱条件进行测定，记录峰面积。
2.3.2 提取时间考察
取附子粉末4.0g（过40目筛），共3份，置具塞100ml锥形瓶中，加氨试液（即25%的氨溶液）4ml,浸润30min，精密加入乙酸乙酯-异丙醇（1:1）混合液100ml，摇匀，称定重量，分别超声30min、60min、90min，放冷称量，用上述混合试剂补足失重，摇匀，滤过，精密称取滤液50ml，40℃下减压回收溶剂至干，用0.05%盐酸-甲醇（体积比）溶解残渣，过滤，定容至10ml作为供试品1、2、3号。分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10μl，按上述色谱条件进行测定，记录峰面积。
2.4 线性关系考察
分别吸取混合标准品溶液1、2、4、8、10、16ul，照上述色谱条件测定峰面积值，采用外标法，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程。
2.5 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液10μL，重复进样5次，于240nm下测定，并计算峰面积的相对标准偏差值RSD
2.6 重复性试验
按供试液制备方法，取同一批样品5份，按上述供试品溶液制备方法制成供
试品溶液，测得乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积值及RSD 值。 2.7 对照品稳定性试验
取混合标准品溶液于0，2，4、6，8h 分别进样10μL ，于240nm 下测定，测得乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积值并计算RSD 值。 2.8 供试品稳定性试验
按供试品溶液制备方法制备供试液，于0，2，4、6，8h 各进样20μL ，于240nm 下测定，测得乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积值并计算RSD 值。 2.9 加样回收试验
精密量取已知含量的样品10g ，共6份，分别加入一定体积一定浓度的对照品溶液，按上述样品制备方法制得供试品溶液，按含量测定方法操作，测定乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的含量，按照公式计算回收率。
回收率（%）=%100?-B
A
C 其中，A ：供试品被测成分含量
B ：加入对照品量
C ：实际测得值 3 实验结果 3.1 检测波长的确定
取乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的对照品溶液于200～800nm 下进行全波长扫描，结果见图2.1～2.7。
图2.1 乌头碱紫外扫描图
Fig2.1 Ultraviolet Scanning Graph of Aconitine
图2.2 次乌头碱紫外扫描图
Fig2.2 Ultraviolet Scanning Graph of Hypaconitine
图2.3 新乌头碱紫外扫描图
Fig2.1 Ultraviolet Scanning Graph of Mesaconitine
图2.4 混合对照品紫外扫描图
Fig2.1 Ultraviolet Scanning Graph of Mix Reference
min
-250
25
mAU
230nm,4nm (1.00)
图2.5 混合对照品230nm 处HPLC 色谱图 Fig2.5 The HPLC Chromatogram of 230nm
min
-10010203040mAU
235nm,4nm (1.00)
图2.6 混合对照品235nm 处HPLC 色谱图 Fig2.6 The HPLC Chromatogram of 235nm
min
010203040mAU
240nm,4nm (1.00)
图2.7 混合对照品240nm 处HPLC 色谱图 Fig2.7 The HPLC Chromatogram of 240nm
由图2.1～2.7可知，乌头类生物碱的紫外最佳吸收波长在230～240nm 之间，结合混合对照品在230nm 、235nm 、240nm 处的HPLC 色谱图(图2.5～2.7)可知，混合对照品的HPLC 色谱图在波长为230～240nm 之间峰形及分离度均较好，但在230nm 和235nm 处，基线不稳，在240nm 处，基线平稳。故该试验选择波长240nm 为检测波长。 3.2 系统适用性试验
分别乌头碱对照品溶液、次乌头碱对照品溶液、新乌头碱对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各10μL ，按照上述色谱条件进行测定，分别记录色谱图，结果见图2.8～2.12。